CN102134555A - 一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法。方法的步骤为：(1)菌种筛选：从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株新型海洋真菌；(2)菌种保藏：菌种接种于修饰的PDA培养基中培养，并于4℃下斜面保藏；(3)菌种活化和扩培：菌种的孢子接种于添加了特殊成分的PDA培养基，活化得到的孢子接种于种子培养基中进行扩培；(4)制备海洋内生拟盘多毛孢菌液体发酵培养基；(5)发酵：采用新配制的培养基进行液体发酵和产酶，确定了优化的产酶条件。本发明所开发的生产漆酶的方法，以新型的海洋内生拟盘多毛孢菌为产生菌，具有培养基粗狂、来源广泛和价廉等特点。
Description
技术领域
本发明涉及用一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法。
背景技术
木质素是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生资源，但因其结构复杂、化学性质非常稳定，是公认的难降解的芳香族化合物之一，一直以来都无法被有效利用，已成为工业生产中重要的废弃物和严重的环境污染物。
由于木质素与半纤维素、纤维素相互镶嵌结合，木质素以衬质包裹着纤维素和半纤维素，沉积或填充于纤维素构成的微晶纤维中，形成一道天然屏障，严重阻碍了纤维素的生物降解和利用。因此，木质素难于降解已成为有效转化地球上最大可再生碳源纤维素的最大障碍。因此，若要有效利用纤维素，就必须首先解决木质素的降解问题。
白腐真菌是自然界中木质素降解的主力军，具有独特的木质素降解酶系和降解能力，其中漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在木质素降解过程中发挥着重要作用，它能高效地催化氧化多种酚型和非酚型化合物，其功能和用途不断被发现和拓展，成为近些年酶工程学和环境科学等领域研究的一个热点。
生产漆酶的微生物目前主要是围绕着陆生微生物而展开。用陆生微生物生产的漆酶，其稳定性和环境耐受性一般都不是特别理想，而木质纤维素植物的降解一般均需要在粗狂的条件下进行，其木质素降解效率常受到限制，因此有必要筛选性能更优异的菌株生产出酶活高、稳定性和环境耐受性好的漆酶。
海洋微生物由于其环境所致，具有不同于陆生微生物的独特性能。海洋微生物的种类繁多，现有的研究已经表明，海洋微生物的种类占了地球微生物种类的80％以上，远远多于已经得到的陆生微生物数量。海洋寡养、高盐的独特环境为孕育出显著不同于陆生微生物特性的微生物提供了一个特殊的环境。生活在寡养环境的微生物往往具有降解大分子物质成为自身可利用的营养物质的酶系，纤维素的降解为可利用的糖类是寡养环境下微生物采用的有效获取营养的主要方式，因此海洋微生物是筛选产漆酶的优异菌株的一个理想选择。从海洋中筛选出内生拟盘多毛孢菌来生产漆酶，利用其适应高盐环境的特点，生产出具有高酶活、高环境耐受性的漆酶，以便用于比较粗狂条件下的木质纤维素资源的降解。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法。
海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法的步骤如下：
1)菌种筛选：
从东海10～20m深的海水底取污泥、海草样品，取样品5～10g加入灭菌人工海水50ml，160～250r/m转速下振荡20～30min，静置10～20min取上清液0.25～0.5ml，涂布PDA平板，26～30℃，培养15～20天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，26～30℃培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体产酶培养基进行发酵培养，26～30℃培养8～12天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌-海洋内生拟盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为：愈创木酚1g，酒石酸铵0.1g，蛋白胨2.6g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，琼脂18g，加人工海水至1000ml，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月13日，分类命名为pestalotiopsissp.j63；
2)菌种保藏：
把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上，26～30℃下培养6～10天，斜面保藏于4℃，保藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；
3)菌种活化：
在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯经1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖10～20g，在26～30℃下培养6～10天，完成活化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为：NaCl 29.8g，MgSO4 5.4g，KCl 0.73g，MgCl2.6H2O 10.7g，CaCl2 0.8306g，蒸馏水1.0L；
4)种子培养基：
将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖6～12g，酒石酸铵1～4g，KH2PO4 0.5～2g，Na2HPO4 0.2g，微量元素液5～15ml，酵母提取物：1～4g，调pH至4.5～6.0，用人工海水定容至1000ml，26～30℃下培养2～4天，其中，微量元素溶液的组成为：MgSO4·5H2O 0.5g/L，FeSO4 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnCl2·4H2O 0.003g/L，H3BO4 0.03g/L，CoCl2·6H2O0.02g/L；
