CN102657561A - 一种复合结构人造血管的静态制备方法 - Google Patents

一种复合结构人造血管的静态制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种复合结构人造血管的静态制备方法，包括：通过机织、针织、编织或非织造得到人造血管的管坯，然后将所述的管坯置于细菌纤维素生物反应器中，用第一管状部件穿过管坯，第一管状部件和第二管状部件与管坯之间分别留有空隙，高温灭菌后，向第一管状部件与第二管状部件的间隙中倒入含细菌纤维素生产菌株的液体培养基，再向第一管状部件内注入氧气或空气，并将密闭容器中充满氧气或空气，最后于20～32℃下静态培养2-20天，即可。本发明的血管径向轴向的强伸性能好、管壁薄符合人造血管的要求，管壁密闭性好，不需要预凝血；本发明的制备方法简单，纳米细菌纤维素涂层生物相容性和生物力学性能好。

Description

一种复合结构人造血管的静态制备方法
技术领域
本发明属于人造血管的制备领域，特别涉及一种复合结构人造血管的静态制备方法。
背景技术
目前大口径血管移植物在临床应用中已经取得了较好的效果，但普通小口径人造血管几乎没有抗血栓性。
我国知识产权系统显示，目前已有知识产权项目通过对血管内壁进行表面修饰的方法减少血栓的形成，如专利申请号为200610166568.6的《一种织物增强的复合人造血管》中提出由抗凝血层、织物增强层和弹性粘结层组成的复合人造血管，在一定程度上提高了人造血管通畅率；但织物增强层与抗凝血层之间需要弹性粘结层连接，致使管壁较厚，不利于应用在小口径人造血管上，且其结构复杂，制备困难，涂层量不可控。
常见的医用人造血管材料一般为疏水性材料表面自由能高，材料本身易与血浆蛋白发生相互作用，形成附壁血栓。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种复合结构人造血管的静态制备方法，该人造血管的内径可以≤6mm，血管径向轴向的强伸性能好、管壁更薄更符合小口径血管的要求，该制备方法简单，涂层与管坯之间的粘附力好，不易剥离。
本发明的一种复合结构人造血管的静态制备方法，包括：
通过机织、针织、编织或非织造得到人造血管的管坯，然后将所述的管坯置于细菌纤维素生物反应器中，用第一管状部件穿过管坯，使得管坯与所述的第一管状部件同轴套于第二管状部件的管腔内，且第一管状部件和第二管状部件与管坯之间分别留有空隙；高温灭菌后，向第一管状部件与第二管状部件的间隙中倒入含细菌纤维素生产菌株的液体培养基，再向第一管状部件内注入氧气或空气，并将密闭容器中充满氧气或空气，最后于20～32℃下静态培养2-20天后在管坯内外表面复合上一层纳米纤维素膜，即可。
所述的非织造为针刺或水刺法。
所述的含细菌纤维素生产菌株的液体培养基的制备方法为将细菌纤维素生产菌株接入液体培养基中扩培，于20-30℃、100-250r/min条件下摇床培养或者静置培养12～48h。
所述的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)或红茶菌(kombucha)。
所述管坯由有机或者无机物组成，为高分子聚合物、多糖类、纤维素、纤维素衍生物、琼脂、甲壳素、壳聚糖、壳聚糖衍生物、纱布、棉布、纸张、海藻酸类、透明质酸、多肽、蛋白质、明胶、胶原、真丝、羊毛、聚谷氨酸、硅胶、橡胶、木材、淀粉、塑料、涤纶、丙纶、尼龙、奥纶、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯乙醇、聚四氟乙烯、聚丙烯酰胺、二氧化硅、玻璃、陶瓷、紫砂、金属、金属盐、金属氧化物中的一种或几种。
本发明所用的细菌纤维素生物反应器，包括密闭容器，第二管状部件，第一管状部件和圆柱空心塞；所述第一管状部件与第二管状部件同轴套于第二管状部件管腔内，第二管状部件的开口处通过圆柱空心塞与第一管状部件密封，第一管状部件与第二管状部件的间隙为倒入发酵培养基的空间；所述的第二管状部件，第一管状部件和圆柱空心塞皆位于密闭容器内；所述的第一管状部件和第二管状部件的材料均为具有透气但不透水性能的材料。
