DE3886382T2

DE3886382T2 - Wärmestabiles cyclodextrin glycosyl-transferase, deren herstellung und verwendung.

Info

Publication number: DE3886382T2
Application number: DE88909307T
Authority: DE
Inventors: Dennis Katkocin; Robert Starnes; Philip Trackman
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1987-10-15
Filing date: 1988-10-14
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2008-10-15
Also published as: WO1989003421A1; FI98737C; KR890701730A; EP0338057A1; KR960015892B1; FI98737B; FI892927A0; DE3886382D1; JPH02500247A; FI892927A; JP2854009B2; EP0338057B1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Diese Erfindung betrifft eine Cyclodextrin-Glycosyl- Transferase, ein Verfahren zu deren Herstellung, einen mikrobiellen Stamm, der in der Lage ist, diese herzustellen, und ihre Verwendung bei Stärkeverflüssigung und bei Cyclodextrinherstellung.

HINTERGRUNDTECHNIK

Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase (1,4-α-D-glucan-4-α-D-(1,4- α-D-glucano)-transferase, E.C. 2.4.1.19), hier im weiteren als Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase oder CGTase bezeichnet, ist ein Enzym, das gekennzeichnet ist durch seine Fähigkeit, Cyclodextrine durch Cyclisierung von Stärke oder Stärkehydrolysat zu bilden.
So produzieren die enzymatischen Cyclisierungsreaktionen Cyclodextrine (abgekürzt als CD und auch bekannt als Schardinger-Dextrine), die cyclische Moleküle sind, die aus sechs, sieben oder acht α-D-Glucopyranose-Resten bestehen, die durch α-1,4-Bindungen verknüpft sind. Sie sind bekannt als α-, β-, oder Gamma-Cyclodextrine, in Abhängigkeit von der Anzahl an Glucoseresten, 6, 7 bzw. 8.
Typischerweise sind Cyclodextrine bisher durch Variationen der Methode hergestellt worden, die von E.B. Tilden und C.S. Hudson beschrieben ist (J. American Chemical Society 64:1432[1942]), wobei dieses Verfahren die Behandlung verflüssigter Stärke mit einem Cyclodextrin-Glycosyl- Transferase(CGTase)-Enzym aus Bacillus macerans umfaßt. Alle Variationen dieses Verfahrens besitzen eine Reihe von Nachteilen. Zunächst muß die Stärke, da die CGTase nicht ausreichend thermostabil ist, um oberhalb der Verkleisterungstemperatur von Stärke eingesetzt zu werden, z.B. mit einer α-Amylase vorbehandelt werden, um die Stärke löslich zu machen. Es ist wichtig, daß die Stärke bis zu einem relativ niedrigen DE (Dextrose Equivalent) verflüssigt wird, so daß nach Durchführung des Stärkeverflüssigungsverfahrens das Behandlungsmittel, normalerweise eine α-Amylase, inaktiviert werden muß, um gute Cyclodextrinausbeute zu erhalten. Zweitens ist die Bacillus macerans-CGTase nicht ausreichend stabil, um bei erhöhten Temperaturen eingesetzt zu werden und folglich wird das enzymatische Cyclodextrinierungsverfahren bei 50ºC durchgeführt, wo es möglicher mikrobieller Kontamination unterliegt. Drittens erfordert Umwandlung von Stärke zu Cyclodextrinen (bei 50ºC, pH 7,0) durch die Bacillus macerans-CGTase längere Reaktionszeit, bevor vernünftige Ausbeuten erreicht werden.
Die bisher im Stand der Technik bekannten CGTase-Enzyme werden von solchen Mikroorganismen produziert wie Bacillus macerans, Bacillus circulans, Bacillus stearothermophilus, Bacillus megaterium, Bacillus ohbensis, alkalophilem Bacillus sp., Micrococcus luteus, Micrococcus varians und Klebsiella pneumoniae. Keine der CGTase-Enzyme, die von diesen Mikroorganismen produziert werden, sind jedoch bei über 60ºC ausreichend stabil zur Verwendung bei der Herstellung von Cyclodextrinen bei Temperaturen, die ausreichend hochgehoben sind, um mögliche mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
Enzymatische Verflüssigung wäßriger Stärkeaufschlämmung wird in weitem Umfang als der erste Schritt bei der Umwandlung von Stärke zu Dextrose (Glucose) praktiziert. Zu einem großen Ausmaß hat die Stärkeindustrie das Verflüssigungsverfahren von US 3,921,590 übernommen. Typische Bedingungen sind Düsenkochen bei 105ºC für 5 Minuten, gefolgt von einem 90minütigen Halten bei 95ºC, bei einer Stärkekonzentration von 35 % TS (Trockensubstanz), gewichtsbezogen. Das in diesem Verfahren verwendete Enzym ist Termamyl (Produkt von Novo Industri A/S), eine α-Amylase aus Bacillus licheniformis. Verflüssigung wird bei einem pH über 6,0 durchgeführt, gefolgt von Verzuckerung mit Glucoamylase bei einem pH von ungefähr 4,5-5,0.
Die Technik hat lange nach Stärkeverflüssigungsenzymen gesucht, die bei pH 4,5 verflüssigen können, um die Notwendigkeit einer pH-Zwischeneinstellung zu eliminieren. α- Amylase aus Bacillus stearothermophilus ist für diesen Zweck vorgeschlagen worden, aber Daten in dieser Beschreibung zeigen, daß sie bei einem so niedrigen pH wie 4,5 nicht gut verflüssigt. US 4,578,532 und US 4,613,570 offenbaren acidurische α-Amylasen aus Clostridium, aber Daten in besagten Patenten zeigen, daß deren Stabilität bei 100ºC oder darüber bei pH 4,5 ungenügend ist.

AUFGABE DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, eine Cyclodextrin- Glycosyl-Transferase mit ausreichender Wärmestabilität bereitzustellen, die für CD-Produktion bei 60ºC oder höher verwendet werden soll, wo das Risiko mikrobieller Infektion gering ist, und sogar für Stärkeverflüssigung oberhalb 90ºC verwendet werden soll, wo die Stärke vollständig verkleistert ist.
Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, ein Enzym bereitzustellen, das Stärke bei pH 4,5 und einer Temperatur oberhalb 100ºC verflüssigen kann.
Andere Aufgaben der Erfindung sind die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung besagten thermostabilen Enzyms und ein mikrobieller Stamm, der in der Lage ist, dieses zu produzieren. Es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, das besagtes Enzym verwendet, um CD bei 60ºC oder höher zu produzieren, und ein Verfahren, das besagtes Enzym zur Stärkeverflüssigung bei einem pH von etwa 4, 5-5,0 verwendet.

DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben eine Anzahl thermophiler, obligater, anaerober Stämme isoliert, die CGTasen mit überraschender Wärnestabilität produzieren.
Demgemäß stellt die Erfindung in ihrem ersten Aspekt eine Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie für einen Stamm von Thermoanaerobacter oder Thermoanaerobium nativ ist, ein Temperatur-Optimum, gemessen bei 5,0, von etwa 95ºC; ein pH- Optimum von etwa 5,0; und eine Restaktivität nach 40 Minuten Inkubation bei 80ºC und pH 5,0 von etwa 95 % in der Abwesenheit von Stärke und Ca&spplus;&spplus; besitzt.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase (CGTase) zur Verfügung, welches Kultivierung eines CGTase produzierenden Stammes von Thermoanaerobacter oder Thermoanaerobium unter anaeroben Bedingungen oder Kultivierung eines transformierten Wirtsorganismus, der die passende genetische Information daraus enthält, unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten nährstoffhaltigen Medium und danach Gewinnung von CGTase aus dem Fermentationsmedium umfaßt.
Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt eine biologisch reine Kultur eines Stammes von Thermoanaerobacter oder Thermoanaerobium zur Verfügung, gekennzeichnet durch die Fähigkeit, Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase zu produzieren, und dadurch, daß sie nicht freibeweglich ist.
Ein vierter Aspekt der Erfindung stellt ein Stärkeverflüssigungsverfahren zur Verfügung, welches umfaßt, daß eine wäßrige Stärkeaufschlämmung enzymatischer Verflüssigung in der Gegenwart besagter Cyclodextrin-Glycosyl- Transferase bei einem pH im Bereich von etwa 4,0 bis 5,5 vorzugsweise bei einer Temperatur, die etwa 100ºC übersteigt, unterzogen wird.
Ein fünfter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin zur Verfügung, welches umfaßt, daß eine Stärkehydrolysatlösung mit besagter Cyclodextrin- Glycosyl-Transferase bei einer Temperatur von über 60ºC enzymatisch behandelt und danach ein Cyclodextrin-Produkt aus der Reaktionsmischung gewonnen wird.
Schließlich stellt ein sechster Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin zur Verfügung, welches umfaßt, daß eine wäßrige Stärkeaufschlämmung mit der Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase von Anspruch 1 bei einer Temperatur von über etwa 100ºC und bei einem pH im Bereich von 4,0-5,5, vorzugsweise im wesentlichen ohne Zugabe eines Calciumsalzes, enzymatisch behandelt wird, der resultierende Sirup danach bei einer Temperatur im Bereich von 80º-90ºC für nicht mehr als etwa 28 Stunden gehalten wird, wobei der Sirup während zumindest eines Teils besagter Halteperiode im Bereich 20-30 TS liegt, und dann ein Cyclodextrin-Produkt aus der Reaktionsmischung gewonnen wird.