5)发酵产酶培养基：
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按5～10％体积比接种量接种于液体发酵产酶培养基，温度26～30℃、装液量30～40％、起始pH 4.5～6.0、转速120～200r/m发酵6～10天，得到4757IU/ml的漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为：不同的碳源组合，酒石酸铵1～4g，KH2PO4 0.5～2g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O150～250μM，微量元素液10～15ml，酵母提取物1～4g，调pH至4.5～6.0，用自来水定容至1000ml。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：
1)该海洋内生拟盘多毛孢菌能耐受较高的盐浓度，并在较高的盐浓度环境下生长良好，为富含盐的木质纤维素资源提供新的途径；
2)培养基简单、价廉；
3)该海洋内生拟盘多毛孢菌液体生产漆酶，得到适宜海洋微生物的独有液体发酵工艺。液体发酵的工艺粗放，酶活较高；
4)培养过程简单，易于控制和放大。
具体实施方式
海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法的步骤如下：
1)菌种筛选：
从东海10～20m深的海水底取污泥、海草样品，取样品5～10g加入灭菌人工海水50ml，160～250r/m转速下振荡20～30min，静置10～20min取上清液0.25～0.5ml，涂布PDA平板，26～30℃，培养15～20天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，26～30℃培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体产酶培养基进行发酵培养，26～30℃培养8～12天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌-海洋内生拟盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为：愈创木酚1g，酒石酸铵0.1g，蛋白胨2.6g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，琼脂18g，加人工海水至1000ml，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月13日，分类命名为pestalotiopsissp.j63；
2)菌种保藏：
把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上，26～30℃下培养6～10天，斜面保藏于4℃，保藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；
3)菌种活化：
在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯经1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖10～20g，在26～30℃下培养6～10天，完成活化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为：NaCl 29.8g，MgSO4 5.4g，KCl 0.73g，MgCl2.6H2O 10.7g，CaCl2 0.8306g，蒸馏水1.0L；
4)种子培养基：
将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖6～12g，酒石酸铵1～4g，KH2PO4 0.5～2g，Na2HPO4 0.2g，微量元素液5～15ml，酵母提取物：1～4g，调pH至4.5～6.0，用人工海水定容至1000ml，26～30℃下培养2～4天，其中，微量元素溶液的组成为：MgSO4·5H2O 0.5g/L，FeSO4 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnCl2·4H2O 0.003g/L，H3BO4 0.03g/L，CoCl2·6H2O0.02g/L；
5)发酵产酶培养基：
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按5～10％体积比接种量接种于液体发酵产酶培养基，温度26～30℃、装液量30～40％、起始pH 4.5～6.0、转速120～200
r/m发酵6～10天，得到漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为：不同的碳源组合，酒石酸铵1～4g，KH2PO4 0.5～2g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O 150～250μM，微量元素液10～15ml，酵母提取物1～4g，调pH至4.5～6.0，用自来水定容至1000ml。
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
1)菌种筛选：
从东海10m深的海水底取污泥、海草样品，取样品5g加入灭菌人工海水50ml，160r/m转速下振荡20min，静置10min取上清液0.25ml，涂布PDA平板，26℃，培养15天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，26℃培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌 株接种于液体产酶培养基进行发酵培养，26℃培养8天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌-海洋内生拟盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为：愈创木酚1g，酒石酸铵0.1g，蛋白胨2.6g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0..2g，琼脂18g，加人工海水至1000ml，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月13日，分类命名为pestalotiopsissp.j63；