所述的第一管状部件和第二管状部件均为圆柱状、多岔管状或手形中空状。
所述的第二管状部件和第一管状部件的横截面形状均为圆形、方形、椭圆形、三角形、心形、菱形或五角星形。
所述的第一管状部件的下端可密闭于第二管状部件和圆柱空心塞内(如图1所示)，也可伸出圆柱空心塞(如图2所示)。
所述的具有透气但不透水性能的材料选自硅胶、陶瓷、纸、玻璃纸、无纺布、紫砂、尼龙、奥纶、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚乙烯乙醇、涤纶、特氟纶、膨体聚四氟乙烯、真丝、尼龙纤维、涤纶纤维、丙纶纤维、再生纤维素纤维、GERO-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、TEXAPROE、DENTIKS、KING-TEX中的一种或几种组合。
所述的细菌纤维素生物反应器在使用时，将管坯与所述的第一管状部件同轴套于第二管状部件管腔内。
本发明的设计方案：
1)材料
依据使用要求，管坯的材料使用纤维材料。这些材料可以是具有生物相容性的医用高分子材料。
纳米纤维素涂层使用细菌发酵得到的纳米纤维素。
2)管坯结构设计
管坯的管壁采取机织、针织、编织或非织造结构，通过采用比较合适的纱线排列和配比、再加上与之相对应的加工方式，实现一种人造血管管壁上带有较大孔隙但结构稳定的织物结构。
3.)纳米纤维素覆膜
基本技术路线如下：
将管坯置于细菌纤维素生物反应器(如图1或图2所示)中，用管状部件穿过管坯，管状部件和与管坯之间分别留有空隙，高温灭菌后，在反应器中倒入无菌的发酵培养基、接入细菌纤维素生产菌种子液，置于一定温度下静态培养2-20天后在管坯内外表面复合上一层纳米纤维素膜，最后将制备的复合结构人造血管材料从模具上取下，然后浸泡于0.5～2wt％的NaOH溶液中，70-100℃水浴处理30-120min，使细菌纤维素材料呈白色半透明后即可，洗涤至中性，即得细菌纤维素复合结构人造血管产品。
本发明得到的复合结构人造血管包括：纺织基的管坯和纳米纤维素涂层，所述管坯的内径可以小于或等于6mm；所述管坯的管壁结构为机织、针织、编织或非织造，其孔隙较大且结构稳定；所述管坯的材料为纤维材料。
本发明将纺织基的管坯浸在培养液中，细菌产生的纳米纤维素在纺织基管坯上以贯穿结构生长形成纤维素涂层，最终形成细菌纤维素涂层的人造血管。
纳米细菌纤维素在纺织基管坯上直接生长，形成贯穿结构的涂层，克服了上述小口径血管结构复杂、制备困难的问题；管坯为单层纺织基，且为了满足纳米细菌纤维素涂层要求，管坯具有大孔隙和结构稳定的性能，得到的小血管管壁更薄；纳米细菌纤维素涂层是由细菌分泌，以贯穿的形式生长粘附到纺织基管坯上，可通过控制生长时间、生长条件等控制其生长的量和方向，所以涂层量可控且涂层更均匀；纳米纤维素涂层具有较高的生物相容性和优异的生物力学性能，且为亲水性材料表面自由能低，材料本身不易与血浆蛋白发生相互作用，防止附壁血栓形成，提高了小口径人造血管的通畅率。
有益效果
(1)本发明的管坯为单层纺织基，具有大孔隙和结构稳定的性能，得到的小血管径向轴向的强伸性能好、管壁更薄更符合小口径血管的要求；
(2)纳米细菌纤维素在纺织基管坯上直接生长，形成贯穿结构的涂层，结构简单、制备容易，涂层与管坯之间的粘附力好，不易剥离；
(3)纳米细菌纤维素涂层是由纤维素细菌分泌，以贯穿的形式生长粘附到纺织基管坯上，可通过控制生长时间、生长条件等控制其生长的量和方向，所以涂层量和均匀性人为可控；
(4)纳米细菌纤维素涂层具有较高的生物相容性和优异的生物力学性能，且为亲水性材料表面自由能低，材料本身不易与血浆蛋白发生相互作用，有效防止附壁血栓形成。
(5)纳米纤维素涂层的人造血管管壁密闭性好，不需要预凝血，后整理工序可以适当简化。
附图说明
图1和图2为本发明所用的细菌纤维素生物反应器的装置剖视图；图中：1-密闭容器，2-第二管状部件，3-第一管状部件，4-管坯，5-圆柱空心塞，6-倒入发酵培养基的空间(空隙)；
图3为实施例1中粘胶纤维管坯或者棉纤维管坯涂覆纳米纤维素的扫描电镜照片；
