CN101584882A - 一种组织工程血管支架材料及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程血管支架材料及其生产方法，是选取木醋杆菌做为模式菌株；以透氧材料制作中空管状模具；将模具置于发酵液内，再向模具内通入氧气进行发酵直至细菌纤维素完全包裹模具材料外周表面并达到所要求的孔隙率、厚度、均一度与结构特征，制得组织工程血管支架原材料；除杂至杂质率＜0.05％，再经消毒封装后得到组织工程血管支架材料。本发明工艺简单，所提供的组织工程血管支架材料安全、无毒副作用，通过控制发酵过程使支架材料空间结构更加均一、孔隙率更为适中，各生产批次材料质地均匀，有效提高产品的质量，有利于实现规模化生产。

Description

一种组织工程血管支架材料及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种组织工程血管支架材料及其生产方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

随着科学技术的发展，利用组织工程手段体外构建器官甚至身体系统来做为替代病变、坏死或缺失组织使得人类各组织器官的再生成为可能，从而为从根本上解决器官移植的供体问题指出了科学的发展方向。

血管是人体必不可少的器官之一，同时更是生命循环得以存续的基本结构。临床外科手术中，大多数的病患均需进行血管重建，尤其是冠心病等心脑血管疾病以及外周血管的治疗更加迫切的需要血管移植物来代替受损的血管。

自体血管如大隐静脉、胸廓内动脉及桡动脉等自体移植是较为理想的选择，术后康复的效果最好，但是能够进行自体移植手术的患者只占总需求人数的30％左右，大多数患者需使用组织工程血管来代替受损血管，因此能够大规模工业化生产的组织工程血管的研制开发早已经成为人类克服血管类疾病，促进康复医学领域跨越式发展，造福人类的迫切需求。

1986年Weinberg等用胶原蛋白和血管壁细胞首次在体外构建了组织工程血管(Tissue Engineering Blood Vessel，TEBV)。

组织工程血管是一种用组织工程方法构建的具有良好的生物相容性和力学特性的血管替代物，它由血管支架材料和组织干细胞经生物学建构构成。

能够成功应用的组织工程血管支架材料必须具备以下条件：

1、安全、无毒副作用，在材料使用的过程中，材料及其降解产物不可以产生任何毒理学效应；

2、良好的生物相容性：不会刺激机体产生免疫排斥反应，同时随着组织工程血管在体内的逐步完善，最终需要进行生物降解以便于组织工程血管成为真正意义上的“天然血管”；

3、良好的可塑性：血管的形状因其所在位置、执行功能、作用不同而十分复杂，支架材料应尽可能与待移植血管相一致，以此保证移植手术的顺利进行、移植后血管的成活率以及血管功能的完整性；

4、较强的机械强度：具有较好的机械强度是组织工程血管对良好支架材料的另一要求。因血管需要承受其纵轴方向的剪切力与横轴方向的环形张力以及人体在运动时由脏器各部分位置的改变产生的各种形变以及心脏搏动造成的瞬间爆发式脉动压力等作用，使得材料的机械强度成为影响组织工程血管优良与否的重要因素；

5、良好的组织构架：种子细胞能够在其空间结构中正常黏附、增殖，并在条件合适时由原始组织干细胞分化成特征目标细胞；

综上所述，组织工程血管支架材料必须具有特定的三维立体(管状)结构，作为组织干细胞定植并分化的基质材料，使得接种细胞能迅速定植、黏附、增殖并在特定空间内有序的分布排列，分化成具有特定功能的细胞并合成适当的细胞外基质(ECM)，此外，所选用的支架材料还要具有与宿主健康血管相近的动力学性能，能够抵抗脉搏的爆发式搏动压力、环形张力与血流冲刷的剪切力等。并且在移植后具有良好的力学和化学方面的生物稳定性、表面抗血栓性、防止内膜增生特性以及多孔性来促进干细胞的定植、分化及生长，实现血管的全功能化。

