CN110760557A - 微生物法生产纳米细菌纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物法生产纳米细菌纤维素的方法。所述方法使用木醋杆菌作为产细菌纤维素的菌种,分别使用芽孢杆菌、木霉菌、曲霉菌或青霉菌作为产纤维素酶的菌种,在木醋杆菌动态培养过程中与产纤维素酶的菌株共培养,制得纳米细菌纤维素。本发明方法简单,可以一步制备出纳米细菌纤维素,制备工艺绿色环保。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物法生产纳米细菌纤维素的方法,属于生物材料技术领域。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial Cellulose,简称BC)是以木醋杆菌(Acetobacterxylinum)为代表的少数微生物合成分泌的一种胞外多糖,是一种天然形成的纤维。由于其结晶度高、持水量高、良好的三维结构、良好的生物相容性,广泛应用于许多领域。
将细菌纤维素进一步降解可得到纳米级的细菌纤维素,长度一般在200-900nm范围内。纳米细菌纤维素不但具有细菌纤维素的基本结构与性能,同时又具有极小的尺寸和巨大的比表面积等纳米微粒特性,可显著提高细菌纤维素化学反应的均匀性,可广泛应用在分散剂、强度增强剂、护肤霜等化妆品基质或药物载体中。
纳米细菌纤维素的制备方法有化学法、物理法和生物法。化学法和物理法有很多局限:化学方法需要用强酸水解,对反应设备要求高,处理反应后的残留物较困难(卢麒麟,胡阳,游惠娟,等.纳米纤维素研究进展[J].广州化工,2013,41(20):1-3.)。物理法需要使用高压并采用特殊的设备,能耗较大(叶代勇.纳米纤维素的制备[J].化学进展,2007,19(10):1568-1575.)。现有的生物法制备纳米级细菌纤维素绿色环保,但对尺寸调节的步骤较为繁琐,因此选择较为简单的生物方法很有必要(董凤霞,刘文,刘红峰.纳米纤维素的制备及应用[J].中国造纸,2012,31(6):68-73.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物法生产纳米细菌纤维素的方法。该方法通过在发酵培养罐中对木醋杆菌进行动态培养,待其能稳定产细菌纤维素时接入产纤维素酶的菌种进行共培养,产生的纤维素酶将大尺寸的细菌纤维素分解成纳米细菌纤维素。
实现本发明目的的技术解决方案为:
微生物法生产纳米细菌纤维素的方法,包括如下步骤:
步骤1,将木醋杆菌种子液接种到发酵液中,动态培养,得到絮状细菌纤维素;
步骤2,在发酵液中接种产纤维素酶的菌株种子液,动态培养,发酵结束后,去除残留的细胞及发酵液,水洗至中性,得到纳米细菌纤维素。
步骤1,所述的木醋杆菌种子液的接种量为8%~12%。
步骤1,所述的动态培养,搅拌速度为150~180rpm。
步骤2,所述的产纤维素酶的菌株选自芽孢杆菌、木霉菌、曲霉菌或青霉菌。
步骤2,所述的产纤维素酶的菌株为芽孢杆菌时,接种量为3~5%,混合后动态培养温度为27~30℃,共培养pH为5.5~6.5,共培养时间为24~48h。
步骤2,所述的产纤维素酶的菌株为木霉菌时,接种量为10-15%,混合后动态培养温度为28~30℃,共培养pH为4.0~5.0,共培养时间为72~96h。
步骤2,所述的产纤维素酶的菌株为曲霉菌时,接种量为5~10%,混合后动态培养温度为30~35℃,共培养pH为5.5~6.0,共培养时间为72~96h。
步骤2,所述的产纤维素酶的菌株为青霉菌时,接种量为3-5%,混合后动态培养温度为30~32℃,共培养pH为5.5~6.5,共培养时间为72~96h。
步骤2中,除去残留细胞及发酵液方法为用浓度为1~5g/L的NaOH和1~5g/L的H2O2在70~100℃条件下水浴0.5~3.0h。
本发明与现有技术相比,其显著优点是:
(1)发酵过程绿色环保,无毒无害,可以在发酵罐中一步生产出纳米细菌纤维素;
(2)生产出的纳米细菌纤维素后处理容易,去除残留的细胞及发酵液后用水冲洗至中性即可。
附图说明
图1是微生物法生产纳米细菌纤维素的流程图。
图2是对比例尺寸大小未经调节的细菌纤维素的扫描电镜图。
图3是实施例1尺寸大小经调节的纳米细菌纤维素的透射电镜图。
图4是实施例2尺寸大小经调节的纳米细菌纤维素的透射电镜图。
图5是实施例5尺寸大小经调节的纳米细菌纤维素的透射电镜图。
图6是实施例6尺寸大小经调节的纳米细菌纤维素的透射电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