图4为实施例1中纱罗组织的管状组织的组织图；
图5为实施例1中纤维素涂层的管壁；
图6为实施例2中纬平针组织的组织图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
管坯的材料采用50D/12f的粘胶有光丝；经纬纱结构为三股合编；管坯组织采用基础组织为纱罗组织的管状组织(如图5所示由地经7、绞经8和纬纱9编织而成)。织物参数：经密*纬密(根/10cm)为400*100，折径(mm)为10，总经根数(根)为40。
织造组织图见图4。选择木醋杆菌发酵的纤维素对管坯进行涂层。在生物反应器(图1或图2)中发酵培养2-20天，最终制得细菌纤维素涂层的人造血管。
发酵培养工艺：
(1)菌种培养：将木醋杆菌(Acetobacter xylinum)接入300mL液体培养基(每1L水中，甘露醇20g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0，121℃灭菌20min；或葡萄糖200g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO4 2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min)扩培，于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养12h后备用；
(2)细菌纤维素复合人造血管的发酵制备：用第一管状部件3穿过管坯4，使得管坯4与所述的第一管状部件3同轴套于第二管状部件2管腔内，第一管状部件3和第二管状部件2与管坯4之间分别留有空隙，向生物反应器(图1)的空隙6中，注满步骤(1)制备的含生产菌株的液体培养基，并确保不漏液，然后向第一管状部件3内注入氧气或空气，并将整个发酵装置(即密闭容器(1)中充满氧气或空气)放入充满氧气或空气的环境中，于20～32℃进行发酵培养2-20天，细菌纤维素产生菌便会在第二管状部件2的内表面和第一管状部件3的外表面上分别合成纤维素，并最终穿过管坯4并与其复合形成一个具备模具形状的细菌纤维素复合结构人造血管整体材料，材料的SEM照片见图3。
实施例2
管坯的材料采用50D/12f的粘胶有光丝；纱线结构为三股合编；组织采用基础组织为纬平针组织的针织管状组织。织物参数：经密*纬密(个/5cm)为35*55，针筒直径(mm)为6。
织造组织图见图6。选择葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)发酵的纤维素对管坯进行涂层。在生物反应器(图1)中发酵培养2-20天，最终制得细菌纤维素涂层的人造血管。涂覆纳米纤维素的人造血管材料的电镜照片与图3结果类似。
发酵培养工艺：
(1)菌种培养：将葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)接入300mL液体培养基(每1L水中，甘露醇20g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0，121℃灭菌20min；或葡萄糖200g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO4 2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min)扩培，于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养12h后备用；
(2)细菌纤维素复合人造血管的发酵制备：用第一管状部件3穿过管坯4，使得管坯4与所述的第一管状部件3同轴套于第二管状部件2管腔内，第一管状部件3和第二管状部件2与管坯4之间分别留有空隙，向生物反应器(图1或图2)的空间6中，注满步骤(1)制备的含生产菌株的液体培养基，并确保不漏液，然后向第一管状部件3内注入氧气或空气，并将整个发酵装置放入充满氧气或空气的环境中，于20～32℃进行发酵培养2-20天，细菌纤维素产生菌便会在第二管状部件2的内表面和第一管状部件3的外表面上分别合成纤维素，并最终穿过管坯4并与其复合形成一个具备模具形状的细菌纤维素复合结构人造血管材料。
