CN102010855B - 一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法 - Google Patents
一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102010855B CN102010855B CN 201010242252 CN201010242252A CN102010855B CN 102010855 B CN102010855 B CN 102010855B CN 201010242252 CN201010242252 CN 201010242252 CN 201010242252 A CN201010242252 A CN 201010242252A CN 102010855 B CN102010855 B CN 102010855B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- substratum
- artificial seawater
- eggplant bottle
- obtains
- plane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Abstract
本发明公开了一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法。包括如下步骤：1)从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，32～40℃下培养60～90小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在32～40℃下培养60～90h，得到活化的孢子；4)活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；5)扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于液体发酵产酶培养基，发酵5～10天，得到纤维素酶。本发明具有产酶活高、酶稳定、耐盐性好等优点，生产的纤维素酶可以在较高盐含量的条件下降解纤维素，为该水解物的后续应用打下基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法。
背景技术
纤维素物质生产生物基产品具有广阔的前景。自然界存在大量的纤维素物质资源，如玉米秸秆、稻草秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆等。这些物质含有的丰富的纤维素被降解后可以获得可发酵的糖类-葡萄糖，利用葡萄糖可以生产大量的生物基产品，如生物乙醇、丁醇、柠檬酸、乳酸、单细胞蛋白等。特别是利用纤维素物质生产生物能源-氢气和乙醇等可以缓解日益紧张的能源压力，具有非常广阔的前景。
纤维素物质被利用的关键步骤是将其转化为可发酵性的糖类。通常有两类方法可以降解纤维素：化学裂解法和生物酶法降解法。化学裂解法的主要缺点在于成本高、污染环境等，而生物酶降解纤维素物质则具有效率高、条件温和等优势。纤维素酶除了拥有生物酶的效率高、条件温和的特点外，还具有最适宜工业化大规模应用的优势。生产纤维素酶的成本较低，是降解纤维素的一个最好的选择。因此获得高活力、高稳定性、耐受性强的纤维素酶成为酶降解纤维素的关键。
生产纤维素酶的微生物多种多样，有细菌、真菌、放线菌等，目前基本上均为陆生微生物。最近有报道称有人开始已经用海洋细菌和酵母菌来生产纤维素酶，但没有见到有用海洋霉菌来生产纤维素酶的报道。用陆生微生物生产的纤维素酶，其稳定性和环境耐受性一般都不是特别理想，而纤维素植物的降解一般均需要在粗狂的条件下进行，其纤维素降解效率常受到限制，因此有必要筛选性能更优异的菌株生产出酶活高、稳定性和环境耐受性好的纤维素酶。
在我国沿海地带，有许多植被在近海大量生长繁殖，如水葫芦、互花米草等，由于其含有大量的盐份，不能相其它纤维素物质那样被广泛的应用，因此被大量废弃。废弃的物质又腐烂造成环境的恶化和污染速度的急剧增加。盐碱地的恶化和持续扩大，在该类型区域内的植被生物量异常丰富，并且含有大量的纤维素。在盐碱地内生长的植被富含高盐分，其有效合理的利用被大大局限，利用效率低下。筛选在高盐环境下生长和产生纤维素酶的真菌，是利用富含盐分的纤维素物质资源的一个有效的方法。
海洋微生物由于其环境所致，具有不同于陆生微生物的独特性能。海洋微 生物的种类繁多，现有的研究已经表明，海洋微生物的种类占了地球微生物种类的80％以上，远远多于已经得到的陆生微生物数量。海洋寡养、高盐的独特环境为孕育出显著不同于陆生微生物特性的微生物提供了一个特殊的环境。生活在寡养环境的微生物往往具有降解大分子物质成为自身可利用的营养物质的酶系，纤维素的降解为可利用的糖类是寡养环境下微生物采用的有效获取营养的主要方式，因此海洋微生物是筛选产纤维素酶的优异菌株的一个理想选择。已经从海洋中筛选出产纤维素酶的微生物，主要集中于细菌、酵母菌，而具有酶系丰富、表达量高、分泌能力强的霉菌却鲜见报道。因此从海洋中筛选出霉菌来生产纤维素酶，利用其适应高盐环境的特点，生产出具有高酶活、高盐环境耐受性好的纤维素酶，以便用于比较粗狂条件下的纤维素资源的降解。
固体发酵具有液体发酵没有的优势：菌丝能有效附着在固体发酵基质表面，提高发酵效率，比酶活高，设备单位体积生产能力高。
因此该发明采用固体发酵，生产能利用富含盐份的纤维素物质资源生产对高盐环境有较好耐受性的纤维素酶。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法。
海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法如下步骤：
1)从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉(Aspergillus sp)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M201032；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于液体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，温度32～40℃、装液量15～30％、起始pH 6.0～8.0、转速120～200r/m发酵5～10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min，三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯经1升人工海水煮沸30min后的滤液1L，葡萄糖20g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：200g土豆经1L人工海水煮沸30min的三层纱布的过滤液80～120ml，葡萄糖1～6g和稻草粉10～50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的液体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草粉0.5～1.5％、麸皮1.5～4.5％、NH4Cl0.05～0.2％、NaCl 1～2.5％、KBr0.005～0.02％、Na2SO4 0.5～1.07％、其余为人工海水，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：
1)该海洋曲霉能在较高盐浓度下生产纤维素酶，且酶活较稳定；为富含盐的纤维素资源利用提供新的途径；
2)培养基简单、更价廉；
3)该海洋黑曲霉液体生产纤维素酶，得到适宜海洋微生物的独有液体发酵工艺。液体发酵的工艺粗放，酶活较高；
4)培养过程简单，易于控制和放大。
附图说明
图1是海洋真菌在显微镜下的照片；
图2是经18S rRNA检测的基因序列。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
本发明采用的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min，三层纱布过滤的滤液1L。
PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯经1升人工海水煮沸30min后的滤液1L，葡萄糖20g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：200g土豆经1L人工海水煮沸30min的三层纱布的过滤液80～120ml，葡萄糖1～6g和稻草粉10～50g；人工 海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的液体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草粉0.5～1.5％、麸皮1.5～4.5％、NH4C10.05～0.2％、NaCl 1～2.5％、KBr0.005～0.02％、Na2SO4 0.5～1.07％、其余为人工海水，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
