CN102010856B - 一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的固体发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的固体发酵方法。包括如下步骤：1)从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上培养，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；3)斜面孢子接种于PDA-1培养基上培养，得到活化的孢子；4)活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；5)扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，发酵8～12天，得到纤维素酶。本发明具有培养基粗狂、来源广泛和价廉等特点，生产的纤维素酶可以在较高盐含量的条件下降解纤维素，并且在高盐环境下酶异常稳定，为该水解物的后续应用打下基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的固体发酵方法。
背景技术
纤维素物质生产生物基产品具有广阔的前景。自然界存在大量的纤维素物质资源，如玉米秸秆、稻草秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆等。这些物质含有的丰富的纤维素被降解后可以获得可发酵的糖类-葡萄糖，利用葡萄糖可以生产大量的生物基产品，如生物乙醇、丁醇、柠檬酸、乳酸、单细胞蛋白等。特别是利用纤维素物质生产生物能源-氢气和乙醇等可以缓解日益紧张的能源压力，具有非常广阔的前景。
纤维素物质被利用的关键步骤是将其转化为可发酵性的糖类。通常有两类方法可以降解纤维素：化学裂解法和生物酶法降解法。化学裂解法的主要缺点在于成本高、污染环境等，而生物酶降解纤维素物质则具有效率高、条件温和等优势。纤维素酶除了拥有生物酶的效率高、条件温和的特点外，还具有最适宜工业化大规模应用的优势。生产纤维素酶的成本较低，是降解纤维素的一个最好的选择。因此获得高活力、高稳定性、耐受性强的纤维素酶成为酶降解纤维素的关键。
生产纤维素酶的微生物多种多样，有细菌、真菌、放线菌等，目前基本上均为陆生微生物。最近有报道称有人开始已经用海洋细菌和酵母菌来生产纤维素酶，但没有见到有用海洋霉菌来生产纤维素酶的报道。用陆生微生物生产的纤维素酶，其稳定性和环境耐受性一般都不是特别理想，而纤维素植物的降解一般均需要在粗狂的条件下进行，其纤维素降解效率常受到限制，因此有必要筛选性能更优异的菌株生产出酶活高、稳定性和环境耐受性好的纤维素酶。
海洋微生物由于其环境所致，具有不同于陆生微生物的独特性能。海洋微生物的种类繁多，现有的研究已经表明，海洋微生物的种类占了地球微生物种类的80％以上，远远多于已经得到的陆生微生物数量。海洋寡养、高盐的独特环境为孕育出显著不同于陆生微生物特性的微生物提供了一个特殊的环境。生活在寡养环境的微生物往往具有降解大分子物质成为自身可利用的营养物质的酶系，纤维素的降解为可利用的糖类是寡养环境里的微生物采用的有效获取营养的主要方式，因此海洋微生物是筛选产纤维素酶的优异菌株的一个理想选择。已经从海洋中筛选出产纤维素酶的微生物，主要集中于细菌、酵母菌，而具有 酶系丰富、表达量高、分泌能力强的霉菌却鲜见报道。
在我国沿海地带，有许多植被在近海大量生长繁殖，如水葫芦、互花米草等，由于其含有大量的盐份，不能相其它纤维素物质那样被广泛的应用，因此被大量废弃。废弃的物质又腐烂造成环境的恶化和污染速度的急剧增加。盐碱地的恶化和持续扩大，在该类型区域内的植被生物量异常丰富，并且含有大量的纤维素。在盐碱地内生长的植被富含高盐分，其有效合理的利用被大大局限，利用效率低下。筛选在高盐环境下生长和产生纤维素酶的真菌，是利用富含盐分的纤维素物质资源的一个有效的方法。
固体发酵具有液体发酵没有的优势：菌丝能有效附着在固体发酵基质表面，提高发酵效率，比酶活高，设备单位体积生产能力高。因此固体发酵成为发酵生产工业化的一个重要方向。该发明利用产酶能力高，分泌能力强的海洋黑曲霉固体发酵生产酶活非常高的纤维素酶。从海洋中筛选出霉菌来生产纤维素酶，利用其适应高盐环境的特点，生产出具有高酶活、高环境耐受性的纤维素酶，以便用于比较粗狂条件下的纤维素资源的降解。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的固体发酵方法。
海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的固体发酵的方法包括如下步骤：
1)从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉(Aspergillussp)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M201032；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.1～0.7ml、起始pH 6.0～7.0、温度42～44℃和发酵8～12天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30 min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯经人工海水煮沸30min后的滤液1L，葡萄糖20g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮10～25％，NH4Cl 0.10～0.15％、NaCl 1.0～3.0％、Na2SO4 0.05～1％、其余为人工海水，稻草和麸皮的质量比为3∶2，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
本发明与现有技术相比具有有益效果：
1)该海洋曲霉能在较高盐浓度下生产纤维素酶，酶活在高盐环境下较稳定；为富含盐的纤维素资源提供新的途径；
2)培养基简单、价廉；
3)该海洋黑曲霉固体生产纤维素酶，得到适宜海洋微生物的独有液体发酵工艺。液体发酵的工艺粗放，酶活非常高；
4)培养过程简单，易于控制和放大；
5)设备利用率高，成本较低。
附图说明
图1海洋真菌的孢囊在显微镜下的照片；
图2海洋真菌的菌丝在显微镜下的照片。
具体实施方式
本发明采用的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯经人工海水煮沸30min后的滤液1L，葡萄糖20g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7～9g，稻草粉70～90g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO45.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮10～25％，NH4Cl 0.10～0.15％、NaCl 1.0～3.0％、Na2SO40.05～1％、其余为人工海水，稻草和麸皮的质量比为3：2，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO45.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L。
滤纸酶活(FPA)测定：取50mg(1X6cm)新华牌滤纸(杭州特种纸业有限公司)，加入酶液0.5mL，再加入pH 4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液2.5mL，60℃反应lh，加入DNS终止反应，沸水浴5min显色，测定A540。酶活力定义：CMCase、BGase及淀粉酶酶活，在上述反应条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位U。
本发明采用从东海近海10～20m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉(Aspergillus sp.ZJUBE2010)，于2010年6月2日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2010132；
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 7.0、温度42℃和发酵10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO45.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L。。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g或9g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO45.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％，NH4Cl 0.15％，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.8％，人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。
经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为20.5U/g干基质或21U/g干基质。
以20∶1(W/V)量的柠檬酸缓冲液体浸提固体基质中的纤维素酶，浸提的酶液5000r/m，离心10min，上清液经过适当稀释后得到用于测定的酶液，以上为待测酶液的制备步骤。取50mg(1X6cm)新华牌滤纸(杭州特种纸业有限公司)，加入待测酶液0.5mL，再加入pH 4.8的柠檬酸钠一柠檬酸缓冲液2.5mL，60℃反应1h，加入DNS终止反应，沸水浴5min显色，测定A540。酶活力定义，在上述反应条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位U。
