CN104611309A - 一种卷枝毛霉dk1菌株制备漆酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，包括：(1)将卷枝毛霉DK1菌株由PDA斜面培养基转接入装有基础液体培养基的三角瓶中，震荡培养，发酵液经过滤得到菌丝体，菌丝体用无菌水洗净打散，随后收集于无菌水中制成菌丝悬浮液，保存备用；(2)在三角瓶中装入产酶培养基，接入上述菌丝悬浮液，震荡培养，培养过程中定时提取发酵液，离心后取上清液即为粗酶液；(3)将上述粗酶液离心，取上清液即得漆酶。本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，制备的漆酶可以有效去除亚麻、黄麻、红麻或竹纤维中的非纤维素胶质，具有脱胶效率高，脱胶周期短，纤维分散率高，精干麻质量好等优点，具有良好的应用前景。

Description

一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法
技术领域
本发明属于生物纺织技术领域，特别涉及一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法。
背景技术
漆酶(Laccase，EC.1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物血浆中的铜蓝蛋白同属于铜蓝氧化酶家族。真菌漆酶由于它具有较高的氧化还原电势，作用底物范围非常广泛，能催化氧化多种酚和芳胺类化合物，同时将分子氧还原成水。漆酶突出的催化特性是它的底物具有广泛性、催化反应具有复杂性，生成的产物具有环境友好性.所以，近年来利用真菌制备漆酶在麻纤维脱胶中的应用研究越来越广泛。
麻纤维种类繁多，它们由不同比重的纤维素、半纤维素、木质素、果胶和杂质组成，纺织加工中，必须经过“脱胶”，即去除果胶、半纤维素和木质素等非纤维素物质(统称为胶质)，才能获得用于轻纺的纤维，实现其使用价值。麻行业常用的煮练方法主要是化学方法，即利用强酸强碱对原麻或粗纱进行处理，化学脱胶工艺耗能大，设备损耗大，且排放的废水无法循环利用，污染问题严重。酶法脱胶就是将脱胶菌培养到菌生长的衰老期后进行过滤或离心等处理，再用得到的粗酶液浸渍原麻。粗酶液可以将麻纤维中的果胶、半纤维素、木质素等物质分解转化为简单的低分子物质，从而完成麻纤维的脱胶过程。也可将粗酶液提纯，浓缩为液剂，或者将该浓缩液干燥成为粉剂。使用时将液剂稀释或将粉剂溶于水，把原麻浸渍在酶稀释液中进行酶解脱胶。酶法脱胶工艺无需专用设备，快速高效，无污染，生产的精干麻质量好。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，该方法具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，制备的漆酶活性高、用量少且酶活稳定。
本发明的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，包括：
(1)将卷枝毛霉DK1菌株由PDA斜面培养基转接入装有基础液体培养基的三角瓶中，在摇床中30～40℃恒温震荡培养3～4d后，发酵液经过滤得到菌丝体，菌丝体用无菌水洗净打散，随后收集于无菌水中制成菌丝悬浮液，保存备用；
(2)在基础液体培养基中分别加入1～2％w/v的天然底物和不同浓度的CuSO4·5H2O作为产酶培养基，在三角瓶中装入产酶培养基，接入上述菌丝悬浮液，在摇床中30～40℃恒温震荡培养，培养过程中定时提取发酵液，离心后取上清液即为粗酶液；
(3)将上述粗酶液于4～6℃离心，取上清液即得漆酶。
所述步骤(1)中的卷枝毛霉DK1菌株的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
根据ITS测序Blast及聚类分析结果，该菌与卷枝毛霉菌相似性为99％，结合生理生化试验结果和镜检分析，命名此菌株为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)DK1菌株。ITS测序中，所采用的正向引物为：ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、反向引物为ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，均为国际通用引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
本发明所采用的卷枝毛霉(Mucor circinelloides)DK1菌株，保藏单位名称：CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.10143，保藏日期为2014年12月15日。建议分类命名为：卷枝毛霉(Mucor circinelloides)。
所述步骤(1)中的基础液体培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
所述步骤(1)中的收集所用的无菌水与发酵液等体积。
所述步骤(1)中的保存温度为40℃。
所述步骤(2)中的天然底物为茶叶、稻草或麦草；CuSO4·5H2O的浓度范围为0-4mM。
所述步骤(2)中的产酶培养基的组成为：NaNO32.5g，KH2PO41g，CaCl2·6H2O 0.1g，MgSO40.3g，NaCl 0.1g，FeCl30.01g，油菜秸秆粉0.5g，蒸馏水1000mL，pH用稀盐酸调至6.0-7.0。
所述步骤(1)和(2)中的震荡转速为180rpm。
所述步骤(3)中的离心转速为8000r/min。
所述步骤(3)得到的漆酶活力为100-300U/ml，在pH5.0-6.0、20-50℃下酶活力稳定。
上述漆酶活力经DNS比色法测定。DNS法即3,5一二硝基水杨酸比色法，其测定原理是3,5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比；DNS比色法是还原糖和纤维素酶活力常用的测定方法。
有益效果
本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，制备的漆酶活性高、用量少且酶活稳定，菌、酶均无毒性，无环境污染，可以有效去除亚麻、黄麻、红麻或竹纤维中的非纤维素胶质，具有脱胶效率高，脱胶周期短，纤维分散率高，精干麻质量好等优点，具有良好的应用前景。
附图说明
图1和图2均为本发明菌株显微镜染色照片(油镜)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法：
(1)菌丝悬浮液：卷枝毛霉DK1菌株由PDA斜面培养基转接入装有50mL基础液体培养基的300mL三角瓶中，在摇床中180rpm，30℃恒温震荡培养3d后，发酵液经无菌纱布过滤，菌丝体用无菌水洗净并在Waring高速打碎杯中打散15s，收集于无菌水(与发酵液等体积)中制成菌丝悬浮液，于40℃下保存备用。
基础液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
(2)摇瓶产酶：在基础液体培养基中分别加入1％(w/v)的天然底物)和不同浓度的CuSO4·5H2O(0-4mM)即为产酶培养基。300mL三角瓶中装入产酶培养基80mL，接入20mL菌丝悬浮液，以未添加天然底物或硫酸铜的试样为对照，在摇床中180rpm，30℃恒温震荡培养。培养过程中定时提取发酵液，离心后上清液即为粗酶液，用于漆酶活力的测定。
产酶培养基：NaNO32.5g，KH2PO41g，CaCl2·6H2O 0.1g，MgSO40.3g，NaCl 0.1g，FeCl30.01g，油菜秸秆粉0.5g，蒸馏水1000mL，pH用稀盐酸调至6.0-7.0。
(3)将步骤(2)所得的发酵菌液于4℃，8000r/min离心，取上清液即所得酶液，然后经DNS比色法测定，漆酶活力为100-300U/ml其在pH5.0-6.0，20-50℃下酶活力较为稳定。
实施例2
由卷枝毛霉DK1制备漆酶粗酶液用于亚麻、黄麻、红麻或竹纤维的脱胶工艺如下：
将5g亚麻、黄麻、红麻或竹纤维原茎置于250ml锥形瓶，以亚麻、黄麻、红麻或竹纤维原茎与漆酶粗酶液按质量比1：20分装于锥形瓶中，装液量为100ml，在40℃，200rpm摇床中分别脱胶1天、2天和4天；脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次，以除去亚麻上的细菌，停止脱胶。
通过对亚麻、黄麻、红麻或竹纤维脱胶观察发现，1天后亚麻、黄麻、红麻或竹纤维脱胶有明显分散，发酵液颜色变深变浑浊；脱胶两天后，原本成束的亚麻、黄麻、红麻或竹纤维分散成纤维状，发酵液明显变稠；脱胶四天后，亚麻、黄麻、红麻或竹纤维脱胶率达90％以上。
实施例3
由卷枝毛霉DK1制备漆酶酶液用于亚麻、黄麻或红麻纱线中脱胶的工艺如下：
将5g亚麻、黄麻或红麻纱线置入250ml锥形瓶，以亚麻、黄麻或红麻纱线与漆酶酶液按质量比1：20分装于锥形瓶中，装液量为100ml，在40℃，200rpm摇床中分别脱胶1天、2天和4天；脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次，以除去亚麻、黄麻或红麻纱线上的细菌，停止脱胶。
通过对亚麻、黄麻或红麻纱线脱胶观察发现，1天后亚麻纤维有明显分散，发酵液颜色变浑浊；脱胶两天后，原本成束的亚麻分散成纤维状，发酵液明显变稠；脱胶四天后，亚麻脱胶率达90％以上。
实施例4
由卷枝毛霉DK1制备漆酶酶液用于亚麻、黄麻、红麻或竹纤维织物脱胶的工艺如下：
将5g灭菌后的亚麻、黄麻、红麻或竹纤维织物置于250ml锥形瓶，以亚麻、黄麻、红麻或竹纤维织物与漆酶酶液按质量比1：20分装于锥形瓶中，装液量为100ml，在40℃，200rpm摇床中分别脱胶1天、2天和4天；脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次，以除去亚麻上的细菌，停止脱胶。
通过对亚麻、黄麻、红麻或竹纤维织物观察发现，1天后亚麻织物白度、柔软度显著改善，刺痒感显著减低。