实施例3
管坯的纱线采用50D/12f的粘胶有光丝；组织采用基础组织为绳编管状组织。织物参数：纱管个数为32，芯筒直径(mm)为6。
选择红茶菌(kombucha)发酵的纤维素对管坯进行涂层。在生物反应器(图1)中发酵培养1-7天，最终制得细菌纤维素涂层的小口径人造血管。涂覆纳米纤维素的人造血管材料的电镜照片与图2结果类似。
发酵培养工艺：
(1)菌种培养：将红茶菌(kombucha)按接入5片直径0.5cm圆片含菌BC膜的接种量接入300mL液体种子培养基(每1L水中，绿茶5g，葡萄糖10、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0，巴氏灭菌30min；每1L水中，葡萄糖100g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH7.5，121℃灭菌20min)扩培，于25℃、150r/min条件下摇床培养或者静置培养24h后备用；
(2)细菌纤维素复合人造血管的发酵制备：用第一管状部件3穿过管坯4，使得管坯4与所述的第一管状部件3同轴套于第二管状部件2管腔内，第一管状部件3和第二管状部件2与管坯4之间分别留有空隙，向生物反应器(图1或图2)的空间6中，注满步骤(1)制备的含生产菌株的液体培养基，并确保不漏液，然后向第一管状部件3内注入氧气或空气，并将整个发酵装置放入充满氧气或空气的环境中，于20～32℃进行发酵培养2-20天，细菌纤维素产生菌便会在第二管状部件2的内表面和第一管状部件3的外表面上分别合成纤维素，并最终穿过管坯4并与其复合形成一个具备模具形状的细菌纤维素复合结构人造血管整体材料。
实施例4
管坯的纱线采用50D/12f的壳聚糖纤维；组织采用基础组织为绳编管状组织。织物参数：纱管个数为32，芯筒直径(mm)为6。
选择木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)发酵的纤维素对管坯进行涂层。在生物反应器(图1或图2)中发酵培养1-7天，最终制得细菌纤维素涂层的小口径人造血管。涂覆纳米纤维素的人造血管材料的电镜照片与图2结果类似。
发酵培养工艺：
(1)菌种培养：将木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)接入300mL液体培养基(每1L水中，甘露醇20g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3.0，121℃灭菌20min；或葡萄糖200g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO4 2.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min)扩培，于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养12h后备用；
(2)细菌纤维素复合人造血管的发酵制备：用第一管状部件3穿过管坯4，使得管坯4与所述的第一管状部件3同轴套于第二管状部件2管腔内，第一管状部件3和第二管状部件2与管坯4之间分别留有空隙，向生物反应器(图1或图2)的空间6中，注满步骤(1)制备的含生产菌株的液体培养基，并确保不漏液，然后向第一管状部件3内注入氧气或空气，并将整个发酵装置放入充满氧气或空气的环境中，于20～32℃进行发酵培养2-20天，细菌纤维素产生菌便会在第二管状部件2的内表面和第一管状部件3的外表面上分别合成纤维素，并最终穿过管坯4并与其复合形成一个具备模具形状的细菌纤维素复合结构人造血管整体材料。
实施例5
