CN1948453A - 从盐肤木筛选漆酶内生菌及通过固态发酵制漆酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从漆树科植物分离筛选产漆酶内生真菌和方法，以及利用固态发酵进行漆酶发酵生产的方法。分离筛选得到的高产漆酶内生菌命名为YY－5，已于2005年9月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCCNo.1462。该方法从植物中分离得到内生真菌，将内生真菌接种到PDA固体培养基上，然后以氧化底物产生变色圈的方法筛选漆酶内生菌；在含麸皮的液体培养基中进行复筛得到漆酶高产菌株YY－5，将YY－5接种到固体培养基中，以25～30℃培养5～10天；发酵产物加入蒸馏水浸泡过滤，离心取上清液得到漆酶液。本方法高产漆酶内生菌分泌的漆酶酶活达288.46IU/g固体基质。
Description
技术领域
本发明属于植物内生菌的分离与筛选及微生物发酵领域，特别涉及从盐肤木中筛选漆酶高产内生菌和筛选的方法，以及通过固态培养、分离、纯化制备漆酶的方法。
背景技术
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，它广泛存在于自然界的多种植物和菌类的分泌物中，根据来源一般将其分为漆树漆酶和真菌漆酶。漆酶能够催化多种底物，如酚类化合物及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及甾醇类化合物等；在ABTS，HBT等介质存在下，漆酶也可以催化一些包括木质素在内的非酚底物。漆酶是目前公认的木素分解酶之一，可以直接从底物吸收电子，使之形成自由基，它具有780mV的氧化还原电势，在没有H2O2和其他次级代谢产物存在下，能够使第二底物O2直接变成水，而自身脱去羟基上的电子或质子形成自由基。该自由基不稳定，可进一步发生聚合或解聚反应。该特性使得漆酶在生物制浆及漂白、废水处理以及高分子材料生物转化等方面都具有重要的环保应用价值和开发潜力，因而成为国内外研究的焦点。
真菌是漆酶的主要来源，目前的真菌漆酶主要包括担子菌纲、子囊菌纲和半知菌纲。担子菌中普遍都能产漆酶，如革菌属，栓菌属，蜜环菌属，多孔菌属，猴头菌属，鬼伞属，皮伞属，口蘑属等中都发现了漆酶，其中研究最多、漆酶产量普遍较高的主要是彩绒革盖菌(Coriolus versicolor)。最近，Givaudan等从稻根分离出来产生漆酶的细菌：生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)，从而扩大了漆酶的来源。但是众多微生物菌种中高产菌株不多，从而使得寻找漆酶高产菌株仍然是非常必要的。
漆酶广泛存在于多种高等植物中，目前已经从多种植物中分离得到漆酶或发现漆酶的基因：如漆树(Rhus vernicifera)、芒果(Mandifera Indica)、加州胡权树(Schinus molle)、巴勒斯坦黄连木(Pistacia)、萜木李(Pleiogynium timoriensa)、黄杨(Populus trichocarpa)、火炬松(Pinus taeda)、水稻(Oryza sativa)以及欧亚槭树(Acer pseudolantanus)等物种中也有报道。
植物内生真菌是指生活在植物体内或生活史的一定阶段处于植物体内的真菌。由于长期处于植物微生态系统中，内生真菌与宿主建立了和谐的联合关系，有大量研究表明，植物内生真菌能产生与其宿主相同的次级代谢产物。近年来，国内外已经有大量从植物中分离具有生物活性代谢产物的内生真菌的报道，如从短叶紫杉、云南红豆杉、南方红豆杉等中分离得到能够产生紫杉醇的内生真菌，从传统药用植物雷公藤的内生真菌Rhinocladiellaspp.中发现了生物碱等。
固态发酵是指微生物在没有或基本没有游离水的固体基质上的生长过程。固态基质中，气、液、固三相同时存在，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。该物理条件非常适合丝状真菌的生长。另外固态发酵产酶可以选用任何天然的纤维素废弃物，并且产量一半比液体发酵高出2～3倍，因而是发酵成本大大降低。因而采用固态发酵制酶比较适合我国的国情。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种从盐肤木植物中分离出高产漆酶的内生菌，漆酶内生菌名称为YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCCNo.
1462；并提供一种分离及筛选高产漆酶的内生菌的方法，从而拓宽微生物产漆酶的菌种来源。
本发明的另一目的，还提供一种将分离得来的产漆酶内生菌YY-5，保藏号为：CGMCCNo.
1462，经过固态发酵、硫酸铵沉淀、离子交换柱层析工艺来制备漆酶的方法。
本发明的目的是这样实现的：
本发明提供的漆酶内生菌名称为YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCCNo.