Claims (10)

1.一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，包括：
(1)将卷枝毛霉DK1菌株由PDA斜面培养基转接入装有基础液体培养基的三角瓶中，在摇床中30～40℃恒温震荡培养3～4d后，发酵液经过滤得到菌丝体，菌丝体用无菌水洗净打散，随后收集于无菌水中制成菌丝悬浮液，保存备用；
(2)在基础液体培养基中分别加入1～2％w/v的天然底物和不同浓度的CuSO4·5H2O作为产酶培养基，在三角瓶中装入产酶培养基，接入上述菌丝悬浮液，在摇床中30～40℃恒温震荡培养，培养过程中定时提取发酵液，离心后取上清液即为粗酶液；
(3)将上述粗酶液于4～6℃离心，取上清液即得漆酶。
2.根据权利要求1所述的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的卷枝毛霉DK1菌株的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的基础液体培养基的组成为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然。
4.根据权利要求1所述的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的收集所用的无菌水与发酵液等体积。
5.根据权利要求1所述的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的保存温度为40℃。
6.根据权利要求1所述的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的天然底物为茶叶、稻草或麦草；CuSO4·5H2O的浓度范围为0-4mM。
7.根据权利要求1所述的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的产酶培养基的组成为：NaNO32.5g，KH2PO41g，CaCl2·6H2O 0.1g，MgSO40.3g，NaCl0.1g，FeCl30.01g，油菜秸秆粉0.5g，蒸馏水1000mL，pH用稀盐酸调至6.0-7.0。
8.根据权利要求1所述的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中的震荡转速为180rpm。
9.根据权利要求1所述的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的离心转速为8000r/min。
10.根据权利要求1所述的一种卷枝毛霉DK1菌株制备漆酶的方法，其特征在于：所述步骤(3)得到的漆酶活力为100-300U/ml，在pH5.0-6.0、20-50℃下酶活力稳定。
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