CN103484356B - 动态培养制备有序化细菌纤维素的发酵反应器及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动态培养制备有序化细菌纤维素的发酵反应器，包括主体容器，所述主体容器的侧壁采用透氧材料，还包括用于驱动主体容器内的液体沿其内壁作相对转动的动力装置。同时本发明中还提供了一种动态培养制备有序化细菌纤维素的方法，包括以下步骤：制备培养基；培养基接种细菌；动态发酵：密封注满细菌发酵液的主体容器后，控制动力装置的转速为100～500r/min，将发酵反应容器置于30℃的恒温培养箱内，培养3～7天，得到纤维素凝胶；产物纯化。本发明采用动态发酵，工艺简单，所制备的细菌纤维素具有定向排列的纳米纤维结构、较高的孔隙率和透明度，具有发酵过程对产物的产量和结构可控性强等优点。

Description

动态培养制备有序化细菌纤维素的发酵反应器及制备方法

技术领域

本发明属于细菌纤维素材料的制备领域，涉及一种动态培养制备有序化细菌纤维素的装置及方法。

背景技术

细菌纤维素与天然纤维素结构非常相似，都是由葡萄糖以β－1,4－糖苷键连接而成的高分子化合物。但是细菌纤维素拥有其独特的特性：（1）高纯度、高结晶度、高聚合度、较大的比表面积和密度；（2）超精细三维网状结构；（3）弹性摸量大、抗张强度以及拉伸强度高；（4）持水能力强，具有很好的形状保持能力；（5）良好的生物相容性、无毒性；（6）生物合成的可调控性。采用不同的培养方法、培养条件，可得到性质不同的纤维素。

细菌纤维素具有以上优异的特性，在组织工程支架、人工血管以及人工眼角膜等生物医学工程中具有广泛的应用前景。在医学材料应用方面，国外的细菌纤维素产品实现商品化的有Biofill和Genginex两种产品，己广泛用作外科和齿科材料。对于二级和三级烧伤、溃疡等，Biofill已被成功用作人造皮肤的临时替代品，Genginex己用于齿根膜组织的修复。另外，Xylose公司生产的Xcell可以作为伤口敷料。

目前，用于医学材料的细菌纤维素多为静置培养，所获得的纤维素内部结构无序排列。而支架中纤维的取向性对细胞行为会有显著影响，定向纤维有利于细胞的迁移、粘附、贴壁和增殖，能够显著提高膜片的机械性能，作为细胞支架时能够支持更强的生物应力。因此，许多学者开始对支架中纤维的取向调控展开研究。但是对细菌纤维素合成微环境的调控难度大，进展缓慢，研究报道较少。Putra等分别采用模板法、硅油法和硅胶管法获得了定向排列的纳米纤维；Sano等通过在培养基外施加电场控制Ax的活动获得了具有取向性排列的纤维支架。

细菌纤维素特有的三维纳米结构中的介孔可作为生物模板来控制合成具有预期形貌与尺寸的纳米材料和纳米结构，从而获得各种新的功能材料。该模板具有合成时性能和结构的可调控性、较高的生物适应性和良好的生物可降解性。有序的纤维结构可以作为模板来引导有序结构的制备与组装，实现对纳米材料的取向、结构和排布等的控制，为研究纳米有序体系的性质提供有利途径。

现有的方法存在产量低、工艺复杂等缺点，需要对现有的方法改进或探索新的方法以高效地制备定向的纳米纤维支架，并将其应用到组织工程领域中。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种动态培养制备有序化细菌纤维素的发酵反应器，通过本发明可以获得微观结构定向排列的细菌纤维素膜，简化了工艺要求，提高了产量。

为了解决上述技术问题，本发明一种动态培养制备有序化细菌纤维素的发酵反应器，包括主体容器，所述主体容器的侧壁采用透氧材料，所述透氧材料选自于硅胶、银基三氧化二铝、GEOR-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、SYNPERTEX、TEXAPROE、DENTIKS和KING-TEX中的一种；还包括动力装置，所述动力装置用于驱动主体容器内的液体沿其内壁作相对转动。

进一步讲，所述动力装置包括设置在所述主体容器内的中心转轴，所述中心转轴上设有搅拌叶片，所述中心转轴由电机带动，所述电机的转速为100～500r/min；或所述动力装置由磁力搅拌器和置于所述主体容器中的磁子构成。

本发明一种动态培养制备有序化细菌纤维素的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备培养基：所述培养基的组分及含量如下：葡萄糖10～25g/L、酵母粉1～7.5g/L、蛋白胨1～10g/L和磷酸氢二钠1～10g/L；将上述组分加入到装有纯净水的容器中，搅拌直至其完全溶解；用冰醋酸调节体系的pH值至3～7之间，高温灭菌后作为细菌生长的培养基；

步骤二、培养基接种细菌：待灭菌后的培养基冷却至室温，在无菌条件下，按照6%的体积分数将种子溶液接种到所述培养基中，放入转速为160r/min的摇床中，30℃温度下振荡24h；