1462。
本发明所提供的漆酶高产菌株YY-5，是从漆树科植物盐肤木中分离得到的内生真菌。经过形态学初步鉴定属于真菌门的无孢菌群(Mycelia Sterilia)。具有以下的形态特征：菌落圆形，不产生孢子，菌丝较短、生长密集、并呈灰褐色，显微镜下观察菌丝有隔。最适生长温度28～30℃，在产酶过程中发酵培养基黏度增大，并伴随有黑色素的生成，到发酵结束时菌体呈黑色球状。在碳源利用方面蔗糖优于葡萄糖。
本发明从盐肤木植物分离及筛选产漆酶植物内生菌(漆酶内生菌名称为YY-5，保藏号为：CGMCCNo.
1462)的方法，包括以下步骤：
(1)清洗新鲜盐肤木：用自来水清洗新鲜盐肤木植物组织表面，干燥后将其根、茎切成段，叶、果实不切，用浓度为75％(W/V)的酒精漂洗1分钟，无菌水冲洗3～4次，再用0.1％(V/V)的升汞浸泡10～60秒，最后再用无菌水冲洗3～4次；
(2)按常规无菌操作的工艺接种培养：将步骤(1)清洗得到的漆树科植物的根的韧皮部、茎、叶、果实切成小片，其中根韧皮部、茎及果实的切片厚度与叶片厚度相当，接种到马铃薯葡萄糖琼脂(以下简称PDA)固体培养基上，置于25～30℃温箱中，进行培养5～7天，待各植物组织切面长出菌丝后，挑取菌丝移至另一块PDA固体培养基上；
(3)将步骤(2)中所得到的内生真菌接种到PDA固体培养基上，置于25～30℃温箱中培养5～10天，待菌落生长良好后，用0.1～1.0mM的丁香醛连氮滴定到菌丝体，选择出现粉红色变色圈的菌株，即为产漆酶内生菌。
还包括步骤(4)，再将步骤(3)得到的菌株在液体培养基中进行复筛：液体培养基为添加了木质纤维素类固体物质的马铃薯葡萄糖液体培养基；培养基组成为：马铃薯葡萄糖液体培养基中添加2％(W/V)木质纤维素类固体基质，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4；发酵培养条件为25～30℃，在恒温振荡培养箱中，以110～200转/分钟(r/min)培养5～10天，即得到漆酶高产内生菌，命名为YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCCNo.
1462。
本发明还包括一种漆酶内生菌通过固态发酵制漆酶方法，其特征在于：
a.将上述的步骤4)复筛得到的漆酶内生菌YY-5接种到固体培养基中，进行固体发酵产酶培养，其中固体培养基由固态发酵基质与马铃薯葡萄糖液体培养基按1∶2～1∶10比例配制，以25～30℃继续培养5～10天；
b.将步骤a)中的固态发酵产物加入蒸馏水浸泡并搅拌后，以滤纸过滤除去固体残渣，液体离心分离，取上清液得到本发明的粗酶液。
在上述的技术方案中，还在步骤(b)中得到的粗酶液中加入硫酸铵至80％饱和度，进行盐析沉淀，盐析液离心后，用0.01mM pH6.5磷酸盐缓冲液悬浮沉淀，并进行透析脱盐，用聚乙二醇浓缩，浓缩后的样品进行离子交换柱层析，所用离子交换剂为DEAESephadex A-25，缓冲体系为20mM pH6.0缓冲液，洗脱体系为含0.1～1.0M NaCl的缓冲液，洗脱速度为1mL/2min，收集具有漆酶活性的洗脱液，浓缩后即得到纯化的本发明的漆酶液。
在上述的技术方案中，所述的木质纤维素类固体物质包括：麸皮，稻草，麦草，玉米秸秆等。
本发明的优点在于：利用本发明提供的筛选方法得到了高产漆酶的内生菌，漆酶内生菌名称为YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCCNo.
