DE3332639C2 - Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose durch Kultivieren eines zum Genus Bacillus gehörenden, Maltopentaose bildenden Mikroorganismus in einem Medium und Isolieren der auf diese Weise angereicherten Maltopentaose aus der Kulturbrühe. Ein typisches Beispiel für den Maltopentaose bildenden Mikroorganismus ist Bacillus cereus NY-14. Dieses Verfahren erlaubt die Herstellung von Maltopentaose ohne Verwendung von Amylase wie in konventionellen Verfahren. Maltopentaose ist beispielsweise geeignet als Substrat für die Bestimmung von Serumamylase.

Description

1) Morphologische Eigenschaften

1) Form und Größe der Zelle

;., Zellen, die in einem 0,S%lgen Natrlumchlorld-Bouillon-Medlum 24 Stunden lang bei 30° C unter aeroben

Bedingungen kultiviert wurden, sind lange Stabchen mit einer Größe von 1 um χ 3,0 bis 4,0 μιη, die einzeln oder in Form von kurzen Ketten aus zwei oder mehr. In einigen Fallen aus S oder 6 derselben, vorliegen.

2) Motlluat

■ö Keine Motllltät; keine Flagellen.

3) Sporenbildung

Die Spore 1st elllpsenformlg, hat eine Größe von 0,7 bis 0,8 μιη und liegt Im Zentrum oder Im Parazentrum vor. Das Sporangium 1st nicht gequollen.

4) Gramverfärbung
4,1 Positiv

II) Kulturelgenschaften

1) Boulllon-Agarplatten-Kultur (48 Stunden bei 30° C)

4s Es breiten sich Kolonien aus. Die Oberflache Ist flach und rauh, der Rand 1st ohrförmlg und dendritisch

weiß.

2) Boulllon-Agar-Schrägkultur (48 Stunden bei 30° C)

Reichliches Wachstum. Die Oberflache Ist rauh, opak und auslaufend. Der Rand Ist lappig. Nichtklebrig.

3) Boulllon-Stab-Kultur (5 Tage bei 30° C)

5» Reichliches Wachstum über die gesamte Oberflache. Wachstum nur entlang der Linie des Stabes.

4) Bouillonbrühe (5 Tage bei 30° C)

Gutes Wachstum. Die Flüssigkeit 1st transparent und es entstehen Sedimente. Es wird keine Haut gebildet. Es entsteht ein leicht aufgehender Ring. Es wird kein Pigment gebildet.

5) 5%Ige Natrlumchlorld-Boulllon-Agarplatten-Kultur (48 Stunden bei 30° C)

„ Kolonien mit unregelmäßiger Form. Die Oberfläche 1st flach und rauh. Der Rand 1st ohrförmlg und

dendritisch weiß. Es entsteht keine kommaförmlge Kolonie.

6) 0,5%lge Natriumchlorid-Boulllon-Agar-Schrägkultur (48 Stunden bei 30° C)

Reichliches Wachstum. Die Oberfläche ist rauh, opak und auslaufend. Der Rand Ist gelappt. Nicht-klebrig.

7) 0,5*lge Natrlumchlorld-Boulllon-Stabkultur (5 Tage bei 30° C)

(,„ Reichliches Wachstum über die gesamte Oberfläche. Wachstum nur entlang der Linie des Stabes.

8) 0,5%lge Natrlumchlorld-Boulllonbrühe (5 Tage bei 30° C)

Gutes Wachstum. Die Flüssigkeit Ist trübe und es entstehen Sedimente. Es bildet sich weder eine Haut noch ein Pigment.

9) Mllch-Agar-Ausstrlchplatte (24 Stunden bei 30° C)
Die Zone der Hydrolyse von Casein 1st breit.

10) Boulllon-Gelatlne-Stabkultur (7 Tage bei 20° C)

Es tritt eine schnelle Vei flüsslgung In Kraterform oder Streifenform auf. III) Physiologische Eigenschaften

1) Reduktion von Nitrat zu Nitrit: positiv

2) Voges-Proskauer-Test: positiv

3) Methylrottest: positiv s

4) Ausnutzung von Citrat: positiv

5) Indolblldung: negativ

6) Schwefelwasserstoffbildung, positiv

7) Ammonlakbildung: positiv

8) Mllchreaktlon: Koagulation

9) Catalase: positiv

10) Wachstumsbereiche: pH-Wert 5,2 bis 10,2. Temperatur 7 bis 37° C

11) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob und Bildung von Glucose unter anaeroben Bedingungen

12) O-F-Test: zersetzt Saccharld (Glucose), bildet Säure unter anaeroben Bedingungen

13) Wachstum In einer Sabouraud-Dextrose-Kulturbrühe/Schrägagar-Kultur positiv is

14) Bildung von Saure und Gas aus Kohlehydraten: wächst nicht In D-Xylose, L-Arablnose, L-Rhamnose, Mannit, D-Rafflnose, Glycerin, D-Galactose, D-Mannose, Lactose und Saccharose.

