CN110101915A - 聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法及制得的人造血管与血管补片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法及制得的人造血管与血管补片，本发明人造血管用材料包括两层：内层为静电纺丝聚氨酯与细菌纤维素复合层，外层为防渗血的致密层；两层膜之间结合紧密，不可分离。该人造血管用材料通过如下方法获得：将聚氨酯溶解于溶剂中，得到均匀的聚氨酯溶液；然后将聚氨酯溶液静电纺于芯轴装置上，得到内膜支撑层；然后将内膜支撑层置于培养液中静态发酵得到静电纺丝管与细菌纤维素复合层，并进行去除细菌内毒素处理，得到内膜层；接着干燥后的内膜层上进行电喷，获得致密的外膜层。依据本发明方法所提供的人造血管与血管补片具有优异的生物相容性、极低的细胞毒性及优良的防渗血性能。

Description

聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法及制得的人造血管与 血管补片

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域；具体地，涉及一种聚氨酯复合人造血管用材 料的制备方法及制得的人造血管与血管补片。

背景技术

人工血管是一种修复和替代病变血管的假体，是一种非自体来源的器官和组 织的血管代用品。随着科学理论、工程技术和材料工业的进步，以及组织工程学、 基因工程学的飞速发展，各类人工血管大量涌现，并广泛应用于临床手术中，极 大地造福了各类血管疾病患者。

细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是由微生物分泌到胞外的一种多糖类 高分子聚合物，具有纳米纤维网络结构、高结晶度、良好的生物相容性等。由于 其独特的性质，已在造纸、食品、美容、医用敷料、人造皮肤等领域已经进入了 实用化阶段。作为功能材料应用于人造血管的开发，将有效提升血管的生物相容 性及为血管功能化提供可能。但在木醋杆菌发酵生成细菌纤维素的过程中，会产 生大量的细菌内毒素(Endotoxin)。

细菌内毒素是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可 激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发 热。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖。因而，最好是能提供一种低内毒素的 聚氨酯复合人工血管，使其更贴近临床上的要求。

发明内容

本发明的主要目的是为了克服现有技术中存在的上述人造血管应用时的缺 陷，提供一种聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法及制得的人造血管与血管补 片，本发明制备的人造血管材料为复合结构，能通过简单可行的方法去除内毒素， 使本发明人造血管达到理想的血液相容性。

为了实现上述目的，在基础的实施方案中，本发明一方面提供一种聚氨酯复 合人造血管用材料的制备方法，包括如下步骤：

S1：将聚氨酯溶于溶剂中，得到均匀的聚合物溶液，分别作为静电纺丝液及 电喷液；

S2：将步骤S1中的静电纺丝液在芯轴上进行静电纺丝，真空干燥后得到血 管内膜支撑层；

S3：将步骤S2所得的内膜支撑层置于培养液中静态发酵得到内膜支撑层与 细菌纤维素复合的内膜层，并进行去除细菌内毒素处理，干燥；

S4：在步骤S3得到的干燥内膜层上，采用步骤S1中得到的电喷液进行电喷 得到致密外膜层，由此获得人造血管用材料；

其中，所述的去除细菌内毒素处理，包括：

a)将所述内膜层浸入在生理盐水中，水浴50～60℃处理30～60min，然后PBS 生理盐水洗脱液反复洗脱，去除培养基残留；

b)将经步骤a)处理后的内膜层浸入到0.1～0.2mol/L的柠檬酸溶液中70～80℃处理60～90min，初步去除残留的内毒素；

c)将经步骤b)处理后的内膜层浸入到1～2％的Triton X-114水溶液中50～60℃水浴60～90min，然后30℃去离子水冲洗3～5min，重复上述操作3～5次；

d)将经步骤c)处理后的内膜层置于无水乙醇中浸渍90～120min，之后采用 去离子水反复冲洗去除残留无水乙醇。

在一种优选的实施方案中，步骤S1中，所述溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)，N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)，丙酮，四氢呋喃(THF)，六氟异丙醇(HFIP) 中的一种或多种。