目前在组织工程血管的开发进程中，大口径血管方向应用涤纶、尼龙或者膨胀聚四氟乙烯等不可降解材料制备的组织工程血管在替代大口径血管时的移植成功率高，形成血栓、内膜增生率较低，通畅率较好。但对于小口径血管，因这些非降解材料不支持内皮细胞的粘附和生长，血管难以充分内皮化；而且，材料不能降解，难以形成真正意义上的血管，且更容易造成内膜增生，形成血栓、血流不畅等问题导致血管移植失败。

近年来，科学家们一直致力于寻找更为合适的材料做为现有组织工程血管支架材料的代替品。人们尝试利用胶原蛋白一几丁聚糖三维骨架构建组织工程血管，将来自动物的骨胶原蛋白做非变性溶解后添加交联剂进行二次塑型，但移植后易发生免疫排斥反应，需长期服用抗排异药物，严重损害人体的免疫系统。

有技术为获得管状细菌纤维素，单纯将培养体系置于30℃空气中，完全依赖自然发酵获得纤维素膜材料用于制造人造血管，但限于培养方式的粗放，难以精确控制发酵过程，无法保证材料的孔隙率、膜体厚度、均一程度及发酵时长等参数达到均一、稳定的要求。使得最终产品的个体间差异很大，规格不一、出品率低。

为进一步探索细菌纤维素材料的可塑性，有学者设计了由双层玻璃套管构成玻璃原膜的发酵装置，但这一装置却存在无法透过氧气的弊端、仍就不能精确调节纤维素膜厚、孔隙率及均一度等参数，难以实现规模化生产。

科学家们尝试各种方法试图找出制备结构均一合理、规格稳定的细菌纤维素管的制备方法。有报道采用空心模具通入空气的方式进行发酵。相对于自然空气发酵与玻璃套管法已经有所改进，但仍不能实现组织工程血管支架材料的精确控制。其原因如下：木醋杆菌发酵分泌细菌纤维素是发生在含有充足氧气的界面上的行为，且氧气含量及氧分压的变化直接影响纤维素的发酵成功率、纤维素膜的均一性及不同发酵批次的稳定性。该方法中未对模具材料表面的氧气浓度与分压做精确控制，因此难以控制细菌纤维素膜的精确构成。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种组织工程血管支架材料及其生产方法，该方法通过选用合适的模式菌株、设计恰当的生产模具、提供适宜的培养条件和处理方法，实现生产理想的组织工程血管支架材料的目的，所得组织工程血管支架材料安全、无毒副作用，具有良好的生物相容性、可塑性和较大机械强度，可以实现任意形状设计并与体内待移植血管全吻合对接，使细菌纤维素支架材料的发酵生产可重复性良好且各批次产品均一、稳定，从而突破产业化瓶颈。

本发明所采用的技术原理：

根据患者病损血管的实际形状与结构特点，设计与之相匹配的血管生成模具(由中空管状透氧材料构成)，将孔隙率适中、孔径大小合适、孔隙分布均一的模具置于含有木醋杆菌菌种的培养体系中，向模具中充入氧气，调整模具内氧气分压，令其从表面释放氧气，使得位于模具表面的木醋杆菌大量增殖并分泌结构均一完整、孔隙适中稳定的细菌纤维素膜，最终生成与模具外周面吻合的管状细菌纤维素支架材料。新生材料的厚度、孔隙率、致密程度及结构特征均可由调整释放氧气的单位密度、单位压强、以及释放时间等可控参数来控制，最终形成理想的由细菌纤维素作为原料的组织工程血管支架材料。

木醋杆菌做为分泌细菌纤维素的模式菌株，在有适量氧气存在的条件下能够代谢产生细菌纤维素，而其代谢产生的细菌纤维素生成于气液两相界面上。这一原位可塑性使得木醋杆菌能够根据人工设计的蓝图生成任意形状、无缝链接的特种材料。

细菌纤维素的特点有如下几个方面：

1细菌纤维素是一种生物相容性极好的天然材料。能够无障碍的存在于生物体内，不会引起免疫排斥反应；

2细菌纤维素具备极高的杨氏模量(15GP，经过热压处理后可达30GP，与金属铝相当)，可以抗高剪切力、高环形张力的作用；

3细菌纤维素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷键连接的聚合物，具有极强的亲水性能与保水能力(吸水比例为1∶50，经特殊处理可达1∶700)。

