CN101348813B - 具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，属于生物领域，涉及具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，特别涉及利用具有渗氧透功能的管材(2)为载体，利用木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812在载体表面生物合成细菌纤维素管，然后将细菌纤维素管与ε-聚赖氨酸复合制备具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法。本发明的方法不需要额外供给氧气，工艺简单，造价较低。该方法制备的细菌纤维素管长度和管径具有可控性，同时具有良好的拉伸性能和抑菌功能，作为食品包装材料以及组织工程支架材料，如肉制品肠衣、血管替代物，具有良好的应用前景。

Description

具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法

技术领域

本发明属于生物领域，涉及具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，特别涉及到利用具有渗氧功能的管材为载体，利用木醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)CGMCC No.1.1812，在载体表面生物合成细菌纤维素管，然后将细菌纤

维素管与ε-聚赖氨酸复合制备具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法。

背景技术

细菌纤维素(bacterial cellulose，简称BC)是某些细菌合成的高分子化合物，具有超精细网状结构，虽然BC和植物或海藻产生的纤维素具有相同的分子结构单元，但BC却具有很多独特的性质如高结晶度、高化学纯度、高抗张强度、高弹性模量、高持水性、良好的生物相容性、生物合成的可调控性等，这些性质是其它来源的纤维无法比拟的。因此在食品、造纸、医学材料、化妆品、化工、废水处理、林业等领域有广泛的应用，成为近年来国际上生物医学材料的研究热点。

目前，生物合成的BC产品形状及性能较单一。产品形状主要是膜状或片状，管状细菌纤维素报导较少。2006年10月25日国家知识产权局公布了“一种人造皮肤用细菌纤维素湿膜的制备方法”，专利申请号：200610026708.X。2007年5月28日国家知识产权局公布了“一种相互粘连多层细菌纤维素膜的制备方法”，专利申请号：200610118317.0。国外虽然有管状细菌纤维素的报导，但其生产工艺较复杂、需要额外供纯氧造价较高、且具有抑菌功能的管状细菌纤维素鲜为人知，而且，由于膜状或片状的细菌纤维素拉伸性能较好，应用较广，而管状产品拉伸性能较差(细菌纤维素管的拉伸强度一般小于1MPa)，其应用受到限制。因此，提供一种制备工艺简单，成本较低、拉伸性能较好、且具有抑菌性能的细菌纤维素管的方法，以丰富细菌纤维素管的品种，更好地满足食品包装和组织工程支架材料等方面的需要，是当务之急。

发明内容

要解决的问题：

本发明的目的是针对上述问题，提供一种工艺简单、成本较低、拉伸性能和抑菌性能较好的细菌纤维素管的制备方法，为拓展细菌纤维素的应用领域奠定基础。

技术方案

具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于：利用具有渗氧透功能的管材2为载体，利用木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCCNo.1.1812，在载体表面生物合成细菌纤维素管，然后将细菌纤维素管与ε-聚赖氨酸复合制备具有抑菌性能的细菌纤维素管，其具体方法是：

菌种培养：将一环或两环活化的木醋杆菌CGMCC No.1.1812斜面种子，接入HS种子培养基3中，于30℃，160r/min培养24小时。

发酵：

以5-20％(v/v)的接种量，接入装满HS发酵培养基3的发酵容器5中，并将具有渗氧功能的管材2，置于发酵容器5中。该发酵容器5选自三角瓶、烧杯、广口瓶或发酵罐，用塞子或盖子4密封，然后向具有氧渗功能的管材2中通入空气1，经30℃静置培养1-6天(优选4天)。木醋杆菌CGMCC No.1.1812，在管材2外表面生物合成细菌纤维素管。发酵完成后从管材2外，即可剥离细菌纤维素管。

或以具有渗氧功能力的封闭管材2兼作发酵容器，即以5-20％(v/v)的接种量，接入装满HS发酵培养基3的管材2中。管材2两端用塞子4密封后，经30℃静置培养1-6天。细菌纤维素管附着在管材2的内表面，从管材2内即可取出细菌纤维素管。

复合ε-聚赖氨酸：

将上述发酵制备的细菌纤维素管，放入ε-聚赖氨酸溶液中，浸泡处理1-6小时(优选2小时)后，取出，经洗涤、干燥，即可得到具有抑菌性能的细菌纤维素管。

需要说明的是：具有渗氧功能的管材2，选自PVC管、硅胶管或胶皮管；管材2的形状为方形、圆形或椭圆形。

所述的HS培养基3成分为：1L水中含葡萄糖20g，酵母膏5g，蛋白胨5g，Na₂HPO₄2.7g，柠檬酸1.15g，pH 6.0。

抑菌实验：

在四个Φ90mm的平皿中，分别倒入已灭菌的肉汤培养基15mL(培养基3是这样配置的：1L水中加入牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH7.2-7.4)。凝固后，接入0.1mm，cfu/ml为10⁶的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌，用已灭菌的涂布器涂布均匀。截取长度为3mm的复合ε-聚赖氨酸的细菌纤维素管和未复合ε-聚赖氨酸的细菌纤维素管各两段，分别置于四个平皿中央，在37℃下培养1天后，量取细菌纤维素管的抑菌环直径。

