DE3714544A1 - Glucosedehydrogenase und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Glucosedehydrogenase mit hoher Reaktivität und Substratspezifität gegenüber Glucose und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Glucosedehydrogenase ist ein Enzym, welches die Reaktion:

β-D-Glucose + NADP⁺ → D-Glucono-δ-lacton + NADPH + H⁺

katalysiert.

Im Feld der klinischen Chemie wird seit kurzem die quantitative Bestimmung von Glucose in Probematerial angewandt, wobei man sich der obengenannten enzymatischen Reaktion bedient. Der Bedarf nach Glucosedehydrogenase ist deshalb ansteigend.

Bis jetzt ist ein Verfahren zur Herstellung von Glucosedehydrogenase durch Mikroorganismen, z. B. Bacillus megaterium (ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 58-2 01 985), Bacillus cereus (ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 57-16 693) und Acetobacter, Acinetobacter, Gluconobacter oder Pseudomonas (ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 59- 25 700) bekannt. Diese Verfahren haben allerdings einige Nachteile. Zum Beispiel ist die Substratspezifität der Glucosedehydrogenase aus Gluconobacter so weitgestreut, daß der Vergleichsaktivitätswert gegenüber 2-Deoxyglucose 227 und gegenüber Mannosamin 95 beträgt, im Vergleich zu Glucose mit einem Wert von 100 (Enzym Handbuch, S. 43, Asakura Pub. Co., Tokyo, 1983).

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine neuartige Glucosedehydrogenase mit hoher Reaktivität und Substratspezifität gegenüber Glucose sowie ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.

Die Erfindung betrifft Glucosedehydrogenase, gekennzeichnet durch folgende biochemische Eigenschaften:

• (1) Enzymwirkung:
  Katalyse der Reaktion, bei welcher aus Glucose und NADP Glucono-δ-lacton und reduziertes NADP entsteht, und
• (2) Substratspezifität:
  Spezifität gegenüber Glucose ohne Substratspezifität gegenüber 2-Deoxyglucose.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Glucosedehydrogenase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen die Glucosedehydrogenase produzierenden Mikroorganismus der Art Cryptococcus in einem Nährmedium züchtet und die dabei entstehende Glucosedehydrogenase aus dem Kulturmedium isoliert.

Der die Glucosedehydrogenase erzeugende Mikroorganismus kann aus der Gruppe der Mikroorganismen der Art Cryptococcus bestehen und ist vorzugsweise Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM P-8709.

Die taxonomischen Eigenschaften des obengenannten Stammes sind:

• 1. Wachstum auf verschiedenen Medien:
  • (1) YM-Flüssigmedium:
    Nach 3tägiger Züchtung bei 25°C entstehen vegetative Hyphen von kugeliger bis elliptischer Form von 2 ∼ 5 × 4 ∼ 5 µm. Das Wachstum besteht in multipolarem Keimen. Es entsteht eine weiße pulverige Fällung. Vom fünften Tag der Züchtung an bildet sich eine ringförmige Haut.
  • (2) YM-Agarmedium:
    Rundkolonie mit vollständig ausgebildetem Rand, mit konvexen Ausbuchungen, glatter Oberfläche, glänzendem Aussehen, butterartiger Konsistenz und weißer Farbe.
  • (3) Ausstrichkultur auf Kartoffelextrakt-Agarmedium:
    Keine Ausbildung von Pseudomycel.
• 2. Ausbildung von Ascosporen: -
• 3. Ausbildung von Ballistosporen: -
• 4. Physiologische Eigenschaften:
  • (1) Optimale Wachstumsbedingung:
    pH 5 ∼ 9, bei 24 ∼ 30°C.
  • (2) Wachstumsbereich:
    pH 4,5 ∼ 11,5, bei 19 ∼ 33°C.
  • (3) Assimilation von Nitrat: -
  • (4) Fettabbau: -
  • (5) Harnstoffabbau: +
  • (6) Gelatineverflüssigung: -
  • (7) Osmophilie oder Osmotoleranz: -
  • (8) Carotinbildung: -
  • (9) Bildung organischer Säure: -
  • (10) Bildung von stärkeähnlicher Substanz: -
  • (11) Wachstum auf vitaminfreiem Medium: + W
• 5. Nutzung von Kohlenstoffquellen:
  Fermentativ:
  D-Glucose- D-Galactose- Maltose- Sucrose- Lactose- Raffinose- Assimilationsfähigkeit:
  D-Arabinose+ S L-Arabinose+ D-Ribose+ D-Xylose+ W D-Glucose+ D-Mannose- D-Galactose- D-Rhamnose+ D-Fructose- L-Sorbose- Maltose+ Sucrose+ Lactose- Melibiose- Cellobiose- Trehalose+ Raffinose+ Melezitose+ α-Methyl-D-glucosid+ Arbutin+ Dextrin- lösliche Stärke+ W Inulin+ W Ethanol± Adonit± Erythrit- Inosit+ D-Mannit+ D-Sorbit+ Dulcit- D-Gluconat- Glycerin- 2-Keto-D-gluconat+ DL-Lactat- Succinat- Citrat-