在一种优选的实施方案中，步骤S1中，所述聚氨酯的溶剂为N,N-二甲基乙 酰胺，形成的聚合物溶液质量分数为15～50wt％。

在一种优选的实施方案中，步骤S1中，所述聚氨酯的重均分子量为1万～ 100万，优选为10万～60万。

在一种优选的实施方案中，步骤S1中，在同一人造血管用材料的制备步骤 中，电喷液的浓度比静电纺丝液的浓度高。低浓度的纺丝液形成疏松多孔隙率的 支撑层，以利于细菌纤维素附着、与其集合更牢固；高浓度的电喷液形成致密的 纤维层加强血管的力学性能。

在一种优选的实施方案中，步骤S2中，所述静电纺丝包括：将所述聚合物 溶液注入静电纺丝设备的注射器中，在注射器的前端加上直径为0.3～0.7mm的不 锈钢针头，设置纺丝电压为18～40kv，纺丝速率为0.5～3mL/h，接收距离为10～25cm， 温度为20-60℃，相对湿度为10％-50％RH的条件下，在旋转接收器上进行静电 纺丝得到聚氨酯内膜支撑层，纺丝时间为0.5～20小时，旋转接收器转速为 50～500r/min。在室温下真空干燥1～5小时，去除残留溶剂，得到所述内膜支撑层。

在一种优选的实施方案中，步骤S2中，所述内膜支撑层的厚度为0.2～0.5mm。

在一种优选的实施方案中，步骤S3中，所述在内膜支撑层上复合细菌纤维 素，包括：将所述内膜支撑层两端用硅胶塞密闭，一端硅胶塞内连接通入氧气的 导管，氧气通入过程中保持压力为0.001Mpa，将通入氧气的内膜支撑层水平至 于培养液内，静置原位培养5～7天，之后反复冻融干燥；

所述培养液为酵母粉0.3～0.6％，葡萄糖2～3％，柠檬酸0.1～0.3％，蛋白胨 0.3～0.6％，无水磷酸氢二钠0.2～0.3％，七水硫酸镁0.05％，乙醇1.0％，生物素 15～25mg/L，烟酰胺3～6mg/L，pH值＝6.0；将培养液密封于120℃高温蒸汽灭菌 20～30min，冷却后制备完成培养液。

在一种优选的实施方案中，步骤S4中，所述电喷包括：第一次电喷、第二 次电喷、…..第n次电喷，获得致密外膜层，其中，所述第一次电喷过程中包括 电喷、停止、电喷、停止…..多次循环。

在一种优选的实施方案中，所述第一次喷涂中停止时间为5～20min，所述第 一次喷涂、第二次喷涂及第n次喷涂的时间为5～50min。

在一种优选的实施方案中，所述第n次喷涂的n值≥3。

在一种优选的实施方案中，所述第n次喷涂的n值为3～8。即便是高浓度纺 丝液仍含有大量的溶剂，单次短时间电喷可微量控制附着在纤维表面的溶液量。 但是单次电喷所含有的溶质不足以完整覆盖在纤维表面形成一定厚度的致密膜， 所以需要间歇重复多次，达到完整覆盖的目的的同时能使电喷溶液的溶剂有足够 时间挥发。

在一种优选的实施方案中，步骤S4中，所述第一次喷涂、第二次喷涂及第n 次喷涂分别采用的聚合物溶液浓度依次增加。溶度范围均须在电喷技术可接受的 范围内，即能被电场牵引喷出溶液。首先流动性较高的低浓度的溶液进行多次电 喷，可让电喷液与纤维紧密无缝接触；待电喷干燥后高浓度可减少溶剂附着同时 在较低时间内达到一定厚度的致密膜。

优选地，所述第一次喷涂、第二次喷涂及第n次喷涂采用的聚合物浓度分别 为15-35％、18-40％及20-60％。

在一种优选的实施方案中，步骤S4中，所述第一次喷涂、第二次喷涂及第n 次喷涂包括：

给料速率为0.1～5mL/h，辊筒转速为50～1000rad/min；

更优选地，环境温度为10～50℃，环境湿度为10～60％RH，电压为5～30kV。

本发明的另一个目的是提供上述制备方法制得的人造血管，包括：静电纺丝 聚氨酯与细菌纤维素复合的内膜层，以及电喷致密外膜层。

在一种优选的实施方案中，所述的内膜层厚度为1μm～1000μm，纤维直径为 50nm～5000nm，致密外膜层厚度为1μm～1000μm；

优选地，所述的纤维内层厚度为5μm～700μm，纤维直径为50nm～3000nm， 致密外层厚度为5μm～700μm；

更优选地，所述的纤维内层厚度为50μm～500μm，纤维直径为800nm～ 3000nm，致密外层厚度为10μm～300μm。

需要说明的是，上述公开方法是人造血管用材料的制备方法，因而同样可以 用来制作人造的血管补片，其功能与现有血管补片相同，不予赘述。

本发明还提供了上述制备方法制得的人造血管的应用，所述人造血管用于体 内血管移植手术或心脏搭桥手术中。

通过上述技术方案，本发明人造血管用材料包括两层：内层为静电纺丝聚氨 酯与细菌纤维素复合层，外层为防渗血的致密层；两层膜之间结合紧密，不可分 离。该人造血管用材料通过如下方法获得：将聚氨酯溶解于溶剂中，得到均匀的 聚氨酯溶液；然后将聚氨酯溶液静电纺于芯轴装置上，得到内膜支撑层；然后将 内膜支撑层置于培养液中静态发酵得到静电纺丝管与细菌纤维素复合层，并进行 去除细菌内毒素处理，得到内膜层；接着干燥后的内膜层上进行电喷，获得致密 的外膜层。本发明所提供的人造血管与血管补片具有优异的生物相容性、极低的 细胞毒性及优良的防渗血性能；本发明所提供的方法均采用已成熟的技术，具有 可操作性强、适应性强及易于规模化生产等特点。另外，本发明中去除内毒素的 方法操作简单，去除效果好，可以很好的避免聚氨酯内膜支撑层被强碱性溶液水解破坏。

附图说明

图1为本发明实施例1获得的人造血管的截面SEM示意图。

图2为本发明实施例1中使用的可密闭的发酵装置示意图。

图3为水渗漏性测试仪器图。

图4为三种人造血管水渗透量测试实验结果对比示意图。

附图标记说明：1.1-内膜层，1.2-致密外膜层。2.1-无菌罩，2.2、2.6-密封塞子，2.3-硅胶管，2.4-培养液，2.5-电纺管，2.7-通气软管。

具体实施方式

为了更好的理解上述技术方案，下面通过具体实施例对本申请技术方案做详 细的说明，应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案 的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实 施例以及实施例中的技术特征可以相互结合。应当理解的是，这里所使用的术语 “和/或”包括其中一个或更多所列出的相关联项目的任意和所有组合。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范 围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的 端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼 此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公 开。

现有技术中试图利用静电纺丝技术制备多层纤维结构的人造血管。但由于纤 维间以及层与层之间存在较大的空隙导致血液从纤维间隙中渗出后会使层与层 之间出现剥离，即在临床上出现假性动脉瘤。也有些用于动静脉造瘘的人造血管 通过减小孔隙率达到一定的防渗漏目的，但是结构上，该人造血管并不具备防渗 血功能且不具备足够强度的血管壁。

因此，申请人研究发现，为了获得性能优异的人造血管，需要对于血管进行 合理选材并对结构进行优化调控。静电纺丝技术是一项操作简便并能对材料结构 进行精细调控的技术，调控尺度可从纳米至微米级，且可获得类细胞骨架矩阵的 结构。因而，采用静电纺丝技术制备本发明实施例复合人造血管的内层结构，可 获得促血管内膜生成的微观结构，从而获得长期通畅率。电喷是在纤维表面聚集， 故能使接触电喷层内纤维层中的纤维融合达到与内层纤维紧密接触的效果。利用 电喷技术微量喷液及高浓度溶液低溶剂含量的特点，使喷在内层纤维的溶液能且 仅仅足够融合内层最表面的纤维但不能继续融合内层深层纤维。待电喷液干燥后 形成初步微渗层，此时该微渗层较内层纤维的孔隙率已大大降低；然后重复微量 喷液将微渗层的孔隙率逐步减小直到消除孔隙，再增大喷液量完成电喷致密外层 的结构。以此获得复合人造血管。另外，通过控制聚合物溶液中溶剂的挥发速率， 也可获得复合紧密的纺丝内层和致密外层结构。致密外层和纺丝内层结构可提供 人造血管所需要的防渗血性能。

以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。实施例中所用的材料 可通过市售渠道获得。

实施例1

本实施例制备两层结构聚氨酯复合细菌纤维素人工血管，包括如下步骤：

1)将医用级聚氨酯粒料(PU)溶于N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中分别配 制成15wt％和25％的溶液，在静电纺丝前搅拌混合均匀，于真空度为0.085Mpa去 除溶液中的气泡；

2)将步骤1)中得到的15wt％聚氨酯-DMAc溶液注入静电纺丝设备的注射器 中，在注射器的前端加上直径为0.6mm的不锈钢针头，旋转接收器滚筒直径6mm， 转速为400r/min，在温度50～55℃，湿度45～50％RH，电压为17kv，溶液流速 1.5mL/h，旋转接收器距离不锈钢针头为15cm的条件下进行静电纺丝得到内径 6mm的聚氨酯内膜支撑层，在室温真空干燥3小时；

3)将步骤3)中得到的聚氨酯内膜支撑层用75％消毒酒精30℃超声120min， 取出，去离子水水浴30℃超声30min，重复操作一次，将聚氨酯内膜支撑层除去 残留DMAc溶剂后环氧乙烷灭菌备用；

4)按照酵母粉0.5％，葡萄糖2.5％，柠檬酸0.2％，蛋白胨0.5％，无水磷酸氢 二钠0.27％，七水硫酸镁0.05％，乙醇1.0％，生物素20mg/L，烟酰胺5mg/L，pH 值＝6.0，配制成发酵培养基，将配制好的发酵培养基密封于120℃蒸汽高温灭菌；

5)将步骤3)中得到的聚氨酯内膜支撑层放置在步骤4)中的发酵装置中(如 图2所示)，带有氧气通入的肝素培养基无菌罩中培养7天，小心取出后，聚氨酯 内膜支撑层连同外层细菌纤维素凝胶膜，一起入0.1M的柠檬酸溶液中80℃处理60 min，后浸入1％的TritonX-114水溶液中60℃水浴60min，然后30℃去离子水冲洗 5min，重复上述操作3次，最后在无水乙醇中浸渍120min，去离子水反复冲洗去 除残留无水乙醇。此操作步骤以完全去除残留的培养基及菌体，样品反复冻融干 燥，得到去除内毒素的内膜层；

6)采用步骤1)中得到的25wt％聚氨酯-DMAc溶液在上述经过步骤5)处 理得到的内膜层上电喷，得到内径6mm的致密外膜层，在室温真空干燥3小时 去除残留溶剂；其中：上述电喷参数包括：给料速率为3mL/h，辊筒转速为 500rad/min；环境温度为25℃，环境湿度为30％RH，电压为15kV。

将本发明实施例1制备的复合人造血管、NicastAVflo人造血管和单层静电 纺丝人造血管进行水渗漏性测定。水渗漏性测试(仪器见附图3)均依据《中华 人民共和国医药行业标准YY-0500-2004》进行测试和结果表征。

水渗透性的测试过程如下：室温下，取有效长度14cm人造血管样品，以毫 米为单位精确到士0.5mm。选用16G穿刺针以0.5cm间隔穿刺，分别进行0、8、 16和24次穿刺后在相当于16千帕的静水压下，测单位时间内透过样本单位面积 上的水渗出量。每种血管均取3组，每组各4个样品，实验数据以平均值记录保 存。水渗漏性测试实验结果表明：经过穿刺后的人造血管的水渗透量均有所上升。 但在相同穿刺次数情况下，本发明实施例复合人造血管的穿刺后的水渗透量低于 Nicast人造血管水渗透量且远低于单层静电纺纤维人造血管水渗透量(见附图4)。 实验结果证明本发明实施例复合人造血管防渗血性能优良。图1为本发明实施例 1获得的人造血管的截面SEM示意图。

所述细菌纤维素中的内毒素去除效率，通过《中华人民共和国药典》(2015 版四部：1143细菌内毒素检查法)，检测实施例1中制备的复合人工血管细菌内 毒素，结果显示未检出内毒素；

根据动态浊度法检测细菌内毒素的方法，检测实施案例1中制备的复合人造 血管细菌内毒素为0.2EU/ml。

实施例2

本实施例制备两层结构聚氨酯复合细菌纤维素人工血管，包括如下步骤：

1)将医用级聚氨酯粒料(PU)溶于N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中分别配 制成15wt％和25％、35％、50％的溶液，在静电纺丝前搅拌混合均匀，于真空度 为0.085Mpa去除溶液中的气泡；

2)将步骤1)中得到的15wt％聚氨酯-DMAc溶液注入静电纺丝设备的注射器 中，在注射器的前端加上直径为0.3mm的不锈钢针头，旋转接收器滚筒直径6mm， 转速为500r/min，在温度20℃，湿度50％RH，电压为40kv，溶液流速1.5mL/h，旋 转接收器距离不锈钢针头为15cm的条件下进行静电纺丝3h得到内径6mm的聚氨 酯内膜支撑层，在室温真空干燥3小时；

3)将步骤3)中得到的聚氨酯内膜支撑层用75％消毒酒精30℃超声120min， 取出，去离子水水浴30℃超声30min，重复操作一次，将聚氨酯内膜支撑层除去 残留DMAc溶剂后环氧乙烷灭菌备用；

4)按照酵母粉0.6％，葡萄糖2％，柠檬酸0.3％，蛋白胨0.3％，无水磷酸氢二 钠0.27％，七水硫酸镁0.05％，乙醇1.0％，生物素25mg/L，烟酰胺3mg/L，pH值 ＝6.0，配制成发酵培养基，将配制好的发酵培养基密封于120℃蒸汽高温灭菌；

5)将步骤3)中得到的聚氨酯内膜支撑层放置在步骤4)中的发酵装置中， 带有氧气通入的肝素培养基无菌罩中培养7天，小心取出后，聚氨酯内膜支撑层 连同外层细菌纤维素凝胶膜，一起入0.2M的柠檬酸溶液中70℃处理90min，后 浸入2％的Triton X-114水溶液中50℃水浴90min，然后30℃去离子水冲洗3min， 重复上述操作5次，最后在无水乙醇中浸渍90min，去离子水反复冲洗去除残留 无水乙醇。此操作步骤以完全去除残留的培养基及菌体，样品反复冻融干燥，得 到去除内毒素的内膜层；

6)a)调节溶液浓度为25％(w/v)，给料速率为0.2mL/h，辊筒转速为60rad/min， 环境温度为30℃，环境湿度10％RH，电压30kV，进行电喷15min后停止10min。 待微量的电喷液在内层纤维表面附着并与纤维进行融合，减小纤维层孔隙率。

b)电喷15min后停止10min使电喷液与纤维二次融合并进一步减少孔隙率。

c)调节浓度为35％(w/v)，给料速率为1.8mL/h，辊筒转速为150rad/min，电 喷20min消除孔隙率并形成较薄的致密电喷膜。

d)调节浓度为50％(w/v)，给料速率为0.5mL/h，辊筒转速为700rad/min，电 喷30min使电喷液在较薄的致密电喷膜表面聚集、干燥形成一定厚度的致密外层。