抑菌性能对照试验见表1：

BC管与本发明BC管复合物的抑菌性能对照表    表1

由上表可看出BC管与ε-聚赖氨酸复合后，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都表现出明显的抑菌性，并且随着ε-聚赖氨酸的浓度增高，其抑菌能力增强。

拉伸性能对比实验见表2：

本发明不同管外径BC管复合物的拉伸强度    表2

由上表可看出本发明方法制备的BC管复合物具有良好的拉伸性能。

有益效果：

本发明提供的制备细菌纤维素管的方法，不需要外加供给氧气、工艺简单，生产成本较低。该方法制备的细菌纤维素管长度和管径具有可控性，且具有良好的拉伸性能。此外，本发明方法制备的产品是与ε-聚赖氨酸复合的，其具有较好的抑菌功能。因此，本发明制备的细菌纤维素管在食品包装和组织工程支架材料方面，如用于肉制品肠衣、血管替代物等，具有良好的应用前景。本发明不仅丰富了细菌纤维素的品种，而且为拓展细菌纤维素的应用领域奠定基础。

附图说明

图1是本发明使用的发酵装置；

图2是本发明使用的发酵装置；

图3是BC管抑菌实验对照图。

在图1中1为空气，2为管材，3为培养基，4为塞子或盖子，5为发酵容器。该发酵装置结构是，将管材2放入盛满培养基3的容器5中。

在图2中1为空气，2为管材(管材2同时还兼做发酵容器，即将管材2中放入培养基3)，4为塞子。该发酵装置特点是管状材料2可以直接作为发酵容器，无需再另配备发酵容器。

在图3中A为BC管(未复合ε-聚赖氨酸)的抑菌图；B为本发明BC管复合物(复合ε-聚赖氨酸)的抑菌图，从图B中能看到复合物具有明显的抑菌性，而未与ε-聚赖氨酸复合的BC管则没有抑菌性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细阐述。

实施例1：

将木醋杆菌CGMCC No.1.1812(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)斜面种子，接入装有100mL种子培养基的锥形瓶中，经30℃下振荡培养24小时后，木醋杆菌种子以5％(v/v)的接种量，接入装满500mL HS发酵培养基3的500mL烧杯中(培养基3是这样配置的：在500mL水中加入葡萄糖10g，酵母膏2.5g，蛋白胨2.5g，Na₂HPO₄1.35g，柠檬酸0.60g，pH 6.0)。其发酵装置如图1所示。以烧杯为发酵容器5，在烧杯内盘装入管材2(管材2采用外径为9mm、长度为25cm的椭圆形胶皮管)，加盖4密封烧杯。椭圆形胶皮管的进气口和出气口置于烧杯外。在椭圆形胶皮管中通入空气1。空气1通过具有渗氧功能的管材-胶皮管的管壁供氧，30℃下静置培养1天。发酵结束后，细菌纤维素管附着在胶皮管的外管壁表面。从椭圆形胶皮管的外管壁表面剥离，即可得到细菌纤维素管；再用0.1NNaOH溶液浸泡，煮沸6小时，用蒸馏水洗涤三次，使其pH为7.2。将上述发酵制备的细菌纤维素管，放入100mL 400mg/L的ε-聚赖氨酸溶液中，浸泡处理1小时后，取出，经10mL蒸馏水洗涤一次，放入烘箱，50℃干燥4小时至恒重。

抑菌实验：

在Φ90mm的平皿中，倒入15mL灭过菌的肉汤培养基(该培养基是这样配置的：15mL水中加入含牛肉膏0.075g，蛋白胨0.15g，NaCl 0.075g，琼脂0.3g，pH7.2-7.4)，凝固后，接入0.1mm、10⁶cfu/ml的金黄色葡萄球菌，用灭过菌的涂布器涂布均匀。截取长度为3mm的细菌纤维素管，置于平皿中，在37℃下培养1天，得到厚度不均匀的细菌纤维素管。其管内径、壁厚和长度分别为9mm、0.20mm和20cm，抑菌环直径为0.5mm。

实施例2：

发酵时，木醋杆菌种子以10％(v/v)的接种量，接入HS发酵培养基3中。其发酵容器5选取500mL锥形瓶。锥形瓶中装入500mL的发酵培养基3和管材2。管材2采用外径为4mm，长度为50cm的圆形硅胶管。在圆形硅胶管2中通入空气1，30℃下静置培养4天。复合ε-聚赖氨酸时，取100mL浓度为1000mg/L的ε-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为2小时，其他同实施例1。得到厚度较均匀的细菌纤维素管，其管内径和壁厚和长度分别为4mm、0.29mm和40cm，抑菌环直径为3.0mm。。