Wächst In löslicher Stärke, D-Glucose, D-Fructose, Trehalose, SaIIcIn und Maltose, bildet Saure, jedoch kein Gas.

15) Wachstum In 0,001* Lysozym: positiv

16) Wachstum In 0,02% Azid: positiv

17) Wachstum In 7% NaCI: positiv

Als Ergebnis einer vergleichenden Untersuchung Im Hinblick auf die obengenannten Eigenschaften unter Bezugnahme auf das Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage (1974), wurde dieser Stamm als Bacillus cereus Identifiziert und als Bacillus cereus NY-14 benannt. Dieser Stamm wurde hinterlegt Im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-329.

Bei der Herstellung von Maltopentaose nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der vorstehend beschriebene Stamm in einem Medium kultiviert, das durch bekannte Mikroorganismen assimilierbare Nährstoffe enthält. Im einzelnen werden zur Herstellung von Maltopentaose benötigt: Polysaccharide mit einer a-1,4-glucosldlschen Bindung, wie z. B. verschiedene Stärken, wie Kartoffelstarke, Malsstarke, Reisstärke, Gerstenstarke, Weizenstarke und Batatenstärke (Süßkartoffelstärke); lösliche Starke; Amylopectin; Amylose, Dextrin und Mischungen davon. Das zur Kultivierung von Bacillus cereus FERM BP-329 verwendete Medium enthalt daher eines oder mehr dieser Polysaccharide und außerdem sind zu seinem Wachstum verschiedene andere Zusätze erforderlich, wie z. B. eine organische oder anorganische Stickstoffquelle, organische oder anorganische Salze und Vitamine.

Um eine maximale Bildung der gewünschten Maltopentaose zu erreichen Ist es zweckmäßig, wenn der pH-Wert 5,5 bis 9,0, vorzugsweise 7,0 bis 8,0 beträgt, die Kultivierungstemperatur 20 bis 37° C, vorzugsweise 25 bis 30° C, beträgt und die Kultivierungsdauer 24 bis 168 Stunden, vorzugsweise 48 bis 72 Stunden, beträgt. Vorzugsweise wird die Kultivierung unter aeroben Bedingungen durchgeführt.

Die dem Medium zugegebene Polysaccharidmenge beträgt 0,5 bis 40%, vorzugsweise 2,5 bis 4%. Die Bildung von Maltotetraose, Maltohexaose und dgl. als Nebenprodukte wird stark herabgesetzt, wenn die Menge innerhalb des bevorzugten Bereiches liegt.

Die Abtrennung der Maltopentaose von der Kulturbrühe nach der Kultivierung und ihre Reinigung können unter Anwendung geeigneter bekannter Methoden erfolgen. So wird beispielsweise die Kulturbrühe unter Anwendung Irgendeines geeigneten Verfahrens filtriert, wobei man ein Flltrat erhält, und das Flltrat wird dann einer chromatographischen Behandlung, beispielsweise einer Gelfiltration und einem Ionenaustausch, unterworfen, wobei man ein gereinigtes Maltopentaose-Produkt erhält.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie es vorstehend beschrieben worden Ist, kann Maltopentaose wirksam hergestellt werden, ohne daß dabei Probleme auftreten, wie z. B. eine zusätzliche Stufe zur Herstellung von Amylase wie bei dem konventionellen Verfahren und Schwierigkelten bei der Reinigung. Die vorliegende Erfindung erlaubt die Massenproduktion von Maltopentaose und vergrößert Ihr Anwendungsgebiet.

In den nachfolgenden Beispielen wurde die Kohlenhydratmenge nach dem Phenol-Schwefelsaure-Verfahren bestimmt und sie 1st berechnet als Glucose angegeben.

Die Saccharldanalyse wurde unter Anwendung der folgenden papierchromatographlschen Analyse durchgeführt:

Eine gegebene Menge einer Saccharld enthaltenden Lösung wurde auf ein Filterpapier Nr. 50 (19 cm χ 19 cm) aufgetropft und zweimal In einer geschlossenen Kammer bei 70° C nach der aufsteigenden Methode mit 65% n-Propylalkohol als Lösungsmittel entwickelt. Nach der Entwicklung wurde jedes Ollgosaccharld durch 30mlnütlge Behandlung mit Glucoamylase bei 40° C hydrolysiert und mittels der Silbernitrat-Tauchmethode nachgewiesen.

Die Menge an gebildeter Maltopentaose wurde wie folgt gemessen:

Die Kulturbrühe wurde auf die gleiche Welse wie bei der Saccharldanalyse paplerchromatographisch entwlkkelt und danach wurde sie einer Glucoamylasebehandlung unterworfen. Ein der Maltopentaosefraktlon entsprechender Teil wurde entnommen und 15 min lang bei 10O⁰C mit heißem Wasser extrahiert. In dem auf diese Weise erhaltenen Extrakt wurde die Maltopentaosemenge (berechnet als Glucose) unter Anwendung des Phenol-Schwefelsaure-Verfahrens gemessen.