Ein vorstehend beschriebener Mikroorganismus aus der Gruppe der Hefen wurde aus Bodenproben isoliert, welche Schweinegehegen bei Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken, Japan entnommen wurden. Die genannten Mikroorganismen zeigen multipolares Keimwachstum und bilden keine Ascosporen, Ballistosporen und Pseudohyphen. Inosit wird assimiliert. Aufgrund dieser Charakteristik gehört der Mikroorganismus zur Art Cryptococcus. Aufgrund der physiologischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Mikroorganismus, nämlich des Assimilationsmusters gegenüber Kohlenstoffquellen, fehlender Assimilation von Nitrat, Vitaminbedarf und Ausbleiben des Wachstums bei 37°C, ist dies ein Stamm von Cryptococcus uniguttulatus und wurde als Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 bezeichnet. Dieser Stamm wurde in der permanenten Kultursammlung des Fermentation Research Institute deponiert und mit der Bezeichnung FERM P-8709 versehen.

Die erfindungsgemäße Glucosedehydrogenase kann nach üblichen Enzymherstellungsverfahren unter Verwendung von Hefekultur hergestellt werden. Ein Medium wird mit Hefe inokuliert und im Submers-Belüftungsverfahren bebrütet.

Es werden die für Mikroorganismen-Züchtung üblichen Nährstoffquellen verwendet. Dabei handelt es sich um assimilierbare Stickstoffquellen, wie Mais-Aufguß, Sojamehl, Caseinhydrolysat, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt. Bevorzugte Kohlenstoffquellen bestehen aus assimilierbaren Kohlenstoffquellen, z. B. Kohlehydraten, wie Glucose, Maltose, Sucrose und Lactose, sowie Dextrin, Stärke, Melasse oder ähnlichen.

Die Bebrütungstemperatur hängt ab vom Wachstum der Mikroorganismen und von der Glucosedehydrogenase-Bildung und variiert von 25 ∼ 37°C, wobei etwa 30°C bevorzugt sind. Die Bebrütungszeit hängt von den Bedingungen ab und beträgt gewöhnlich 20 bis 50 Stunden. Die Züchtung sollte beendet werden, wenn der Zustand maximaler Enzymproduktion vorliegt.

Die Glucosedehydrogenase wird aus dem so erhaltenen Kulturmedium isoliert. Beispielsweise wird die Enzymisolierung vorgenommen durch Behandlung des Kulturmediums über Filtration oder Zentrifugierung, wobei das Mycel abgetrennt wird. Das isolierte Mycel wird dann mittels Ultraschall, Französischer Presse (French press) oder mechanischem Aufschluß mit Glaskugeln behandelt oder wird mit einem organischen Lösungsmittel autolysiert, wobei eine Roh-Glucosedehydrogenase- Lösung erhalten wird. Die Roh-Enzymlösung wird 10 bis 30 min auf 50°C erhitzt und unmittelbar danach zur Abtrennung der überstehenden Lösung zentrifugiert. Eine weitere Reinigung kann durch Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex A-25, DEAE- Sepharose, CM-Cellulose, CM-Sephadex C-25 oder CM-Sepharose CL-6B und anschließender Behandlung durch Chromatographie an Hydroxylapatit erreicht werden. Gegebenenfalls wird lyophilisiert, um das gereinigte Glucosedehydrogenasepulver zu erhalten.

Das folgende, nicht einschränkende Beispiel veranschaulicht die Erfindung.