本发明采用从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉(Aspergillus sp.ZJUBE2010)，于2010年6月2日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010132；
实施例1
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液80mL或100mL或120mL、葡萄糖2g、稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr0.01％(w/w)，Na2SO4 0.7％(w/w)，人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)93.19％(w/w)，pH 7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH 7.0、发酵7天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到1.18U/ml、1.23U/ml、1.21U/ml。
发酵得到的液体5000r/m，离心10min，上清液经过适当稀释后得到用于测定的待测酶液。取50mg(1X6cm)新华牌滤纸(杭州特种纸业有限公司)，加入待测酶液0.5mL，再加入pH 4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液2.5mL，60℃反应lh，加入DNS终止反应，沸水浴5min显色，测定A540。酶活力定义，在上述反应条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位U。
实施例2
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖1g或2g或6g，稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr0.01％(w/w)，Na2SO4 0.7％(w/w)，其余为人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)，pH 7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH 7.0、发酵7天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到1.08U/ml、1.23U/ml、1.20U/ml。酶活测定同实施例2
实施例3
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖2g，稻草粉10g或50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr 0.01％(w/w)，Na2SO4 0.7％(w/w)，其余为人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)，pH 7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH 7.0、发酵7天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到0.98U/ml、1.23U/ml、1.00U/ml。酶活测定同实施例2
实施例4
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖2g，稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉0.5％(w/w)或1％(w/w)或1.5％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr 0.01％(w/w)，Na2SO4 0.7％(w/w)，其余为人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)，pH7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH 7.0、发酵7天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到0.97U/ml、1.23U/ml、1.08U/ml。酶活测定同实施例2
实施例5
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖2g，稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g 和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1.5％(w/w)，麸皮1.5％(w/w)或3％(w/w)或4.5％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr 0.01％(w/w)，Na2SO4 0.7％(w/w)，其余为人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)，pH7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH 7.0、发酵7天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到0.77U/ml、1.23U/ml、1.20U/ml。酶活测定同实施例2
实施例6
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖2g，稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1.5％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.05％(w/w)或0.1％(w/w)或0.2％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr 0.01％(w/w)，Na2SO4 0.7％(w/w)，其余为人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)，pH7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH 7.0、发酵7天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到1.12U/ml、1.23U/ml、1.05U/ml。酶活测定同实施例2
实施例7
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8 层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖2g，稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1.5％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 1％(w/w)或2％(w/w)或2.5％(w/w)，KBr 0.005％(w/w)或0.01％(w/w)或0.02％(w/w)，Na2SO40.7％(w/w)，其余为人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)，pH 7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH7.0、发酵7天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到0.92U/ml、1.23U/ml、1.03U/ml。酶活测定同实施例2
实施例8
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖2g，稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1.5％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr0.005％(w/w)或0.01％(w/w)或0.02％(w/w)，Na2SO40.5％(w/w)或0.7％(w/w)或1.0％(w/w)，其余为人工海水(NaCl 29.8，MgSO45.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl20.8306，蒸馏水1.0L)，pH 7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH7.0、发酵7天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到0.88U/ml、1.23U/ml、1.13U/ml。酶活测定同实施例2
实施例9
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖2g，稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1.5％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr 0.005％或0.01％(w/w)或0.02％，Na2SO4 0.5％(w/w)或0.7％(w/w)或1.0％(w/w)，其余为人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)，pH 7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH 7.0、发酵6天或7天或8天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到0.94U/ml、1.23U/ml、1.23U/ml。酶活测定同实施例2
实施例10
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，孢子按照不同的扩培工艺：A：32-40℃培养2-4天，32-40℃培养0.5天，35-45℃培养3天；B：32-40℃培养2-4天，32-40℃培养0.5天，35-45℃培养4天；32-40℃培养2-4天，32-40℃培养0.5天，35-45℃培养2天.，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖2g，稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1.5％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr 0.005％或0.01％(w/w)或0.02％，Na2SO4 00.7％(w/w)，人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)93.19％(w/w)，pH 7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH 7.0，发酵7天，测定液体发酵滤纸酶活分别为达到0.84U/ml、1.23U/ml、0.99U/ml。酶活测定同实施例2
实施例11
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，孢子按照不同的扩培工艺：A：32-40℃培养2-4天，32-40℃培养0.5天，35-45℃培养3天；B：32-40℃培养2-4天，32-40℃培养0.5天，35-45℃培养4天；32-40℃培养2-4天，32-40℃培养0.5天，35-45℃培养2天.，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：土豆人工海水煮沸30min的三层纱布滤液100mL、葡萄糖2g，稻草粉50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，斜面孢子接种于发酵产酶培养基，发酵产酶培养基组成：稻草粉1.5％(w/w)，麸皮3％(w/w)，NH4Cl 0.1％(w/w)，NaCl 2％(w/w)，KBr 0.005％或0.01％(w/w)或0.02％，Na2SO4 00.7％(w/w)，人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)93.19％(w/w)，pH 7.0，在温度40℃、装液量20％、发酵起始pH 7.0，发酵7天
6)酶在高盐环境下的稳定性测定。发酵一定时间的固体发酵产酶培养基加入20倍的Ph4.5的柠檬酸缓冲液，在30℃浸提2h.浸提的液体滤纸过滤后5000r/m离心10min，上清液为最终的待测酶液。酶液加入NaCl，在含有NaCl浓度为0％、4％、6％、8％、10％的不同盐浓度环境下，50℃水浴4h后测定滤纸酶活，把测定的4％、6％、8％、10％的盐浓度环境下滤纸酶活与0％盐浓度环境下的滤纸酶活的比值作为相对酶活。测定的相对酶活依次为100％、100％、100％、100％。 酶活测定同实施例2
实施例12
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)菌体海洋特性测定。为测定菌体是否具有典型的海洋特性-生长的最适盐度在1％～3％之间。活化的孢子接入PDA-2培养基，PDA-2培养基的组成：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，蒸馏水1L。然后在去琼脂的PDA-1培养基中加入NaCL，使NaCL最终浓度为1％(W/W)、2％(W/W)、3％(W/W)、4％(W/W)，250ml的三角瓶装入去琼脂的PDA-1培养基50ml，37℃，150r/m，培养24h，得到菌丝球的悬浮液5ml，该悬浮液5000r/m离心，去掉上清夜，60℃干燥至恒重，称量得到菌体的质量分别为0.128mg、0.148mg、0.203mg、0.156mg。
Claims (1)
1.一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法，其特征在于如下步骤：
1)将保藏编号为CCTCC NO：M2010132的海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养60小时，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
2)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养60h，得到活化的孢子；
3)60g茄子瓶斜面扩培培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74小时，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
4)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于液体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，温度32～40℃、装液量15～30％、起始pH 6.0～8.0、转速120～200r/m发酵5～10天，得到纤维素酶；
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min，三层纱布过滤的滤液1L；所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯经1升人工海水煮沸30min后的滤液1L，葡萄糖20g，人工海水的组成为：NaCl29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L；所述的茄子瓶斜面扩培培养基的组成为：200g土豆经1L人工海水煮沸30min的三层纱布的过滤液80～120ml，葡萄糖1～6g和稻草粉10～50g；人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L；所述的液体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草粉0.5～1.5％、麸皮1.5～4.5％、NH4Cl0.05～0.2％、NaCl 1～2.5％、KBr0.005～0.02％、Na2SO40.5～1.07％、其余为人工海水，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO45.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010242252 CN102010855B (zh) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | 一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010242252 CN102010855B (zh) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | 一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102010855A CN102010855A (zh) | 2011-04-13 |
