DE2424833A1

DE2424833A1 - Verfahren zur herstellung von maltose

Info

Publication number: DE2424833A1
Application number: DE19742424833
Authority: DE
Inventors: Takashi Adachi; Hidemasa Hidakea; Kanagawa Kawasaki; Yutaka Nakajima; Fumio Sugawara; Chobe Yomoto; Tsukasa Yoshida
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1973-05-22
Filing date: 1974-05-22
Publication date: 1975-05-28
Also published as: JPS5244378B2; BE815415A; JPS505591A; NL163563B; IT1011854B; DE2424833C3; CA1017694A; FR2230726A1; FR2230726B1; NL7406921A; DE2424833B2; IN139775B; NL163563C; US3998696A; GB1433847A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung¹von Maltose durch enzymatische Spaltung verflüssigter Stärke durch Amylase, unter Verwendung einer Kombination aus ß-Amylase und einer solchen, die aus STREPTOMYCES gewonnen wurde.

Maltose ist ein Disaccharid, bei dem zwei Moleküle D-Glukose miteinander über eine a-Bindung vereinigt sind. Sie bildet ein weißes Pulver oder Kristalle, besitzt hohe Wasserlöslichkeit und eine angenehme Süßkraft, die etwa 1/2 bis 1/3 derjenigen von Rohrzucker entspricht.

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Maltose wird als Süßstoff verwendet und etwickelt dabei Eigenschaften, die reinem Rohrzucker überlegen sein können. Weiter findet Maltose Verwendung u.a. als Nährboden in der GährungsIndustrie sowie als Ausgangsmaterial für Maltosederivate wie Maltit usw.

Es ist bereits bekannt, ß-Amylase, Isoamylase oder Pullulanase als industriell brauchbare Enzyme zu verwenden. Weiter ist bekannt, daß a-Amylase als brauchbares Enzym bei der enzymatischen Spaltung von verflüssigter Stärke unter Bildung von Maltose eingesetzt werden kann. Wirken alle diese genannten Enzyme gemeinsam, so bilden Maltose und Maltotriose die hauptsächlichsten Spaltprodukte. Die Bildung von Maltotriose wird mit dem Grad der a-Amylase-Einwirkung stark gefördert, doch kann Maltotriose bekanntlich durch keines der vorgenannten Enzyme hydrolysiert werden.

Zwecks Erzielung einer hohen Ausbeute an Maltose ist es daher erforderlich, bei der enzymatischen Saccharifizierung die Menge entstehender Maltotriose so niedrig als möglich zu halten.

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Bei der gleichzeitigen Einwirkung von a-Amylase und ß-Amylase auf verflüssigte Stärke wird ein Maltosegehalt im Saccharifizierungsprodukt von max. etwa 4o - 7o % beobachtet.

Um zu höheren Maltosegehalten zu gelangen, wurde bisher so verfahren, daß man entweder eine verflüssigte Stärke mit sehr niedrigem Dextroseäquivalent (D), erzeugt durch laufende Kontrolle der a-Amylaseeinwirkung während der Verflüssigung, oder eine durch mechanische Verflüssigung hergestellte Stärke mit ß-Amylase und Isoamlylase saccharifiziert.

Da aber verflüssigte Stärke bereits bei niedriger Konzentration zur "Umkehr" neigt und diese Reaktion mit steigender Konzentration zunimmt, kann ein Produkt mit hohem Maltosegehalt nicht ohne weiteres im industriellen Maßstab aus hochkonzentrierter Stärke gewonnen werden. Man ist daher an den Einsatz relativ niedriger Stärkekonzentrationen gebunden, was sich aber wiederum als Nachteil auf die Produktionsquantität auswirkt.