DETAILLIERTE ERLÄUTERUNG DER ERFINDUNG

Mikroorganismus

Die Mikroorganismen der Erfindung sind thermophile, obligate, anaerobe Bakterien, die zur Gattung Thermoanaerobacter (J. Wiegel und L.G. Ljungdahl, Arch. Microbiol. (1981) 128: 343- 348) oder zur Gattung Thermoanaerobium (J.G. Zeikus et al., Arch. Microbiol., 122, 41-48 (1979) gehören. Die Taxonomie für diese Gattungen ist nicht festgestellt und es wird als wahrscheinlich angesehen, daß die zwei Gattungen richtig als ein und dieselbe Gattung klassifiziert werden könnten, da sie so ähnlich sind, daß sogar ein Fachmann auf diesem Gebiet sie nicht unterscheiden kann.
Im Gegensatz zu bekannten Stämmen von Thermoanaerobacter und Thermoanaerobium sind die mikrobiellen Stämme der Erfindung durch die Fähigkeit gekennzeichnet, CGTase zu produzieren, und dadurch, daß sie nicht freibeweglich sind. Einige Stämme der Erfindung sind auch Indol-positiv, im Gegensatz zu bekannten Stämmen. Es wurde festgestellt, daß die bekannten Stämme T. ethanolicus DSM 3389 und T. finii DSM 2246 keine Produzenten von thermostabiler CGTase sind.
8 Stämme wurden von den Erfindern isoliert und wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) und den National Collections of Industrial Marine Bacteria (NCIMB) zu Zwecken der Patentierung gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages wie folgt hinterlegt: Hinterlegungs-Nr. Hinterlegungsdatum Bezeichnung des Hinterlegers
Mutanten und Varianten der obigen Stämme liegen ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung.
Diese 8 Stämme wurden alle von NCIMB, Schottland, als Thermoanaerobacter sp. oder Thermoanaerobium sp., klassifiziert, wobei die Gattung nicht aufgelöst wurde. Weitere taxonomische Daten sind unten angegeben: Stamm Nr. ºC Inkubation Zellmorphologie Gram Sporen Freibeweglichkeit Kolonie-Morphologie Wachstum viskos in KOH-Test Glukose Ye Wachstum TYG Katalase Oxidase, Kovacs P-W-S Chloramphenicol Empfindlichkeit Hämolyse auf Pferde-Blutagar Lackmusmilch Reduktion PNPG H&sub2;S-Produktion Siehe Bemerkungen (a) - (f) auf der nächsten Seite.

Bemerkungen:

(a) Granuläre Stäbchen variierender Länge, in Ketten.
(b) Reguläre Stäbchen, "granuläre" Anfärbung, einzeln und in kurzen Ketten.
(c) (Stärkeagar, 3 Tage): rund, regulär, ganz, glatt, niedrig (?), konvex (?), opak, gelblich-lederfarben, 2,5 mm Durchmesser.
(d) (R.C.M., 3 Tage): rund, regulär, ganz, glatt, glänzend, durchscheinend, flach, weiß, 3 mm Durchmesser.
(e) + (langsam 7 Tage)
(f) Pepton Wasser Zucker: Keine Säure oder Gas.
ND Nicht bestimmt API 20A Anaerobic-Test 24 Stunden 60ºC Stamm. Nr. Indol Urease Säure aus: Glucose Mannit Lactose Saccharose Maltose Salicin Xylose Arabinose Glycerin Cellobiose Mannose Melezitose Raffinose Sorbit Rhamnose Trehalose Gelatinase* Aesculin hydrolyse NC Keine Veränderung nach Inkubation ± Spurenreaktion * Kann Artefakt sein, bewirkt durch hohe Temperatur

Produktion von CGTase

Die Herstellung des CGTase-Enzyms kann durchgeführt werden durch Kultivieren eines mikrobiellen Stammes der Erfindung (zum Beispiel ATCC 53,627) unter anaeroben Bedingungen in einem Medium, das Maltodextrin als die Kohlenstoffquelle, Hefeextrakt und Minerallösungen enthält. Der optimale pH und die optimale Temperatur für die Produktion der CGTase ist pH 7,0 und 67ºC. Das Enzym wird in das Fermentationsmedium ausgeschieden, was zeigt, daß es ein extracelluläres Enzym ist.
Alternativ kann CGTase der Erfindung durch aerobe Kultivierung eines Transformanten produziert werden, der die passende genetische Funktion enthält. Im allgemeinen wird dieses Produktionsverfahren die folgenden Schritte umfassen:
(a) Bereitstellen eines geeigneten rekombinanten DNA- Klonierungsvektors, der DNA-Sequenzen umfaßt, die Funktionen kodieren, die Genexpression erleichtern, und eine DNA-Sequenz, die die CGTase eines Thermoanaerobacter- oder Thermoanaerobium-Stammes kodiert;
b) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem Klonierungsvektor aus Schritt (a);
c) Kultivieren des transformierten Wirts unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten nährstoffhaltigen Medium und danach Gewinnen von CGTase aus dem Medium.
Beispiele geeigneter Wirtsorganismen sind Stämme von Escherichia, Streptomyces, Bacillus oder Aspergillus, vorzugsweise ein Stamm von E. coli, B. subtilis, B. licheniformis oder A. oryzae.
Die CGTAse kann gewonnen werden, indem die Zellen aus dem Fermentationsmedium entfernt werden und die Brühe dann konzentriert wird z.B. durch Ultrafiltration.

CGTase-Reinigung

Für Charakterisierungszwecke wurde Reinigung der rohen CGTase- Zubereitung aus ATCC 53,627 bis zu Homogenität durch DEAE- Sepharose-Chromatographie, Chromatofocusing und Acarbose- Sepharose-Affinitätschromtographie erreicht. Drei Komponenten, die mit I, II und III bezeichnet wurden, wurden gereinigt. Nur eine CGTase-Komponente wurde in den Rohzubereitungen aus den anderen Stämmen gefunden, auf Grundlage von SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese.

CGTase-Thermostabilität

CGTasen der Erfindung sind gekennzeichnet durch gegenüber Enzymen nach dem Stand der Technik weit überlegene Thermostabilität. Nach Inkubation in 5% Lintner-Stärke- 0,1 M Natriumacetat pH 5,0 (50 ppm Ca&spplus;&spplus;) - für 50 Minuten bei 95ºC behielt CGTase der Erfindung (ATCC 53,627) nahezu 100% ihrer Aktivität.
Figur 3 zeigt die Restaktivität roher GCTase aus ATCC 53,627 nach 40 Minuten Inkubation bei verschiedenen Temperaturen bei pH 5,0 in Abwesenheit von Substrat und Ca&spplus;&spplus;. Wie gezeigt, behielt sie ungefähr 95 % ihrer Aktivität bei 80ºC bei diesen Bedingungen. Zum Vergleich sind auch Daten für zwei Verflüssigungsenzyme nach dem Stand der Technik dargestellt: α-Amylase aus Bacillus licheniformis (Termamyl ) und α-Amylase aus Bacillus stearothermophilus.
Die Komponenten I, II und III haben ähnliche Thermostabilität wie die rohe CGTase von ATCC 53,627. Zum Vergleich wird von
b) Transformieren eines geeigneten Wirtsorganismus mit dem Klonierungsvektor aus Schritt (a);
c) Kultivieren des transformierten Wirts unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten nährstoffhaltigen Medium und danach Gewinnen von CGTase aus dem Medium.
Beispiele geeigneter Wirtsorganismen sind Stämme von Escherichia, Streptomyces, Bacillus oder Aspergillus, vorzugsweise ein Stamm von E. coli, B. subtilis, B. licheniformis oder A. oryzae.
Die CGTAse kann gewonnen werden, indem die Zellen aus dem Fermentationsmedium entfernt werden und die Brühe dann konzentriert wird z.B. durch Ultrafiltration.

CGTase-Reinigung

Für Charakterisierungszwecke wurde Reinigung der rohen CGTase- Zubereitung aus ATCC 53,627 bis zu Homogenität durch DEAE- Sepharose-Chromatographie, Chromatofocusing und Acarbose- Sepharose-Affinitätschromtographie erreicht. Drei Komponenten die mit I, II und III bezeichnet wurden, wurden gereinigt. Nur eine CGTase-Komponente wurde in den Rohzubereitungen aus den anderen Stämmen gefunden, auf Grundlage von SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese.

CGTase-Thermostabilität

CGTasen der Erfindung sind gekennzeichnet durch gegenüber Enzymen nach dem Stand der Technik weit überlegene Thermostabilität. Nach Inkübation in 5% Lintner-Stärke- 0,1 M Natriumacetat pH 5,0 (50 ppm Ca&spplus;&spplus;) - für 50 Minuten bei 95ºC behielt CGTase der Erfindung (ATCC 53,627) nahezu 100% ihrer Aktivität.
ATCC 53,627 I 117,000 Daltons
ATCC 53,627 II 110,000 -
ATCC 53,627 III 108,000 -
NCIB 40,053 99,000 -
NCIB 40,054 106,000 -
NCIB 40,055 104,000 -
NCIB 40,056 101,000 -
NCIB 40,057 126,000 -
NCIB 40,058 210,000 -
NCIB 40,059 154,000 -
Diese Ergebnisse beweisen, daß die CGTasen alle verschieden sind.
Isoelektrische Punkte. Isoelektrisches Fokussieren unter Verwendung einer LKB-Ampholine-PAG-Platte, pH 3,5-9,5, gefolgt von einer Deckschicht 0,8% Lintner-Stärke/Jod-Agar, bei pH 6,0, 55ºC, hat gezeigt, daß die isoelektrischen Punkte von CGTase I, II und III 4,55, 4,50 bzw. 4,50 sind.
Wirkungsmuster. Aminex HPX-42A (Bio-Rad)HPLC unter Verwendung des Brechungsindex zum Nachweis bewies, daß die Wirkungsmuster, erzeugt aus dem Abbau von Lintner-Stärke durch jede CGTase aus ATCC 53,627, identisch waren (siehe Figur 4). Die drei CGTasen sind daher katalytisch dieselben. Die drei Peaks rechts tauchen nach Hydrolyse auf und haben sich nach NMR als (von links nach rechts) α-, Gamma- bzw. β-Cyclodextrin erwiesen.
Fig. 7 vergleicht das von CGTase der Erfindung (ATCC 53,627) erzeugte Wirkungsmuster mit einem Verflüssigungsenzym nach dem Stand der Technik, nämlich α-Amylase aus Bacillus stearothermophilus.