2)菌种保藏：
把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上，26℃下培养6天，斜面保藏于4℃，保藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；
3)菌种活化：
在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯经1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖10g，在26℃下培养6天，完成活化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为：NaCl 29.8，MgSO45.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L；
4)种子培养基：
将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖6g，酒石酸铵1g，KH2PO4 0.5g，Na2HPO4 0.2g，微量元素液5ml，酵母提取物：1g，调pH至4.5，用人工海水定容至1000ml，26℃下培养2天，其中，微量元素溶液的组成为：MgSO4·5H2O 0.5g/L，FeSO40.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnCl2·4H2O 0.003g/L，H3BO4 0.03g/L，CoCl2·6H2O 0.02g/L；
5)发酵产酶培养基：
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按5％体积比接种量接种于液体发酵产酶培养基，温度26℃、装液量30％、起始pH 4.5、转速120r/m发酵6天，得到4757IU/ml的漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为：不同的碳源组合，酒石酸铵1g，KH2PO4 0.5g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O 150μM，微量元素液10ml，酵母提取物1g，调pH至4.5，用自来水定容至1000ml。
实施例2
1)菌种筛选：
从东海20m深的海水底取污泥、海草样品，取样品10g加入灭菌人工海水50ml，250r/m转速下振荡30min，静置20min取上清液0.5ml，涂布PDA平板，30 ℃，培养20天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，30℃培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体产酶培养基进行发酵培养，30℃培养12天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌-海洋内生拟盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为：愈创木酚1g，酒石酸铵0.1g，蛋白胨2.6g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，琼脂18g，加人工海水至1000ml，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月13日，分类命名为pestalotiopsissp.j63；
2)菌种保藏：
把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上，30℃下培养10天，斜面保藏于4℃，保藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；
3)菌种活化：
在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯经1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖20g，在30℃下培养10天，完成活化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为：NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L；
4)种子培养基：
将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖12g，酒石酸铵4g，KH2PO4 2g，Na2HPO4 0.2g，微量元素液15ml，酵母提取物：4g，调pH至6.0，用人工海水定容至1000ml，30℃下培养4天，其中，微量元素溶液的组成为：MgSO4·5H2O 0.5g/L，FeSO4 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnCl2·4H2O 0.003g/L，H3BO4 0.03g/L，CoCl2·6H2O 0.02g/L；
5)发酵产酶培养基：
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按10％体积比接种量接种于液体发酵产酶培养基，温度30℃、装液量40％、起始pH 6.0、转速200r/m发酵10天，得到4757IU/ml的漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为：不同的碳源组合，酒石酸铵4g，KH2PO4 2g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O 250μM，微量元素液15ml，酵母提取物4g，调pH至6.0，用自来水定容至1000ml。
实施例3