| CN102010855B true CN102010855B (zh) | 2013-06-05 |
Family
ID=43841187
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010242252 Expired - Fee Related CN102010855B (zh) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | 一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102010855B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104711199B (zh) * | 2015-03-25 | 2018-02-02 | 陕西理工学院 | 一株产纤维素酶的嗜盐黑曲霉及其应用 |
| CN105439292B (zh) * | 2015-12-14 | 2018-01-16 | 浙江大学 | 一种海洋黑曲霉脱除溶液中六价铬的方法 |
| CN105838697A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-08-10 | 浙江大学舟山海洋研究中心 | 一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法 |
| CN105969753B (zh) * | 2016-07-15 | 2019-08-20 | 湖北工业大学 | 一种提高黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中热稳定性的方法 |
| CN106191011B (zh) * | 2016-07-15 | 2019-08-20 | 湖北工业大学 | 一种提高黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中热稳定性和嗜盐度的方法 |
| CN107488595A (zh) * | 2017-08-14 | 2017-12-19 | 浙江大学舟山海洋研究中心 | 一种海洋黑曲霉zjube2010及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6558937B1 (en) * | 1997-07-31 | 2003-05-06 | Dsm N.V. | Cellulose degrading enzymes of aspergillus |
| CN101717729A (zh) * | 2009-11-10 | 2010-06-02 | 武汉博普奥多肽生产技术有限公司 | 一种黑曲霉菌株发酵生产纤维素酶和多肽蛋白饲料的制备方法 |
-
2010
- 2010-07-30 CN CN 201010242252 patent/CN102010855B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6558937B1 (en) * | 1997-07-31 | 2003-05-06 | Dsm N.V. | Cellulose degrading enzymes of aspergillus |
| CN101717729A (zh) * | 2009-11-10 | 2010-06-02 | 武汉博普奥多肽生产技术有限公司 | 一种黑曲霉菌株发酵生产纤维素酶和多肽蛋白饲料的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Mandels M,ET AL.The production of cellulase.《Adv Chem Seres》.1969,第95卷391－413. * |
| 白爱枝,等.黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的优化.《食品科技》.2008,第34卷(第3期),11-13. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102010855A (zh) | 2011-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102010855B (zh) | 一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的液体发酵方法 | |
| EP2475776B1 (en) | A process for integrated production of ethanol and seawood sap from kappaphycus alvarezii | |
| CN101717728B (zh) | 一株青霉菌及其用于催化水解木质纤维素的用途 | |
| US20240011060A1 (en) | Method For Producing Citric Acid by Degrading Roughages with the Rumen Fungus-methanogen Co-culture from Qinghai Yaks | |
| CN103409382B (zh) | 一种增强黄孢原毛平革菌固态发酵中木质素降解的技术 | |
| Moshi et al. | Production of raw starch-degrading enzyme by Aspergillus sp. and its use in conversion of inedible wild cassava flour to bioethanol | |
| CN108753642A (zh) | 一株产褐藻胶裂解酶菌株约氏黄杆菌 | |
| CN101805759B (zh) | 一种以木薯粉为原料生产l-乳酸的方法 | |
| CN103409383B (zh) | 一种增强米曲霉固态发酵中木质素降解的技术 | |
| CN102010856B (zh) | 一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的固体发酵方法 | |
| CN102134555A (zh) | 一种海洋内生拟盘多毛孢菌生产漆酶的液体发酵方法 | |
| CN104357364A (zh) | 一种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法 | |
| CN105062928B (zh) | 一种耐高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的运动发酵单胞菌及其应用 | |
| CN103667169A (zh) | 工业规模化发酵产黄孢原毛平革菌厚垣孢子及其制剂的方法及其制剂 | |
| CN105838697A (zh) | 一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的发酵方法 | |
| CN102550809A (zh) | 利用白腐菌协同木质纤维素降解复合菌系青贮棉秆的方法 | |
| CN109486693A (zh) | 一种酿酒酵母菌及其在乙醇发酵中的用途 | |
| CN102492634B (zh) | 一株耐高温酵母菌及其应用 | |
| CN102181410B (zh) | 一种发酵生产漆酶的方法 | |
| CN104031847A (zh) | 一种降解非木纤维木质素的复合菌剂及制备方法 | |
| CN102559511B (zh) | 高产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的肉座菌及其应用 | |
| CN113388525A (zh) | 红曲霉菌在处理超高浓度白酒废水中的应用 | |
| CN102250857A (zh) | 一种提高纤维素酶单位活性的液体发酵工艺 | |
| CN107488595A (zh) | 一种海洋黑曲霉zjube2010及其应用 | |
| CN105002128B (zh) | 一种耐高浓度乙酸的运动发酵单胞菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130605 Termination date: 20180730 |