Beispiel 1

10 ml eines Mediums (pH 8,0), das 3,5% lösliche Starke, 1% Pepton und 0,5% NaCl In Leitungswasser enthielt,

wurden In ein Reagenzglas (Durchmesser 21 mm. Länge 210 mm) gegeben und 10 MIn. lang bei 121° C sterilislert. Aus dem Schrägagar wurde Bacillus cereus FERM BP-329 entnommen und In ein .Reagenzglas Inokuliert.

Die Inkubation wurde 24 Stunden iang bei 30° C auf einem Rüttler (250 Schläge pro Minute, Amplitude 20 mm)

durchgeführt.

Nach der Inkubation wurde die Kulturbrühe mit 15 000 UpM bei 4° C zentrifugiert, um die Bakterienzeilen za entfernen. In der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit betrug die Maltopeniaose-Konzcntratlon 9,0 mg pro ml und 37% der restlichen Saccharide konnten als Maltopentaose angereichert werden und die Kohlenhydraikonzentration betrug 24,1 mg/ml.

Die paplerchromatographlsche Analyse bestätigte, daß Maltopentaose In Form eines einzelnen Fleckes vorlag. 10 ml der oben erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurden gelchromatographisch an einer Kolonne mit Acrylamldgel kenzentriert und dann gefriergetrocknet, wobei man 50 mg Maltopentaose in Form eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei diesmal 2,5% jedes Polysaccharide, wie In der Tabelle I angegeben, anstelle der löslichen Stärke verwendet wurden. Die Ergebnisse sind ebenfalls In der Tabelle I angegeben. Die Maltopentaose-Ausbeute betrug 40 bis 60%.

Tabelle I

KohlenstofFquelle	Kohlenhydrat- konzentrsiion (mg/ml)	Maltopentaose- konzentration (mg/ml)	Verhältnis (%)
Amylose (Kartoffel)	0,5	-	-
Amylose (DP = 17)	15,2	7,8	51
Amylose (DP = 100)	2,8	2,2	79
Amylopectin (Kartoffel)	20,5	7,7	38
Dextrin	24,3	5,2	21
	Beispiel 3

101 eines Mediums (pH 8,0), das 2,5% lösliche Stärke, 1% Pepton und 0,5% NaCl enthielt, wurden In einen 30-1-FermentatlonskoIben eingeführt und 10 MIn. lang bei 121° C sterilisiert. Als Inokulum für den 30-l-Fermentatlonskolben (Rotation des Propellers mit 150 UpM und Belüftung mit 101/Mln.) wurden 100 ml einer Suspension von Bacillus cereus FERM BP-329, der vorher In dem gleichen Medium wie oben kultiviert worden war, verwendet.

Nach 48stündlger Inkubation bei 30° C wurde die Kulturbrühe mit 6000 UpM bei 4° C zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu entfernen. In der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit betrug die Kohlenhydratkonzentratlon 16,4 mg pro ml und die Maltopentaosekonzentratlon betrug 6,2 mg pro ml und 38% der restlichen Saccharide konnten als Maltopentaose angereichert werden.

11 der oben erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurden auf die gleiche Welse wie In Beispiel 1 behandelt, wobei man 3,5 g Maltopentaose In Form eines weißen Pulvers erhielt.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus cereus FERM BP-329 in einem Medium, das ein Polysaccharid mit einer a-l,4-glucosidlschen Bindung enthalt, kultiviert zur Anreicherung von Maltopentaose in der Kulturbrühe und die Maltopentaose daraus isoliert.

   in Maltopentaose wurde bisher hergestellt durch Hydrolyse von Stärke oder Amylose unter Verwendung verschiedener Amylasen. Dieses Herstellungsverfahren hat jedoch den Nachteil, daß die zu seiner Durchführung erforderlichen Amylasen hergestellt werden müssen und daß das erhaltene Hydrolysat große Mengen an anderen Maltooligosacchariden als Maltopentaose enthalt, wodurch die Reinigung von Maltopentaose sehr erschwert wird.

   : Maltopentaose wird heutzutage in großem Umfang verwendet, beispielsweise als Substrat für die Bestimmung von Serumamylase. Es Ist daher mit einer Massenproduktion von Maltopentaose zu rechnen. Wie vorstehend angegeben, kann diese nach dem konventionellen Herstellungsverfahren jedoch nicht realisiert werden.

   Im Rahmen der Erfindung hat es sich nun gezeigt, daß sich beim Kultivieren bzw. Züchten von Bacillus cereus FERM BP-329, isoliert aus Erdboden, In einem Medium, das z. B. lösliche Starke als Kohlenstoffquelle

   :,, enthalt, unter aeroben Bedingungen, in der Kulturbrühe eine große Menge Maltopentaose anreichert.

   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß von man Bacillus cereus FERM BP-329 in einem Medium, das ein Polysaccharid mit einer a-l,4-glucosidischen Bindung enthalt, kultiviert zur Anreicherung von Maltopentaose in der Kulturbrühe und die Maltopentaose daraus isoliert.
   Die mikrowellen Eigenschaften von Bacillus cereus FERM BP-329 sind folgende: