KR960015892B1

KR960015892B1 - 열안정성 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제, 그의 제조방법 및 이용

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Publication number: KR960015892B1
Application number: KR1019890701081A
Authority: KR
Inventors: 엘. 스타안즈 로버트; 시. 트랙만 필립; 엠. 캣콕신 데니스
Original assignee: 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브; 안네 제케르
Priority date: 1987-10-15
Filing date: 1988-10-14
Publication date: 1996-11-23
Also published as: WO1989003421A1; EP0338057A1; FI98737C; DE3886382D1; KR890701730A; FI892927A; JPH02500247A; FI892927A0; EP0338057B1; JP2854009B2; FI98737B; DE3886382T2

Abstract

내용없음.

Description

[발명의 명칭]

열안정성 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제, 그의 제조방법 및 이용

[도면의 간단한 설명]

제1도는 CGTase에 대한 상대적 활성대 온도를 도시한다.

제2도는 CGTase에 대한 상대적 활성대 pH를 도시한다.

제3도는 ATCC 53,627로부터의 CGTase와 바실루스 스테아로써모필루스 α-아밀라제 및 테르마밀^TM의 열안정성을 비교한 그래프이다.

제4도는 CGTase I, II, III의 작용 패턴을 보여주는 HPLC 플롯도이다.

제5도는 CGTase, 테르마밀^TM및 바실루스 스테아로써모필루스 α-아밀라제를 사용하여 전분 액화를 비교한 점성대 시간의 그래프도이다.

제6도는 CGTase의 용량수준을 변화시켜가면서 얻어진 액화된 전분 용액의 점성의 변화를 나타내는 토크대 회전속도 측정의 그래프를 도시한다.

제7도는 CGTase의 작용 패턴과 바실루스 스테아로써모필루스 α-아밀라제의 작용 패턴을 비교하는 HPLC 그래프도이다.

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제, 그의 제조방법, 그것을 생산할 수 있는 미생물 균주 및 그의 전분 액화 및 시클로덱스트린 제조에의 이용에 관한 것이다.

[배경기술]

본원에서 이하 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제 또는 CGTase라 칭하는 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제(1,4-α-D-글루칸 4-α-D-(1,4-α-D-글루카노)-트란스퍼라제, E.C.2.4.1.19)는 전분 또는 전분 가수분해물의 고리화에 의하여 시클로덱스트린을 형성할 수 있는 능력을 가지고 있는 효소이다.

그에 따라, 효소적 고리화 반응은 시클로덱스트린(CD로 약칭하고 또한 사르딩거 덱스트린으로도 알려짐)을 생성하고, 그렇게 만들어진 고리형 분자는 α-1,4-결합에 의해 연결된 6,7 또는 8개의 α-D-글루코피 라노스잔기로 구성된다.

그것들은 각각 글루코스 잔기의 수, 6,7 또는 8에 따라 α-, β-, 또는 감마-시클로덱스트린으로 알려져 있다.

전형적으로 시클로덱스트린은 지금까지 이. 비. 틸든과 시. 에스. 허드슨의 방법(

: 1432(1942))을 변용하여 제조되어 왔는데, 그 방법은 액화된 전분을 바실루스 마세란스

로부터의 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제(CGTase) 효소로 처리하는 것을 포함한다.

이 방법의 모든 변형 방법들은 많은 단점이 있다.

첫째, CGTase가 전분의 젤라틴화 온도이상에서 사용될 때에는 충분히 열안정성이지 못하므로, 전분이 예비처리되어야 한다.

예컨대, 전분을 용해하기 위하여 α-아밀라제로 예비처리하여야 한다. 전분은 상대적으로 낮은 DE(덱스트로스 당량)로 액화되어야 하고, 그러한 전분 액화공정을 수행한 후에는 처리제, 정상적으로는 α-아밀라제가, 양호한 시클로덱스트린 수율을 얻기 위해 비활성화되어야만 한다는 것이 중요하다.

둘째, 바실루스 마세란스 CGTase는 상승온도에서도 사용할 수 있을 정도로 충분히 안정하지 못하며, 따라서, 효소적 시클로덱스트린화 공정은 약 50℃에서 수행되며, 이런 상황은 미생물 오염이 되기 쉽다.

셋째, 바실루스 마세란스 CGTase에 의한, 전분의 시클로덱스트린으로의 전환( 50℃, pH 7.0에서)은 이론적인 수율이 얻어지기 전에, 연장된 반응시간을 필요로 한다.

당해 기술분야에 지금까지 알려진 CGTase 효소는 바실루스 마세란스, 바실루스 서큘란스

, 바실루스 스테아로써모필루스

, 바실루스 메가테리움

, 바실루스 오벤시스

, 알칼리 친화성 바실루스종, 마이크로코커스 루테우스

, 마이크로코커스 바리안스

및 클레브시엘라 뉴모니아에

같은 미생물에 의해 생성된다.

그러나, 이들 미생물에 의해 생성되는 CGTase 효소중 어느 것도 가능한 미생물 오염을 피하기 위해 충분히 상승된 온도에서 시클로덱스트린을 제조하기 위해 사용할 수 있도록 60℃ 이상에서 충분히 안정하지는 못하다.

수성 전분 슬러리의 효소적 액화는 전분을 덱스트로스(글루코스)로 전환시키는 첫 번째 단계로서 광범위하게 실시된다.

대단한 정도로 전분산업은 US 3,921,590의 액화공정을 채택하고 있다. 전형적인 조건은 105℃에서 5분동안의 제트쿡킹(jet cooking)과 이어서 35중량% DS(건조물)의 전분 농도로, 95℃에서의 90분동안의 보유이다.

이 공정에서 사용되는 효소는 바실루스 리케니포르미스

로부터의 α-아밀라제인 테르마밀^TM(노보 인두스트리 아크티에 셀스카브 제품)이다. 액화는 pH 약 6.0에서 수행되며 그런 다음에 글루코아밀라제로 대략 4.5-5.0의 pH에서 당화가 수행된다.

당해 기술분야에서는 중간 pH 조정에 대한 필요성을 제거하기 위하여 pH 4.5에서 액화시킬 수 있는 전분 액화효소를 오랫동안 찾아왔다. 바실루스 스테아로써모필루스로부터의 α-아밀라제가 이 목적에 적당한 것으로 추정되었지만 이 명세서중의 데이터는 4.5 정도로 낮은 pH에서는 그것이 액화를 잘 진행시키지는 못한다는 것을 보여준다. US 4,578,532와 US 4,613,570은 클로스트리듐

으로부터의 산성 α-아밀라제를 개시하고 있지만, 상기 특허에서의 데이터는 100℃ 또는 그 이상에서 및 pH 4.5에서의 그의 안정성이 불충분하다는 것을 나타내고 있다.

[발명의 목적]

본 발명의 목적은 미생물 감염의 위험이 적은 60℃ 이상에서 CD 제조에 사용되기에 충분한 및 전분이 완전히 젤라틴화되는 90℃ 이상에서의 전분 액화에도 사용될 수 있기에 충분한 열안정성을 가진 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제를 제공하는 것이다.

발명의 다른 목적은 pH 4.5에서 및 100℃ 이상의 온도에서 전분을 액화할 수 있는 효소를 제공하는 것이다.

발명의 또 다른 목적은 상기 열안정성 효소의 제조방법과 그것을 제조할 수 있는 미생물 균주의 제공에 있다.

또 하나의 목적은 60℃ 이상에서 CD를 제조하기 위하여 상기 효소를 사용하는 방법과 4.5-5.0 부근의 pH에서 전분 액화에 상기 효소를 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

[발명의 설명]

본 발명자들은 놀랄만한 열안정성의 CGTase를 생산하는 호열성 편성(obligate) 혐기성 균주를 다수 단리하였다.

따라서, 발명의 첫 번째 측면으로, 써모안에어로박터

또는 써모안에어로븀

의 균주 기원의, pH 5.0에서 약 95℃로 측정된 최적 온도; 약 5.0의 pH 최적; 및 전분 및 Ca++의 부재하에 80℃ 및 pH 5.0에서 40분 인큐베이션후 약 95%의 잔류 활성을 가지는 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제가 제공된다.