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5％(v/v)接种量接种到液体发酵培养基 上，液体培养基组成：葡萄糖10g，酒石酸铵2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O 200μM(终浓)，微量元素液10ml，酵母提取物：2g，调pH至5.5，用自来水定容至1000ml。在温度28℃、装液量40％、发酵起始pH 5.5、发酵8-10天测定液体发酵漆酶活达到421.5IU/ml。酶活单位IU定义为每分钟氧化1μmolABTS所需的酶量为一个漆酶活力单位。酶活测定方法：发酵培养基10000r/m离心10min，上清液即为粗酶液。取经过适当稀释后的粗酶液0.1ml，加入NaAc-HAc(pH4.5)缓冲液2.5ml，混匀，加入ABTS0.4ml，反应在25℃下进行，测定3min内反应液在420nm处OD值的变化。
实施例4
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5％(v/v)接种量接种于液体发酵培养基，不同的液体培养基组成：(A：葡萄糖5g；B：蔗糖5g；C：麦芽糖：5g；D：麸皮5g；E：可溶性淀粉：5g)，稻草粉5g，酒石酸铵2g，KH2PO4 1g，Na2HPO40.2g，CuSO4·5H2O 200μM，微量元素液10ml，酵母提取物：1-4g，自来水定容至1000ml，调pH 5.5。在温度28℃、装液量40％、发酵起始pH5.5，发酵10天测定液体发酵漆酶活分别为1925IU/ml、1680IU/ml、1400IU/ml、333IU/ml、1455IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。
实施例5
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5％(v/v)接种量接种到含不同浓度稻草粉的液体发酵培养基上，液体培养基组成：(稻草粉分别为5g、10g、15g)，酒石酸铵2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O 200μM，微量元素液10ml，酵母提取物：2g，自来水定容至1000ml，pH 5.5，在温度28℃、装液量40％、起始pH 5.5、发酵6天测定液体发酵漆酶活分别为123IU/ml、1016IU/ml、1462IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。
实施例6
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5％(v/v)接种量接种到液体发酵培养基上，液体培养基组成：(A：稻草粉5g；B：稻草粉10g；C：稻草粉15g；D：稻草粉20g)，麦芽糖3g，酒石酸铵2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O 200μM，微量元素液10ml，酵母提取物：2g，自来水定容至1000ml，pH 5.5。在温度28℃、装液量40％、起始pH 5.5发酵7天，测定液体发酵漆酶活分别为138IU/ml、804IU/ml、3738IU/ml、4757IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。
实施例7
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5％(v/v)接种量接种到液体发酵培养基上，液体培养基组成：(A：稻草粉5g；B：稻草粉10g；C：稻草粉15g；D：稻草 粉20g)，麦芽糖5g，酒石酸铵2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O 200μM，微量元素液10ml，酵母提取物：2g，自来水定容至1000ml，pH 5.5。在温度28℃、装液量40％、起始pH 5.5发酵7天，测定液体发酵漆酶活分别为254IU/ml、4028IU/ml、1658IU/ml、4293IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。
实施例8
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5％(v/v)接种量接种到液体发酵培养基上，液体培养基组成：(A：稻草粉5g；B：稻草粉10g；C：稻草粉15g；D：稻草粉20g)，麦芽糖10g，酒石酸铵2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O200μM，微量元素液10ml，酵母提取物：2g，自来水定容至1000ml，pH 5.5。在温度28℃、装液量40％、起始pH 5.5发酵7天，测定液体发酵漆酶活分别为8IU/ml、143IU/ml、2156IU/ml、3298IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。实施例9
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5％(v/v)接种量接种到液体发酵培养基上，液体培养基组成：葡萄糖10g，酒石酸铵2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，微量元素液10ml，酵母提取物：2g，自来水定容至1000ml，pH 5.5。在温度28℃、装液量40％、起始pH 5.5、CuSO4的添加量分别为0、100μM、500μM、1mM、1.5mM、2mM，发酵7天测定液体发酵漆酶活分别达到1.3IU/ml、385IU/ml、51.4IU/ml、21.1IU/ml、1IU/ml、1IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。
实施例10
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以5％(v/v)接种量接种到不同起始pH值的液体发酵培养基上，液体培养基组成：葡萄糖10g，酒石酸铵2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，微量元素液10ml，酵母提取物：2g，自来水定容至1000ml，调不同pH值。在温度28℃、装液量40％、起始pH分别调节为3.03、4.03、5.00、5.93、7.03、7.90发酵7天测定液体发酵漆酶活分别达到1.1IU/ml、150IU/ml、430IU/ml、418IU/ml、210IU/ml、18IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。