Schließlich ist es wegen der geringen thermischen Stabilität von Isoamylase, die ebenfalls bei der technischen Saccharifizierung verwendet wird, not-

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wendig, bei Temperaturen von 5ο - 55 C in Gegenwart einer Kombination ß-Amylase/Isoamylase zu arbeiten. Hierbei bilden sich aber in erheblichem Maße Nebenprodukte und Abscheidungen im Endprodukt, die erneut ernsthafte Probleme aufwerfen.

Es wurde nun gefunden, daß hochmaltosehaltige Stoffe erzeugt werden können, ohne daß es zu den vorstehend genannten Nachteilen kommt.

Hierzu wird verflüssigte Stärke in Gegenwart von ß-Amylase und einer weiteren Amylase saccharifiziert, die durch STREPTOMYCES-Stämme gewonnen wurde.

Das neue Verfahren hat gegenüber den bekannten Arbeitsweisen erhebliche Vorteile, die vor allem durch eine verminderte Enzymmenge bei höherer Stärkekonzentration und kürzerer Saccharifizierzeit gegeben sind.

Es hat sich gezeigt, daß eine Substanz mit sehr hohem Maltosegehalt aus Stärke gewonnen werden kann, wenn eine Amylase eingesetzt wird, die durch den Einfluß ganz spezieller Streptomyces-Stämme entstanden ist. Diese Amylase wird bei bestimmten Bedingungen gemeinsam mit ß-Amylase eingesetzt.

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Wie weiter festgestellt wurde, besitzt die aus STREPTOMYCES gewonnene und im vorliegenden Verfahren eingesetzte Amylase eine sehr hohe Maltose-Bildungsaktivität sowie eine erhebliche Stärkeverflüssigungsfähigkeit. Wenden diese Eigenschaften in richtiger Weise mit denjenigen von ß-Amylase kombiniert, so tritt ein synergistischer, die Maltoseausbeute steigernder Effekt ein.

Ein Verfahren zur Herstellung der durch STREPTOMYCES gebildeten Amylase, die für vorliegenden Prozeß geeignet ist, sowie die spezifischen Eigenschaften dieser Enzyme, werden in der FR-Patentanmeldung 71-38545 beschrieben. Im einzelnen sind genannt:

ηq fi 7 2 / 0 9 6 6

Stamm

Zahl der Hinterlegunger F.R.I ATCC

STREPTOMYCES TOASäENSIS SF-1o85 (Dieser Stamm wurde erstmals von der Patentsucherin entdeckt und isoliert)

STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS

SF-1o84

(Dieser Stamm ist identisch mit Streptomyces Hygroscopicius, wie in Waksman, "The Actinomycites", Bd. 2 (1961) und in Applied Microbiology, 1o, 258-263 (1962) beschrieben)

STREPTOMYCES VIRIDOCHROMOGENES

SF-1o87

(Dieser Stamm ist identisch mit Streptomyces viridochromogenes, wie in Waksman, (1.c) und J. Bacteriol., 85, 676-69o (1963) beschrieben).

STREPTOMYCES ALBUS SF-Io89 (identisch mit Streptomyces Albus nach Waksman, "The Actiomycetes", Bd. 2, (1961).

STREPTOMYCES FLAVUS ■ STREPTOMYCES AUREOFACIENS STREPTOMYCES HYGROSCOPICIUS ANGUST' OMYCETES

6o1 6o2

6o3

6o4

6o5

6o6

6o7

21723

21722

21724

21725

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•η _

F.R.f ist eine Abkürzung für "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry of Japan, Inage, Chiba, Japan und ATCC eine Abkürzung für "American Type Culture Collection", Washington, USA-Geeignete Kohlenstoff lief eranten für das Zuchtmedium der genannten STREPTOMYCES-Stämme zur Gewinnung der Amylase sind u.a. verschiedene Stärkearten wie lösliche Stärke, Glukose, Maisstärke usw. Als Stickstofflief eraten eignen sich entöltes Sojamehl, entöltes Leinsamenmehl, Weizenkorn, Erdnußmehl, Fischmehl,
Trockenhefe, entrahmte Milch, Kasein, Malzextrakt, Hefeextrakt, Natrium- und Kaliumnitrat usw. Zusätzlich können dem Medium eines oder mehrere anorganische Salze wie KH₃PO₄, MgSO₄, Mn₂ (SO₄)₃, Fe₂(SO₄J₃ CaCO₃ u.a. zugesetzt werden. Um das Wachstum des Mikroorganismus zu fördern und die Enzymbildung zu steigern, ist auch der Zusatz von Spurenelementen geeignet.