발명의 두 번째 측면으로는, 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제(CGTase)의 제조방법이 제공되는데, 그 방법은 써모안에어로박터 또는 써모안에어로븀의 CGTase 생성균주를 적당한 영양함유 배지에서 혐기조건하에서 배양하거나, 또는 그로부터 적합한 유전정보를 함유하는 형질전환된 숙주 유기체를 호기 조건하에서 배양한 후 발효 배지로부터 CGTase를 회수하는 것을 포함한다.

발명의 세 번째 측면으로는, 써모안에어로박터 또는 써모안에어로븀의 균주의 생물학적으로 순수한 배양액이 제공되며, 그들 균주는 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제를 생산할 수 있는 능력과 비운동성인 것을 특징으로 한다.

발명의 네 번째 측면으로는, 전분 액화방법이 제공되며, 그 방법은 수성 전분 슬러리에 상기 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제의 존재하에 약 4.0 내지 5.5 범위의 pH에서, 바람직하게는 약 100℃ 이상의 온도에서 효소적 액화를 수행하는 것으로 이루어진다.

발명의 다섯 번째 측면으로는, 시클로덱스트린의 제조방법이 제공되는데, 그 방법은 상기 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제로 전분 가수분해물 용액을 60℃ 이상의 온도에서 효소적으로 처리한 후 반응 혼합물로부터 시클로덱스트린 생성물을 회수하는 것으로 이루어진다.

마지막으로, 발명의 여섯 번째 측면으로는 시클로덱스트린의 제조방법이 제공되며, 그 방법은 수성 전분 슬러리를 특허청구 범위 제1항에서 청구되는 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제로, 약 100℃ 이상의 온도에서 및 4.0 내지 5.5 범위의 pH에서, 바람직하게는 필수적인 칼슘염의 첨가없이 효소적으로 처리한 후, 그 결과의 시럽을 80℃ 내지 90℃ 범위의 온도에서 약 28시간 이하의 시간동안 보유하여 그 시럽이 상기 보유시간의 적어도 일부분에서 20-30DS의 범위에 있도록 한 후, 반응 혼합물로부터 시클로덱스트린 생성물을 회수하는 것으로 이루어진다.

[발명의 상세한 설명]

[미생물]

발명의 미생물은 써모안에어로박터 속

또는 써모안에어로븀 속(J.G.Zeikus

Arch. Microbiol., 122 41-48(1979))에 속하는 호열성 편성 혐기성 박테리아이다.

이들 속의 분류학은 수립되어 있지 않으며, 이 분야의 전문가 조차도 이들을 구별할 수 없을 정도로 그렇게 유사하므로 두가지 속이 적절하게 하나의 동일한 속으로 분류될 수 있으리라 여겨진다.

써모안에어로박터와 써모안에어로븀의 공지 균주와는 대조적으로 발명의 미생물 균주는 CGTase를 생산할 수 있는 능력과 비운동성인 것을 특징으로 한다.

발명의 몇가지 균주는 또한 공지 균주와는 달리 인돌양성이다. 공지 균주인 티. 에탄올리쿠스

DSM 3389와 티. 피니이

DSM 2246은 열안정성 CGTase의 생산주가 아닌 것으로 밝혀졌다.

발명자들은 8균주를 단리하여 부다페스트 조약의 규정하에 특허 수속상의 목적으로 아메리칸 타입 컬춰콜렉션(ATCC)과 더 내셔날 콜렉션즈 오브 인더스트리알 마린 박테리아(the National Collections of Industrial Marine Bacteria; NCIMB)에 기탁하였고, 그것은 다음과 같다 :

상기 균주들의 돌연변이주 및 변이주들도 또한 발명의 범주에 포함된다.

이들 8균주는 모두 NCIMB(Scotland)에 의해 써모안에어로박터종 또는 써모안에어로븀종으로 분류되었고 그 속은 불분명하다. 다른 분류학적 데이터를 아래에 제시한다 :

주 : (a) 다양한 길이의 과립형 막대, 사슬형.

(b) '과립형'이 끼어있는 정규적인 막대형, 단일 사슬 및 짧은 사슬.

(c) (전분아가, 3일) : 둥글고 규칙적이며, 완전하고 매끄러운, 낮은(?), 볼록한(?), 불투명한 황색기가 있는 버프, 직경 2.5mm.

(d) (R.C.M., 3일) : 둥글고 규칙적이며, 완전하고 매끄러운, 빛나는 반투명의, 평평한 백색, 직경 3mm.

(e) +(느리게 7일)

(f) 펩톤 물 당 : 산 또는 가스가 없음.

ND 측정되지 않음.

API 20A 혐기성 시험

24시간 60℃

NC : 배양후 변화없음

± : 미량반응

* : 고온에 의해 유발된 인공물일 것이다.

[CGTase의 제조]

CGTase 효소의 제조는 발명의 미생물 균주(예컨대 ATCC 53,627)를 혐기성 조건하에서, 탄소공급원으로서 말토덱스트린, 효모추출물 및 광용액(mineral solutions)을 함하는 배지중에서 배양함으로써 이루어질 수 있다.

CGTase의 제조에 대한 최적 pH 및 온도는 pH 7.0과 67℃이다. 발효배지중으로 배설된 효소는 그것이 세포외재성 효소임을 의미한다.

또는, 발명의 CGTase는 적합한 유전정보를 함유하는 형질전환체의 호기배양에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이 제조방법은 다음 단계들을 포함할 것이다 :

(a) 유전자 발현을 용이하게 하는 기능을 코드화하는 DNA 서열과 써모안에어로박터 또는 써모안에어로븀 균주의 CGTase를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 적당한 재조합 DNA 클로닝 벡터를 준비하는 단계;

(b) 적당한 숙주 유기체를 단계(a)로부터의 클로닝 벡터로 형질전환하는 단계;

(c) 형질전환된 숙주를 호기성 조건하에서 적당한 영양함유 배지중에서 배양한 후 배지로부터 CGTase를 회수하는 단계.

적당한 숙주 유기체의 실례는 어셔리시아

, 스트렙토마이세스

, 바실루스

또는 아스페르길루스

의 균주들이며 대장균, 고초균, 바실루스 리케니포르미스

또는 아스페르길루스 오리자에(A. oryzae)가 바람직하다.

CGTase는 발효배지로부터 세포를 제거한 후 브로스를 예컨대 한외여과에 의하여 농축함으로써 회수될 수 있다.

[CGTase의 정제]

특성확인이라는 목적에 대해서, ATCC 53,627로부터의 미정제 CGTase 제제의 균질물로의 제제는 DEAE-세파로스 크로마토그래피, 등전점크로마토그래피R 및 아카르보스-세파로스 친화성 크로마토그래피에 의해 수행하였다.

I, II 및 III으로 표시한 3가지 성분을 정제하였다.

단지 하나의 CGTase 성분만이 다른 균주로부터의 미정제 제제에 있음을 SDS-폴리아크릴아미드 겔전기 영동을 토대로 알았다.

[CGTase의 열안정성]

발명의 CGTase를 그 열안정성으로 인하여 선행기술 효소보다 훨씬 월등한 것으로 특성 짓는다.

5% 린트너 전분-0.1M 아세트산나트륨 pH 5.0(50ppm

)-에서 50분동안 95℃에서 배양한 후에도, 발명의 CGTase(ATCC 53,627)는 그 활성의 거의 100%를 보유한다.

제3도는 pH 5.0에서 다양한 온도에서 기질과 Ca⁺⁺의 부재하에 40분동안 배양한 후의 ATCC 53,627로부터의 미정제 CGTase의 잔여 활성을 도시한다.

도시된 바와 같이 그것은 80℃에서 및 이들 조건에서 그의 활성의 대략 95%를 보유한다.

비교를 위해서, 2가지의 선행기술 액화 효소에 대한 데이터도 또한 도시한다 : 바실루스 리케니포르미스로부터의 α-아밀라제(Termamyl^TM)와 바실루스 스테아로써모필루스로부터의 α-아밀라제.

성분 I, II 및 III은 ATCC 53,627의 미정제 CGTase와 유사한 열안정성을 갖는다.

비교를 위해서, 기재된 바실루스 마세란스 CGTase는 50℃ 이하의 온도에서만 안정하고 50℃ 이상에서는 신속하게 활성을 잃어버린다(Stavn, A. and Granum, P.E. in

75[1979]243).