Umwandlung von Stärke zu Cyclodextrinen.

Die Bestimmung der % Umwandlung zu α-, Gamma- oder β- Cyclodextrin während der Verflüssigung mit CGTase aus ATCC 53,627 bei einer Standard-Dosis von 4,46 Phadebas U/g TS ist unten dargestellt. Die Bedingungen waren 35 % TS Maisstärke bei pH 4,5 mit primärer Verflüssigung bei 105ºC für 14 Minuten und sekundärer Verflüssigung bei 90ºC für 4 Stunden. Auch dargestellt sind die % Umwandlung für CGTase (6,8 Phadebas U/g TS) mit 5 % TS Lintner-Stärke - 0,1 M Natriumacetat (50 ppm Ca&spplus;&spplus;) bei pH 5,0 und 95ºC für 50 Minuten. Bei der Verflüssigung werden gleiche Mengen α- und Gamma-Cyclodextrine produziert, während nahezu zweimal soviel β-Cyclodextrin gebildet wird. In der Lintner-Stärkereaktion wird zweimal soviel β-Cyclodextrin wie Gamma-Cyclodextrin gebildet, jedoch wird dreimal soviel α- Cyclodextrin gebildet wie Gamma-Cyclodextrin. Cyclodextrin Reaktion Gamma-CD Lintner-stärke Verflüssigung

Vergleich der Cyclodextrin-Glycosyl-Transferasen.

Ein Vergleich von CGTase der Erfindung mit veröffentlichten Daten über mehrere bekannte CGTasen ist in der Tabelle unten dargestellt. Mehrere klare Unterschiede sind offensichtlich, insbesondere das Temperatur-Optimum und die Temperaturstabilität. VERGLEICH VON CYCLODEXTRIN-GLYCOSYL-TRANSFERASEN AUS VERSCHIEDENEN MIKROOGANISMEN Erfindung Bacillus stearothermophilus Bacillus megaterium Bacillus circulans Bacillus macerans Bacillus sp Micrococcus sp Isoelektrischer Punkt Relative Molekülmasse (SDS) Temperatur-Optimum pH-Optinum Temperaturstabilität* (behält 95-100% Aktivität) * Abwesenheit von Substrat

Stärkeverflüssigungsverfahren

Stärkeverflüssigung dient dazu, Stärke teilweise zu depolymerisieren und löslich zu machen, um sie anschließender enzymatischer Verzuckerung, z.B. durch Glucoamylase, zugänglich zu machen. Zu einem großen Umfang hat die Industrie das Verflüssigungsverfahren von US 3,921,590 übernommen. Typische Bedingungen sind Erhitzen auf 105ºC, z.B. durch Düsenkochen, Halten für 5 Minuten bei dieser Temperatur, gefolgt von einem 90minütigen Halten bei 95ºC mit B. licheniformis-α-Amylase bei etwa pH 6. Da Glucoamylase bei einem pH von 4,0-5,5 verwendet wird, ist es erwünscht gewesen, bei einem pH in diesem Bereich zu verflüssigen. α-Amylase aus B. stearothermophilus verflüssigt gut bei pH 5,8, aber beide der besagten α-Amylase können nicht unter pH 5,0 verflüssigen. Das Verflüssigungsverfahren, das von dieser Erfindung bereitgestellt wird, wird bei etwa pH 4,0-5,5 (vorzugsweise 4,5-5,5) durchgeführt, wodurch anschließende Verzuckerung ohne pH-Zwischeneinstellung durchgeführt werden kann.
CGTase der Erfindung benötigt kein Ca&spplus;&spplus; zur Stabilität, selbst bei niedrigem pH, so daß Zugabe von Calciumsalz im allgemeinen nicht erforderlich ist.
Geeignete Verflüssigungsbedinungen sind etwa 1-60 Minuten bei etwa 100-115ºC, vorzugsweise gefolgt von Halten für etwa 50 Minuten bis 4 Stunden bei etwa 80-100ºC. Ein kontinuierliches Verfahren ist bevorzugt und das Erhitzen erfolgt bevorzugt durch Düsenkochen. Die CGTase der Erfindung verflüssigt Stärke gut bei Dosierungsniveaus von 2-5 Phadebas U (siehe unten) pro Gramm Stärke TS (Trockensubstanz). Die Stärkekonzentration wird üblicherweise im Bereich 15-40 % TS (Gew.-% Trockensubstanz), am häufigsten 25-35 % TS liegen.
Durch α-Amylase katalysierte Hydrolyse von Stärke führt zu einer Verringerung der Viskosität gleichzeitig mit einem Anstieg an reduzierenden Zuckern. CGTase baut auch Stärke ab, aber im wesentlichen ohne Erzeugung reduzierender Zucker. Die enzymatischen Reaktionen senken den Polymerisationsgrad beträchtlich, was eine Lösung liefert, die hochmolekulare Maltodextrine zusammen mit einem beträchtlichen Gehalt an α-, β- und Gamma-Cyclodextrinen enthält. So beträgt die Umwandlung von 35 % TS Maisstärke bei pH 4,5 aus Verflüssigung bei 105ºC für 14 Minuten und einer Halteperiode bei 90ºC für 4 Stunden zu α-, β- und Gamma-Cyclodextrin 3,8 %, 6,4 % bzw. 3,6 %.
Das Verflüssigungsverfahren der Erfindung kann zur Herstellung von Dextrose (Glucose) in hoher Ausbeute aus naß vermahlener Maisstärke oder anderer raffinierter Stärke durch Verflüssigung mit der CGTase, gefolgt von Verzuckerung mit Glucoamylase, allein oder zusammen mit Pullulanase, verwendet werden.
Das Verflüssigungsverfahren der Erfindung kann auch zur Herstellung von Ethanol aus stärkehaltiger Biomasse verwendet werden. In diesem Fall wird die Biomasse mit CGTase bei einem pH von 4,5-5,5 verflüssigt, gefolgt von Verzuckerung mit Glucoamylase, um Glucose zu bilden, und gleichzeitig oder anschließend Fermentation der Glucose zu Ethanol mit Hefe. Danach kann der Alkohol mit in der Technik bekannten Verfahren gewonnen werden. Vorzugsweise wird das gesamte Verfahren bei einem pH von etwa 5,0 ohne irgendeine pH-Zwischeneinstellung durchgeführt und die gleichzeitige Verzuckerung und Fermentation wird bei etwa 30ºC für bis zu 72 Stunden ausgeführt. Die Verflüssigung kann entweder bei niedrigen TS- Gehalten (15-20 %) oder hohen TS-Gehalten (20-40 %) durchgeführt werden. Bei den Verfahren mit hohem TS-Gehalt muß der TS-Gehalt vor der Fermentation auf etwa 20 % verringert werden, um eine maximale Hefetoleranz von 10 % Alkohol (volumenbezogen) zu erhalten.
Das Rohmaterial zur Alkoholherstellung kann raffinierte Stärke, wie etwa naß vermahlene Maisstärke; rohe, nichtverarbeitete Materialien, wie etwa Mais, Weizen, Reis, Sorghum, Cassawa und Kartoffel (deren Stärkegehalt im Bereich von 15-80 % liegt); und andere stärkehaltige Materialien, wie etwa Abfall und Nebenprodukte aus der Industrie, einschließen. Im Falle raffinierter Stärke schließt das Verflüssigungsverfahren vorzugsweise eine Anfangsbehandlung oberhalb 100ºC, gefolgt von einem Halten bei einer niedrigeren Temperatur bis zu vollständiger Verflüssigung, ein. Im Falle anderer Rohmaterialien (mit niedrigerem Stärkegehalt) wird Verflüssigung vorzugsweise im Bereich 60-100ºC durchgeführt.