Die Herstellung der STREPTOMYCES Stämme erfolgt in bekannter Weise und unter üblichen Bedingungen, wie sie im allgemeinen für STREPTOMYCES angewendet werden, so daß sowohl flüssig als auch fest kultiviert werden kann, obwohl die Kultivierung in flüssiger Phase und hier insbesondere submers und aerob bevorzugt wird.

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Erfolgt die Inkubation eines der oben genannten Stämme bei einer Temperatur von 25 - 37° C und einem pH-Wert im Bereich zwischen schwach sauer und schwäch alkalisch unter submers-aeroben Bedingungen (Belüften und Rühren), so erreicht die Bildung von Amylase in 3 bis 5 Inkubationstagen ein Maxi-mum.

Für die Gewinnung der erzeugten Amylase wird die Kultur, in der die Inkubation der STREPTOMYCES erfolgt, in bekannter Weise aufgearbeitet. Durch Filtration wird z.B. der Myzelkuchen abgetrennt und das Filtrat durch Zusatz eines anorganischen Salzes ausgesalzt. Ein geeignetes Salz ist z.B. Ammoniumsulfat. Oder es wird durch Fällung mit einem wassermischbaren organischen Lösemittel wie Äthanol, Methanol, Isopropanol, Aceton usw. oder auch durch ein Adsorptions-Eluierverfahren die Amylase abgetrennt. Anschließend kann sie durch Sprühtrocknung, Heißluft-Trocknung, Vakuum-Trocknung, Gefriertrocknung oder ähnliche Verfahren in ein rohes Amylasepulver übergeführt werden.

Eine elektrophoretisch einheitliche und reine Amylase kann durch Reinigung des rohen Pulvers erhalten werden. Hierzu eignen sich bekannte Methoden, wie sie z.B. in der FR-Patentanmeldung 71-38545 beschrieben sind.

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1. Enzymatische Reaktion

Wird ein reines Amylase enthaltendes Produkt aus STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS mit Stärke und Amylase umgesetzt, so werden diese Kohlehydrate hydrolysiert unter Bildung einer kleinen Menge Glukose und einer größeren Menge von Maltosen:

Relative Menge an Zucker

Substrat

Grad der Hydrolyse

Glukose Maltose

Malto-Obligozucker

Stärke
Amylose

74,8 % 78,6 %

3,2 % 0

58,2%
62,8%

38,6 % 34,9 %

) Der Hydrolysengrad wurde bestimmt durch Reaktion der Amylase mit dem Substrat bei pH 5,5 -5,8, 5o C und 2o Std. bei einer Substratkonzentration von 1% (die Amylase wurde in einer Menge, von 5oo Saccharifizier-Einheiten per g Substrat zugesetzt), Messung des Gesamtgehalts an reduzierenden Zuckern nach der Methode von Somogyi, Berechnung des ermittelten Gesamt- Z ucker gehalt als Maltose und anschließend Bestimmung des Hydrolysegrads nach folgender Gleichung:

-Ίο -

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Gesamtmenge an gebildeten reduzierenden Zuckern Hydrolysegrad =.

(berechnet als Maltose) χ

Menge an Stärke (berechnet als Maltose)

Der Begriff "Menge an Stärke berechnet als Maltose" entspricht der vollständigen Substrathydrolyse durch Erhitzen mit genügend 2N HCL auf dem Dampfbad, Neutralisation des Reaktionsgemisches mit NaOH, Bestimmung der Menge gebildeter Glukose nach der Titrationsmethode von Somogyi und Berechnung der Glukose als Maltose, d.h. Multiplikation mit o,95.