[CGTase의 특성확인]

온도 최적. CGTase 활성에 미치는 온도의 영향을 측정하였다.

ATCC 53,627로부터의 CGTase는 pH 5.0에서 0.1M 아세트산나트륨-100ppm

중에서 95℃에서의 온도 최적을 갖는다(제1도 참조).

이 최적은 pH 6.0에서 55℃인 것으로 기록된 바실루스 마세란스 CGTase의 그것과는 대조적이다(Stavn, A.와 Granum, P.E.

75[1979]243).

pH 최적. CGTase 활성에 미치는 pH의 영향을 60℃에서 조사하였다.

ATCC 53,627로부터의 CGTase의 pH 최적은 시트레이트포스페이트-0.5% 린트너 전분-100ppm

완충액 시스템에서 시험한 경우, 5.0이며 산성영역에서 광역 활성을 가진다(제2도 참조).

이 값은 바실루스 마세란스 CGTase에 대해 보고된 5.2 내지 5.7의 pH 최적과 유사하다(Stavn, A.와 Granum, P.E.

75[1979]243).

분자량. SDS-폴리아크릴아미드 겔전기 영동과 이어서 pH 6.0, 55℃에서의 0.8% 린트너 전분-요오드 겔라이트^R중첩에 의해 측정한 CGTase의 분자량은 다음과 같았다 :

ATCC 53,627 I 117,000달톤

ATCC 53,627 II 110,000-

ATCC 53,627 III 108,000-

NCIB 40,053 99,000-

NCIB 40,054 106,000-

NCIB 40,055 104,000-

NCIB 40,056 101,000-

NCIB 40,057 126,000-

NCIB 40,058 210,000-

NCIB 40,059 154,000-

이들 결과는 CGTase가 모두 상이하다는 것을 증명한다.

등전점. pH 3.5 내지 9.5에서 LKB 암폴린 PAG 플레이트와 이어서 pH 6.0, 55℃에서의 0.8% 린트너 전분 요오드 아가중첩을 사용한 등전점 전기영동은 CGTase I, II 및 III의 등전점이 각각 4.55, 4.50 및 4.50임을 보여주었다.

작용 패턴. 검출에 대하여 굴절율을 사용한 Aminex^RHPX-42A(Bio-Rad) HPLC는 ATCC 53,627로부터의 각 CGTase에 의한 린트너 전분의 분해로부터 생성된 작용 패턴이 동일함을 입증하였다(제4도 참조).

그러므로 세가지 CGTase는 촉매학상으로는 동일하다.

세 개의 피크가 가수분해 후에 오른쪽에 나타나고 NMR에 의하여 각각(좌로부터 우측으로) α-, 감마-, 그리고 β-시클로덱스트린인 것을 나타냈다.

제7도에서는 선행기술 액화효소, 즉, 바실루스 스테아로써모필루스로부터의 α-아밀라제와 발명의 CGTase(ATCC 53,627)에 의해 생성된 작용 패턴을 비교한다.

[전분의 시클로덱스트린으로의 전환]

4.46파데바스 U/g DS의 표준 용량으로 ATCC 53,627로부터의 CGTase를 사용하여 액화하는 도중의 α-, 감마-, 또는 β-시클로덱스트린의 %전환의 측정을 아래에 도시한다.

조건은 pH 4.5에서 35% DS 옥수수 전분으로 첫 번째 액화는 105℃에서 14분동안 이었고 두 번째 액화는 90℃에서 4시간동안 이었다.

또한 pH 5.0 및 95℃에서 5% DS 린트너 전분-0.1M 아세트산나트륨(50ppm Ca²⁺)으로 50분동안 CGTase(6.8Phadebas U/g DS)에 대한 %전환을 도시한다.

액화시에 동량의 α- 및 감마-시클로덱스트린이 제조되는 현편 β-시클로덱스트린은 거의 2배가 형성된다.

린트너 전분 반응에서는 감마-시클로덱스트린의 거의 2배량의 β-시클로덱스트린이 형성되지만, α-시클로덱스트린은 감마-시클로덱스트린보다 3배 더 많이 형성된다.

[시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제의 비교]

발명의 CGTase와 여러 공지 CGTase에 대해 공개된 데이터를 비교하여 아래의 표에 나타낸다.

여러 가지 분명한 차이점이 분명하며 특히 온도 최적과 안정성에서 차이가 명백하다.

[각종 미생물로부터의 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제의 비교]

* 기질의 부재

[전분 액화과정]

전분의 액화는 전분의 부분적인 탈폴리머화와 용해에 기여하여 계속해서 그것이 예컨대 글루코아밀라제에 의하여 효소적 당화를 따르기 쉽게 만든다.

대단한 정도로 산업은 US 3,921,590의 액화과정을 채택하고 있다.

전형적인 조건은 예컨대 제트쿡킹에 의하여 105℃로 가열하고, 그 온도에서 5분동안 보유한 후 바실루스 리케니포르미스 α-아밀라제와 함께 95℃에서 약 pH 6에서 90분동안 보유하는 것이다.

글루코아밀라제가 약 4.0-5.5의 pH에서 사용되므로, 이 범위의 pH에서 액화되도록 고안하였다.

바실루스 스테아로써모필루스로부터의 α-아밀라제는 pH 5.8에서 액화를 잘 진행시키지만 상기 α-아밀라제는 2가지 모두 pH 5.0 이하에서는 액화능력이 없다.

본 발명에 의해 제공된 액화과정은 약 4.0-5.5(바람직하게는 4.5-5.5)의 pH에서 이루어지고, 그로써 후속적인 당화가 중간 pH 조정없이도 이루어질 수 있다.

발명의 CGTase는 안정성을 위해서 낮은 pH에서도 Ca⁺⁺를 필요로 하지 않으며 따라서 칼슘염의 첨가가 일반적으로는 필요하지 않다.

적당한 액화조건은 약 100-115℃에서 약 1-60분이며, 그런 다음 약 50분 내지 4시간동안 약 80-100℃에서 보유되는 것이 바람직하다.

계속적인 공정이 바람직하며 제트쿡킹에 의한 가열이 가장 바람직하다.

발명의 CGTase는 전분 DS의 그램(건조물)당 2-5파데바스 U(하기참조)의 용량수준으로 전분을 잘 액화시킨다.

전분 농도는 통상 15-49% DS(w/w% 건조물질)일 것이며, 가장 빈번하게는 25-35% DS이다.

전분의 α-아밀라제 촉진된 가수분해는 환원당의 증가에 수반하여 점도의 감소를 유발한다.

CGTase는 또한 전분을 분해하지만 필수적으로 환원당을 생성하지는 않는다.

효소적 반응은 실질적으로 중합도를 감소시켜서 α-, β- 및 감마-시클로덱스트린의 실제 함량을 따라서 고분자량 말토덱스트린을 함유하는 용액을 산출한다.

그에 따라, 105℃에서 14분동안의 액화와 90℃에서 4시간동안의 보유시간으로부터 pH 4.5에서 35% DS 옥수수 전분의 α-, β- 및 감마-시클로덱스트린으로의 전환은 각각 3.8%, 6.4% 및 3.6%이다.

발명의 액화과정은 습성 제분 옥수수 전분 또는 다른 정련한 전분으로부터 CGTase로의 액화와 이어서, 글루코아밀라제 단독으로 또는 풀룰라나제와 함께 당화시킴으로써 고수율로 데스트로스(글루코스)를 제조하는데 사용될 수 있다.

발명의 액화과정은 또한 전분-함유 생체물질로부터 에탄올을 제조하는 데에도 사용될 수 있다.

이 경우 생체물질은 4.5-5.5의 pH에서 CGTase로 액화되고, 이어서 글루코아밀라제로 당화되어 글루코스가 형성되며 동시에 또는 계속해서 글루코스의 효모를 이용한 에탄올로의 발효가 일어난다.

그런다음 알코올이 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 회수될 수 있다.

전체과정은 5.0 주위의 pH에서 중간단계의 어떠한 pH 조정없이 수행되며 동시의 당화 및 발효는 약 30℃에서 72시간까지의 시간동안에 수행되는 것이 바람직하다.

액화는 낮은 DS 수준(15-20%) 또는 높은 DS 수준(20-40%)의 어느 수준에서도 수행될 수 있다.