Cyclodextrinherstellung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinen mit thermostabiler CGTase bereit. Im Verfahren dieser Erfindung wird verflüssigte Stärke mit der CGTase bei einer Temperatur, die etwa 60ºC übersteigt, enzymatisch behandelt, wunschenswerterweise für nicht mehr als etwa 24 Stunden, und danach werden die Cyclodextrine aus der Reaktionsmischung gewonnen.
in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren Verflüssigung einer Stärkeaufschlämmung mit dem CGTaSe-Enzym bei etwa pH 5,0 bei einer anfänglichen Behandlungstemperatur, die etwa 100ºC übersteigt, gefolgt von Umwandlung der verflüssigten Stärke zu Cyclodextrinen, indem die verflüssigte Stärke bei etwa 80º-90ºC für bis zu etwa 24 Stunden in einem Halteschritt gehalten wird, vorzugsweise ohne pH-Einstellung und wünschenswerterweise ohne erneute Dosierung mit Enzym.
Im Gegensatz zu Verfahren nach dem Stand der Technik verwendet das Verfahren dieser Erfindung Temperaturen, die ausreichend hoch sind, um die schwerwiegende Gefahr mikrobieller Kontamination zu vermeiden, was natürlich vorteilhaft ist. Ein separater (aber damit zusammenhängender) Vorteil ist, daß die enzymatische Umwandlung mit der CGTase bei den erhöhten Umwandlungstemperaturen schneller abläuft. Behandlungszeit, die etwa 24 Stunden auf einem bereits verflüssigten Stärkesubstrat nicht übersteigt, wird für die Praxis dieser Erfindung in Betracht gezogen. Trotz der oben beschriebenen vorteilhaften Merkmale ist die Umwandlung bereits verflüssigter Stärke nicht eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung. Weit vorteilhafter ist es, das Verfahren mit Rohstärke, z.B. einer Stärkeaufschlämmung, zu beginnen und die CGTase zu verwenden, um die verflüssigte Stärke daraus zu erzeugen.
Das CGTase-Enzym kann verwendet werden, um Stärke bei dem pH- Bereich 4,0-5,5 in Abwesenheit von zugesetztem Calcium und unter Standard-Stärkeverflüssigungsbedingungen (wie oben beschrieben) zu verflüssigen (d.h. einen gießbaren Sirup aus einer Stärkeaufschlämmung zu erzeugen). Verwendung der CGTase, um eine Stärkeaufschlämmung zu verflüssigen und dann die verflüssigte Stärke zu Cyclodextrinen umzuwandeln, stellt ein höchst vorteilhaftes Verfahren dar und stellt die bevorzugte Praxis der Erfindung dar.
Verflüssigung der Stärke mit CGTase wird begleitet von Umwandlung der Stärke zu Cyclodextrinen. So ist eine beträchtliche Menge an Cyclodextrinen erhalten worden und liegt in der verflüssigten Stärke vor, bevor die weitere enzymatische Umwandlung verflüssigter Stärke zu Cyclodextrinen durchgeführt wird.
Insgesamt wird die Ausbeute an Cyclodextrinen, die direkt aus dem Stärkeverflüssigungsverfahren erhältlich ist, nicht als angemessen angesehen. Außerdem erhöht enzymatische Umwandlung der verflüssigten Stärke mit CGTase die Ausbeute an Cyclodextrinen beträchtlich.
Die Haltebehandlung bei erhöhter Temperatur der (düsen)- gekochten Stärke, die Teil der Standardbedingungen des Stärkeverflüssigungsverfahrens bildet, kann etwa 24 Stunden ausgedehnt werden, wünschenswerterweise jedoch bei etwa 90ºC, um mehr der verflüssigten Stärke zu Cyclodextrinen umzuwandeln, wobei der Umwandlungsschritt von mäßiger Verdünnung der verflüssigten Stärke zu einem optimaleren TS- Gehalt begleitet wird, falls erwünscht. Jede für optimale enzymatische Umwandlung zu Cyclodextrinen gewünschte pH- Einstellung kann entweder in der anfänglichen Stärke- Aufschlämmung oder als ein Zwischenschritt zur Verdünnung durchgeführt werden. Erneute Dosierung mit mehr von dem CGTase-Enzym nach dem Stärkeverflüssigungsschritt hat sich jedoch als nicht-notwendig herausgestellt.
Die Thermostabilität der Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase der Erfindung, die ihren Einsatz bei höheren enzymatischen Umwandlungstemperaturen ermöglicht, als es für die Enzyme nach dem Stand der Technik möglich ist (merkbar höher als für das Bacillus macerans-Enzym, dessen Grenztemperatur 50ºC ist), ermöglicht, daß das kombinierte Verflüssigungs und Umwandlungsverfahren ohne signifikante Zwischenkühlung des Sirups durchgeführt werden kann. Um dies zu wiederholen, die Fähigkeit, Cyclodextrine bei erhöhten Temperaturen zu produzieren, vermeidet die ausgedehnten Reaktionszeiten, die bisher verwendet wurden, und in der Praxis dieser Erfindung werden Reaktionszeiten von nicht mehr als 24 Stunden für die enzymatische Umwandlung der verflüssigten Stärke in Betracht gezogen.
Die bei der praktischen Umsetzung der Erfindung verwendete Stärke kann aus jeder pflanzlichen Quelle erhalten werden, einschließlich z.B. Wachsmais, Mais, Weizen, Sorghum, Kartoffel, Tapioka, Reis oder Sago. Zusätzlich zu nichtmodifizierten Formen der Stärken können auch modifizierte Formen, die aus der Behandlung der Stärke mit Enzymen, Säuren, Alkalis, etc. gewonnen sind, als Substrate verwendet werden. Die Cyclodextrinproduktionsreaktionen können auf verflüssigter Stärke bei TS-Konzentration im Bereich von 1 % bis 40 % TS durchgeführt werden, aber für maximale Umwandlungseffizienz ist eine Lösung mit 20-30 % TS-Feststoffgehalt bevorzugt. Falls erwünscht können konzentriertere Stärkeaufschlämmungen verflüssigt werden (wobei die Standardbedingungen 35 % TS sind), dann auf 20-30% TS Dextrinlösungen verdünnt zur Umwandlung zu Cyclodextrinen.
Um die Bedingungen eines Gesamtverfahrens, in denen das Ausgangsmaterial Rohstärke ist, zusammenzufassen, kann CGTase der Erfindung in einem weiten Bereich von Bedingungen eingesetzt werden, einschließlich den relativ scharfen Standard-Verflüssigungsbedingungen einer Aufschlämmung mit 35 % TS, Düsenkochen bei 105ºC und 90minütigem Halten bei 95ºC über den Bereich pH 4,0-5,5 in Abwesenheit von Ca&spplus;&spplus;, gefolgt von einem ausgedehnteren Halten bei über 55ºC für bis zu etwa 24 Stunden. Für maximale Umwandlung und/oder minimalen CGTase- Verbrauch sollten beide Halteschritte (die natürlich ein einziges ausgedehntes Halten sein können) innerhalb des Bereich 80ºC - 90ºC durchgeführt werden und die Stärkekonzentration im Bereich 20-30 % TS liegen (entweder in der anfänglichen Stärkeaufschlämmung oder durch Verdünnung der verflüssigten Stärke).
In weiterer Zusammenfassung können die Cyclodextrine aus verflüssigter Stärke durch Inkubation des Sirups mit CGTase der Erfindung im Temperaturbereich von 50-95ºC, vorzugsweise bei 80-90ºC, durch Umsetzen für etwa 24 Stunden oder weniger im pH-Bereich 4-9, am bevorzugtesten bei etwa 5,0, hergestellt werden. Das Cyclodextrinprodukt kann aus der Reaktionslösung wie bisher gewonnen werden. Überdies können die gewonnenen Cyclodextrine zu α-, β- und Gamma-Cyclodextrin gemäß den in der Technik bekannten Praktiken fraktioniert werden, z.B durch Verfahren, wie sie von D. French et al. in Journal of American Chemical Society 71:353 (1949) beschrieben sind.
Die diskontinuierlichen Umwandlungen von Stärkehydrolysat zu Cyclodextrinen mit der Bacillus macerans-CGTase ist bisher oft in Gegenwart eines geeigneten Komplexbildners durchgeführt worden, um das Gleichgewicht in Richtung auf Produktbildung zu verschieben. Wünschenswerterweise sind die Cyclodextrin- Clathrate unlöslich und fallen daher in der Reaktionsmischung aus Lösung aus. Das komplexierte Cyclodextrin kann durch Filtration oder Zentrifugation gewonnen werden und der Komplexbildner kann dann mit in der Technik bekannten Verfahren vertrieben werden. Geeignete Cyclodextrin- Komplexbildner schließen Cyclooctan, Hexan, 1-Butanol, 1- Decanol, etc. ein. Eine Anzahl von Komplexbildnern ist identifiziert worden, die selektiv mit der α- oder β-Form einen Komplex bilden (siehe US-Patent # 3,640,347 zum Beispiel). Insbesondere ist Cyclooctan selektiv für β- Cyclodextrin, während 1-Decanol selektiv für α-Cyclodextrin ist. Die Praxis dieser Erfindung sieht die Durchführung von Umwandlungen unter Verwendung von CGTase in der Gegenwart von Komplexbildnern in Betracht.

Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase-Test

Die Stärke-Dextrinierungs-Aktivität von CGTase wird mit dem Pharmacia Phadebas (R) Amylase-Test bei pH 6,0, 60ºC gemessen, indem 200 ul der Enzymlösung mit 4,0 ml 0,1 M Natriumacetat (100 ppm Ca&spplus;&spplus;) plus einer Phadebas-Tablette für 15 Minuten inkubiert werden. Die Reaktion wird dann mit 0,5 ml 1,0 N HCl gestoppt.
Die Testlösung wird 2 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge bei Raumtemperatur zentrifugiert und die Extinktion des Überstands wird bei 620 nm abgelesen, ein Extinktionswert von 1,0-3,0 sollte erreicht werden. Eine Standardkurve unter Verwendung von Bacillus licheniformis-α-Amylase als dem Standard wurde konstruiert, wobei eine Phadebas-Einheit definiert wird als die Enzymmenge, die die Hydrolyse von 1,0 umol Glucosidbindungen von Lintner-Stärke pro Minute bei 60ºC pH 6,0 katalysieren wird.