1462，本发明菌株YY-5产生的漆酶分泌于细胞外，在本发明提供的固态培养条件下，YY-5最高产酶活力可以达到288.46IU/g固体基质。发酵培养物中无木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶活力，以滤纸酶活表示纤维素酶活力表明，培养物中纤维素酶活力非常低。从而有利于漆酶的分离及纯化。另外利用固态发酵进行漆酶的发酵生产，可以充分利用廉价的农业废弃物，既可以减少其造成的环境污染，又大大降低了漆酶的生产成本。
附图说明
图1是实施例4的液态培养条件下得到的YY-5发酵产酶的曲线图
图2本发明制备纯化后漆酶的电泳图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
需要说明的是本发明的实施例中漆酶的测定方法，是采用国际公认的丁香醛连氮测定方法(摩尔消光系数65000M·cm-1)进行测定的。其中3mL反应液中包括：0.1M、pH6.5磷酸缓冲液2.20mL，粗酶液0.5mL，0.2mM丁香醛连氮溶液0.3mL。测定30℃下，反应液在530nm处吸光度的变化。定义每分钟氧化1μmol底物所需要的酶量为一个酶活力单位(U·mL-1)。
实施例1
从盐肤木(Rhus Chinensis Mill)的枝干来分离筛选高产漆酶的内生菌，其具体分离筛选步骤如下：
1.自来水清洗新鲜盐肤木树种枝干的表面，晾干后将其切成约2cm的小段，用75％(W/V)的酒精漂洗1min，无菌水冲洗3～4次，再用0.1％(V/V)升汞浸泡1min，无菌水冲洗3～4次；
2.按无菌操作的方法取枝干的韧皮部，将其切成厚度约为1mm的薄片，接种到PDA固体培养基上，置于25～28℃温箱培养5～7天，待各植物组织切面长出菌丝后，将其移至新的固体培养基上，经纯化后即得内生真菌；
3.待菌落生长良好后，用0.5mM的丁香醛连氮滴定到菌丝体边缘，选择出现粉红色变色圈的菌株，得到产漆酶的内生真菌。
实施例2
本实施例从盐肤木(Rhus Chinensis Mill)树的叶做原料，来分离内生真菌的方法如下步骤：
1.自来水清洗新鲜树种叶子的表面，晾干后用浓度为75％(W/V)的酒精漂洗1min，无菌水冲洗3～4次，再用0.1％(V/V)的升汞浸泡15s，无菌水冲洗3～4次；
2.按无菌操作的方法将叶子切成薄片，接种到PDA固体培养基上，置于25～28℃温箱培养5～7天，待各叶的切面长出菌丝后，将其移至新的固体培养基上，经纯化后即得内生真菌；
3.待菌落生长良好后，用0.5mM的丁香醛连氮滴定到菌丝体边缘，选择出现粉红色变色圈的菌株，即为产漆酶的内生真菌。
实施例3
本实施例从盐肤木(Rhus Chinensis Mill)的茎做原料，来分离内生真菌的方法包括如下步骤：
1.自来水清洗新鲜树种叶子的表面，晾干后用浓度为75％(W/V)的酒精漂洗1min，无菌水冲洗3～4次，再用0.1％(V/V)的升汞浸泡30s，无菌水冲洗3～4次；
2.按无菌操作的方法将茎切成厚度约1mm的薄片，接种到PDA固体培养基上，置于25～28℃温箱培养5～7天，待各茎的切面长出菌丝后，将其移至新的固体培养基上，经纯化后即得内生真菌；
3.待菌落生长良好后，用0.5mM的丁香醛连氮滴定到菌丝体边缘，选择出现粉红色变色圈的菌株，即为产漆酶的内生真菌。
实施例4
利用实施例1、2或3得到的产漆酶的内生真菌，分别进行液体培养基复筛漆酶高产菌的具体操作为
：菌株接种在PDA固体培养基上，30℃培养3天，从菌落边沿取直径为1cm的菌片3个，接入液体培养基中：2％(W/V)葡萄糖，2％(W/V)麸皮，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4。装液量为250mL三角瓶装50mL培养基。在30℃温度下，以160r/min(转/分钟)在恒温振荡培养箱中培养5～10天；采用国际公认的丁香醛连氮测定方法测定上清液中漆酶的活力。即得到的高产漆酶的内生真菌，漆酶内生真菌名称为YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCCNo.