++) Die "relative Menge an Zucker" wurde ermittelt durch chromatographische Fraktionierung des hydrolysierten Substrats, daneben Bestimmung der Menge einer jeden Zuckerverbindung und Ermittlung der Verhältnisse untereinander in Gew.-%.

2. Substrat-Spezifikation

Beim Umsatz von gereinigter Amyläse von STREPTOMYCES HYGROSCOPICüS mit verschiedenen Substraten werden folgende Hydrolyseprodukte erhalten:

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Substrat	Saccharifiz ier-	Gebildete Zucker
	Grad⁺⁾	G₁ G₂ G₃ G₄ G₅
Lösliche Stärke	100%
Maisstärke.	92,8%	± +++ ++ + +
Glykogen	45,8%	+++ ++ + +
Amylose	1o6,5%	+++ ++ - +
Dextrin	91,o%	+ +++ ++ + ₊
ß-Cyclodextrin		- +
a-Cyclodextrin		- +
Maltohexaose		++ + +
Maltopentaose		++ ++
Maltotetraose		+ ++ +
Maltotriose		- - - -
Maltose		- - - -
Phenyl-D-Glukoside		— — — —

) Der "Saccharifiziergrad" ist bestimmt durch den Grad der Hydrolyse von löslicher Stärke durch die Einwirkung einer bestimmten Menge gereinigter Amyläse bei 1oo %.

)Die "gebildeten Zucker" wurden analysiert durch Bestimmung der Anwesenheit der jeweiligen Zucker nach der Papier-Chromatographischen Methode im Anschluß an den Umsatz des Enzyms mit dem Substrat bei pH= 5,5, einer Substratkonzentration von o,8 % und einer Enzymkonzentration von o,ooo17 % bei 4o° C während 6o Min.

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In der Tabelle stehen die Buchstaben G.., G„, G₃, G., G₁-für (in der Reihenfolge) Glukose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose und Maltopentaose'. Die Mengen sind durch die Indizes definiert. Es bedeuten: +++ : Ein überwiegender Anteil des jeweiligen Zuckers,

++ : Ein hoher Anteil des jeweiligen Zuckers

+ : Ein erheblicher Anteil des jeweiligen Zuckers

'+ : Nur Spuren des Zuckers nachweisbar

- : Kein Zucker nachweisbar

Die Amylase gemäß vorliegender Anmeldung wurde in ähnlicher Weise mit anderen Substraten umgesetzt und zwar mit Laminaren (Araban ß-1,3 : ß-1,6 - 7 : 3), Pachyman (ß-1,3) und Dextran (a-1,6). Dabei zeigte sich, daß diese Glukane durch die Einwirkung der erfindungsgemäßen Amylase nicht hydrolysiert werden.

3. Optimaler pH, stabiler pH und andere Eigenschaften

Die neue, gereinigte Amylase von STREPTOMYCES HYGROS-COPICUS zeigt folgende Eigenschaften:

Optimaler pH für Aktivität: 4,5-5,ο Optimale Aktivitätstemperatur: 5o-6o° C

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pH-Stabilität:

Thermische Stabilität:

Spezifische Aktivität: Elementaranalyse.:

Molekulargewicht:

"UV-Ab sorption: Isoelektrischer Punkt:

Elektrophorese ( in Cellulose-Acetat-Gel):

restliche enzymatisch^ Aktivität nach Behandlung des Enzyms bei 4o C während 60 Min. bei pH = 4,5 - 9,8, nicht unter 9o% der ursprünglichen Aktivität

restliche enzymatische Aktivität nicht unter 5o% nach 15 Min. Behandlung bei pH = 6,8 und 3o 95° C