实施例11
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液以不同的接种量接种到液体发酵培养基上，液体培养基组成：葡萄糖10g，酒石酸铵2g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O 200μM，微量元素液10ml，酵母提取物：2g，自来水定容至1000ml，pH 5.5。在温度28℃、装液量40％、起始pH 5.5，分别以1％、3％、5％、7％、9％的接种量发酵7天，测定液体发酵漆酶活分别为102IU/ml、255IU/ml、445IU/ml、360IU/ml、298IU/ml。酶活测定和定义同上实施例。
序列表
<110>浙江大学
<120>一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>553
<212>DNA
<213>海洋真菌-海洋内生拟盘多毛孢菌
<400>1
gagttttcta aactcccaac ccatgtgaac ttaccattgt tgcctcggca gaagctgctc 60
ggcgcgcctt accttggaac ggcctaccct gtagcgcctt accctggaac ggcttaccct 120
gcaacggctg ccggtggact accaaactct tgttatttta tggttatctg agcgtcttat 180
tttaataagt caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca 240
gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 300
acattgcgcc cattagtatt ctagtgggca tgcctgttcg agcgtcattt caacccttaa 360
gcctagctta gtgttgggag cctactgctt ttgctagctg tagctcctga aatacaacgg 420
cggatctgcg atatcctctg agcgtagtaa tttttatctc gcttttgact ggagttgcag 480
cgtctttagc cgctaaaccc cccaattttt aatggttgac ctcggatcag gtaggaatac 540
ccgctgaact taa 553
Claims (1)
1.一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法，其特征在于它的步骤如下：
1)菌种筛选：
从东海10～20m深的海水底取污泥、海草样品，取样品5～10g加入灭菌人工海水50ml，160～250r/m转速下振荡20～30min，静置10～20min取上清液0.25～0.5ml，涂布PDA平板，26～30℃，培养15～20天；挑取菌落，接种于分离选择培养基，26～30℃培养，若分离得到产漆酶的菌株，则会在含愈创木酚的选择培养基上因愈创木酚的氧化而显示出红棕色，颜色越深，范围越大表明菌株产漆酶的能力越强，将产漆酶的菌株接种于液体产酶培养基进行发酵培养，26～30℃培养8～12天测定漆酶活，选取漆酶活力高的为目的菌种，依据菌种的ITS分析和菌种的形态特征鉴定，得到一株新型的海洋真菌-海洋内生拟盘多毛孢菌作为发酵菌种，其中，分离选择培养基的组成为：愈创木酚1g，酒石酸铵0.1g，蛋白胨2.6g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 0.2g，琼脂18g，加人工海水至1000ml，菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010300，保藏日为2010年11月13日，分类命名为pestalotiopsissp.j63；
2)菌种保藏：
把内生拟盘多毛孢菌接种于PDA培养基上，26～30℃下培养6～10天，斜面保藏于4℃，保藏期限为30天，保藏30天后重复传代保藏；
3)菌种活化：
在PDA培养基中添加新的成分形成PDA-a培养基，新添加的成分为200g马铃薯经1升人工海水煮沸30min后的滤液和葡萄糖10～20g，在26～30℃下培养6～10天，完成活化，得到活化的内生拟盘多毛孢菌，人工海水组成为：NaCl 29.8g，MgSO4 5.4g，KCl 0.73g，MgCl2.6H2O 10.7g，CaCl2 0.8306g，蒸馏水1.0L；
4)种子培养基：
将活化的内生拟盘多毛孢菌株挑取少量菌丝接种到种子培养基中进行扩培，得到内生拟盘多毛孢菌的一级种子液，种子培养基的组成为：葡萄糖6～12g，酒石酸铵1～4g，KH2PO4 0.5～2g，Na2HPO4 0.2g，微量元素液5～15ml，酵母提取物：1～4g，调pH至4.5～6.0，用人工海水定容至1000ml，26～30℃下培养2～4天，其中，微量元素溶液的组成为：MgSO4·5H2O 0.5g/L，FeSO4 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.01g/L，MnCl2·4H2O 0.003g/L，H3BO4 0.03g/L，CoCl2·6H2O 0.02g/L；
5)发酵产酶培养基：
内生拟盘多毛孢菌的一级种子液按5～10％体积比接种量接种于液体发酵产酶培养基，温度26～30℃、装液量30～40％、起始pH 4.5～6.0、转速120～200r/m发酵6～10天，得到4757IU/ml的漆酶；其中，液体发酵产酶培养基组成为：不同的碳源组合，酒石酸铵1～4g，KH2PO4 0.5～2g，Na2HPO4 0.2g，CuSO4·5H2O150～250μM，微量元素液10～15ml，酵母提取物1～4g，调pH至4.5～6.0，用自来水定容至1000ml。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110727 |