1462。在此液态培养条件下得到的YY-5发酵产酶的曲线图见附图1。
实施例5
利用实施例4得到的高产漆酶的内生真菌，进行漆酶固态发酵具体操作为：菌株YY-5接入液体培养基中：2％(W/V)葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4，30℃下，以160r/min在恒温振荡培养箱中培养3天作为固体发酵的液体种子。液体种子按照1ml/g固体基质接至麦草固体培养基中(250ml三角瓶中放入5g麦草)，使接种后固态培养基的固液比为1∶3，30℃培养7天，即得到较高的漆酶活力。
实施例6
利用实施例4得到的高产漆酶的内生真菌，进行漆酶固态发酵具体操作为：菌株YY-5接入液体培养基中：2％(W/V)葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4，30℃下，以160r/min在恒温振荡培养箱中培养3天作为固体发酵的液体种子。液体种子按照1ml/g固体基质接至麸皮固体培养基中(250ml三角瓶中放入5g麸皮)，使接种后固态培养基的固液比为1∶4，30℃培养7天，即得到较高的漆酶活力。
实施例7
利用实施例4得到的高产漆酶的内生真菌，进行漆酶固态发酵具体操作为：菌株YY-5接入液体培养基中：2％(V/V)葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4，30℃下，以160r/min在恒温振荡培养箱中培养3天作为固体发酵的液体种子。液体种子按照1ml/g固体基质接至玉米秸秆固体培养基中(250ml三角瓶中放入5g玉米秸秆)，使接种后固态培养基的固液比为1∶5，30℃培养7天，即得到较高的漆酶活力。
实施例8
实施例5，6，7中得到的粗酶液100ml中加入硫酸铵至80％饱和度，进行盐析，盐析液离心后，沉淀用20ml 10mM pH6.5磷酸盐缓冲液悬浮，并透析脱盐。以DEAE SephadexA-25进行离子交换柱层析，缓冲体系为20mM pH6.0缓冲液，洗脱体系为含0.1～1.0MNaCl的缓冲液，洗脱速度为1mL/2min，收集具有漆酶活性的洗脱液，浓缩后即得到纯化的本发明的漆酶液。附图2为本发明实施例纯化后漆酶的电泳图。
Claims (5)
1.一种从盐肤木植物分离筛选的漆酶内生真菌菌株，名称为YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCCNo.
1462。
2.一种从盐肤木植物分离筛选漆酶内生真菌的方法，分离得到的漆酶内生菌的名称为YY-5，保藏号为：CGMCCNo.
1462，包括以下步骤：
1)清洗新鲜盐肤木植物：用自来水清洗植物组织表面，干燥后将其根、茎切成段，连同叶一起用浓度为75％(w/v)的酒精漂洗1分钟，无菌水冲洗3～4次，再用0.1％(V/V)的升汞浸泡10～60秒，最后再用无菌水冲洗3～4次；
2)按常规无菌操作的工艺接种培养：将步骤1)清洗得到的产漆酶植物的根的韧皮部、茎、叶、果实切成小片，其中根韧皮部、茎及果实的切片厚度与叶片厚度相当，接种到PDA固体培养基上，置于25～30℃温箱中，进行培养5～7天，待各植物组织切面长出菌丝后，挑取菌丝移至另一块PDA固体培养基上；
3)将步骤2)中所得到的内生真菌接种到PDA固体培养基上，置于25～30℃温箱中培养5～10天，待菌落生长良好后，用0.1～1.0mM的丁香醛连氮滴定到菌丝体，选择出现粉红色变色圈的菌株，得到产漆酶内生真菌；
4)将步骤3)得到的产漆酶内生菌，在液体培养基中进行复筛：所述的培养基组成为：马铃薯葡萄糖液体培养基中添加2％(W/V)木质纤维素类固体基质，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4；发酵培养条件为25～30℃，在恒温振荡培养箱中以110～200转/分钟，培养5～10天，按照丁香醛连氮法测定上清液中漆酶的酶活，筛选得到高产的漆酶内生真菌，命名为YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为：CGMCC No.
1462。
3.一种漆酶内生菌通过固态发酵制漆酶方法，其特征在于：
a.将权利要求2中的步骤4)复筛得到的漆酶内生菌YY-5接种到固体培养基中，进行固体发酵产酶培养，其中固体培养基由固态发酵基质与马铃薯葡萄糖液体培养基按1∶2～1∶10比例配制，以25～30℃继续培养5～10天；
b.将步骤a)中的固态发酵产物加入蒸馏水浸泡并搅拌后，以滤纸过滤除去固体残渣，液体离心分离，取上清液得到本发明的粗酶液。
4.按权利要求3所述的漆酶内生菌通过固态发酵制漆酶方法，其特征在于：还包括再在步骤b)得到的粗漆酶液中加入硫酸铵至80％饱和度，进行盐析沉淀，盐析液离心后，用0.01mM pH 6.5磷酸盐缓冲液悬浮沉淀，并进行透析脱盐，用聚乙二醇浓缩，浓缩后的样品进行离子交换柱层析，所用离子交换剂为DEAE SephadexA-25，缓冲体系为20mM pH6.0缓冲液，洗脱体系为含0.1～1.0M NaCl的缓冲液，洗脱速度为1mL/2min，收集具有漆酶活性的洗脱液，浓缩后得到纯化的漆酶液。
5.按权利要求3所述的漆酶内生菌通过固态发酵制漆酶方法，其特征在于，所述的木质纤维素类固体物质选自：麸皮，稻草，麦草或玉米秸秆。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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