DE3787777T2 - Verwendung von Zusammensetzungen auf Basis von Cellulase für die Kultivierung und Anwendung von Mikroorganismen, welche Zellulose herstellen. - Google Patents
Verwendung von Zusammensetzungen auf Basis von Cellulase für die Kultivierung und Anwendung von Mikroorganismen, welche Zellulose herstellen.Info
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Description
- Die Vorliegende Erfindung betrifft die Wirkung von zellulolytischen Enzymen zum Abbau von Zellulose, wie sie von Zellulose-erzeugenden Mikroorganismen wie z. B. Acetobacter xvlinum erzeugt wird. Die Grundidee, die mit dieser Erfindung verbunden ist, ist vielfältig. Organismen wie Acetobacter, die große Mengen von Zellulose hervorbringen, sind ziemlich schwer von einem Inokulum zum anderen zu transferieren, weil die Zellen häufig in dem dicken zelluloseartigen Überzug hängen bleiben. Für die Erzeugung von Zellulose in großem Maßstab ist ein großes Inokulum für den abschließenden Schritt der Zelluloseerzeugung in großem Maßstab erforderlich. Zellulase- Enzym-Präparationen erschweren das Zellwachstum nicht, wenn auch bei Zugabe von geeigneten Konzentrationen an Zellulase- Praparationen zu dem Wachstumsmedium kein Entstehen von Zellulose beobachtet wird. Bei Anwendung dieses Systems ist es möglich, eine große Zahl an Zellen zu erhalten, die Physiologisch intakt und die Vollständige Fähigkeit besitzen, Zellulose zu synthetisieren, sobald die Zellulase-Präparation entweder verdünnt oder aus dem Kulturnährmedium entfernt wurde.
- Die Zusammenfassung "Cellulase- and Cellulose-free Cell Production mit Acetobacter xylinum" von Dillingham et al (1961), Bacteriological Proceedings: 67, beschreibt die Wirkungen von Zellulase auf die Acetobacter-Zellulose erzeugung. Bei weiteren Recherchen in der Literatur wurden jedoch keine entsprechenden, nachfolgenden Publikationen über weitere Einzelheiten gefunden. In dieser Zusammenfassung heißt es:
- Die normale Kultur entwickelt wenig oder keine Trübung unter dem weißen Zelluloseüberzug. In Anwesenheit von Zellulase bildet sich kein Überzug, und es entwickelt sich eine typische trübe Zellensuspension (lebensfähig Zählung 10,0 · 10&sup7; im Vergleich zu 112 · 10&sup5; in 30 Stunden bei normalen Kulturen).
- Dies zeigt eine etwa 9-fache Zunahme der Zellendichte, die der Anwesenheit einer teilweise gereinigten Zellulase von Myrothecium verrucaria zuzuschreiben ist.
- Es ist Vorgeschlagen worden, Acetobacter xylinum in Acetobacter pasteurianus umzubenennen (siehe De Ley (1984) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Williams and Wilkins, Baltimore/London, S. 268-274). Diese Namen sind in dieser Beschreibung austauschbar.
- Erfindungsgemäß enthält ein Nährmedium, in welchem Zellulaseerzeugende Mikroorganismen kultiviert werden, zwischen 0,000375 und 0,015 Einheiten an Zellulase pro ml; die Zellulase liegt in einer Menge vor, die zur Hydrolyse im wesentlichen der gesamten Zellulose nicht ausreicht, wobei die Geschwindigkeit der Zellulosesynthese durch die kultivierten Mikroorganismen ansteigt und die erzeugte Zellulose einen mehr amorphen Character haben kann.
- Erfindungsgemäß geeignete Zellulose-erzeugende Mikroorganismen umfassen Prokaryonte wie jene der Gattung Acetobacter (bevorzugt), Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas oder Alcaligenes. Es wird ein steriles Nährmedium, das eine Zellulase-Präparation umfaßt, hergestellt. Zellulase-Präparationen, die als Komponenten für Nährmedien verwendbar sind, sollten das Enzym Zellulase (Beta-1,4-glucan-glucanhydrolase, E. C. 3.2.1.4) umfassen und können gegebenenfalls auch Zellobiohydrolase oder Beta-glucosidase (Beta-D-glucosid-glucohydrolase, E.C. 3.2.1.21) umfassen. Zellulase-Präparationen können von Organismen wie jene der Gattung Myrothecium, Trichoderma oder Polyporus erhalten werden. Insbesondere können die Zellulase- Präparationen erhalten werden von Organismen der Arten Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride, Trichoderma reesei oder Polyporus versicolor.