Beispiel Herstellung von Glucosedehydrogenase durch Züchtung von Cryptococcus uniguttulatus Y 0033:

• (i) 100 ml eines wäßrigen Mediums, enthaltend 0,5% Hefeextraktpulver, 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Glucose, 0,15% KH₂PO₄, 0,033% CaCl₂ · 2H₂O, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O und 0,2% NaCl wurden in einem Erlenmeyer-Kolben mit einer Öse voll Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM P-8709 beimpft. Das Gemisch wurde unter Schütteln 50 h bei 30°C bebrütet. Die Kulturbrühe wurde 10 min bei 4500 Upm zentrifugiert und dabei das Mycel erhalten. Das in 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0, 10 ml) suspendierte Mycel wurde in einem Brown-Homogenisator aufgeschlossen und 10 min bei 15 000 Upm zentrifugiert, um Mycelrückstände zu entfernen. Es wurden 10 ml einer überstehenden Lösung (0,6 Einheiten/ml) erhalten.
• (ii) 100 ml eines wäßrigen Mediums, enthaltend 0,5% Hefeextraktpulver, 1,0% Casein-Säurehydrolysat, 2,0% Sucrose, 0,15% KH₂PO₄, 0,033% CaCl₂ · 2H₂O, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O und 0,2% NaCl wurden in einem Erlenmeyer-Kolben mit einer Öse voll Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM P-8709 beimpft. Das Gemisch wurde 50 h unter Schütteln bei 30°C bebrütet. Die Kulturbrühe wurde in derselben Weise, wie unter (i) vorstehend beschrieben, behandelt. Dabei wurden 10 ml Roh- Enzymlösung (14 Einheiten/ml) erhalten.
• (iii) 100 ml eines wäßrigen Mediums, enthaltend 0,5% Hefe, 1,0% Thunfischextrakt, 1,0% Maltose, 0,15% KH₂PO₄, 0,033% CaCl₂ · 2H₂O, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O und 0,2% NaCl wurden in einem Erlenmeyer-Kolben mit einer Öse voll Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM P-8709 beimpft. Das Gemisch wurde 50 h bei 30°C unter Schütteln bebrütet. Die Kulturbrühe wurde in derselben Weise, wie vorstehend unter (i) beschrieben, behandelt. Dabei wurden 10 ml Roh-Enzymlösung (6 Einheiten/ ml) erhalten.
• (iv) 150 ml Roh-Enzymlösung aus 1050 ml Kulturbrühe, erhalten wie vorstehend in (ii) beschrieben, wurden 15 min auf 50°C erhitzt und 10 min bei 4500 Upm zentrifugiert. Die so erhaltene überstehende Lösung wurde durch eine DEAE-Sepharose CL-6B-Säule von 4,8 × 4 cm zur Adsorption des Enzyms geschickt und mit je 100 ml 0,1 M KCl, 0,2 M KCl und 0,3 M KCl eluiert. Die Glucosedehydrogenase eluierte beim Stand von 75 ml 0,3 M KCl. Die Enzymlösung wurde zur Entsalzung mit Diaflow-Membranfiltermaterial (Amicon Co.) behandelt und an einer Hydroxylapatit-Säule von 4,8 × 1 cm (Sigma Chem. Co.) adsorbiert. Die Elution wurde mit je 50 ml 0,1 M-, 0,2 M- und 0,3 M Phosphatpufferlösung von pH 7,0 vorgenommen. Die Glucosedehydrogenase eluierte beim Stand von 20 ml 0,3 M Phosphatpufferlösung. Es wurden 20 ml Enzymlösung (23,6 Einheiten/ml) erhalten.

Die erhaltene Glucosedehydrogenase hat folgende Eigenschaften.