本发明所用的细菌纤维素生物反应器，包括密闭容器1，第二管状部件2，第一管状部件3和圆柱空心塞5；所述第一管状部件3与第二管状部件2同轴套于第二管状部件2管腔内，第二管状部件2的开口处通过圆柱空心塞5与第一管状部件3密封，第一管状部件3与第二管状部件2的间隙为倒入发酵培养基的空间6；所述的第二管状部件2，第一管状部件3和圆柱空心塞5皆位于密闭容器1内；所述的第一管状部件3和第二管状部件2的材料均为具有透气但不透水性能的材料。
所述的第一管状部件3和第二管状部件2为圆柱状，或多岔管状，或手形中空状。
所述的第二管状部件2和第一管状部件3的横截面形状为圆形、方形、椭圆形、三角形、心形、菱形或五角星形。
所述的第一管状部件3的下端可密闭于第二管状部件2和圆柱空心塞5内(如图1所示)，也可伸出圆柱空心塞5(如图2所示)。
所述的具有透气但不透水性能的材料选自硅胶、陶瓷、纸、玻璃纸、无纺布、紫砂、尼龙、奥纶、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚乙烯乙醇、涤纶、特氟纶、膨体聚四氟乙烯、真丝、尼龙纤维、涤纶纤维、丙纶纤维、再生纤维素纤维、GERO-TEX、EVENT、ADVANCE-TEX、TEXAPROE、DENTIKS、KING-TEX中的一种或几种组合。
所述的细菌纤维素生物反应器在使用时，将管坯4与所述的第一管状部件3同轴套于第二管状部件2管腔内。

Claims (7)

1.一种复合结构人造血管的静态制备方法，包括：
通过机织、针织、编织或非织造得到人造血管的管坯(4)，然后将所述的管坯(4)置于细菌纤维素生物反应器中，用第一管状部件(3)穿过管坯(4)，使得管坯(4)与所述的第一管状部件(3)同轴套于第二管状部件(2)的管腔内，且第一管状部件(3)和第二管状部件(2)与管坯(4)之间分别留有空隙，高温灭菌后，向第一管状部件(3)与第二管状部件(2)的间隙(6)中倒入含细菌纤维素生产菌株的液体培养基，再向第一管状部件(3)内注入氧气或空气，并将密闭容器(1)中充满氧气或空气，最后于20～32℃下静态培养2-20天，即可。
2.根据权利要求1所述的一种复合结构人造血管的静态制备方法，其特征在于：所述的非织造为针刺或水刺法。
3.根据权利要求1所述的一种复合结构人造血管的静态制备方法，其特征在于：所述的含细菌纤维素生产菌株的液体培养基的制备方法为将细菌纤维素生产菌株接入液体培养基中扩培，于20-30℃、100-250r/min条件下摇床培养或者静置培养12～48h。
4.根据权利要求1或3所述的一种复合结构人造血管的静态制备方法，其特征在于：所述的细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(Gluconobactersp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonascepacia)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)或红茶菌(kombucha)。
5.根据权利要求1所述的一种复合结构人造血管的静态制备方法，其特征在于：所述管坯(4)由有机或者无机物组成，为高分子聚合物、多糖类、纤维素、纤维素衍生物、琼脂、甲壳素、壳聚糖、壳聚糖衍生物、纱布、棉布、纸张、海藻酸类、透明质酸、多肽、蛋白质、明胶、胶原、真丝、羊毛、聚谷氨酸、硅胶、橡胶、木材、淀粉、塑料、涤纶、丙纶、尼龙、奥纶、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯乙醇、聚四氟乙烯、聚丙烯酰胺、二氧化硅、玻璃、陶瓷、紫砂、金属、金属盐、金属氧化物中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的一种复合结构人造血管的静态制备方法，其特征在于：所述的第一管状部件(3)和第二管状部件(2)均为圆柱状、多岔管状或手形中空状。
7.根据权利要求1所述的一种复合结构人造血管的静态制备方法，其特征在于：所述的第二管状部件(2)和第一管状部件(3)的横截面形状均为圆形、方形、椭圆形、三角形、心形、菱形或五角星形。
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