Quantitative Bestimmung von Cyclodextrin-Produkt

Die Ausbeuten an α-, β- und Gamma-Cyclodextrinen wurden bestimmt mit BioRad Aminex Carbohydrate HPX-42A High Performance Liquid Chromatography. Zwei Säulen (300 x 7,8 mm) wurden im Tandem bei 85ºC mit über Glas destilliertem Wasser als dem Elutionsmittel bei einem Durchfluß von 0,6 ml/min verwendet. Nachweis erfolgte durch Brechungsindex. Standardkurven wurden mit authentischen Proben von α-, β- und Gamma-Cyclodextrinen konstruiert (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri).

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist ein Diagramm von relativer Aktivität gegen Temperatur für die CGTase;
Figur 2 ist ein Diagramm von relativer Aktivität gegen pH für die CGTase;
Figur 3 ist ein Diagramm der Thermostabilität von CGTase aus ATCC 53,627 relativ zu Bacillus Stearothermophilus-α-Amylase und Termamyl ;
Figur 4 sind die HPLC-Diagramme, die die Wirkungsmuster der CGTasen I, II, III zeigen;
Figur 5 ist ein Diagramm Viskosität gegen Zeit, das die Stärkeverflüssigung mit der CGTase, Termarnyl und Bacillus stearothermophilus-α-Amylase vergleicht;
Figur 6 veranschaulicht ein Diagramm von Drehmoment- gegen Rotationsgeschwindigkeitsmessung, das die Variationen in der Viskosität von verflüssigten Stärkelösungen beweist, die mit variierenden Dosierungsniveaus von CGTase erhalten werden;
Figur 7 sind die HPLC-Diagramme, die die Wirkungsmuster der CGTase und der α-Amylase von Bacillus stearothermophilus vergleichen.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Herstellung von CGTase durch anaerobe Kultivierung

Der Stamm ATCC 53,627 wurde kultiviert in einem vorreduzierten Flüssigmedium unter Argon bei einem Anfangs-pH von 7, das aus den folgenden Bestandteilen in Gramm pro Liter bestand: Maltrin M-100, 5,0; KH&sub2;PO&sub4;, 2,0; K&sub2;HPO&sub4;, 6,0; NaCl, 1,0; (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2,5; MgSO&sub4;7H&sub2;O, 0,5; CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 0,05; Hefeextrakt, 2,0; Na&sub2;S, 0,5; Cystein-HCl, 0,5; Resazurin (Redoxindikator), 2 ng; und Spurenmetalle 5,0 ml. Die Spurenmetallösung bestand aus den folgenden Bestandteilen in Gramm pro Liter: FeCl&sub3;.6H&sub2;O, 5,40; ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 1,45; MnCl&sub2;.4H&sub2;O, 1,00; CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 0,25; und
H&sub3;BO&sub3;, 0,10. Die Spurenmetallösung wurde mit konzentrierter HCl angesäuert, um die Salze zu lösen.
Der Stamm wurde bei 67ºC ohne Bewegung für 40 Stunden inkubiert. Das maximale Aktivitätsniveau nach 40 Stunden betrug 200 Phadebas U pro Liter Brühe. Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert, dann filtriert und schließlich auf eine volumetrische Aktivität von 30-50 Phadebas U pro ml unter Verwendung eines Millipore Minitan Systems konzentriert.
Reinigung von CGTase aus ATCC 53,627 wurde durch aufeinanderfolgende Schritte erreicht, die DEAE-Sepharose- Chromatographie Chromatofocusing und Acarbose-Sepharos- Affinitätschromatographie umfaßten. DEAE-Sepharose- Chromatografie wurde durchgeführt bei pH 7,5 in 10 mM Tris-HCl (2,5 mM CaCl&sub2;) 4ºC, unter Verwendung eines linearen NaCl- Gradienten (0-200 mM). Chromatofocusing (Pharmacia) wurde durchgeführt bei 4ºC unter Verwendung eines linearen pH- Gradienten von pH 7-5. Acarbose-Affinitätschromatographie wurde durchgeführt bei pH 6,0, 4ºC, und Elution wurde erreicht mit einer 0,1 M Natriumacetat (100 ppm Ca&spplus;&spplus;)-Pufferwaschung. Drei einzelne CGTase-Komponenten, bezeichnet mit I, II und III, wurden durch Chromatofocusing erhalten und mit Acarbose- Affiflitätschromatographie bis zu Homogenität gereinigt. Die relativen Mengen der drei CGTasen im Anschluß an Chromatofocusing betrugen CGTase I - 20 %, CGTase II - 60 % und CGTase - 20 %.

BEISPIEL 2

Herstellung von CGTase durch aerobe Kultivierung eines transformierten Wirtsorganismus

Chromosomale DNA wurde aus Zellen des Stammes ATCC 53,627 wie folgt isoliert. Zellen (3,1 g Naßgewicht) wurden in 4,5 ml 25 % Saccharose-50 mM Tris pH 8,0 - 40 mM EDTA suspendiert Die Suspension wurde mit Lysozym (2 mg/ml) für 30 Minuten auf Eis, gefolgt von 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Pronase (1 mg/ml) wurde zugegeben und die Suspension wurde bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Das Lysat wurde zweimal mit 8 ml Phenol für 30 Minuten nach Zugabe von 3 ml Puffer 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 extrahiert. Die wäßrige Phase wurde dann zweimal mit 10 ml Chloroform extrahiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 0,45 ml 3 M Natriumacetat - 1 mM EDTA pH 7,0 und 2,75 ml Isopropanol ausgefällt und auf Eis für 5 Minuten inkubiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation pelletiert und einmal mit 70 % Ethanol gewaschen. Der Pellet wurde für 10 Minuten unter Vakuum getrocknet und dann erneut in 15 ml Puffer 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 gelöst.
Die DNA-Zubereitung wurde einer Caesiumchloridgradient- Zentrifugation bei 15ºC, 192.000 g für 40 Stunden unterzogen. Die Bande der chromosomalen DNA wurden gesammelt, dreimal mit mit Caesiumchlorid gesättigtem Isopropanol extrahiert und gegen Puffer 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 bei 4ºC dialysiert. Insgesamt 590 ug chromosomale DNA wurden gewonnen.
Die DNA wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym EcoRI durch Inkubieren von 200 ug mit 33 Einheiten EcoRI in 150 ul 50 mM Tris pH 8,0 - 10 mM MgCl&sub2; - 100 mM NaCl für 12 Minuten bei 37ºC verdaut. Die teilweise verdaute DNA wurde einer Zentrifugation mit 10-40 % Saccharosegradient bei 135.000 g, 15ºC für 16 Stunden unterzogen. Fraktionen von 180 ul wurden gesammelt und 5 ul-Aliquote wurden mit Gelelektrophorese auf 1 % Agarosegel analysiert. Fraktionen, die in der Größe im Bereich von 7 bis 15 kb lagen, wurden gepoolt, gegen 1 l Puffer 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 dialysiert, ethanolgefällt und in 100 ul Puffer 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 gelöst.
Der Vektor pBR322 wurde mit EcoRI durch Inkubieren von 2,5 ug mit 30 Einheiten EcoRI in 125 ul 50 mM Tris pH 8,0 - 10 mM MgCl&sub2; - 100 mM NaCl für 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Analyse der DNA auf einem Agarose-Gel zeigt, daß die Verdauung vollständig war. Der verdaute Vektor wurde zweimal mit Phenol, einmal mit Ether extrahiert und ethanolgefällt
Der Vektor wurde in 100 ul 100 mM Tris pH 8,0 - 1 mM MgCl&sub2; gelöst und mit 20 Einheiten Kalbsintestinal-Alkalinphosphatase bei 37ºC für 30 Minuten dephosphoryliert. Der dephosphorylierte Vektor wurde zweimal mit Phenol extrahiert, zweimal mit Chloroform extrahiert und ethanolgefällt Der dephosphorylierte pBR322 wurde in 50 ul Puffer 10 mM Tris - 1 mM EDTA pH 7,4 gelöst.
Ligation des verdauten pBR322 und der DNA aus Stamm ATCC 53,627 wurde bewerkstelligt durch Vermischen von 0,4 ug der teilweise mit EcoRI verdauten chromosomalen DNA (7-15 kb) und 0,1 ug des mit EcoRI verdauten, dephosphorylierten pBR322 mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase in 20 ul 50 mM Tris pH 7,4 - 10mM MgCl&sub2; - 20 mM DTT - 1 mM ATP, enthaltend 5 ug BSA/ml, und Inkubieren über Nacht bei 14ºC.
Kompetente E. coli-HB101(ATCC 33,694)-Zellen wurden durch Transformation mit dem Verfahren von T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in Molecular Cloning - A Laboratory manual, Seite 250, hergestellt.
Eine Hälfte der oben hergestellten ligierten DNA wurde in kompetente Zellen von E. coli HB101 gemäß dem Verfahren von Maniatis et al. (aaO.) transformiert. Die Zellen wurden über Nacht bei 37ºC auf Platten kultiviert, die Luria-Bertani(LB)- Medium und Tetracyclin bei einer Konzentration von 15 ug/ml enthielten. Die Tetracyclin-resistenten Kolonien wurde dann replicaplattiert auf Stärkeplatten, die 1 % Amylopectin-LB- Medium und Tetracyclin (15 ug/ml) enthielten, und über Nacht bei 37ºC inkubiert. CGTaSe-Produktian wurde bestimmt, indem die Stärkeplatten nach Wärmebehandlung bei 70ºC für eine Stunde Joddampf ausgesetzt wurden, wobei Clearing-Zonen beobachtet wurden.
Ein CGTase-positiver Transformant, bezeichnet mit E. coli NV601, wurde aus über 5.000 Kolonien gewonnen. Der Stamm war sowohl Ampicillin- als auch Tetracyclin-resistent. Gewinnung des rekombinanten Plasmids durch Standardverfahren der alkalischen Lyse und Re-Transforination von kompetenten E. coli-HP101-Zellen lieferte CGTase-positive Transformanten.
Restriktionskartierung des rekombinanten Plasmids ergab, daß ein DNA-Fragment, 12,8 kb groß, in die EcoRI-Stelle von pBR322 inseriert worden war. Deletionsanalyse mit dem Restriktionsenzym BamHI ergab, daß das Gen, das die CGTase kodiert, auf einem 6,0 kb BamHI-BamHI-Fragment lokalisiert war.
Die CGTase wurde durch Kultivieren von E. coli NV601 in Luria- Bertani-Medium, das 15 ug Tetracyclin pro ml Medium enthielt, bei 37ºC, 300 UPM für 24 Stunden produziert Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und dann durch Beschallung lysiert.
Charakterisierung der rekombinanten CGTase relativ zur nativen CGTase im Hinblick auf relative Molekülmasse (SDS-PAGE), isoelektrischen Punkt, Thermostabilität, Wirkungsmuster, Verflüssigungsaktivität und Cyclodextrinproduktion zeigte keinen Unterschied zwischen den Enzymen. Die rekombinante CGTase reagierte über Kreuz mit Antikörper, der gegen die native CGTase (Komponente II) gezüchtet worden war.