以下实施例中,种子液配方:葡萄糖22.5g/L,蔗糖27.5g/L,硫酸铵1g/L,磷酸二氢钾5g/L,硫酸镁0.7g/L,乳酸钙0.2g/L,柠檬酸0.6g/L,醋酸1.5g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸粉7.5g/L。
发酵液配方:葡萄糖22.5g/L,蔗糖27.5g/L,硫酸铵1g/L,磷酸二氢钾5g/L,硫酸镁0.7g/L,乳酸钙0.2g/L,柠檬酸0.6g/L,醋酸1.5g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸粉7.5g/L。
实施例1
第一步:木醋杆菌进行种子扩增,摇床震荡培养,培养温度30℃,摇床转速160rpm,培养时间48h;
第二步:发酵液配制完成后,121℃高温灭菌30min,冷却至室温;
第三步:木醋杆菌以8%的接种量进行接种,接种后在发酵罐中动态培养36h,动态培养温度30℃;
第四步:待第三步培养后,芽孢杆菌以3%的接种量向发酵罐中接入,接种后在27℃、pH6.5条件下动态培养36h;
第五步:发酵结束后,用质量分数3g/L的NaOH和3g/L的H2O2在80℃条件下水浴2.0h,除去残留的细胞及发酵液;
第六步:用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。
由实施例1获得的纳米细菌纤维素如图3所示,可以看出细菌纤维素尺寸大小分布在纳米级尺寸范围内,纳米细菌纤维素尺寸在500-900nm。
实施例2
第一步:木醋杆菌进行种子扩增,摇床震荡培养,培养温度30℃,摇床转速160rpm,培养时间48h;
第二步:发酵液配制完成后,121℃高温灭菌30min,冷却至室温;
第三步:木醋杆菌以8%的接种量进行接种,接种后在发酵罐中动态培养36h,动态培养温度30℃;
第四步:待第三步培养后,木霉菌以12%的接种量向发酵罐中接入,接种后28℃、pH5.0动态培养96h;
第五步:发酵结束后,用质量分数3g/L的NaOH和3g/L的H2O2在80℃条件下水浴2.0h,除去残留的细胞及发酵液;
第六步:用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。
由实施例2获得的纳米细菌纤维素如图4所示,可以看出细菌纤维素尺寸大小分布在纳米级尺寸范围内,纳米细菌纤维素尺寸在900-1500nm。
实施例3
第一步:木醋杆菌进行种子扩增,摇床震荡培养,培养温度30℃,摇床转速160rpm,培养时间48h;
第二步:发酵液配制完成后,121℃高温灭菌30min,冷却至室温;
第三步:木醋杆菌以8%的接种量进行接种,接种后在发酵罐中动态培养36h,动态培养温度30℃;
第四步:待第三步培养后,曲霉菌以6%的接种量向发酵罐中接入,接种后30℃、pH5.5动态培养72h;
第五步:发酵结束后,用质量分数3g/L的NaOH溶液和3g/L的H2O2在80℃条件下水浴2.0h,除去残留的细胞及发酵液;
第六步:用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。
由实施例3获得的纳米细菌纤维素尺寸较大,在1200-1800nm。
实施例4
第一步:木醋杆菌进行种子扩增,摇床震荡培养,培养温度30℃,摇床转速160rpm,培养时间48h;
第二步:发酵液配制完成后,121℃高温灭菌30min,冷却至室温;
第三步:木醋杆菌以8%的接种量进行接种,接种后在发酵罐中动态培养36h,动态培养温度30℃;
第四步:待第三步培养后,青霉菌以3%的接种量向发酵罐中接入,接种后30℃、pH5.5动态培养72h;
第五步:发酵结束后,用质量分数3g/L的NaOH溶液和3g/L的H2O2在80℃条件下水浴2.0h,除去残留的细胞及发酵液;
第六步:用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。
由实施例4获得的纳米细菌纤维素尺寸较大,在1600-2000nm。
实施例5
第一步:木醋杆菌进行种子扩增,摇床震荡培养,培养温度30℃,摇床转速160rpm,培养时间48h;
第二步:发酵液配制完成后,121℃高温灭菌30min,冷却至室温;
第三步:木醋杆菌以8%的接种量进行接种,接种后在发酵罐中动态培养36h,动态培养温度30℃;
第四步:待第三步培养后,芽孢杆菌以5%的接种量向发酵罐中接入,接种后在27℃、pH6.5条件下动态培养36h;
第五步:发酵结束后,用质量分数3g/L的NaOH和3g/L的H2O2在80℃条件下水浴2.0h,除去残留的细胞及发酵液;
第六步:用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。