4可塑性强，符合天然血管的力学结构特征；

5具有多孔结构，且孔径排列均匀，利于细胞定植；

6细胞相容性好，适于细胞黏附生长；

7可实现任意形状设计，实现与体内血管全吻合对接；

8生物可降解；

9可大规模工业化生产。

通过调节材料的形状、直径、模式菌株的浓度、发酵时间、氧气分压来控制支架材料的形状、直径、孔隙率及厚度，最终形成特定规格、形状，品性优渥的中空管状组织工程血管支架材料。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案：

一种组织工程血管支架材料及其生产方法，是选用木醋杆菌做为模式菌株，选用硅胶等透氧材料做为生产模具，通过调节透氧材料制备过程中的工艺参数制备孔隙率均一适中的模具，然后将模具一端封闭，另一端与氧气发生装置(氧气瓶等)紧密结合，通过调节阀门向模具内通入浓度、压力一定的氧气，再将模具置于木醋杆菌发酵培养基液层内部，人工创造气——液两相界面，通过调节氧气的浓度与压强，我们就可以控制细菌纤维素膜的结构形成过程。

其具体步骤如下：

1、选配菌种

选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌做为模式菌株，将模式菌株活化制备成种子醪液，然后投放种子醪液至发酵培养基内制成含活性菌株的初始发酵液。

所述木醋杆菌属菌株是木葡糖酸醋杆菌323。

所述种子醪液中菌株的浓度为0.5％～95％。

2、选择模具材料

选择在常温常压下的氧气透过速度为100ml.m^-2.s^-1～1000ml.m^-2.s^-1，孔隙均一度偏差(两孔中心间距与两孔中心平均距离之差)＜±0.3的透氧材料做为模具材料，根据血管的实际形状、直径及大小制作外周直径与目标血管内径一致的中空管状模具。

所述透氧材料是指硅胶、银基三氧化二铝、GEOR-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、SYNPERTEX、TEXAPROE、DENTIKS或KING-TEX。

材料的孔隙率、孔径及孔隙均一度是控制氧气在模具表面的释放密度及释放强度的决定性因素。

孔隙率过低过细则氧气透过困难，供氧量低、氧分压不足，菌体表面氧化还原电势低，不利于葡萄糖向纤维素的转化。

孔隙率过高过大，虽然能够保证有足够的氧气释放到模具表面，但其压力过大就足以影响木醋杆菌与模具材料的固定结合能力及细菌纤维素的分泌情况，破坏纤维膜完整、均一的空间结构。

孔隙分布不均一会造成局部氧气浓度、分压差异较大，菌体发育程度不一、最终导致细菌纤维素膜体结构参差不齐。膜体结构不均一是干细胞定植失败的最重要因素之一。同时膜体不均还会影响血液的流体动力学特征，容易产生血栓及血管内膜增生等不良反应。

3、通氧发酵

木醋杆菌为好氧微生物，在生长繁殖的过程中首先大量增殖迅速扩增菌体，当菌体生长处于对数生长中末期，外界环境条件合适时向胞外分泌细菌纤维素，这一系列代谢过程中周围环境中氧气浓度及氧分压对细菌纤维素的分泌情况起决定性的作用。发明人通过试验观察到细菌纤维素空间结构的结合程度、孔隙均一度等参数均受氧分压及氧气浓度的控制。通过调整氧分压、氧气浓度、可以有效调控以细菌纤维素为原料的组织工程血管形成过程。

将模具置于含有活性菌株的初始发酵液内并向模具内通入氧气，氧气分压为0.05MP～0.08MP，氧气浓度为10％～100％；至细菌纤维素完全包裹模具材料外周表面，制得孔隙率为90％～99.9％、厚度为0.1～3.0mm、孔隙均一度偏差(两孔中心间距与两孔中心平均距离之差)＜±0.2的初级组织工程血管支架材料。