经测量，静电纺丝纤维内层厚度为200μm，纤维直径为1000nm，致密外层 厚度为100μm。

通过动态浊度法定量检测，实施例2中制备的复合人工血管细菌内毒素为0.25EU/ml，满足CFDA的要求。

实施例3

本实施例制备两层结构聚氨酯复合细菌纤维素人工血管，包括如下步骤：

1)将医用级聚氨酯粒料(PU)溶于N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中分别配 制成15wt％和18％、22％的溶液，在静电纺丝前搅拌混合均匀，于真空度为 0.085Mpa去除溶液中的气泡；

2)将步骤1)中得到的15wt％聚氨酯-DMAc溶液注入静电纺丝设备的注射器 中，在注射器的前端加上直径为0.7mm的不锈钢针头，旋转接收器滚筒直径6mm， 转速为50r/min，在温度60℃，湿度10％RH，电压为40kv，溶液流速1.5mL/h，旋 转接收器距离不锈钢针头为10cm的条件下进行静电纺丝10h得到内径6mm的聚氨 酯内膜支撑层，在室温真空干燥3小时；

3)将步骤3)中得到的聚氨酯内膜支撑层用75％消毒酒精30℃超声120min， 取出，去离子水水浴30℃超声30min，重复操作一次，将聚氨酯内膜支撑层除去 残留DMAc溶剂后环氧乙烷灭菌备用；

4)按照酵母粉0.3％，葡萄糖3％，柠檬酸0.1％，蛋白胨0.6％，无水磷酸氢二 钠0.27％，七水硫酸镁0.05％，乙醇1.0％，生物素15mg/L，烟酰胺6mg/L，pH值 ＝6.0，配制成发酵培养基，将配制好的发酵培养基密封于120℃蒸汽高温灭菌；

5)将步骤3)中得到的聚氨酯内膜支撑层放置在步骤4)中的发酵装置中， 带有氧气通入的肝素培养基无菌罩中培养7天，小心取出后，聚氨酯内膜支撑层 连同外层细菌纤维素凝胶膜，一起入0.2M的柠檬酸溶液中75℃处理80min，后 浸入2％的Triton X-114水溶液中60℃水浴60min，然后30℃去离子水冲洗3min， 重复上述操作4次，最后在无水乙醇中浸渍120min，去离子水反复冲洗去除残留 无水乙醇。此操作步骤以完全去除残留的培养基及菌体，样品反复冻融干燥，得 到去除内毒素的内膜层；

6)a)调节聚合物溶液浓度为15％(w/v)，给料速率为3.0mL/h，辊筒转速为 50rad/min，环境温度为50℃，环境湿度50％RH，电压30kV，进行电喷30min 后停止20min。待微量的电喷液在内层纤维表面附着并与纤维进行融合，减小纤 维层孔隙率。

b)电喷30min后停止20min使电喷液与纤维二次融合并进一步减少孔隙率。

c)调节浓度为18％(w/v)，给料速率为4mL/h，辊筒转速为50rad/min，电喷 10min消除孔隙率并形成较薄的致密电喷膜。

d)调节浓度为22％(w/v)，给料速率为0.1mL/h，辊筒转速为80rad/min，电喷30min使电喷液在较薄的致密电喷膜表面聚集、干燥形成一定厚度的致密外层。