实施例3：

发酵时，木醋杆菌种子以20％(v/v)的接种量，接入2L的HS发酵培养基3中(培养基是这样配置的：2L水中加入葡萄糖40g，酵母膏10g，蛋白胨10g，Na₂HPO₄5.4g，柠檬酸2.4g，pH 6.0)。其发酵容器5选取2L广口瓶。管材2采用外径为20mm，长度为75cm的圆形硅胶管。在圆形硅胶管中通入空气1，30℃下静置培养6天。复合ε-聚赖氨酸时，取100mL浓度为1600mg/L的ε-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为6小时，接入0.1mm、10⁶cfu/ml的大肠杆菌，其他同实施例1。得到厚度较均匀的细菌纤维素管，其管内径和壁厚和长度分别为20mm、0.25mm和65cm，抑菌环直径为2.6mm。

实施例4：

发酵时，木醋杆菌种子以20％(v/v)的接种量，接入5L的HS发酵培养基3中(培养基成分为：5L水中加入葡萄糖100g，酵母膏25g，蛋白胨25g，Na₂HPO₄13.5g，柠檬酸6.0g，pH 6.0)。其发酵容器5选取5L发酵罐。管材2选取外径为31mm，长度为100cm的圆形硅胶管。在圆形硅胶管中通入空气1，30℃下静置培养6天。复合ε-聚赖氨酸时，取200mL浓度为1600mg/L的ε-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为2小时，其他同实施例1。得到厚度较均匀的细菌纤维素管，其管内径和壁厚和长度分别为31mm、0.25mm和85cm，抑菌环直径为2.8mm。

实施例5：

发酵时，木醋杆菌种子以5％(v/v)的接种量，接入装满HS发酵培养基3的管材2中。管材2选取内径为16mm、长度为75cm的方形PVC管，将发酵培养基3装入管材2中。管材2兼做发酵容器，其发酵装置如图2所示。方形PVC管两端用胶塞4密封。无需向PVC管内另通空气。空气1由PVC管外，通过具有渗氧功能的PVC管的管壁供氧。经30℃静置培养4天，细菌纤维素管附着在管材2的内表面。从管材2内即可取出细菌纤维素管。复合ε-聚赖氨酸时，取100mL浓度为800mg/L的ε-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为6小时，其它同实施例1。得到厚度不均匀的细菌纤维素管，其管外径、壁厚和长度分别为16mm、0.35mm和70cm，抑菌环直径为0.20mm。

实施例6：

发酵时，木醋杆菌种子以20％(v/v)的接种量，接入装满HS发酵培养基3的管材2中。管材2采用内径为16mm、长度为50cm的圆形硅胶管。其两端用胶塞4密封。其发酵装置结构如图2所示。30℃下静置培养4天。复合ε-聚赖氨酸时，取100mL浓度为3200mg/L的ε-聚赖氨酸溶液，浸泡时间为2小时，其它同实施例5。得到厚度均匀的细菌纤维素管，其管外径、壁厚和长度分别为16mm、0.45mm和45cm，抑菌环直径为4.0mm。

Claims (4)

1.具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于：利用具有渗氧功能的管材(2)为载体，利用木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCCNo.1.1812在载体表面生物合成细菌纤维素管，然后将细菌纤维素管与ε-聚赖氨酸复合制备具有抑菌性能的细菌纤维素管，具体方法是：

①菌种培养：将一环或两环活化的木醋杆菌CGMCC No.1.1812斜面种子，接入HS种子培养基(3)中，于30℃，160r/min，培养24小时；

②发酵：以5-20％(v/v)的接种量接入装满HS发酵培养基(3)的发酵容器(5)中，并将具有渗氧功能的管材(2)置于发酵容器(5)中，该发酵容器(5)选自三角瓶、烧杯、广口瓶或发酵罐，用塞子或盖子(4)密封，然后向具有渗氧功能的管材(2)中通入空气(1)，经30℃静置培养1-6天，木醋杆菌CGMCC No.1.1812在管材(2)外表面生物合成细菌纤维素管，发酵完成后从管材(2)外即可剥离细菌纤维素管；或以具有渗氧功能的封闭管材(2)兼作发酵容器，即以5-20％(v/v)的接种量接入装满HS发酵培养基(3)的管材(2)中，管材(2)两端用胶塞(4)密封后，经30℃静置培养1-6天，细菌纤维素管附着在管材(2)的内表面，从管材(2)内即可取出细菌纤维素管；

③复合ε-聚赖氨酸

将上述发酵制备的细菌纤维素管，放入ε-聚赖氨酸溶液中，浸泡处理1-6小时后，取出经洗涤、干燥，即可得到具有抑菌性能的细菌纤维素管；

所述的HS培养基(3)成分为：1L水中含葡萄糖20g，酵母膏5g，蛋白胨5g，Na₂HPO₄2.7g，柠檬酸1.15g，pH 6.0。

2.按照权利要求1所述的具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于具有渗氧功能的管材(2)，选自PVC管、硅胶管或胶皮管。

3.按照权利要求1所述的具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于管材(2)的形状为方形、圆形或椭圆形。

4.按照权利要求1所述的具有抑菌性能的细菌纤维素管的制备方法，其特征在于复合ε-聚赖氨酸时，浸泡处理时间为2小时。 

Images