Verflüssigungsstärke: 23100 ,u/mg. N Saccharifxzierpotential: 59oo ,u/mg. N

C 44,87%
H 6,84%
N 13,84%

ca. 35.OOO (bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode) ·

1% ' =13,1, bei 280 m,u (pH = 6,

I OiH /

Etwa bei pH = 4,3 (gemessen durch Elektrophorese)

8)

Wanderung von 2,2cm zum positiven Pol während 65 Min. bei einem Strom von 0,8 mA/cm, gepuffert bei pH = 8,7 durch Tris-HCL Puffer Lösung ( ,u = o,oo5)

Grundlage des neuen Verfahrens ist die Tatsache, daß eine verflüssigte Stärke mit ß-Amylase reagiert, wobei die Amylose- und Amylopektin-Ketten abgebaut werden. Anschließend werden weitere Kettenglieder durch den Einfluß der STREPTOMYCES-AMYLASE zu Ende hydrolysiert.

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Da die Reaktionsgeschwindigkeit der beiden Amylasetypen verschieden ist, kann die STREPTOMYCES-AMYLASE gleichzeitig mit der ß-Amylase oder auch während oder nach der Einwirkung der ß-Amylase zugeführt werden, ohne daß die Gesamtreaktion hierdurch beeinflußt wird.

Wird eine stark verzweigtkettige Stärke als Substrat verwendet, so kann durch zusätzliche Isoamylase die Saccharifizierung der Stärke günstig gesteuert werden.
Nachfolgend wird der Verlauf der Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung am Beispiel der Bildung von Maltose durch Einwirkung von ß-Amylase und anschließende Behandlung mit STREPTOMYCES-AMYLASE im einzelnen beschrieben.

Zunächst muß die Stärke verflüssigt werden, da die gewöhnlich infrage kommenden Stärkematerialien für Stärkehydrolysate, wie Getreidestärke, Kartoffelstärke, Süßkartoffelstärke, Tapiokastärke, Reisstärke, Weizenstärke sowie deren a-Inversionsprodukte direkt nicht verwendbar sind. Geeignete Verflüssigungsverfahren sind mechanische Einwirkung zusammen mit Erhitzung sowie übliche enzymatische Verfahren mit a-Amylase oder STREPTOMYCES-AMYLASE .

Zweckmäßig ist ein Kettenabbau gemäß einem DE-Wert von möglichst unter 4, doch ist ein DE-Wert unter 1o nicht von entscheidendem negativem Einfluß auf den Verlauf
des Verfahrens.

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Nach beendeter Verflüssigung wird die Lösung gekühlt. Hierbei soll ein Temperaturbereich eingestellt werden/ der bei etwa 45 - 65° C liegt, was für die Reaktivität von ß-Amylase besonders günstig ist. Dann wird der pH auf 4,5 - 6,ο eingestellt und die ß-Amylase zugegeben. Die Reaktionszeit richtet sich nach der Menge eingesetzten Enzyms, der" Reaktionstemperatur und dem pH.

Die Einwirkung der ß-Amylase kann entweder bis zum maximalen Abbau oder weniger geführt werden. Hierbei stellt sich im allgemeinen ein Maltosegehalt von rund 6o% ein. Anschließend wird der Abbau der Stärke durch Einwirkung der STREPTOMYCES-AMYLASE fortgesetzt. Dabei kann man die noch vorhandene ß-Amylase vorher entweder zerstören oder auch in der Lösung belassen.

Im allgemeinen liegt die Menge eingesetzter STREPTOMYCES-AMYLASE bei 2oo - T5oo Einheiten /g Stärke bei einer Reaktionstemperatur von 45 - 65 C und einem pH von 5,ο - 7,ο.