经测量，静电纺丝纤维内层厚度为500μm，纤维直径为800nm，致密外层厚 度为300μm。

通过动态浊度法定量检测，实施例3中制备的复合人工血管细菌内毒素为0.22EU/ml，满足CFDA的要求。

实施例4

本实施例制备两层结构聚氨酯复合细菌纤维素人工血管，包括如下步骤：

1)将医用级聚氨酯粒料(PU)溶于N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中分别配 制成15wt％和35％、40％的溶液，在静电纺丝前搅拌混合均匀，于真空度为 0.085Mpa去除溶液中的气泡；

2)将步骤1)中得到的15wt％聚氨酯-DMAc溶液注入静电纺丝设备的注射器 中，在注射器的前端加上直径为0.6mm的不锈钢针头，旋转接收器滚筒直径6mm， 转速为400r/min，在温度50～55℃，湿度45～50％RH，电压为17kv，溶液流速 1.5mL/h，旋转接收器距离不锈钢针头为15cm的条件下进行静电纺丝5h得到内径 6mm的聚氨酯内膜支撑层，在室温真空干燥3小时；

3)将步骤3)中得到的聚氨酯内膜支撑层用75％消毒酒精30℃超声120min， 取出，去离子水水浴30℃超声30min，重复操作一次，将聚氨酯内膜支撑层除去 残留DMAc溶剂后环氧乙烷灭菌备用；

4)按照酵母粉0.5％，葡萄糖2.5％，柠檬酸0.2％，蛋白胨0.5％，无水磷酸氢 二钠0.27％，七水硫酸镁0.05％，乙醇1.0％，生物素20mg/L，烟酰胺5mg/L，pH 值＝6.0，配制成发酵培养基，将配制好的发酵培养基密封于120℃蒸汽高温灭菌；

5)将步骤3)中得到的聚氨酯内膜支撑层放置在步骤4)中的发酵装置中， 带有氧气通入的肝素培养基无菌罩中培养7天，小心取出后，聚氨酯内膜支撑层 连同外层细菌纤维素凝胶膜，一起入0.1M的柠檬酸溶液中80℃处理60min，后 浸入1％的Triton X-114水溶液中60℃水浴60min，然后30℃去离子水冲洗5min， 重复上述操作3次，最后在无水乙醇中浸渍120min，去离子水反复冲洗去除残留 无水乙醇。此操作步骤以完全去除残留的培养基及菌体，样品反复冻融干燥，得 到去除内毒素的内膜层；

6)a)调节溶液浓度为35％(w/v)，给料速率为0.2mL/h，辊筒转速为800rad/min，环境温度为10℃，环境湿度20％RH，电压5kV，进行电喷15min后停止10min。 待微量的电喷液在内层纤维表面附着并与纤维进行融合，减小纤维层孔隙率。

b)电喷15min后停止10min使电喷液与纤维二次融合并进一步减少孔隙率。

c)调节浓度为35％(w/v)，给料速率为0.1mL/h，辊筒转速为300rad/min，电 喷5min消除孔隙率并形成较薄的致密电喷膜。

d)调节浓度为40％(w/v)，给料速率为1.5mL/h，辊筒转速为600rad/min，电 喷20min使电喷液在较薄的致密电喷膜表面聚集、干燥形成一定厚度的致密外层。

其中，所述的纤维内层厚度为50μm，纤维直径为3000nm，致密外层厚度为 10μm。

通过动态浊度法定量检测，实施例3中制备的复合人工血管细菌内毒素为0.21EU/ml，满足CFDA的要求。

Claims (10)

1.一种聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：将聚氨酯溶于溶剂中，得到均匀的聚合物溶液，分别作为静电纺丝液及电喷液；