높은 DS 과정에서는 DS 수준은 약 10부피% 알코올의 최대 효모 관용을 얻기 위하여 발효전에 약 20%로 감소되어야만 한다.

알코올 제조에 대한 원료물질은 습성 제분 옥수수 전분같은 정련된 전분; 옥수수, 밀, 쌀, 소르검, 카사와 및 감자(그의 전분 함량은 15-80%이다) 같은 원래의 가공처리되지 않은 물질; 및 산업 소모품 및 부산물같은 기타의 전분-함유 물질을 포함한다.

정련된 전분의 경우, 액화과정은 100℃ 이상의 초기처리와 이어서 더 낮은 온도에서의 보유를 포함하여 액화를 완전히 이루는 것이 바람직하다.

기타의 원재료(전분 함량이 보다 낮은)의 경우 액화는 60-100℃의 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.

[시클로덱스트린의 제조]

본 발명은 열안정성 CGTase를 사용하여 시클로덱스트린을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법으로 액화된 전분은 약 60℃를 초과하는 온도에서 바람직하게는 약 24시간 이하의 시간동안에 CGTase로 효소적으로 처리되고 그런 다음 반응 혼합물로부터 시클로덱스트린이 회수된다.

발명의 바람직한 형태에서 방법은 약 100℃를 초과하는 초기 처리온도에서 약 pH 5.0에서 CGTase 효소로 전분 슬러리를 액화한 후 보유단계에서 액화된 전분을 약 80°- 90℃에서 약 24시간까지의 시간동안, 바람직하게는 pH 조정없이 및 또한 바람직하게는 효소의 재사용없이 유지하는 것을 포함한다.

선행 기술방법과는 대조적으로, 본 발명의 방법은 미생물 오염이라는 심각한 위험을 피하기 위해 충분히 상승된 온도를 이용하며, 그것은 말할것도 없이 유리하다.

별도의(관련은 없는) 장점은 효소적 전환이 상승된 전환온도에서 CGTase로 보다 신속하게 일어난다는 것이다.

이미 액화된 전분 기질에 대한 약 24시간을 초과하지 않는 처리시간이 본 발명의 실시에 대해 숙고된다.

상기 설명된 장점이 기여하는 것에도 불구하고 이미 액화된 전분의 전환은 본 발명의 특별히 바람직한 형태는 아니다.

훨씬 더 좋은 장점은 전분 슬러리같은 원래의 전분으로 그 공정을 시작하는 것이고 그로부터 액화된 전분을 생성하기 위하여 CGTase를 사용한다는 것이다.

CGTase 효소는 4.0-5.5 범위의 pH에서 칼슘의 첨가없이 및 표준 전분 액화조건(상술된 바와 같은)하에서 전분을 액화하기 위하여(즉, 전분 슬러리로부터 쏟아부을 수 있는 시럽을 제조하기 위하여) 사용될 수 있다.

전분 슬러리를 액화하고 그런 다음 그 액화된 전분을 시클로덱스트린으로 전환하기 위해 CGTase를 사용하는 것은 가장 유리한 방법을 구성하고 발명의 바람직한 실시를 구성한다.

CGTase로 전분을 액화하는 것에는 전분의 시클로덱스트린으로의 전환이 수반된다.

그에따라, 실제량의 시클로덱스트린이 얻어지며 액화된 전분의 시클로덱스트린으로의 추가의 효소적 전환의 수행전의 액화된 전분에 존재한다.

전체적으로, 전분 액화 과정으로부터 직접 이용할 수 있는 시클로덱스트린의 수율은 적당한 것으로 생각되지는 않는다.

나아가, 액화된 전분의 CGTase의 효소적 전환은 시클로덱스트린의 수율을 실질적으로 증가시킨다.

표준조건 전분 액화 방법의 일부를 형성하는 (제트)쿡킹된 전분의 상승온도 보유처리는 약 24시간으로 연장될 수 있지만, 그러나 약 90℃에서 보다 많은 액화된 전분의 시클로덱스트린으로의 전환에 대해서는 원한다면 보다 최적의 DS 수준으로의 액화된 전분의 알맞는 희석에 의하여 전환단계가 이루어지는 것이 바람직하다.

시클로덱스트린으로의 최적 효소적 전환에 대해 고안된 어떠한 pH 조정은 초기 전분 슬러리에 대해 또는 희석에 부수되는 것으로서 행해질 수 있다.

그러나, 전분 액화 단계후에 더 많은 CGTase 효소를 재투입하는 것이 필요한 것으로 발견되지는 않았다.

선행기술 효소에 대해서보다 더 높은 효소적 전환 온도에서의 사용을 가능하게 하는 발명의 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제의 열안정성은, (그 한계온도가 50℃인 바실루스 마세란스 효소에 대한 것보다 훨씬 더 높다) 시럽의 심각한 중간단계 냉각없이 실시될 수 있는 조합된 액화 및 전환과정을 허용한다.

반복하여 말하면, 상승온도에서 시클로덱스트린을 제조할 수 있는 이런 능력은 지금까지 사용된 연장된 반응시간을 피하게 해주고, 본 발명의 실시에 있어서 약 24시간 이하의 반응시간이 액화된 전분의 효소적 전환에 대하여 숙고된다.

발명의 실시에 사용된 전분은 납빛 옥수수, 옥수수, 밀, 소르검, 감자, 타피오카, 쌀 또는 사고를 포함하여 어떠한 식물공급원으로부터도 얻을 수 있다.

전분의 미변형 형태에 더불어 전분을 효소, 산, 알칼리 등으로 처리한 것으로부터 유도된 변형형태도 기질로서 사용될 수 있다.

시클로덱스트린 생성반응은 1% 내지 40% DS 범위의 DS 농도에서 액화된 전분에 대해 수행될 수 있지만 전환의 최대 효율을 위해서는 20 내지 30% DS 고체용액이 바람직하다.

원한다면, 더 많이 농축된 전분 슬러리가 액화될 수 있고(표준 조건은 35% DS가 된다), 그런 다음 시클로덱스트린으로의 전환을 위해 20 내지 30% DS 덱스트린 용액으로 희석될 수 있다.

출발물질이 원래의 전분인 경우의 전체 과정의 조건을 요약하면, 발명의 CGTase는 35% DS 슬러리, pH 4.0-5.5 범위에서 및 Ca⁺⁺의 부재하에 105℃에서의 제트쿡킹 및 95℃에서의 90분 보유와 이어서 약 24시간까지의 시간동안 55℃ 이상에서의 더 많은 연장보유의 상대적으로 엄격한 표준 액화조건을 포함하여 다양한 조건하에서 사용될 수 있다. 최대 전환 및/또는 최소 CGTase 사용을 위해서는, 두가지 보유단계(물론 단일한 연장보유일 수 있다)는 80℃-90℃ 범위내에서 수행되어야만 하고 전분 농도는 20-30% DS 범위내여야 하다(초기 전분 슬러리에서 또는 액화된 전분의 희석을 통해서).

다시 더 요약하면 시클로덱스트린은 시럽을 발명의 CGTase와 함께 50-95℃, 바람직하게는 80-90℃의 온도 범위에서 4-9 범위의 pH에서 가장 바람직하게는 약 pH 5.0에서 약 24시간 이하의 시간동안 반응시킴으로써 배양하여 액화된 전분으로부터 제조될 수 있다.

시클로덱스트린 생성물은 지금까지와 같은 반응용액으로부터 회수될 수 있다.

더욱이, 회수된 시클로덱스트린은 당해 기술분야에 공지된 실시예를 따라서, 예컨대, 디. 프렌취 등이

71 : 353(1949)에 기재한 방법을 통하여 α-, β- 및 감마-시클로덱스트린으로 분류될 수 있다.

바실루스 마세란스 CGTase에 의한 전분 가수분해물의 시클로덱스트린으로의 배치전환은 지금까지는 생성물 형성의 방향으로 평형을 이동시키기 위하여 적당한 복합제의 존재하에 수행되어 왔다.

시클로덱스트린 클라트레이트는 불용성이므로, 반응 혼합물에서 용액으로부터의 침전이 바람직하다.

복합된 시클로덱스트린은 여과 또는 원심분리로 회수될 수 있고, 그런 다음 복합제는 기술분야에 공지된 방법에 의해 제거될 수 있다.