Die Aktivitätseinheit des Enzyms wird wie folgt bestimmt:

Eine Mischung aus 1 ml Enzymlösung, 2 ml 2%iger Stärkelösung und 2 ml Mcllvaine-Puffer vom pH- 5,5 wurde während 3 Min. bei 4o° C inkubiert. Durch überführen von 1 ml der Mischung in Somogyi's Reagenz wurd die Reaktion gestoppt, die Menge erzeugter reduzierender Zucker nach der Titratiqnsmethode von Somogyi bestimmt und als Maltose in der

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— I D —

gesamten Lösung von 5 ml berechnet. Eine Einheit entspricht der Enzymmenge, die in 60 Min. 1 mg Maltose erzeugt.

In der Praxis liegt die Saccharifizierungszeit bei 72 Std., nach welcher Zeit ein Umsatz von 8o-9o% Maltose erreicht wird. Nach beendeter Saccharifizierung wird die Lösung durch Aktivkohle und Ionenaustauscher entfärbt und gereinigt. Anschließend folgt dann die Konzentrierung auf die gewünschte Stärke.

Beispiel 1

6 kg Süßkartoffel-Stärke, enthaltend 16 % Wasser, wurden in 11 Liter Wasser suspendiert, d^r pH auf 6,0 eingestellt und die Stärke bei 87° C mit 1o Einheiten /g Stärke einer verflüssigenden Amylase behandelt. Nach Inaktivierung der Amylase durch Verkochen lag der DE-Wert bei 3,6.

Die Lösung wurde auf 55 C gekühlt und durch Zugabe von 15 Einheiten ß-Amylase /g Stärke während 4 Std. saccharifiziert. Dann wurde die teilsaccharifizierte Lösung zwecks Inaktivierung der ß-Amylase gekocht und erneut auf 55° C abgekühlt. Während der pH der Lösung auf 6,0 gehalten wird, wurden 12oo Einheiten STREPTOMYCES-AMYLASE /g Stärke zugesetzt und die Saccharifizierung im Verlauf von 7o Std. zu Ende geführt.

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Danach wurde erneut gekocht, filtiert und mit A-Kohle bzw. einem Ionenaustauscher entfärbt und gereinigt. Die Zusammensetzung der Zuckeranteile des Produkts, bestimmt durch Gas-Flüssig-Chromatographie, betrug:

Verfahren	Zusammensetzung	Maltose	des Zuckers
	Glukose		Maltotriose
erfindungsgemäß nach Beispiel 1
(■15 Einheiten ß-Amylase + 15oo		83,6 %
Einheiten STREPTOMYES-AMYLASE)	7,2 %		4,8%
Vergleichsbeispiel
(15oo Einheiten der STREPTOMYCES-		76,4
,AMYLASE allein)	9,4	8,8

Beispiel 2

1oo kg Kartoffelstärke mit 18 % Wasser wurden zu einer 3o % igen wässrigen Suspension verrührt, auf pH=6,o eingestellt und durch 2oo Einheiten STREPTOMYCES-AMYLASE / g Stärke bei 85 C verflüssigt. Die resultierende Lösung wird zwecks Inaktivierung der Amylase mit Dampf behandelt und anschließend mit 15 Einheiten ß-Amylase pro g Stärke während 2 Std. bei pH - 6,ο saccharifiziert. Dabei wurde eine Lösung erhalten, die neben Wasser ca. 62 % Maltose, o,3 % Maltotriose und ?7,7% Dextrin enthielt. Die Lösung wurde auf 55° C gekühlt, mit 15oo Einheiten STREPTOMYCES-AMYLASE pro g Stärke versetzt und weiter für die Dauer von 48 Std. bei pH- 6,ο saccharifiziert. Wie in Beispiel 1 angegeben, wurde entfärbt und gereinigt und auf 75 % konzentriert.

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Nach der gaschromatographischen Analyse setzt sich der Zuckergehalt aus 8,0 % Glukose, 84,5 % Maltose und 5,ο % Maltotriose zusammen.