S2：将步骤S1中的静电纺丝液在芯轴上进行静电纺丝，真空干燥后得到血管内膜支撑层；

S3：将步骤S2所得的内膜支撑层置于培养液中静态发酵得到内膜支撑层与细菌纤维素复合的内膜层，并进行去除细菌内毒素处理，干燥；

S4：在步骤S3得到的干燥内膜层上，采用步骤S1中得到的电喷液进行电喷得到致密外膜层，由此获得人造血管用材料；

其中，所述的去除细菌内毒素处理，包括：

a)将所述内膜层浸入在生理盐水中，水浴50～60℃处理30～60min，然后PBS生理盐水洗脱液反复洗脱，去除培养基残留；

b)将经步骤a)处理后的内膜层浸入到0.1～0.2mol/L的柠檬酸溶液中70～80℃处理60～90min，初步去除残留的内毒素；

c)将经步骤b)处理后的内膜层浸入到1～2％的Triton X-114水溶液中50～60℃水浴60～90min，然后30℃去离子水冲洗3～5min，重复上述操作3～5次；

d)将经步骤c)处理后的内膜层置于无水乙醇中浸渍90～120min，之后采用去离子水反复冲洗去除残留无水乙醇。

2.根据权利要求1所述聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺，丙酮，四氢呋喃(THF)，六氟异丙醇中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述聚氨酯的溶剂为N,N-二甲基乙酰胺，形成的聚氨酯溶液质量分数为15～50wt％。

4.根据权利要求1所述聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述静电纺丝包括：将所述聚合物溶液注入静电纺丝设备的注射器中，在注射器的前端加上直径为0.3～0.7mm的不锈钢针头，设置纺丝电压为18～40kv，纺丝速率为0.5～3mL/h，接收距离为10～25cm，温度为20-60℃，相对湿度为10％-50％RH的条件下，在旋转接收器上进行静电纺丝得到聚氨酯内膜支撑层，纺丝时间为0.5～20小时，旋转接收器转速为50～500r/min。在室温下真空干燥1～5小时，去除残留溶剂，得到所述内膜支撑层。

5.根据权利要求1或4所述聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述内膜支撑层的厚度为0.2～0.5mm。

6.根据权利要求1所述聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述在内膜支撑层上复合细菌纤维素，包括：将所述内膜支撑层两端用硅胶塞密闭，一端硅胶塞内连接通入氧气的导管，氧气通入过程中保持压力为0.001Mpa，将通入氧气的内膜支撑层水平至于培养液内，静置原位培养5～7天，之后反复冻融干燥；

所述培养液为酵母粉0.3～0.6％，葡萄糖2～3％，柠檬酸0.1～0.3％，蛋白胨0.3～0.6％，无水磷酸氢二钠0.2～0.3％，七水硫酸镁0.05％，乙醇1.0％，生物素15～25mg/L，烟酰胺3～6mg/L，pH值＝6.0；将培养液密封于120℃高温蒸汽灭菌20～30min，冷却后制备完成培养液。

7.根据权利要求1所述聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述电喷包括：第一次电喷、第二次电喷、…..第n次电喷，获得致密外膜层，其中，所述第一次电喷过程中包括电喷、停止、电喷、停止…..多次循环；

优选地，所述第一次喷涂中停止时间为5～20min，所述第一次喷涂、第二次喷涂及第n次喷涂的时间为5～50min。

优选地，所述第n次喷涂的n值≥3。

8.根据权利要求1或7所述聚氨酯复合人造血管用材料的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述第一次喷涂、第二次喷涂及第n次喷涂包括：

给料速率为0.1～5mL/h，辊筒转速为50～1000rad/min；

环境温度为10～50℃，环境湿度为10～60％RH，电压为5～30kV。

9.如权利要求1～8任一项所述制备方法制得的人造血管，其特征在于：包括：静电纺丝聚氨酯与细菌纤维素复合的内膜层，以及电喷致密外膜层。

10.根据权利要求9所述的人造血管，其特征在于：所述的内膜层厚度为1μm～1000μm，纤维直径为50nm～5000nm，致密外膜层厚度为1μm～1000μm；

优选地，所述的纤维内层厚度为5μm～700μm，纤维直径为50nm～3000nm，致密外层厚度为5μm～700μm；

更优选地，所述的纤维内层厚度为50μm～500μm，纤维直径为800nm～3000nm，致密外层厚度为10μm～300μm。