BEISPIEL 3

Cyclodextrinproduktion

Ein Vergleich der Cyclodextrin-Ausbeuten, produziert von CGTase der Erfindung (ATCC 53,627) und der CGTase aus Bacillus macerans, wurde vorgenommen. Da die Bacillus macerans-CGTase unter normalen Düsenkocher-Bedingungen Stärke nicht verflüssigen kann, wurde eine vorbehandelte Stärke, d.h. Lintner-Stärke verwendet. Die Enzyme wurden mit 15 % TS Lintner-Stärke (plus 40 ppm Ca&spplus;&spplus;) bei 50ºC und 90ºC, pH 5,0 für 24 Stunden umgesetzt. Die Dosierung betrug 4,46 Phadebas U pro Gramm TS Stärke. Die Bacillus macerans-CGTase wurde auch bei pH 7,0 wie oben umgesetzt, um als ein Kontrollversuch zu dienen. Cyclodextrin-Ausbeute CGTase Gamma-CD Gesamt-CD Erfindung Bacillus macerans
Die Ergebnisse beweisen, daß CGTase der Erfindung überlegene Umwandlung bei 50ºC ergibt, was das Optimum für das B. macerans-Enzym nach dem Stand der Technik ist. Die CGTase der Erfindung zeigt im wesentlichen dieselbe hohe Umwandlung bei 90ºC, wo zu sehen ist, daß das Enzym nach dem Stand der Technik nahezu inaktiv ist. Die CGTase der Erfindung produziert α-, β- und Gamma-Cyclodextrin in einem Verhältnis (bei 50ºC), von 0,74:1,0:0,41, d.h. relativ mehr α-CD als das B. macerans-Enzym.

BEISPIEL 4

Stärkeverflüssigung bei verschiedenem pH

35 % TS Maisstärke mit oder ohne 40 ppm Ca&spplus;&spplus; wurde bei 105ºC für 14 Minuten verflüssigt, gefolgt von 4 Stunden bei 90ºC. Enzym wurde dosiert bei 4,46 Phadebas U/g TS (60ºC, pH 6,0). CGTase der Erfindung (ATCC 53,627) wurde verglichen mit Terrnamyl (B. licheniformis-α-Amylase, erhältlich von Novo Industri A/S) und B. stearothermophilus-α-Amylase (erhältlich als G-Zyme G995 von Enzyme Bio-Systems, Ltd.).
Dextrose-Äquivalent (DE) wurde gemessen nach Verflüssigung und die Stärke wurde als verflüssigt eingestuft, wenn der Stärkesirup nach Verflüssigung gießbar war (was eine beträchtlich Viskositätsverringerung anzeigt). Enzym verflüssigt CGTase BS-Amylase Termamyl nicht nachweisbar Ja Nein * Als verflüssigt bewertet, aber sehr viskos.
Man kann sehen, daß gute Verflüssigung mit CGTase der Erfindung sogar bei einem so niedrigen pH wie 4,5 ohne Ca&spplus;&spplus;- Zugabe und im wesentlichen ohne Bildung reduzierender Zucker erreicht werden kann.

BEISPIEL 5

Stärkeverflüssigung bei verschiedenen Enzymdosierungen

35 % TS Maisstärke wurde verflüssigt mit CGTase (ATCC 53,627) bei pH 4,5 in der Abwesenheit von zugesetztem Enzymdosierungen von 0,223, 0,446, 0,892, 2,23 und 4,46 Phadebas U/g TS wurden verwendet. Zum Vergleich wurde Termamyl bei pH 6,2 und B. stearothermophilus-Amylase bei pH 5,8 verwendet, beide bei 4,46 U/g TS und mit 40 ppm vorhandenem Ca&spplus;&spplus;. Verflüssigungsbedingungen waren 14 Minuten bei 100ºC oder 105ºC (wie unten angegeben), gefolgt von 4 Stunden bei 90ºC. Nach Verflüssigung wurde Viskosität bei 60ºC mit einem Viskosimeter Haake Rotovisco RV 12 mit NV-Sensorsystem und M500-Meßantriebseinheit bei den entsprechenden Verflüssigungs- pHs gemessen. Ergebnisse sind unten angegeben und in Fig. 6 dargestellt. Enzym Dosierung in U/g TS zugesetztes Ca&spplus;&spplus; primäre verfl. Temp. Viskoaität (CP) bei Antriebsrot. Geschwindigkeit 32 CGTase Termamyl BS-Amylase *) Messung nicht möglich bei dieser Geschwindigkeit
Die Ergebnisse zeigen, daß ein Dosisniveau von 2-5 U/g TS CGTase geeignet ist.

BEISPIEL 6

Verzuckerung von verflüssigter Stärke

Die verflüssigten Stärken von Beispiel 4 wurden auf pH 4,3 oder 4,5 bei 60ºC eingestellt und Dextrozyme 150/50 wurde bei einer Dosierung von 1,2 l/t TS zugegeben. Dextrozyme ist ein Gemisch aus Glucoamylse aus Aspergillus niger und Pullulanase aus Bacillus acidopullulyticus; es ist erhältich von Nova Industri A/S. Verzuckerung wurde für 48 Stunden bei 60ºC durchgeführt und Dextrose wurde mit Bio-Rad Aminex HPX-87C HPLC bestimmt. Enzym % Dextrose CGTase BS-Amylase Termämyl nicht nachweisbar
Die Ergebnisse zeigen gute Verzuckerung aller Stärken, die gemäß der Erfindung verflüssigt worden sind. Die Fähigkeit, die bei pH 4,5 verflüssigte Stärke zu verzuckern, beweist einen klaren Verfahrensvorteil dieser Erfindung gegenüber Verflüssigungen nach dem Stand der Technik mit α-Amylase aus B. licheniformis oder B. stearothermophilus, da im Falle einer Stärkeverflüssigung gemäß der Erfindung geringe oder keine pH- Einstellung vor der Verzuckerung notwendig ist.

BEISPIEL 7

Herstellung von Cyclodextrin bei verschiedenen Stärkekonzentrationen

Die Maisstärke wurde variiert von 15 % bis 40 % TS. Die Aufschlämmungen wurden zunächst verflüssigt bei pH 5,0 ohne zugesetztes Calcium durch eine 14minütige Behandlung bei 105ºC, gefolgt von einem 4stündigen Halten bei 90ºC, unter Verwendung der CGTase (ATCC 53,627) bei einer Dosis von 4,46 Phadebas U pro Gramm TS Stärke. Die Herstellung von Cyclodextrin wurde überwacht nach Fortsetzen des Halteteils des Stärkeverflüssigungsverfahrens, um die enzymhaltige Dextrinlösung für zusätzliche 24 Stunden bei pH 5,0 und 90ºC zu inkubieren. Cyclodextrin-Ausbeuten wurden mit Bio-Rad Aminex Carbohydrate HPX-42A HPLC bestimmt. Ergebnisse: Cyclodextrin-Ausbeute Gamma-CD Gesamt-CD
Es wurde beschlossen, daß eine Anfangsstärkekonzentration von etwa 20-30 % für die Herstellung von Cyclodextrin optimal war, bezogen auf Gesamt-% CD und g CD/100 ml. Eine Konzentration von 25 % TS wurde daher für weitere Beispiele ausgewählt. β- Cyclodextrin wurde primär bei allen Stärkekonzentrationen produziert. Das Verhältnis von β:α:Gamma-Cyclodextrinen betrug 1,0:0,47:0,39 bei 25 % TS. Die höchste beobachtete Ausbeute an Cyclodextrin aus 25 % TS Stärke betrug ungefähr 30 %.
Erneute Dosierung mit dem CGTase-Enzym und Ausdehnen der Reaktionszeit auf 48 Stunden erhöhte die Ausbeuten nicht.