由实施例5获得的纳米细菌纤维素如图5所示,可以看出细菌纤维素尺寸大小分布在纳米级尺寸范围内,纳米细菌纤维素尺寸在700-1000nm。
实施例6
第一步:木醋杆菌进行种子扩增,摇床震荡培养,培养温度30℃,摇床转速160rpm,培养时间48h;
第二步:发酵液配制完成后,121℃高温灭菌30min,冷却至室温;
第三步:木醋杆菌以8%的接种量进行接种,接种后在发酵罐中动态培养36h,动态培养温度30℃;
第四步:待第三步培养后,芽孢杆菌以5%的接种量向发酵罐中接入,接种后在32℃、pH6.5条件下动态培养36h;
第五步:发酵结束后,用质量分数3g/L的NaOH和3g/L的H2O2在80℃条件下水浴2.0h,除去残留的细胞及发酵液;
第六步:用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。
由实施例6获得的纳米细菌纤维素如图6所示,可以看出细菌纤维素尺寸大小分布在纳米级尺寸范围内,纳米细菌纤维素尺寸在240-500nm。同时可以看出实施例6培养条件相对于其他几组更为合适,所得到的纳米细菌纤维素尺寸最小。
对比例
未调节细菌纤维素尺寸大小的方法:
第一步:木醋杆菌进行种子扩增,摇床震荡培养,培养温度30℃,摇床转速160rpm,培养时间48h;
第二步:发酵液配制完成后,121℃高温灭菌30min,冷却至室温;
第三步:木醋杆菌以8%的接种量进行接种,接种后在发酵罐中动态培养36h,动态培养温度30℃;
第四步:发酵结束后,用质量分数3g/L的NaOH溶液和3g/L的H2O2在80℃条件下水浴2.0小时,除去残留的细胞及发酵液;
第五步:用去离子水冲洗纳米细菌纤维素至中性。
由对比例获得的未经调节的细菌纤维素如图2所示,可以看出单根细菌纤维素尺寸较大,弯曲缠绕。
Claims (9)
1.微生物法生产纳米细菌纤维素的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1,将木醋杆菌种子液接种到发酵液中,动态培养,得到絮状细菌纤维素;
步骤2,在发酵液中接种产纤维素酶的菌株种子液,动态培养,发酵结束后,去除残留的细胞及发酵液,水洗至中性,得到纳米细菌纤维素。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1,所述的木醋杆菌种子液的接种量为8%~12%。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1,所述的动态培养,搅拌速度为150~180rpm。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2,所述的产纤维素酶的菌株选自芽孢杆菌、木霉菌、曲霉菌或青霉菌。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2,所述的产纤维素酶的菌株为芽孢杆菌时,接种量为3~5%,混合后动态培养温度为27~30℃,共培养pH为5.5~6.5,共培养时间为24~48h。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤2,所述的产纤维素酶的菌株为木霉菌时,接种量为10-15%,混合后动态培养温度为28~30℃,共培养pH为4.0~5.0,共培养时间为72~96h。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤2,所述的产纤维素酶的菌株为曲霉菌时,接种量为5~10%,混合后动态培养温度为30~35℃,共培养pH为5.5~6.0,共培养时间为72~96h。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤2,所述的产纤维素酶的菌株为青霉菌时,接种量为3-5%,混合后动态培养温度为30~32℃,共培养pH为5.5~6.5,共培养时间为72~96h。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2中,除去残留细胞及发酵液方法为用浓度为1~5g/L的NaOH和1~5g/L的H2O2在70~100℃条件下水浴0.5~3.0h。
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- 2018-07-27 CN CN201810842739.5A patent/CN110760557A/zh active Pending
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