步骤三、动态发酵：取接种细菌的培养液注满到如权利要求1所述的发酵反应容器中，排除气泡后用凡士林密封，控制动力装置的转速为100～500r/min，将发酵反应容器置于30℃的恒温培养箱内，培养3～7天，得到纤维素膜凝胶；

步骤四、产物纯化：将所得纤维素膜凝胶用去离子水和浓度为0.1mol/L的NaOH反复交替煮沸，调节pH为7，最终获得纯净的纤维素水凝胶，将其置于蒸馏水中，冷藏待用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.相对于模板法和电场控制等方法，该发明采用动态培养反应器的核心部件为半透膜和动力装置，工艺简单，操作简便，能耗较低，无污染，适合工业化量产。

2.本发明方法对产物的结构和产量可控性较强。通过控制动力系统调节转速，可以同时控制纤维取向度和纤维素的产量；采用不同透氧能力的半透膜，可以控制产物的产量。

附图说明

图1所示为叶片搅拌发酵反应器结构示意图；

图2所示为磁子搅拌发酵反应器结构示意图；

图3所示为利用该反应器静态培养细菌纤维素的SEM图像；

图4所示为利用该反应器动态培养细菌纤维素的SEM图像。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。

本发明一种动态培养制备有序化细菌纤维素的发酵反应器，包括主体容器，所述主体容器的侧壁2采用透氧材料，所述透氧材料选自于硅胶、银基三氧化二铝、GEOR-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、SYNPERTEX、TEXAPROE、DENTIKS和KING-TEX中的一种；还包括动力装置，所述动力装置用于驱动主体容器内的液体沿其内壁作相对转动，如图1所示，所述动力装置包括设置在所述主体容器内的中心转轴4，所述中心转轴4上设有搅拌叶片3，所述中心转轴4由电机1带动，所述电机1的转速为100～500r/min。如图2所示，所述动力装置还可以由磁力搅拌器6和置于所述主体容器中的磁子5构成。

本发明一种动态培养制备有序化细菌纤维素的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备培养基：所述培养基的组分及含量如下：葡萄糖10～25g/L、酵母粉1～7.5g/L、蛋白胨1～10g/L和磷酸氢二钠1～10g/L；将上述组分加入到装有纯净水的容器中，搅拌直至其完全溶解；用冰醋酸调节体系的pH值至3～7之间，高温灭菌后作为细菌生长的培养基；

步骤二、培养基接种细菌：待灭菌后的培养基冷却至室温，在无菌条件下，按照6%的体积分数将种子溶液接种到所述培养基中，放入转速为160r/min的摇床中，30℃温度下振荡24h；

步骤三、动态发酵：取接种细菌的培养液注满到如权利要求1所述的发酵反应容器中，排除气泡后用凡士林密封，控制动力装置的转速为100～500r/min，将发酵反应容器置于30℃的恒温培养箱内，培养3～7天，得到纤维素凝胶，至于培养天数的不同只影响到纤维素凝胶的产量对本发明产物的特性不起作用。

步骤四、产物纯化：将所得纤维素凝胶用去离子水和浓度为0.1mol/L的NaOH反复交替煮沸，调节pH为7，最终获得纯净的纤维素水凝胶，将其置于蒸馏水中，冷藏待用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

采用机械传动装置驱动发酵液沿半透膜内壁相对运动的培养方式，如图1所示。

1.设计发酵反应器的高为100mm，直径为90mm，所述主体容器的侧壁材料采用1.5mm厚度的硅胶板,动力装置中的叶片长为20mm,中心转轴连接有变频电机。

2.配制培养基：将葡萄糖25g/L、酵母粉7.5g/L、蛋白胨10g/L和磷酸氢二钠10g/L依次加入装有1000ml超纯水的烧杯中，搅拌直至其完全溶解；用冰醋酸调节体系的pH值至4～5之间。115℃高温灭菌30min后取出，作为细菌生长的培养基。

3.培养基接种细菌：待灭菌后的培养基冷却至室温，在无菌条件下，按照6%的体积分数将种子溶液接种到新鲜的培养基中，放入摇床中，30℃振荡24h，摇床转速为160r/min。

4.动态发酵：取接种细菌的培养液注满整个反应容器，排除气泡后用凡士林密封。调节电机转速100r/min左右，将发酵反应器置于通风良好的30℃的恒温培养箱，连续培养7天。

5.产物纯化：将所得纤维素膜凝胶置于去离子水中清洗，加热至水沸，反复换水煮沸，煮至产物变白，液体无气味。再加入NaOH（0.1mol/L）加热煮沸清洗几次，再用去离子水煮至pH为7，即得到纯净的纤维素水凝胶，将其置于蒸馏水中，并冷藏待用。

6.微观形貌观察：将细菌纤维素膜用液氮冷冻，置于冷冻干燥机中，在-50℃、抽真空的条件下冻2天，将干膜用导电胶粘附在样品台上，离子溅射仪对样品表面进行喷金（5mA，5min）。采用FEI Nano430型场发射扫描电子显微镜观察样品的微观形貌。

图3所示为利用该反应器静态培养细菌纤维素的SEM图像，图4所示为利用该反应器动态培养细菌纤维素的SEM图像。对比两图说明：利用该反应容器动态培养细菌纤维素出现有序排列，且沿一定方向排列的纤维直径较大，这些纤维之间由直径较小的纤维素丝缠绕连接。

实施例2

采用磁力搅拌装置驱动发酵液沿半透膜内壁相对运动的培养方式，如图2所示。

本实施例2的制备方法步骤如下：

1.设计发酵反应器的高为100mm，直径为90mm，所述主体容器的侧壁材料采用1.5mm厚度的硅胶板,选用长度约为30mm磁子。

2.配制培养基：如实施例1。

3.培养基接种细菌：如实施例1。

4.动态发酵：取接种细菌的培养液注满整个反应容器，排除气泡后用凡士林密封。调节磁力搅拌器的转速100r/min左右，将发酵反应器置于通风良好的30℃的恒温培养箱，连续培养7天。

其他步骤如实施例1。

实施例3

采用磁力搅拌装置驱动发酵液沿半透膜内壁相对运动的培养方式，如图2所示。

本实施例3的制备方法步骤如下：

1.设计发酵反应器的高为70mm，直径为60mm，所述主体容器的侧壁材料采用1.5mm厚度的硅胶板,选用长度约为30mm磁子。

2.配制培养基：如实施例1。

3.培养基接种细菌：如实施例1。

4.动态发酵：取接种细菌的培养液注满整个反应容器，排除气泡后用凡士林密封。调节磁力搅拌器的转速300r/min左右，将发酵反应器置于通风良好的30℃的恒温培养箱，连续培养7天。

其他步骤如实施例1。

实施例4

采用磁力搅拌装置驱动发酵液沿半透膜内壁相对运动的培养方式，如图2所示。

本实施例4的制备方法步骤如下：

1.设计发酵反应器的高为100mm，直径为90mm，所述主体容器的侧壁材料采用0.8mm厚度的硅胶板,选用长度约为30mm磁子。

2.配制培养基：如实施例1。

3.培养基接种细菌：如实施例1。

4.动态发酵：取接种细菌的培养液注满整个反应容器，排除气泡后用凡士林密封。调节磁力搅拌器的转速500r/min左右，将发酵反应器置于通风良好的30℃的恒温培养箱，连续培养7天。

其他步骤如实施例1。

对比实施例1和实施例2说明，两种动力装置均能达到制备有序化细菌纤维素的目的。对比实施例2、实施例3和实施例可以得出：随动力装置搅拌速度的增加，发酵液沿半透膜内壁的的相对运动速度增加，产物的微观结构中，纳米纤维的有序化度增加。

尽管上面结合图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以作出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (4)

1.一种动态培养制备有序化细菌纤维素的发酵反应器，包括主体容器，其特征在于，所述主体容器的侧壁采用透氧材料，所述主体容器用凡士林密封，还包括动力装置，所述动力装置用于驱动主体容器内的液体沿其内壁作相对转动；所述动力装置包括设置在所述主体容器内的中心转轴，所述中心转轴上设有搅拌叶片，所述中心转轴由电机带动，所述电机的转速为300r/min或500r/min。

2.根据权利要求1所述动态培养制备有序化细菌纤维素的发酵反应器，其特征在于：所述透氧材料选自于硅胶、银基三氧化二铝、GEOR-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、SYNPERTEX、TEXAPROE、DENTIKS和KING-TEX中的一种。

3.根据权利要求1所述动态培养制备有序化细菌纤维素的发酵反应器，其特征在于：所述动力装置由磁力搅拌器和置于所述主体容器中的磁子构成。

4.一种动态培养制备有序化细菌纤维素的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备培养基：所述培养基的组分及含量如下：葡萄糖10～25g/L、酵母粉1～7.5g/L、蛋白胨1～10g/L和磷酸氢二钠1～10g/L；将上述组分加入到装有纯净水的容器中，搅拌直至其完全溶解；用冰醋酸调节体系的pH值至3～7之间，高温灭菌后作为细菌生长的培养基；

步骤二、培养基接种细菌：待灭菌后的培养基冷却至室温，在无菌条件下，按照6％的体积分数将种子溶液接种到所述培养基中，放入转速为160r/min的摇床中，30℃温度下振荡24h；

步骤三、动态发酵：取接种细菌的培养液注满到如权利要求1所述的主体容器中，排除气泡后用凡士林密封，控制动力装置的转速为300或500r/min，将发酵反应容器置于30℃的恒温培养箱内，培养3～7天，得到纤维素凝胶；

步骤四、产物纯化：将所得纤维素凝胶用去离子水和浓度为0.1mol/L的NaOH反复交替煮沸，调节pH为7，最终获得纯净的纤维素水凝胶，将其置于蒸馏水中，冷藏待用。