- Das die Zellulase-Präparation (zwischen 0,000375 und 0,015 Einheiten Zellulase pro ml) enthaltende Nährmedium wird mit Zellulose-erzeugenden Mikroorganismen beimpft. Das inokulierte Medium wird dann unter aeroben Bedingungen, im allgemeinen zwischen 20 und 40ºC, inkubiert. Das Nährmedium hat vorzugsweise einen pH-Wert zwischen 3 und 7. Für die Kultivierung von Zellulose-erzeugenden Mikroorganismen geeignete Nährmedien umfassen eine große Vielzahl von Medien, die dem Fachmann bekannt sind, wie jene, die einfache oder komplexe Kohlehydrate, Stickstoffquellen, Mineralien und Vitamine enthalten. Viele geeignete Quellen von Stickstoff, Kohlenstoff etc. für Acetobacter werden von De Ley in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 1, S. 268-274 (1984), Williams and Wilkins, Baltimore/London, genannt.
- Das folgende Beispiel beschreibt die Erfindung.
- Acetobacter xylinum wurde in einem Medium gezüchtet, das Zellulase (1220B, Novo Industri A/5) in einer Konzentration von 0,25 mg pro 100 ml Medium enthielt. Es wurde beobachtet, daß nach 1 Woche bei 28ºC auf einer Umlaufschüttelkultur die Menge an erzeugter Zellulose in der Zellulase-Kultur etwa 1,5 x mehr betrug als die der Vergleichskultur (ohne Zellulase). Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle angegeben. Tabelle Zellulase-behandelt (Gewicht der erzeugten Zellulose in g) Vergleich (ohne Zellulase) (Gewicht der erzeugten Zellulose in g) Durchschnitt
- Die zu dem Kulturmedium in geringen Konzentrationen zugefügte Zellulase steigerte die Ausbeute an mikrobieller Zellulose. Dies traf zu, wenn das Ausgangs-Inokulum von Acetobacter sehr gering war (etwa 10.000 Zellen pro Kolben). War das Ausgangs-Inokulum größer, oder ließ man die Kulturen länger als 1 Woche wachsen, war die Erhöhung der Zelluloseproduktion gegenüber der des Vergleichs viel geringer und manchmal sogar gleich oder sogar weniger als in den Vergleichsmedien. Dieses Gebiet muß noch näher bestimmt werden, es zeigt sich bis jetzt jedoch, daß die Menge an erzeugter Zellulose durch die Zugabe von zellulolytischen Enzymen geregelt werden kann.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von mikrobieller Zellulose,
welches das Kultivieren von Zellulose-erzeugenden
Mikroorganismen in einem Nährmedium einschließlich
zwischen 0,000375 und 0,015 Einheiten an Zellulase pro
ml Nährmedium umfaßt, in der Weise, daß nicht die gesamte
erzeugte Zellulose hydrolysiert wird, sondern die
Zellulosekristallisation verändert und die
Geschwindigkeit der Zelluloseerzeugung dadurch beschleunigt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nährmedium einen
pH-Wert zwischen 3 und 7 aufweist.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
der Zellulose-erzeugenden Mikroorganismus ein Prokaryont
ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Prokaryont einer der
Gattung Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas,
Alcaligenes oder Acetobacter ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Gattung Acetobacter
ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Prokaryont Von der
Art Acetobacter xylinum ist.
7. Verfahren nach einem der Vorhergehenden Ansprüche, wobei
die Zellulase erhältlich ist von einem Organismus der
Gattung Myrothecium, Trichoderma oder Polyporus.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Organismus von der
Art Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride,
Trichoderma reesi oder Polyporus versicolor ist . .
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei
das Zellulase-enthaltende Medium zusätzlich
Zellobiohydrolase und Beta-glucosidase umfaßt.
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