所述初级组织工程血管支架材料两孔之间平均距离为50nm～100nm。

4、纯化处理

将初级组织工程血管支架材料经酸液浸泡、碱液浸泡后用去离子水洗涤至杂质率＜0.05％，再经消毒封装后得到组织工程血管支架材料。

在本发明中，骨髓间充质干细胞作为组织工程血管定植种子细胞，包括并不限于内皮祖细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞等干细胞均可用于本发明。

本发明具有如下优点：

1、极好的生物相容性

细菌纤维素是一种生物相容性极好的天然材料。人体细胞基质的主要成分为胶原纤维蛋白可以无障碍的存在于生物体内，不会引起免疫排斥反应，能够与宿主和平共处；

2、原位可塑性

实现任意形状设计，实现与体内血管吻合对接。木醋杆菌是专性需氧菌，在有氧条件下能够代谢产生细菌纤维素，而其代谢产生的细菌纤维素生成于气液两相界面上。这一特点使得我们能够成功设计并生成任意形状，无缝链接的特种材料。

3、支架材料结构可控性

人体的血管种类繁多，其形状与结构也因部位与功能的不同而有极为显著的差异。血管的厚度、直径等参数是组织工程支架材料制备的限定性因素。更为重要的是，支架材料的微观结构是决定组织干细胞定植成功率、细胞分化程度及组织工程血管全功能化的关键因素。

孔隙率、孔径和孔隙均一度是衡量材料的结构均一完整度及传质能力的基础参数。传统组织工程材料对血管的孔隙率、孔径均一程度等参数重视程度不够，在材料的制备过程中并未将其做为材料优良与否的判断依据。因此导致很多种组织工程血管材料制成后因细胞难以均一定植及干细胞分化不完全频频发生定植失败的惨痛实例。

基于此选择传质能力适当、孔隙均一、分布完整的模具材料是制备优良组织工程血管支架材料的前提条件。

选用合适材质的透氧模具材料，结合氧分压及氧气浓度等相关参数的设定，严格控制支架材料的孔隙率、孔径大小，使得材料的孔隙均一完整，结构稳定可靠。

4、生物可降解

人体不具备分解细菌纤维素的能力，因此不能自然降解。这为我们人为控制降解时间与降解速度创造了条件。

细菌纤维素能够为纤维素酶降解，这种蛋白质对人体无不良影响，因此可根据患者康复需要调整细菌纤维素降解时间与降解速度，从而加快组织工程血管与宿主之间完全融合，加快移植过程，极大提高移植成功率。

5、实现小口径血管的组织工程化

小口径血管因其口径过小，因此很容易形成血栓、缝合处内膜增生等病变，根据细菌纤维素的特点，可以设计合适的模具材料，从而获得管径为0.5mm～6mm的小口径组织工程血管支架材料，最终实现小口径血管的全功能组织工程化。

6、利于组织干细胞定植

细菌纤维素具备极高的保水特性与亲水能力，细胞生长试验表明，组织干细胞完全能够适应细菌纤维素的理化特征与生物反应信息，细胞在膜内能够很好的黏附、定植、增殖并分化成各特征功能细胞。其超强的保水能力还可以为定植细胞吸附充足的养料更加利于细胞的生长繁殖。

具体实施方式

下面结合非限定性实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一

制备人体外颈动脉组织工程血管支架材料

1)蓝本

以成年人体(＞18周岁)外颈动脉形态结构为蓝本，制备内周直径为5mm、外周直径为6mm，有效长度为500mm的中空管状组织工程血管支架材料。

2)模具材料

选用孔隙率为50％的医用透氧硅胶为原材料，制备内周直径为4mm、外周直径为5mm的中空管状组织工程血管支架模具。

3)模式菌株

选取木葡糖酸醋杆菌323做为模式菌株，将模式菌株活化制备成浓度为5％的木醋杆菌种子醪液，将木醋杆菌种子醪液接种至椰子水发酵培养基内制成含木醋杆菌活性菌株的初始发酵液。

4)材料形状及安放位置

将设计规格为外周直径5mm、内周直径4mm、孔隙率为50％、长度为500mm的中空管状医用硅胶透氧模具浸没于含木醋杆菌活性菌株的初始发酵液内，保证模具所处位置不高于液面以下50mm。