적당한 시클로덱스트린 복합제로는 시클로옥탄, 헥산, 1-부탄올, 1-데칸올 등이다.

α- 또는 β- 형태와 선택적으로 복합체를 형성하는 많은 복합체가 확인되었다(예를 들어 US특허 제3,640,847호 참조).

특히 시클로옥탄은 β-시클로덱스트린에 대해 선택적이고 1-데칸올은 α-시클로덱스트린에 대해 선택적이다.

본 발명의 실시는 복합체의 존재하에 CGTase를 사용하여 전환을 수행하는 것을 고려한다.

[시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제 측정]

CGTase 전분 덱스트린화 활성을 파마시아 파데바스(R) 아밀라제 시험에 의하여 pH 6.0, 60℃에서 200㎕의 효소용액을 4.0ml의 0.1M 아세트산나트륨(100ppm

)+파데바스 정제와 함께 15분동안 배양함으로써 측정한다.

그런 다음 반응은 0.5ml의 1.0N HCl로 중지시킨다.

측정용액은 에펜도르프 원심분리기로 실온에서 2분동안 원심분리하고, 상장액의 흡광도는 620nm에서 읽으며, 이때 1.0-3.0의 흡광도 값이 얻어져야 한다.

기준으로서 바실루스 리케니포르미스 α-아밀라제를 사용하여 표준 곡선을 제조하는데 이때에 1파데바스 유니트는 60℃, pH 6.0에서 1분당 린트너 전분의 글루코시드 연쇄 1.0μmole의 가수분해를 촉진시키는 효소의 양으로 규정한다.

[시클로덱스트린 생성물의 정량]

α-, β- 및 감마-시클로덱스트린의 수율을 바이오래드아미넥스(R) 카르보하이드레이트 HPX-42A 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 2개의 컬럼(300×7.8mm)을 85℃에서 용리액으로서 글래스 증류수를 사용하여 0.6ml/분의 유속으로 나란히 사용하였다. 굴절율로 검출하였다.

표준 곡선은 α-, β- 및 감마-시클로덱스트린의 믿을 만한 샘플(Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri)로 작성하였다.

[실시예]

[실시예 1]

[혐기성 배양에 의한 CGTase의 제조]

균주 ATCC 53,627을 아르곤하의 예비환원된 액체 배지중에서 초기 pH 7에서 배양하였다.

배지는 리터당 그램의 다음 성분들로 구성되었다 : 말트린 M-100, 5.0; KH²PO₄2.0; K₂HPO₄, 6.0; NaCl, 1.0; (NH₄)₂SO₄, 2.5; MgSO₄·7H₂O, 0.5; CaCl₂·2H₂O, 0.05; 효모추출물 2.0; Na₂S, 0.5; 시스테인-HCl, 0.5; 레사주린(산화환원 지시자), 2ng; 및 미량의 금속 5.0ml.

미량 금속용액은 리터당 그램의 다음 성분들로 이루어졌다 : FeCl₃·6H₂O, 5.40; ZnSO₄·7H₂O, 1.45; MnCl₂·4H₂O, 1.00; CuSO₄·5H₂O, 0.25; 및 H₃BO₃, 0.10. 미량 금속용액을 염을 녹이기 위하여 농축 HCl로 산성화하였다.

균주를 교반없이 67℃에서 40시간동안 배양하였다.

40시간후의 최대 활성수준은 브로스 리터당 200파데바스 U였다.

배양 브로스를 원심분리한 후 여과하고, 마지막으로 밀리포아 미니탠 시스템에 의하여 부피활성이 밀리리터당 30-50파데바스 U가 되도록 농축하였다.

ATCC 53,627로부터의 CGTase의 정제는 DEAE-세파로스 크로마토그래피, 등전점 전기영동, 그리고 아카르보스-세파로스 친화성 크로마토그래피를 포함하는 연속단계로 수행하였다.

DEAE-세파로스 크로마토그래피는 선형 NaCl 구배(0-200mM)를 사용하여 10mM Tris-HCl(2.5mM CaCl₂), pH 7.5, 4℃에서 수행하였다.

등전점 전기영동(Pharmacia)은 4℃에서 pH 7-5의 선형 pH 구배를 사용하여 수행하였다.

아카르보스 친화성 크로마토그래피는 pH 6.0, 4℃에서 수행하였고, 용출은 0.1M 아세트산나트륨(100ppm

) 완충액으로 세척함으로써 행하였다.

I, II 및 III으로 표시한 개개의 CGTase 성분을 등전점 전기영동으로 얻었고 아카르보스 친화성 크로마토그래피에 의해 균질물로 정제하였다. 등전점 전기영동 단계 이후의 세가지 CGTase의 상대량은 CGTase I-20%, CGTase II-60% 및 CGTase III-20%였다.

[실시예 2]

[형질전환된 숙주 유기체의 호기성 배양에 의한 CGTase의 제조]

염색체 DNA를 균주 ATCC 53,627의 세포로부터 다음과 같이 단리하였다. 세포(3.1g, 습성중량)를 4.5ml의 25% 슈크로스-50mM Tris pH 8.0-40mM EDTA에 현탁시켰다.

현탁액을 라이소자임으로(2mg/ml) 30분동안 얼음상에서, 그 다음에는 30분동안 실온에서 처리하였다.

프로나제(1mg/ml)를 첨가하여 그 현탁액을 37℃에서 30분동안 배양하였다.

용해물을 8ml 페놀로 30분동안 2회 추출한후 3ml의 10mM Tris-1mM EDTA pH 7.4 완충액을 첨가하였다.

그런 다음 수성층을 10ml의 클로로포름으로 2회 추출하였다.

DNA를 0.45ml의 3M 아세트산나트륨-1mM EDTA pH 7.0과 2.75ml의 이소프로판올을 첨가하고 얼음상에서 5분동안 방치함으로써 침전시켰다.

DNA를 원심분리하여 펠릿화하여 70% 에탄올로 1회 세척하였다.

펠릿을 10분동안 진공 건조시킨 후 15ml의 10mM Tris-1mM EDTA pH 7.4 완충액에 재용해시켰다.

DNA 제제를 염화세슘 구배 원심분리기에 걸어서 15℃, 192,000g에서 40시간동안 원심분리하였다.

염색체 DNA 밴드를 수집하여 염하세슘 포화 이소프로판올로 3회 추출하고 10mM Tris-1mM EDTA pH 7.4 완충액에 대해 4℃에서 투석하였다. 총 590㎍의 염색체 DNA를 회수하였다.

그 DNA를 제한효소 EcoRⅠ을 사용하여 200㎍의 DNA를 33유니트의 EcoRⅠ과 함께 150㎕의 50mM Tris pH 8.0-10mM MgCl₂-100mM NaCl에서 12분동안 37℃에서 항온반응시킴으로써 부분 소화시켰다.

부분소화된 DNA를 10-40% 슈크로스 구배 원심분리기에 걸어서 135,000g, 15℃에서 16시간동안 원심분리하였다. 180㎕의 분획을 수집하여 그중 5㎕ 알리큇을 1% 아가로스 겔전기영동으로 분석하였다.

7 내지 15kb 범위크기의 분획을 모아서 1ι의 10mM Tris-1mM EDTA pH 7.4 완충액에 대해 투석한 후 에탄올 침전시켜서 100㎕의 10mM Tris-1mM EDTA pH 7.4 완충액에 재용해시켰다.

2.5㎍의 pBR322를 30유니트의 EcoRⅠ과 함께 125㎕의 50mM 트리스 pH 8.0-10mM MgCl₂-100mM NaCl중에서 2시간동안 37℃에서 항온반응시킴으로써 벡터 pBR322를 EcoRⅠ을 사용하여 소화시켰다.

아가로스 겔상에서의 DNA의 분석으로 소화가 완전했음을 알았다. 소화된 벡터를 페놀로 2회, 에테르로 1회 추출하고 에탄올 침전시켰다.

벡터를 100㎕의 100mM 트리스 pH 8.0-0.1mM MgCl₂에 녹이고 20유니트의 소의 장내 알칼리 포스파타제로 37℃에서 30분동안 탈인산화시켰다. 탈인산된 벡터를 페놀로 2회, 클로로포름으로 2회 추출하고 에탄올 침전시켰다.

탈인산된 pBR322를 50㎕의 10mM 트리스-1mM EDTA pH 7.4 완충액에 녹였다.