BEISPIEL 8

Herstellung von Cyclodextrin bei verschiedenem pH

Der pH-Effekt auf die Cyclodextrin-Herstellung wurde bestimmt unter Verwendung einer 25 % TS Maisstärkeaufschlämmung. Die Stärkeaufschlämmungen wurden bei den angegebenen pH-Werten verflüssigt, ansonsten aber wie in Beispiel 7, und die verflüssigten Stärken wurden dann 24 Stunden bei 90ºC bei denselben pH-Werten inkubiert.
Die Ergebnisse, die unten dargestellt sind, zeigen, daß pH 5,0 für das kombinierte Verfahren der Stärkeverflüssigung und Cyclodextrinherstellung optimal war. Cyclodextrin-Ausbeute Gamma-CD Gesamt-CD

BEISPIEL 9

Herstellung von Cyclodextrin bei verschiedenen Temperaturen

Der Temperatureffekt auf die Cyclodextrinherstellung mit CGTase der Erfindung (ATCC 53,627) wurde in Abwesenheit von zugesetztem Calcium durch Führen des Inkubationsschrittes für 24 Stunden bei pH 5,0 bei verschiedenen Temperaturen, wie unten angegeben, untersucht. Eine 15 % TS oder 25 % TS Aufschlämmung von Maisstärke wurde zunächst mit der CGTase unter den Bedingungen von Beispiel 7 bei einer Dosis von 4,46 Phadebas U pro Gramm TS Stärke verflüssigt. Ergebnisse: 15 % TS Cyclodextrin-Ausbeute Temperatur ºC Gamma-CD Gesamt-CD 25 % TS Cyclodextrin-Ausbeute Temperatur ºC Gamma-CD Gesamt-CD
Die Ergebnisse zeigen eine Umwandlungstemperatur von 80-90ºC als optimal, sowohl bei 15 % TS als auch bei 25 % TS (nach einer 24stündigen Inkubation). Absenken der Temperatur auf 50ºC lieferte eine geringere Ausbeute.

BEISPIEL 10

Herstellung von Cyclodextrin bei hoher Temperatur mit und ohne erneute Dosieruna von Enzym

Die Möglichkeit, daß Gleichgewicht noch nicht erreicht worden war, wurde bei 90ºC und 95ºC durch erneutes Dosieren der Reaktionsmischungen von Beispiel 9, die 15 % TS Stärke umfassen, mit CGTase vor der 24-Stunden-Inkubation und Fortschreitenlassen der Reaktion für zusätzliche 24 Stunden untersucht. Die Ergebnisse (siehe unten) beweisen, daß bei 90ºC Gleichgewicht erreicht worden war. Bei 95ºC war erneute Dosierung notwendig, um dieselben Ausbeuten an Cyclodextrinen zu erreichen, was auf einen gewissen Verlust einer Enzymaktivität während längerer Inkubation bei 95ºC hindeutet. Cyclodextrin-Ausbeute erneute Dosierung Zeit (Std.) Gamma-CD Gesamt-CD

BEISPIEL 11

Herstellung von Cyclodextrin mit und ohne Calciumzugabe

Der Einfluß von Calcium auf die Cyclodextrinherstellung wurde untersucht. Eine 25 % TS Maisstärkeaufschlämmung wurde mit CGTase der Erfindung (ATCC 53,627) bei pH 5,0 in Gegenwart und Abwesenheit von 40 ppm Calcium bei einer Dosis von 4,46 Phadebas U pro Gramm TS Stärke verflüssigt. Die verflüssigten Stärken wurden dann für 24 Stunden bei 90ºC inkubiert. Die Ergebnisse (siehe unten) zeigen, daß die Gegenwart von Calciumionen keinen Einfluß aüf die Geßamtausbeute hat. Cyclodextrin-Ausbeute Calcium Gamma-CD Gesamt-CD

BEISPIEL 12

Herstellung von Cyclodextrin bei verschiedenen Enzymdosierungen

Der Einfluß des Variierens der CGTase-Dosis auf die Cyclodextrin-Ausbeute wurde unter Verwendung von 25 % TS Maisstärke bestimmt. Die Dosis wurde von 2,23 bis 6,69 Phadebas U pro Gramm TS Stärke variiert. Die Stärke wurde bei pH 5,0 unter Verwendung der oben angegebenen Dosen in Abwesenheit von zugegebenem Calcium mit der CGTase von ATCC 53,627 verflüssigt. Die verflüssigten Stärken wurden dann 24 oder 48 Stunden bei 90ºC, pH 5,0 inkubiert. Andere Bedingungen waren wie in Beispiel 5.
Die Ergebnisse (siehe unten) bewiesen, daß nach 24 Stunden und 48 Stunden die höchsten Ausbeuten bei Dosen von 4,46 und 3,35 Phadebas U pro Gramm TS Stärke erreicht wurden. Cyclodextrin-Ausbeute Dosis, Phadebas U pro Gramm TS Zeit, Stunden Gamma-CD Gesamt-CD

BEISPIEL 13

Herstellung von Cyclodextrin unter Verwendung von Komplexbildner

Der Einfluß von Cyclooctan als einem β-Cyclodextrin- Komplexbildner bei der Umwandlung von Cyclodextrinen wurde untersucht. Eine 25 % TS Maisstärkeaufschlämmung wurde bei pH 5,0 in Abwesenheit von zugegebenem Calcium mit der CGTase von ATCC 53,627 unter den Bedingungen von Beispiel 7 bei einer Dosis von 4,46 Phadebas U pro Gramm TS Stärke verflüssigt. Dann folgte Umwandlung zu Cyclodextrin bei 90ºC für 24 Stunden, aber Cyclooctan wurde bei einem Gehalt von 0,6 Gram pro Gramm TS Stärke vor Beginn der 24stündigen Inkubation zugegeben.
Die Umwandlungsergebnisse (siehe unten) beweisen, daß die Zugabe von Cyclooctan die endgültige Cyclodextrinausbeute erhöhte, insbesondere diejenige von β-Cyclodextrin. 15 % TS Cyclodextrin-Ausbeute Gamma-CD Gesamt-CD Kontrolle Mit Cyclooctan: nichtkomlexiert komplexiert Gesamt

BEISPIEL 14

Herstellung von Cyclodextrin aus verschiedenen Stärken

Ein Vergleich mehrerer Stärken wurde durchgeführt. Aufschlämmungen (25 % TS von Stärke aus Mais, Kartoffeln, Weizen, Reis und Wachsmais wurden bei pH 5,0 in Abwesenheit von zugegebenem Calcium mit CGTase der Erfindung (ATCC 53,627) bei einer Dosis von 4,46 Phadebas U pro Gramm TS Stärke unter den Bedingungen von Beispiel 7 verflüssigt. Die verflüssigten Stärkelösungen wurden dann 24 Stunden bei 90ºC inkubiert.
Die Ergebnisse (siehe unten) zeigten, daß es Unterschiede in der endgültigen Cyclodextrinausbeute gab und daß β- Cyclodextrin das Primärprodukt war, das in allen Fällen gebildet wurde. Cyclodextrin-Ausbeute Stärke Gamma-CD Gesamt-CD Mais Kartoffel Weizen Reis Wachsmais

BEISPIEL 15

Ethanolfermentation von verflüssigter Stärke

Eine 31,5 % TS Aufschlämmung von naß gemahlener Maisstärke wurde mit CGTase der Erfindung (ATCC 53,627) bei pH 5,0 ohne zugegebenes Calcium für 14 Minuten bei 105ºC, gefolgt von 4 Stunden bei 90ºC, verflüssigt. Eine Kontrolle mit Termamyl wurde ebenfalls durchgeführt wie beschrieben, ausgenommen bei pH 6,2 in Gegenwart von 40 ppm Calcium. Die Enzymdosis in jedem Fall betrug 5,0 Phadebas-Einheiten pro Gramm TS Stärke.
Am Ende der Verflüssigung wurde die dünnflüssige Stärke auf 22,4 % TS mit einer Hefe-Nährstoffmischung verdünnt. Die Endkonzentration der Bestandteile in der Nährstoffmischung pro Liter waren 4,0 g Hefeextrakt, 1,6 g Ammoniumphosphat, 0,4 g Magnesiumsulfat, 3,2 g Zitronensäure und 0,6 g Natriumcitrat. Der End-pH betrug 5,2. AMG 200 L (NOVO Laboratories, Inc. Danbury, CT) wurde bei einer Dosis von 0,44 Gew.-%, bezogen auf die Stärke, zugegeben. Penicillin G und Streptomycin- Sulfat wurden bei Gehalten von 200 ug/ml eingeschlossen. Die Fermentationen wurden bei 30ºC, 300 UPM für 64 Stunden inkubiert.
Ethanolproduktion wurde indirekt durch Kohlendioxidproduktion gemessen, d.h. Gewichtsverlust als eine Funktion der Zeit. Die endgültigen Ethanolausbeuten wurden bestätigt durch Bio-Rad Aminex HPX-42A High Performance Liquid Chromatography.
Nach 64 Stunden betrug die Ausbeute an Ethanol, auf der Grundlage der Kohlendioxid-Produktion, 87,3 % und 89,7 % für mit CGTase bzw. Termamyl verflüssigte Stärken. Diese Ausbeuten wurden bestätigt durch Bio-Rad Aminex HPX42A HPLC. Die industrielle Standardausbeute beträgt im allgemeinen etwa 86- 90 %.

BEISPIEL 16

Herstellung von CGTase durch anaerobe Kultivierung von NCIB 40,053-40,059

Stämme NCIB 40,053 bis 40,053 wurden kultiviert, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Kultivierungstemperatur 55ºC betrug.
Das maximale Aktivitätsniveau nach etwa 40 Stunden Inkubation in Phadebas-Einheiten pro Liter Brühe war wie folgt NCIB 40,053: 18, NCIB 40,054: 53, NCIB 40,055: 26, NCIB 40,056: 22, NCIB 40,057: 27, NCIB 40,058: 78 und NCIB 40,059: 10. Die Kulturbrühen wurden zentrifugiert, dann filtriert und schließlich auf eine volumetrische Aktivität von 30-50 Phadebas-Einheiten pro Milliliter unter Verwendung eines Millipore Minitan Systems konzentriert.