5)固定

模具一端封闭固定，另一端无缝对接氧气供气口。

6)供氧

开启阀门，持续向模具内通入压力为0.075MP的医用氧气。

7)培养发酵

将模具与培养容器一同置入30℃的恒温培养箱培养6d。

8)产物

收获内周直径为5mm、外直周径为6mm，完整、光滑、无缝的中空管状组织工程血管支架材料，其孔隙率为98.6％，两孔之间平均距离为54nm。

9)纯化

将上述初级组织工程血管支架材料用0.5mol盐酸溶液浸泡1h，0.1mol盐酸酸洗0.5h；再用0.5mol氢氧化钠溶液浸泡1h；接着用去离子水浸泡1h，然后用去离子水反复冲洗洗至杂质率＜0.05％。

10)杀菌

将处理后的初级组织工程血管支架材料在800℃，20个大气压处理1h，环氧乙烷杀菌，医用树脂容器密封包装后置4℃冰箱备用保存。

对产品的最终孔隙率、杨氏模量、持水力进行测定，测定结果见表1。

表1技术参数

名称	参数
		组织工程血管支架材料最终孔隙率	70％
组织工程血管支架材料杨氏模量	30GP
		组织工程血管支架材料持水力	1∶700

实施例二

制备人体手臂挠动脉组织工程血管支架材料

1)蓝本

以成年人体(＞18周岁)手臂挠动脉形态结构为蓝本，制备内周直径为1mm、外周直径为2mm，有效长度为200mm的中空管状组织工程血管支架材料。

2)模具材料

选用孔隙率为50％的医用透氧硅胶为原材料，制备内周直径为0.5mm、外周直径为1mm的中空管状组织工程血管支架模具。

3)模式菌株

选取木葡糖酸醋杆菌323做为模式菌株，将模式菌株活化制备成浓度为5％的木醋杆菌种子醪液，将木醋杆菌种子醪液接种至椰子水发酵培养基内制成含木醋杆菌活性菌株的初始发酵液。

4)材料形状及安放位置

将设计规格为外周直径1mm、内周直径0.5mm、孔隙率为50％、长度为200mm的中空管状医用硅胶透氧模具浸没于含木醋杆菌活性菌株的初始发酵液内，保证模具所处位置不高于液面以下50mm。

5)固定

模具一端封闭固定，另一端无缝对接氧气供气口。

6)供氧

开启阀门，持续向模具内通入压力为0.075MP的医用氧气。

7)培养发酵：

将模具与培养容器一同置入29℃的恒温培养箱培养6d。

8)产物

收获内周直径为0.5mm、外直周径为1mm，完整、光滑、无缝的中空管状组织工程血管支架材料，其孔隙率为98.8％，两孔之间平均距离为53nm。

9)纯化

将上述初级组织工程血管支架材料用0.5mol盐酸溶液浸泡1h，0.1mol盐酸酸洗0.5h；再用0.5mol氢氧化钠溶液浸泡1h；接着用去离子水浸泡1h，然后用去离子水反复冲洗洗至杂质率＜0.05％。

10)杀菌

将处理后的初级组织工程血管支架材料在800℃，20个大气压处理1h，环氧乙烷杀菌，医用树脂容器密封包装后置4℃冰箱备用保存。

对产品的最终孔隙率、杨氏模量、持水力进行测定，测定结果见表2。

表2技术参数

名称	参数
		组织工程血管支架材料最终孔隙率	70％
组织工程血管支架材料杨氏模量	30GP
		组织工程血管支架材料持水力	1∶700

实施例三

制备人体下肢静脉组织工程血管支架材料

1)蓝本

以成年人体(＞18周岁)下肢静脉形态结构为蓝本，制备内周直径为3mm、外周直径为4mm，有效长度为500mm的中空管状组织工程血管支架材料。

2)模具材料

选用孔隙率为50％的医用透氧硅胶为原材料，制备内周直径为2mm、外周直径为3mm的中空管状组织工程血管支架模具。

3)模式菌株

选取木葡糖酸醋杆菌323做为模式菌株，将模式菌株活化制备成浓度为5％的木醋杆菌种子醪液，将木醋杆菌种子醪液接种至椰子水发酵培养基内制成含木醋杆菌活性菌株的初始发酵液。