• (1) Enzymwirkung:
  Katalyse der Reaktion von Glucose und NADP zu Glucono- δ-lacton und reduziertem NADP gemäß folgender Gleichung:
• (2) pH-Stabilität:
  Gemessen wird die Enzymaktivität (1 Einheit/ml, 40 mM Pufferlösung) nach 10minütiger Behandlung bei 53°C. Wie Fig. 1 zeigt, ist das Enzym bei pH 6,0 bis 7,0 stabil.
  Figuren-Legende:
  ○ ○: Dimethylglutarat-Pufferlösung,
  ⚫ ⚫: Phosphat-Pufferlösung,
  ∆ ∆: Tris-HCl-Puffer.
  (Die Symbole werden in allen folgenden Figuren beibehalten, sofern nicht anders angegeben).
• (3) pH-Optimum:
  pH 6 bis 8 (siehe Fig. 2).
  Figuren-Legende:
  ▲ ▲: Acetat-Pufferlösung
• (4) Hitzestabilität:
  Es wird die Enzym-Restaktivität nach 10minütiger Behandlung bei verschiedenen Temperaturen gemessen (1 Einheit/ ml, 40 mM Phosphat-Pufferlösung, pH 6,0). Wie in Fig. 3 gezeigt, ist das Enzym bis 50°C stabil.
• (5) Temperaturoptimum:
  gemäß Fig. 4 etwa 55°C.
• (6) Molekulargewicht:
  11 × 10⁴ ± 11 000 (gemessen an superfeinem Sephacryl- S-200).
• (7) Isoelektrischer Punkt:
  pH 4,9 ± 0,5.
• (8) Michaelis-Konstante (Km):
  2,6 × 10^-3 ± 2,6 × 10^-4M (Glucose)
  4,6 × 10^-6 ± 4,6 × 10^-7M (NADP)
  (gemessen in Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,5).
• (9) Wirkung von Metallionen und oberflächenaktiven Stoffen:
  siehe Tabelle I.
• (10) Substratspezifität:
  siehe Tabelle II (50 mM Substrat, 0,005 Enzymeinheiten, 10 min).

Enzymaktivität und Restaktivität werden nach folgender Testmethode ermittelt.

Testmethode:
0,2 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5)0,4 ml 10 mM NADP0,05 10% Triton X-1000,01 0,5 M Glucose0,1 Destilliertes Wasser0,44 1,0

Das vorstehend beschriebene Reaktionsgemisch (1,0 ml) wird 2 bis 3 min bei 37°C vorinkubiert. Dazu werden 20 µl Enzymlösung gegeben und 10 min bei 37°C inkubiert. Es wird die optische Dichte bei 340 nm gemessen.

Eine Einheit wird definiert als die Enzymmenge, welche in 1 min 1 µMol reduziertes NADP erzeugt.

Tabelle I

Tabelle II

Wie vorstehend gezeigt, liefert die Erfindung eine neuartige Glucosedehydrogenase sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.

Beim Vergleich der neuartigen Glucosedehydrogenase mit einem bereits bekannten Enzym, wie aus Bacillus cereus erhalten (Methods in Enzymology, Bd. 9, S. 109), fällt der Km- Wert des erfindungsgemäßen Enzyms sehr niedrig aus (2,6 × 10^-3M), während der des bekannten Enzyms demgegenüber höher ist (2 × 10^-2M). Das bedeutet, daß das erfindungsgemäße Enzym etwa zehnmal aktiver ist als das bekannte Enzym. Damit hat die erfindungsgemäße Glucosedehydrogenase wesentlich bessere Eigenschaften.

4. Kurze Erklärung der Zeichnungen:

Fig. 1: pH-Stabilität von Glucosedehydrogenase,

Fig. 2: pH-Optimum von Glucosedehydrogenase,

Fig. 3: Hitzestabilität von Glucosedehydrogenase und

Fig. 4: Temperaturoptimum von Glucosedehydrogenase.

Claims (5)

1. Glucosedehydrogenase, gekennzeichnet durch folgende biochemische Eigenschaften:

• (1) Enzymwirkung:
  Katalyse der Reaktion, bei welcher aus Glucose und NADP Glucono-δ-lacton und reduziertes NADP entsteht, und
• (2) Substratspezifität:
  Spezifität gegenüber Glucose ohne Substratspezifität gegenüber 2-Deoxyglucose.

2. Glucosedehydrogenase nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein pH-Optimum von pH 6 bis 8, ein Temperaturoptimum von etwa 55°C, eine pH-Stabilität im Bereich von pH 6,0 bis 7,5, ein Molekulargewicht von 11 × 10⁴ ± 11 000, eine Michaelis-Konstante Km von 2,6 × 10^-3 ± 2,6 × 10^-4M bezüglich Glucose und 4,2 × 10^-6 ± 4,2 × 10^-7M bezüglich NADP sowie einen isoelektrischen Punkt von 4,9 ± 0,5.

3. Verfahren zur Herstellung von Glucosedehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Glucosedehydrogenase produzierenden Mikroorganismus der Art Cryptococcus in einem Nährmedium züchtet und die dabei entstehende Glucosedehydrogenase aus dem Kulturmedium isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der zur Art Cryptococcus gehörende Glucosedehydrogenase produzierende Mikroorganismus Cryptococcus uniguttulatus ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Cryptococcus uniguttulatus Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM P-8709 ist.