소화된 pBR322와 균주 ATCC 53,627의 DNA의 연결은 0.4㎍의 EcoRI 부분 소화된 염색체 DNA(7-15kb)와 0.1㎍의 EcoRI 소화되고 탈인산된 pBR322를 10유니트의 T4 DNA 연결효소와 함께 5㎍ BSA/ml을 함유하고 있는 20㎕의 50mM 트리스 pH 7.4-10mM MgCl₂-20mM DTT-1mM ATP중에서 혼합하여 14℃에서 밤새 항온배양시킴으로써 이루어졌다.

경합 대장균 HB101(ATCC 33,694) 세포를

p250에 기재되어 있는 티. 마니아티스, 이. 에프. 프리츠히 및 제이. 샘브룩의 방법에 의해 형질전환을 위해 제조하였다.

상기 제조된 연결 DNA의 반을 마니아티스 등의 방법(상기 동일)을 따라서 대장균 HB101의 경합세포안으로 형질전환시켰다. 그 세포를 루리아-버태니(LB) 배지와 15㎍/ml 농도의 테트라사이클린을 함유하고 있는 플레이트상에서 37℃에서 밤새 배양하였다.

그런 다음 항-테트라사이클린 콜로니를 1% 아밀로펙틴-LB 배지와 테트라사이클린(15㎍/ml)을 함유하고 있는 전분 플레이트 위에 중복-플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양하였다.

CGTase 생성은 전분 플레이트를 70℃에서 1시간동안 열처리한 후 투명조운을 관찰할 수 있도록 요오드 증기에 노출시킴으로써 측정하였다.

대장균 NV601로 표시한 하나의 CGTase-양성 형질전환체를 5000 이상의 콜로니로부터 회수하였다.

균주는 암피실린과 테트라사이클린에 모두 내성이었다.

표준 알칼리 용해과정과 경합 대장균 HB101 세포의 재형질전환에 의한 재조합 플라스미드의 회수로 CGTase-양성 형질전환체를 얻었다.

재조합 플라스미드의 제한 지도작성으로 12.8kb 크기의 DNA 단편이 pBR322의 EcoRI 부위에 삽입되었음을 알았다.

제한효소 BamHI으로의 결실분석으로는 CGTase를 코드화하는 유전자가 6.0Rb의 BamHI-BamHI 단편상에 위치하고 있음을 알았다.

대장균 NV601을 15㎍/ml의 테트라사이클린 함유 루리아 버태니 배지중에서 37℃, 300rpm에서 24시간동안 배양함으로써 CGTase를 제조하였다. 세포를 원심분리에 의해 수집한 후 초음파 처리로 용해시켰다.

분자량(SDS-PAGE), 등전점, 열안정성, 작용 패턴, 액화활성 및 시클로덱스트린 생성의 견지에서 천연 CGTase와 비교한 재조합 CGTase의 특성확인은 효소들간에 차이가 없음을 나타냈다.

재조합 CGTase는 천연 CGTase에 대해서 유발된 항체와 교차 반응한다(성분 II).

[실시예 3]

[시클로덱스트린 제조]

발명의 CGTase(ATCC 53,627)와 바실루스 마세란스로부터의 CGTase에 의해 생성된 시클로덱스트린 수율을 비교하였다.

바실루스 마세란스 CGTase가 정상 제트쿡커 조건하에서는 전분을 액화시킬 수 없으므로 예비처리된 전분, 즉, 린트너 전분을 사용하였다.

효소들을 15% DS 린트너 전분(+400ppm

)과 50℃에서 및 90℃에서 pH 5.0에서 24시간동안 반응시켰다.

사용량은 그램 DS 전분당 4.46파데바드 U였다.

또한 바실루스 마세란스 CGTase를 대표 표준을 작성하기 위하여 pH 7.0에서 상기와 같이 반응시켰다.

결과는 발명의 CGTase가 선행기술 바실루스 마세란스 효소에 대해 최적 온도인 50℃에서 월등한 전환을 제공하는 것을 증명한다.

발명의 CGTase는, 선행기술 효소가 거의 비활성으로 나타나는 온도인 90℃에서도 본질적으로 동일한 높은 전환을 보여준다.

발명의 CGTase는 0.74 : 1.0 : 1.41의 비율(50℃에서)의 α-, β- 및 감마-시클로덱스트린, 즉, 바실루스 마세란스 효소보다 상대적으로 더 많은 α-CD를 생산한다.

[실시예 4]

[다양한 pH에서의 전분 액화]

40ppm

가 있는 또는 없는 35% DS 옥수수 전분을 105℃에서 14분동안, 그리고 4시간동안 90℃에서 액화시켰다.

효소의 사용량은 4.46파데바스 U/g DS(60℃, pH 6.0)였다.

발명의 CGTase(ATCC 53,627)를 테르마밀^TM(바실루스 리케니포르미스 α-아밀라제, Novo Industri A/S에서 구입가능함) 및 바실루스 스테아로써모필루스 α-아밀라제(G-Zyme^TMG995로서 Enzyme Bio-Systems, Ltd로부터 구입가능함)와 비교하였다.

덱스트로스 당량(DE)을 액화후에 측정하고, 액화후의 전분 시럽이 따라 부울 수 있는 것이라면(실질적인 점도 감소) 전분이 액화된 것이라고 판단하였다.

* 액화된 것으로 평가하지만 매우 끈적끈적하다.

발명의 CGTase로 4.5정도로 낮은 pH에서도 Ca⁺⁺첨가없이, 그리고 본질적으로 환원당의 형성없이 양호한 액화가 이루어질 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 5]

[다양한 효소용량에서의 전분 액화]

35% DS 옥수수 전분을 pH 4.5에서 Ca⁺⁺첨가없이 CGTase(ATCC 53,627)로 액화시켰다.

0.223, 0.446, 0.892, 2.23 및 4.46파데바스 U/g DS의 사용량으로 효소를 사용하였다.

비교하기 위해서 테르마밀을 pH 6.2에서 사용하였고 바실루스 스테아로써모필루스 아밀라제를 pH 5.8에서 사용하였으며 두가지 모두 4.46U/g DS와 40ppm

가 첨가된 상태였다.

액화조건은 100℃ 또는 105℃에서 4분간(하기 표시와 같이), 그리고 90℃에서 4시간이었다.

액화후에 NV 센서 시스템과 액화의 각 pH에서 구동유니트를 측정하는 M500이 부착된 하아케 로토비스크 RV12 점도계로 60℃에서 점도를 측정하였다.

그 결과를 아래에 제시하고 제6도에 도시한다.

* 이 속도에서는 측정이 가능하지 않음.

그 결과는 CGTase의 2-5U/g DS의 사용량 수준이 적당함을 가리킨다.

[실시예 6]

[액화된 전분의 당화]

실시예 4의 액화된 전분을 60℃에서 pH 4.3 또는 4.5로 조정하고 덱스트로자임^TM150/50을 1.2l/t DS의 용량으로 첨가하였다.

덱스트로자임은 아스페르길루스 니거로부터의 글루코아밀라제와 바실루스 아시도풀룰리티쿠스로부터의 풀룰라나제의 혼합물이며; 노보 인두스트리 A/S로부터 구입 가능하다.

당화는 48시간동안 60℃에서 수행하였고 덱스트로스는 바이오-래드 아미넥스^RHPX-87C HPLC에 의해 측정하였다.

결과는 발명에 따르는 모든 액화된 전분의 당화가 양호함을 나타낸다.

pH 4.5에서 액화된 전분을 당화시키는 능력은 발명에 따라 전분을 액화하는 경우 당화전에 pH를 조정할 필요가 거의 또는 전혀 없기 때문에 바실루스 리케니포르미스 또는 스테아로써모필루스로부터의 α-아밀라제를 이용하는 선행기술 액화보다 월등한 본 발명의 분명한 방법상의 장점을 증명한다.

[실시예 7]

[다양한 전분 농도에서의 시클로덱스트린의 제조]

옥수수 전분을 15%에서 40% DS까지로 변화시켰다.

슬러리를 먼저 칼슘 첨가없이 pH 5.0에서 g DS 전분당 4.46파데바스 U 용량의 CGTase(ATCC 53,627)를 사용하여 14분동안의 105℃처리에 이어 4시간동안의 90℃에서의 보유에 의해 액화시켰다.