Beispiel 3

1,4 kg Kornstärke wurden in· 1,5 Liter Leitungswasser suspendiert, verflüssigende Amy läse und Ca(OH)₂ in Mengen von o,3 bzw. o,o2 %f bezogen auf die Stärke, zugegeben, die Lösung auf pH = 6,o eingestellt und in 1,3 Liter heißes Wasser von 9o - 91° C eingegossen. Anschließend wurde die Lösung während 1o Min. auf 12o C erhitzt und durch Zugabe von o,o5 % Amyläse erneut verflüssigt. Nach Beendigung der enzymatischen Reaktion wurde für 5 Min. zwecks Inaktivierung der Amylase auf 1oo° C erhitzt und anschließend auf 55° C gekühlt. Durch Zugabe von ß-Amylase in einer Menge von o,2 % der Stärke wurde zunächst während 4 Std. und dann in Gegenwart von 800 Einheiten STREPTOMYCES-AMYLASE pro g. Stärke während 72 Std. zu Ende saccharifiziert,

Die Lösung wurde wie in Beispiel 1 aufgearbeitet und auf 75 % konzentriert. Die Analyse dieses Endprodukts ergab 4,3 % Glukose, 80,2 % Maltose und 9,5 % Maltotriose.

Das in den Beispielen 1 bis 3 verwendete STREPTOMYCES ENZYM STREPTOMYCES HYGROSCOPICÜS wurde, wie nachstehend beschrieben, hergestellt:

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1oo ml einer Nährkultur aus 2 % Maismehl, 1% Weizenkeim und o,5 % "Ferma Medium" von pH = 7,o wurde in einen 5oo ml Kolben gebracht und sterilisiert. Mit Sporen oder Myzelien von STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS wurde geimpft und anschließend bei 28 C unter Schütteln 24 Std. kultiviert.

2o Liter eines Produktionsansatzes, enthaltend 12 % lösliche Stärke, 3 % Sojamehl und o,2 % KH₂PO₄ sowie einen pH von 7,ο wurden daneben in einer 3o Liter Weithalsflasche sterilisiert, gekühlt und mit der oben bereiteten Impfkultur versetzt. Dann wurden weitere 9o Std. bei 35° C kultiviert. Das Filtrat der erhaltenen Maische wurde auf 1/5 des ursprünglichen Volumens konzentriert und mit der zweifachen Menge kaltem Äthylalkohol das Enzym gefällt. Nach dem Trocknen wurden 77 g Rohenzym, mit 45ooc Einheiten je Gramm, erhalten.

Beipiel 4

Beispiel 3 wurde wiederholt, jedoch bei einer Saccharifiziertemperatur von 6o° C und 48 Std. Dauer. Das erhaltene Produkt bestand aus 4,2 % Glukose, 81,4 % Maltose und 9,2 % Maltotriose.

Bespiel 5

Anstelle des gereinigten Enzyms aus STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS nach Beispiel 4 wurde im=folgenden Beispiel ein

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Enzympräparat aus STREPTOMYCES TOSAENSIS nov. Sp. verwendet. Dabei wurde ein Produkt erhalten, das 4,5 % Glukose, 8o,6 % Maltose und 9,4 % Maltotriose enthielt.

Das entsprechende Enzym wurde nach folgender Vorschrift hergestellt: Sporen oder Myzelien von Streptomyces Tosaensis nov. Sp. wurden in- 1oo ml einer Einzelkultur eingeimpft, die aus 2% Maismehl, 1 % Weizenmehl und o,5 % "Ferma Medium" bestand. Bei einem pH von 7,ο wurde anschließend in einem 5oo ml Kolben unter Schütteln bei 28° C während 24 Std. mit Belüftung kultiviert.

Die erhaltene Keimkultur wurde in 2o Liter einer Produktionsmaische eingerührt, die 8,4 % Maismehl, 2 % Polypepton und o,2 % KH₂PO₄ enthielt und einen pH von 7,o aufwies.

Kultiviert wurde anschließend bei 28° C während 85 Std. unter Schütteln und Belüften.