4)材料形状及安放位置：

将设计规格为外周直径3mm、内周直径2mm、孔隙率为50％、长度为200mm的中空管状医用硅胶透氧模具浸没于含木醋杆菌活性菌株的初始发酵液内，保证模具所处位置不高于液面以下50mm。

5)固定

模具一端封闭固定，另一端无缝对接氧气供气口。

6)供氧

开启阀门，持续向模具内通入压力为0.075MP的医用氧气。

7)培养发酵

将模具与培养容器一同置入28℃的恒温培养箱培养6d。

8)产物

收获内周直径为3mm、外直周径为4mm，完整、光滑、无缝的中空管状组织工程血管支架材料，其孔隙率为98.1％，两孔之间平均距离为58nm。

9)纯化：

将上述初级组织工程血管支架材料用0.5mol盐酸溶液浸泡1h，0.1mol盐酸酸洗0.5h；再用0.5mol氢氧化钠溶液浸泡1h；接着用去离子水浸泡1h，然后用去离子水反复冲洗洗至杂质率＜0.05％。

10)杀菌

将处理后的初级组织工程血管支架材料在800℃，20个大气压处理1h，环氧乙烷杀菌，医用树脂容器密封包装后置4℃冰箱备用保存。

对产品的最终孔隙率、杨氏模量、持水力进行测定，测定结果见表3。

表3技术参数

名称	参数
		组织工程血管支架材料最终孔隙率	70％
组织工程血管支架材料杨氏模量	30GP
		组织工程血管支架材料持水力	1∶700

上述实施例中，可根据实际操作过程中各指标的变化调整菌种浓度、发酵时间、液层深度、氧气分压等参数设定来控制细菌纤维素支架材料的孔隙率、结构强度及厚度等工艺参数。

应当指出，以上仅是本发明的非限定实施例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1、一种组织工程血管支架材料的生产方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)、选配菌种

选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌做为模式菌株，将模式菌株活化制备成种子醪液，然后投放种子醪液至发酵培养基内制成含活性菌株的初始发酵液；

2)、选择模具材料

选择在常温常压下的氧气透过速度为100ml.m^-2.s^-1～1000ml.m^-2.s^-1，孔隙均一度偏差＜±0.3的透氧材料做为模具材料，根据血管的实际形状、直径及大小制作外周直径与目标血管内径一致的中空管状模具；

3)、通氧发酵

将模具置于含有活性菌株的初始发酵液内并向模具内通入氧气，氧气分压为0.05MP～0.08MP，氧气浓度为10％～100％；至细菌纤维素完全包裹模具材料外周表面，制得孔隙率为90％～99.9％、厚度为0.1～3.0mm、孔隙均一度偏差＜±0.2的初级组织工程血管支架材料；

4)、纯化处理

将初级组织工程血管支架材料经酸液浸泡、碱液浸泡后用去离子水洗涤至杂质率＜0.05％，再经消毒封装后得到组织工程血管支架材料。

2、根据权利要求1所述的组织工程血管支架材料的生产方法，其特征在于：所述木醋杆菌属菌株是木葡糖酸醋杆菌323。

3、根据权利要求1所述的组织工程血管支架材料的生产方法，其特征在于：所述种子醪液中菌株的浓度为0.5％～95％。

4、根据权利要求1所述的组织工程血管支架材料的生产方法，其特征在于：所述透氧材料是指硅胶、银基三氧化二铝、GEOR-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、SYNPERTEX、TEXAPROE、DENTIKS或KING-TEX。

5、根据权利要求1所述的组织工程血管支架材料的生产方法，其特征在于：所述初级组织工程血管支架材料两孔之间平均距离为50nm～100nm。

6、一种权利要求1所述的组织工程血管支架材料的生产方法制备得到的组织工程血管支架材料。