BEISPIEL 17

Stärkeverflüssigung mit CGTase aus NCIB 40,053-40,059

Die CGTase-Zubereitungen, hergestellt wie in Beispiel 16, wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen, 35 % TS Maisstärke bei pH 4,5 zu verflüssigen. Die Stärke wurde bei 105ºC für 14 Minuten, gefolgt von 4 Stunden bei 90ºC, bei einer Enzymdosis von 4,46 Phadebas U/g TS (60ºC, pH 6,0) verflüssigt.
Dextrose-Äquivalent (DE) wurde nach Verflüssigung gemessen und die Stärke wurde als verflüssigt eingestuft, wenn der Stärkesirup nach Verflüssigung gießbar war, was eine beträchtliche Verringerung in der Viskosität anzeigte.
Die Ergebnisse zeigten, daß alle CGTasen gute Verflüssigung bei pH 4,5 ähnlich zu der CGTase aus Stamm ATCC 53,627 erzielen konnten. In allen Fällen war praktisch kein DE meßbar, was CGTase-Aktivität anzeigt.
Aminex HPX-42A (Bio-Rad) HPLC unter Verwendung des Brechungsindex zum Nachweis bewies, daß die Wirkungsmuster, produziert aus der Verflüssigung der Maisstärke, typisch für eine CGTase waren, wo die drei Peaks α-, Gamma- und β- Cyclodextrin waren. Es wurden keine wesentlichen Unterschiede im relativen Verhältnis der produzierten Cyclodextrine, verglichen mit der CGTase von ATCC 53,627, beobachtet.

BEISPIEL 18

Verflüssigung mit klonierter CGTase

Eine 35 % TS Maisstärkeaufschlämmung wurde behandelt mit klonierter CGTase, hergestellt wie in Beispiel 2, bei einer Dosierung von 8,92 Phadebas-Einheiten pro g TS bei pH 4,5 ohne zugegebenes Ca&spplus;&spplus;. Düsenbehandlung wurde durchgeführt bei 105ºC für 5 Minuten (Primärverflüssigung), gefolgt von einem Halten bei 95ºC für 2 Stunden oder 90ºC für 4 Stunden (Sekundärverflüssigung). Während der Sekundärverflüssigung bei 95ºC oder 90ºC wurde eine schnelle Verringerung in der Viskosität beobachtet. Bei 90ºC wurde die Viskositätsverringerung über die Zeit unter die Verwendung eines Nametre-Viskosimeters überwacht. Die Ergebnisse bewiesen, daß es eine schnelle Verringerung in der Viskosität auf 400 Centipoise x g/cm³ nach 7 Minuten in die Sekundärverflüssigung hinein gab. Die Wirkungsmuster der verflüssigten Stärken nach Sekundärverflüssigung, nachgewiesen mit Bio-Rad Aminex HPX-42A HPLC, wiesen das charakteristische Cyclodextrinmuster bei beiden Temperaturen nach. DE-Werte von < 1,0 wurden erhalten mit der Neocuproin- Methode, was die Abwesenheit von reduzierenden Endgruppen anzeigt, was mit dem Mechanismus einer CGTase konsistent ist.

BEISPIEL 19

Verzuckerung von verflüssigter Stärke mit klonierter CGTase

Die Stärkelösungen, die mit CGTase bei pH 4,5 in Beispiel 18 verflüssigt worden waren, wurden mit AMG und Dextrozyme bei pH 4,5, 60ºC für 48 Stunden bei einer Dosis van 0,18 AG pro g TS verzuckert. Dextrose-Ausbeuten wurden durch Bio-Rad Aminex HPX-87C HPLC bestimmt. % Ausbeute Enzym Dextrose Sekundärverflüssigung Dextrozyme
Die Ergebnisse zeigen eine gute Ausbeute an Dextrose in allen Fällen. Die höchste Ausbeute wurde erreicht mit Sekundärverflüssigung bei 95ºC und Verzuckerung mit Dextrozyme.

Claims

1. Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase, dadurch gekennzeichnet, daß sie für einen Stamm von Thermoanaerobacter oder Thermanaerobium nativ ist, ein Temperatur-Optimum, gemessen bei pH 5,0, von etwa 95ºC; ein pH-Optimum von etwa 5,0; und eine Restaktivität nach 40 Minuten Inkubation bei 80ºC und pH 5,0 von etwa 95 % in der Abwesenheit von Stärke und Ca&spplus;&spplus; besitzt.

2. Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase nach Anspruch 1, die für Stamm ATCC 53,627 oder einen der Stämme NCIB 40,053 bis NCIB 40,059 nativ ist.

3. Verfahren zur Herstellung einer Cyclodextrin-Glycosyl- Transferase (CGTase), die ein Temperatur-Optimum, gemessen bei 5,0, von etwa 95ºC besitzt; ein pH-Optimum von etwa 5,0; und eine Restaktivität nach 40 Minuten Inkubation bei 80ºC und pH 5,0 von etwa 95 % in der Abwesenheit von Stärke und Ca&spplus;&spplus; besitzt, wobei das Verfahren Kultivierung eines CGTase produzierenden Stammes von Thermoanaerobacter oder Thermoanaerobium unter anaeroben Bedingungen oder Kultivierung eines transformierten Wirtsorganismus, der die passende genetische Information daraus enthält, unter aeroben Bedingungen In einem geeigneten nährstoffhaltigen Medium und danach Gewinnung von CGTase aus dem Fermentationsmedium umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Stamm ATCC 53,627, einer der Stämme NCIB 40,053 bis NCIB 40,059 oder eine Mutante oder Variante derselben ist, der (die) eine Cyclodextrin- Glycosyl-Transferase mit den in Anspruch 1 angegebenen Merkmalen produzieren kann.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Wirtsorganismus ein Stamm von Escherichia, Streptomyces, Bacillus oder Aspergillus ist, vorzugsweise ein Stamm von E.coli, B. subtilis, B. licheniformis oder A. oryzae.

6. Biologisch reine Kultur eines Stammes von Thermoanaerobacter oder Thermoanaerobium, gekennzeichnet durch die Fähigkeit, Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase zu produzieren, die ein Temperatur-Optimum, gemessen bei pH 5,0 von etwa 95ºC; ein pH-Optimum von etwa 5,0; und eine Restaktivität nach 40 Minuten Inkubation bei 80ºC und pH 5,0 von etwa 95 % in der Abwesenheit von Stärke und Ca&spplus;&spplus; besitzt, und dadurch, daß sie nicht freibeweglich ist.

7. Kultur nach Anspruch 6 des Stammes ATCC 53,627, eines der Stämme NCIB 40,053 bis NCIB 40,059 oder einer Mutante oder Variante derselben, der (die) eine Cyclodextrin-Glycosyl- Transferase mit den in Anspruch 1 angegebenen Merkmalen produzieren kann.

8. Stärkeverflüssigungsverfahren, welches umfaßt, daß eine wäßrige Stärkeaufschlämmung enzymatischer Verflüssigung in der Gegenwart der CGTase von Anspruch 1 oder 2 bei einem pH im Bereich von etwa 4,0 bis 5,5 vorzugsweise bei einer Temperatur, die etwa 100ºC übersteigt, unterzogen wird.

9. Stärkeverflüssigungsverfahren nach Anspruch 8, im wesentlichen ohne Zugabe eines Calciumsalzes zur Stärkeaufschlämmung.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die verflüssigte Stärke anschließend enzymatischer Verzuckerung in der Gegenwart von Glucoamylase unterzogen wird, im wesentlichen ohne eine pH-Zwischeneinstellung

11. Verfahren nach Anspruch 10, das außerdem Ethanol- Fermentation mit Hefe gleichzeitig mit oder anschließend an besagte Verzuckerung umfaßt.

12. Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin, das enzymatische Behandlung einer verflüssigten Stärkelösung mit der Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase von Anspruch 1 bei einer Temperatur von über 60ºC und danach Gewinnung eines Cyclodextrin-Produktes aus der Reaktionsmischung umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei besagte Enzymbehandlung für weniger als etwa 24 Stunden durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei besagte verflüssigte Stärkelösung durch enzymatisches Verflüssigen einer Stärkeaufschlämmung mit besagter CGTase erzeugt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei besagte Enzymverflüssigung bei einem pH im Bereich von etwa 4,0 - 5,5 durchgeführt wird und besagte anschließende Enzymbehandlung des Stärkehydrolysats im wesentlichen ohne pH- Zwischeneinstellung durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei besagte Enzymbehandlung des Stärkehydrolysats ohne erneute Dosierung der verflüssigten Stärke mit CGTase durchgeführt wird.

17. Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrln, welches umfaßt, daß eine wäßrige Stärkeaufschlämmung mit der Cyclodextrin-Glycosyl-Transferase von Anspruch 1 bei einer Temperatur von über etwa 100ºC und einem pH im Bereich von 4,0 - 5,5, vorzugsweise im wesentlichen ohne Zugabe eines Calciumsalzes, enzymatisch behandelt wird, der resultierende Sirup danach bei einer Temperatur im Bereich von 80º - 90ºC für nicht mehr als etwa 28 Stunden gehalten wird, wobei der Sirup während wenigstens eines Teils besagter Halteperiode im Bereich 20 - 30 TS liegt, und dann ein Cyclodextrin-Produkt aus der Reaktionsmischung gewonnen wird.