전분 액화과정의 보유시간을 지속시켜 효소함유 덱스트린 용액이 추가로 24시간동안 pH 5.0 및 90℃에서 배양되도록 한 후 시클로덱스트린의 생성을 모니터하였다.

시클로덱스트린 수율을 바이오-래드 아미넥스 카르보하이드레이트 HPX-42A HPLC에 의해 측정하였다.

[결과 :]

총 %CD와 g CD/100ml을 토대로 하여 약 20-30%의 초기 전분 농도가 시클로덱스트린의 제조에 대해 가장 적당하다고 결론 지을 수 있었다.

그러므로 추가의 실시예에 대하여 25% DS의 전분을 선택하였다.

β-시클로덱스트린이 모든 전분 농도에서 일차로 생성되었다.

β : α : 감마 시클로덱스트린의 비율은 25% DS에서 1.0 : 0.47 : 0.39였다.

25% DS 전분으로부터 관찰된 시클로덱스트린의 가장 높은 수율은 대략 30%였다.

CGTase 효소의 재투입 및 보유시간을 48시간동안으로 연장하는 것을 수율을 증가시키지 못하였다.

[실시예 8]

[다양한 pH에서의 시클로덱스트린의 제조]

시클로덱스트린 제조에 미치는 pH의 영향을 25% DS 옥수수 전분 슬러리를 사용하여 측정하였다.

전분 슬러리를 표시된 pH값에서, 그러나 그밖의 것은 실시예 7에서와 같이하여 액화시키고, 그런 다음 액화된 전분을 24시간동안 90℃에서 및 동일한 pH값에서 배양하였다.

하기 제시하는 그 결과는 pH 5.0이 전분 액화와 시클로덱스트린 제조의 조합과정에 가장 적절하다는 것을 나타낸다.

[실시예 9]

[다양한 온도에서의 시클로덱스트린의 제조]

발명의 CGTase(ATCC 53,627)에 위한 시클로덱스트린 제조에 미치는 온도의 효과를 칼슘의 첨가없이 하기 표시된 바와 같이 pH 5.0에서 및 다양한 온도에서 24시간동안 배양단계를 수행함으로써 조사하였다.

옥수수 전분의 15% DS 또는 25% DS 슬러리를 실시예 7의 조건하에 DS 전분 그램당 4.46파데바스 U의 용량으로 CGTase를 사용하여 먼저 액화시켰다.

결과는 두가지 15% DS와 25% DS에서(24시간 배양후) 80-90℃의 전환 온도가 가장 적절한 것임을 나타낸다.

온도를 50℃로 낮추면 수율이 더 적어진다.

[실시예 10]

[효소의 재투입이 있는 및 없는 고온에서의 시클로덱스트린의 제조]

평형이 이루어지지 않는 가능성을 90℃와 95℃에서 15% DS 전분과 CGTase를 포함하는 실시예 9의 반응 혼합물을 24시간 배양에 앞서 재투입하고 반응을 추가로 24시간 지속시킴으로써 조사하였다.

그 결과는(아래 참조) 90℃ 평형이 이루어졌음을 증명하였다.

95℃에서는 시클로덱스트린의 동일한 수율을 얻기 위해서는 재투입이 필요하였고, 그로써 95℃에서의 연장된 배양중에 효소 활성이 약간 손실되었다.

[실시예 11]

[칼슘 첨가가 있는 및 없는 시클로덱스트린의 제조]

시클로덱스트린의 제조에 미치는 칼슘의 효과를 조사하였다.

25% DS 옥수수 전분 슬러리를 DS 전분 그램당 4.46파데바스 U의 용량의 발명의 CGTase(ATCC 53,627)로, pH 5.0에서 40ppm 칼슘의 존재 및 부재하에 액화하였다.

그런 다음 액화된 전분을 24시간동안 90℃에서 배양하였다.

그 결과(하기 참조)는 칼슘이온의 존재가 전체 수율에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.

[실시예 12]

[다양한 효소 용량에서의 시클로덱스트린의 제조]

CGTase 용량의 변화가 시클로덱스트린 수율에 미치는 효과를 25% DS 옥수수 전분을 사용하여 측정하였다.

용량은 DS 전분 그램당 2.23에서 6.69파데바스 U까지 다양하였다.

전분을 칼슘 첨가없이 ATCC 53,627의 CGTase를 상기 주어진 용량으로 사용하여 pH 5.0에서 액화시켰다.

그런 다음 액화된 전분을 90℃, pH 5.0에서 24 또는 48시간동안 항온반응시켰다.

기타의 조건은 실시예 5와 같았다.

그 결과(하기 참조)는 24시간 및 48시간후 가장 높은 수율이 DS 전분 그램당 4.46과 3.35파데바스 U의 용량에서 이루어졌음을 입증하였다.

[실시예 13]

[복합제를 사용한 시클로덱스트린의 제조]

시클로덱스트린의 전환시에 β-시클로덱스트린, 복합제로서의 시클로옥탄의 효과를 조사하였다.

25% DS 옥수수 전분 슬러리를 pH 5.0에서 칼슘 첨가없이 ATCC 53,627의 실시예 7의 조건하에 DS 전분 그램당 4.46파데바스 U의 용량으로 CGTase를 사용하여 액화시켰다.

그런 다음 90℃에서 24시간동안 시클로덱스트린을 전환시켰다.

단, 시클로옥탄은 24시간 배양을 시작하기 전에 DS 전분 그램당 0.62그램의 수준으로 첨가하였다.

전환 결과(하기 참조)는 시클로옥탄의 첨가로 최종 시클로덱스트린 수율, 특히 β-시클로덱스트린의 최종 수율이 증가되었음을 입증하였다.

[실시예 14]

[다양한 전분으로부터 시클로덱스트린의 제조]

여러 가지 전분을 비교하였다.

옥수수, 감자, 밀, 쌀 및 납빛 옥수수로부터의 전분의 슬러리(25% DS)를 pH 5.0에서 칼슘 첨가없이 발명의 CGTase(ATCC 53,627)를 DS 전분 그램당 4.46파데바스 U의 용량으로 사용하여 실시예 7의 조건하에서 액화시켰다.

그런 다음 액화된 전분 용액을 24시간동안 90℃에서 인큐베이션 하였다.

그 결과(하기 참조)는 최종 시클로덱스트린 수율에 차이가 있고 β-시클로덱스트린이 모든 경우에 형성된 일차 생성물임을 나타냈다.

[실시예 15]

[액화된 전분의 에탄올 발효]

습식-제분 옥수수 전분의 31.5% DS 슬러리를 발명의 CGTase(ATCC 53,627)로 pH 5.0에서 칼슘 첨가없이 14분동안 105℃에서, 그 후에는 4시간동안 90℃에서 액화시켰다.

테르마밀^TM을 사용하여 대조 표준을 상술한 바와 같이, 단, pH 6.2에서 40ppm의 칼슘의 존재하에 수행하였다.

각 경우에 효소 용량은 DS 전분 그램당 5.0파데바스 유니트였다.

액화의 마지막에, 성기어진 전분을 효모 영양 혼합물로 22.4% DS로 희석시켰다.

영양 혼합물중의 성분의 농도는 리터당 4.0g의 효모추출물, 1.6g의 인산암모늄, 0.4g의 황산마그네슘, 3.2g의 시트르산 및 0.6g의 시트르산 나트륨이었다. 최종 pH는 5.2였다.

AMG 200L(NOVO Laboratories, Inc., Danbury, CT)을 전분을 토대로 0.44%wt/wt의 용량으로 첨가하였다.

페니실린 G와 황산 스트렙토마이신을 200㎍/ml의 수준으로 포함시켰다. 발효물을 30℃, 300rpm에서 64시간동안 인큐베이션하였다.

에탄올 생성을 이산화탄소 생성에 의해, 즉 시간의 함수로서 중량 손실에 의해 간접 측정하였다.

최종 에탄올 수율을 바이오-래드 아미넥스 HPX-42A 고성능 액체 크로마토그래피로 확정하였다.

64시간후, 이산화탄소 생성을 토대로 한 에탄올 수율은 CGTase와 테르마밀 액화 전분에 대해 각각 87.3%와 89.7%였다.