Das Filtrat des Nährbodens wurde dann bei einer Temeratur unter 4o° C und im Vakuum auf 1/5 des ursprünglichen Volumens eingedampft und mit der zweifachen Menge kaltem Äthylalkohol versetzt. Die erhaltene Amylase wurde getrocknet und schließlich 28 g eines Rohproduktes gewonnen, das etwa 22.000 Einheiten pro g enthällt.

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Beispiel 6

In diecem Beispiel wurde STREPTOMYCES ALBUS verwendet. Erhalten wurde bei gleicher Arbeitsweise wie in Beispiel 4 ein Produkt, das 3,9 % Glukose, 81,ο % Maltose und 9,ο % Maltotriose enthält.
Bedingungen für die Herstellung des Enzyms:

Einzelkultur aus 2 % Maismehl, 1 % Weizenkeim,
und o,5 % "Ferma Medium", pH=7,o. Nach Sterilisation wurde mit STREPTOMYCES-ALBUS-Sporen geimpft und bei 28°/24 Std. unter Schütteln kultiviert.

Diese Einzelkur wurde mit 2o Liter einer Stammlösung vereinigt, die 9,4 % Stärke, 1,3 % Fisch-, mehl und o,2 % KH₂PO₄ (pH-7,o) enthielt. Bei 35° 9o Std. wurde dann zu Ende kultiviert.

Nach Eindampfen des Filtrats r.uf 1/5 wurde mit der zweifachen Menge kaltem Äthanol gefällt und nach dem Trocknen 53 g Rohenzym mit 10.000 Einheiten pro g gewonnen.

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Claims

P atentanspruche

1. Verfahren zur Herstellung von Maltose durch enzymatische Spaltung verflüssigter Stärke, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltung durch ß-Amylase und Streptomyces-Amylase gleichzeitig oder unabhängig voneinander erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Amylase erzeugende Streptomyces eine solche aus der Gruppe Streptomyces Hygroscopicus, Streptomyces Viridochromogenes, Streptomyces Aureofaciens, Streptomyces Flavus, Streptomyces Hygroscopicus var. Angustomycetes, Streptomyces Albus oder Streptomyces Tosaensis nov. Sp. verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als verflüssigte Stärke eine solche verwendet wird, die aus Kartoffel-Stärke, Süßkartoffel-Stärke, Tapioka-Stärke, Weizenstärke, Reisstärke, deren a-Stärken oder Mischungen dieser Stärken gewonnen wurde.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die verflüssigte Stärke durch den gleichzeitigen Einsatz von ß-Amylase und Streptomyces-Amylase saccharfiziert wird, wobei 2oo bis 15oo Einheiten Streptomyces-Amylase pro g Stärke verwendet werden.

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharifizierung bei 45 bis 65° C, einem ρ von 4,5 bis 7,ο und einer Reaktionszeit von 72 Std. durchgeführt

wird. ·

6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine verflüssigte Stärke mit einem DE-Wert von unter To, insbesondere unter 4 zum Einsatz kommt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung von Streptomyces Hygroscopicus, Streptomyces Tosaensis nov. Sp. oder Streptomyces Albus eine verflüssigte Stärke verwendet wird, die aus Kartoffelstärke Maisstärke, Süßkartoffelstärke, T?.pickastärke, Weizenstärke, Reisstärke, deren a-Stärken oder Gemische dieser Stärken gewonnen wurde.

8. Verfahren zur Herstellung von Maltose nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die verflüssigte Stärke zunächst mit ß-Amylase und anschließend mit 2oo - 15oo Einheiten Streptomyces-Amyläse pro g Stärke saccharifiziert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharifizierung durch ß-Amylase bei einem ρ von etwa 4,5 - 6,ο und die Saccharifizierung durch Streptomyces-Amylase bei p„ = 5,ο - 7,ο sowie einer Gesamt-Reaktionszeit von nicht mehr als 72 Std. erfolgt.

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