이들 수율을 바이오-래드 아미넥스 HPX-42A HPLC로 확인하였다. 산업 표준 수율은 일반적으로 약 86-90%이다.

[실시예 16]

[NCIB 40,053-40,059의 혐기성 배양에 의한 CGTase의 제조]

균주 NCIB 40,053에서 40,059까지를 실시예 1에서와 같이 배양하였다. 단, 배양온도는 55℃였다.

약 40시간의 배양후의 최대 활성 수준은 브로스 리터당 파데바스 유니트로 다음과 같았다 : NCIB 40,053 : 18, NCIB 40,054 : 53, NCIB 40,055 : 26, NCIB 40,056 : 22, NCIB 40,057 : 27, NCIB 40,058 : 78, 그리고 NCIB 40,059 : 10.

배양 브로스를 원심분리한 후 여과하고, 마지막으로 밀리포아 미니탠 시스템을 사용하여 부피활성이 밀리리터당 30-50파데바스 유니트가 될 때까지 농축하였다.

[실시예 17]

[NCIB 40,053-40,059의 CGTase로의 전분의 액화]

실시예 16에서 제조한 CGTase 제제를 pH 4.5에서 35% DS 옥수수 전분을 액화시키는 능력에 대해 비교하였다.

전분을 105℃에서 14분, 그리고 90℃에서 4시간동안 4.46파데바스 U/g DS(60℃, pH 6.0)의 효소 용량으로 액화시켰다.

덱스트로스 당량(DE)을 액화후에 측정하고 만약 액화후의 전분 시럽이 따라 부울 수 있을 정도라면 전분이 액화된 것으로 판단하고, 그것은 점도의 실질적인 감소를 의미한다.

결과는 모든 CGTase가 균주 ATCC 53,627로부터의 CGTase와 유사하게 pH 4.5에서 양호한 액화를 이루었음을 나타냈다.

모든 경우에, 본질적으로 CGTase 활성을 나타내는 측정 가능한 DE는 없었다.

검출에 대하여 굴절율을 사용한 아미넥스^(R)HPX-42A(Bio-Rad) HPLC는 옥수수 전분의 액화로부터 생성된 작용 패턴이 세가지 피크가 α-, 감마- 및 β-시클로덱스트린인 전형적인 CGTase였음을 입증하였다.

각 효소에 의해 생성된 시클로덱스트린과 ATCC 53,627의 CGTase에 의해 생성된 것과 비교하여 상대적인 비율에서 큰 차이는 없었다.

[실시예 18]

[클론된 CGTase로의 액화]

35% DS 옥수수 전분 슬러리를 실시예 2에서 제조된 클론된 CGTase를 8.92파데바스 U/g DS의 용량으로 pH 4.5에서 Ca⁺⁺의 첨가없이 처리하였다.

제팅(Jetting)은 105℃에서 5분동안(일차액화), 이어서 95℃에서 2시간동안 또는 90℃에서 4시간동안 보유함으로써(2차 액화) 수행하였다.

95℃ 또는 90℃에서의 2차 액화중에 점도의 급속 감소를 관찰하였다. 90℃에서, 점도 감소는 Nametre 점도계를 사용하여 시간에 걸쳐 모니터하였다.

그 결과는 2차 액화에서 7분에 의하여 400센티포이스 xg/㎤까지의 점도의 감소를 입증하였다.

2차 액화후의 액화된 전분의 작용 패턴은 바이오-래드 아미넥스^(R)HPX-42A HPLC로 측정하였고 그 결과 두가지 온도에서 특징적인 시클로덱스트린 패턴을 입증하였다.

네오큐프로인 방법에 의해 얻은 1.0 이하의 DE 값은 CGTase의 메카니즘과 부합하는 환원 말단기의 부재를 의미한다.

[실시예 19]

[클론된 CGTase로 액화된 전분의 당화]

실시예 18에서 pH 4.5에서 CGTase로 액화된 전분 용액을 AMG와 덱스트로자임을 사용하여 pH 4.5, 60℃에서 48시간동안 gDS당 0.18AG의 용량으로 당화시켰다.

덱스트로 수율을 바이오-래드 아미넥스^(R)HPX-87C HPLC로 측정하였다.

결과는 모든 경우에 덱스트로스의 양호한 수율을 나타낸다. 가장 높은 수율은 95℃에서 2차 액화와 덱스트로자임으로의 당화로 이루어졌다.

Claims

시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제로서, 써모안에어로박터
또는 써모안에어로븀
의 균주를 기원으로 하고, pH 5.0에서 측정된 약 95℃의 최적 온도; 약 5.0의 최적 pH; 및 80℃와 pH 5.0에서 40분 배양후에 전분과 Ca⁺⁺의 부재하에 약 95%의 잔여 활성을 가지는 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제.
제1항에 있어서, 균주 ATCC 53,627 또는 균주 NCIB 40,053에서 NCIB 40,059중의 하나로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제.
시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제(CGTase)의 제조방법으로서, 적당한 영양함유 배지중에서 써모안에어로박터 또는 써모안에어로븀의 CGTase 생성균주를 혐기성 조건하에서 배양하거나, 또는 그로부터의 적절한 유전정보를 함유하는 형질전환된 숙주 유기체를 호기성 조건하에서 배양한 후 발효 배지로부터 CGTase를 회수하는 것으로 이루어지는 방법.
제3항에 있어서, 균주가 ATCC 53,627, 균주 NCIB 40,053에서 NCIB 40,059중의 하나 또는 그의 돌연변이주 또는 변이주인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 숙주 유기체가 어셔리시아
, 스트렙토마이세스
, 바실루스
또는 아스페르길루스
의 균주이고, 바람직하게는 대장균
, 고초균

, 바실루스 리케니포르미스
또는 아스페르길루스 오리자에
의 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
써모안에어로박터 또는 써모안에어로븀의 균주의 생물학적으로 순수한 배양물로서, 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제를 생산할 수 있는 능력과 비운동성인 것을 특징으로 하는 배양물.
제6항에 있어서, 균주 ATCC 53,627, 균주 NCIB 40,053에서 NCIB 40,059중의 하나 또는 그의 돌연변이주 또는 변이주인 것을 특징으로 하는 배양물.
전분 액화 방법으로서, 수성 전분 슬러리에 제1항 또는 제2항의 CGTase의 존재하에 약 4.0 내지 5.5 범위의 pH에서, 바람직하게는 약 100℃ 이상의 온도에서 효소적 액화를 수행하는 것으로 이루어지는 방법.
제8항에 있어서, 본질적으로 전분 슬러리에 칼슘염의 첨가없이 이루어지는 것을 특징으로 하는 전분 액화 방법.
제8항 또는 9항에 있어서, 액화된 전분에 글루코아밀라제의 존재하에, 실질적으로 중간 pH 조정없이 효소적 당화를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 당화와 동시에 또는 그 다음에 효모를 이용한 에탄올 발효를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
시클로덱스트린의 제조방법으로서, 액화된 전분 용액을 제1항의 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제로 60℃이상의 온도에서 효소적으로 처리한 후, 반응 혼합물로부터 시클로덱스트린 생성물을 회수하는 단계로 이루어지는 방법.
제12항에 있어서, 상기 효소처리가 약 24시간 이하의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 액화된 전분 용액이 전분 슬러리를 상기 CGTase로 효소적으로 액화시킴으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 효소액화가 약 4.0-5.5 범위의 pH에서 행해지고 상기 후속하는 전분 가수분해물의 효소처리가 실질적으로 중간 pH 조정없이 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항 또는 15항에 있어서, 전분 가수분해물의 상기 효소처리가 액화된 전분에 CGTase를 재투입하지 않고서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
시클로덱스트린의 제조방법으로서, 수성 전분 슬러리를 제1항의 시클로덱스트린 글리코실 트란스퍼라제로 약 100℃ 이상의 온도에서 및 4.0 내지 5.5 범위의 pH에서, 바람직하게는 필수적으로 칼슘염의 첨가없이 효소적으로 처리한 후, 그 결과의 시럽을 80°-90℃ 범위의 온도에서 약 28시간 이하의 시간동안 보유하여 시럽이 상기 보유시간의 적어도 일부중에 20-30DS 범위가 되도록 하고, 그런 다음 반응 혼합물로부터 시클로덱스트린 생성물을 회수하는 것으로 이루어지는 방법.