实施例2
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 7.0、温度42℃和发酵10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g或80g或90g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0 L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％，NH4Cl 0.15％，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.8％，人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为19.8U/g干基质、20.6U/g干基质、21U/g干基质。酶活测定同实施例2
实施例3
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 7.0、温度42℃和发酵10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)10％或15％或20％或25％，NH4Cl 0.15％，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.8％，人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为19.2U/g干基质、19.6U/g干基质、20.2U/g干基质、21U/g干基。酶活测定同实施例2
实施例4
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 7.0、温度42℃和发酵10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％，NH4Cl 0.05％或0.10％或0.15％，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.8％，人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为17.2U/g干基质、18.3U/g干基质、20.0U/g干基质、21U/g干基质。酶活测定同实施例2
实施例5
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 7.0、温度42℃和发酵10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L。。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％，0.15％，NaCl 2.0％或2.5％或3.0％，Na2SO4 0.8％，人工海水(NaCl 29.8，MgSO45.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为17.2U/g干基质、17.3U/g干基质、19.2U/g干基质、21U/g干基质。酶活测定同实施例2
实施例6
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 7.0、温度42℃和发酵10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液 130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％，0.15％，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.05％或0.8％或1.0％(w/w)，人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl20.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为18.8U/g干基质、21U/g干基质、20.5U/g干基质。酶活测定同实施例2
实施例7
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 7.0、温度36℃或38℃或40℃或42℃和发酵10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％， 0.15％，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.8％(w/w)，人工海水(NaCl 29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为18.0U/g干基质、18.8U/g干基质、20.5U/g干基质、21U/g干基质。酶活测定同实施例2
实施例8
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量分别为0.1ml或0.4ml或0.6ml或0.7ml，起始pH 7.0、温度42℃，发酵10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％(w/w)，0.15％(w/w)，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.8％(w/w)，人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为16.0U/g干基质、19.8U/g干基质、21U/g干基质、20.1U/g干基质。酶活测定同实施例2
实施例9
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 5.0或6.0或7.0、温度42℃和发酵10天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％(w/w)，0.15％(w/w)，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.8％(w/w)，人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为17.0U/g干基质、19.8U/g干基质、21U/g干基质。酶活测定同实施例2
实施例10
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400m1人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌 20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 7.0、温度42℃和发酵8天或10天或12天，得到纤维素酶。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％(w/w)，0.15％(w/w)，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.8％(w/w)，人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。经过不同茄子瓶斜面培养基扩培后，纤维素酶的滤纸酶活依次为20.0U/g干基质、21U/g干基质、19.8U/g干基质。酶活测定同实施例2
实施例11
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
5)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.6ml、起始pH 7.0、温度42℃和发酵8天或10天或12天，得到纤维素酶。
6)酶在高盐环境下的稳定性测定。发酵一定时间的固体发酵产酶培养基加入20倍的Ph4.5的柠檬酸缓冲液，在30℃浸提2h.浸提的液体滤纸过滤后5000r/m离心10min，上清液为最终的待测酶液。酶液加入NaCl，在含有NaCl浓度为0％、4％、6％、8％、10％的不同盐浓度环境下，50℃水浴4h后测定滤纸酶活， 把测定的4％、6％、8％、10％的盐浓度环境下滤纸酶活与0％盐浓度环境下的滤纸酶活的比值作为相对酶活。测定的相对酶活依次为100％、100％、100％、100％。
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L。
所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。。
所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7g，稻草粉70g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮(3∶2)25％(w/w)，0.15％(w/w)，NaCl 3.0％，Na2SO4 0.8％(w/w)，人工海水(NaCl29.8，MgSO4 5.4，KCl 0.73，MgCl2.6H2O 10.7，CaCl2 0.8306，蒸馏水1.0L)71.5％。
实施例12
1)从东海近海10m深处的泥土里筛选得到一株海洋黑曲霉；
2)海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
3)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
4)菌体海洋特性测定。为测定菌体是否具有典型的海洋特性-生长的最适盐度在1％～3％之间。活化的孢子接入PDA-2培养基，PDA-2培养基的组成：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖20g，稻草粉70g，蒸馏水1L。然后在去琼脂的PDA-1培养基中加入NaCL，使NaCL最终浓度为1％(W/W)、2％(W/W)、3％(W/W)、4％(W/W)，250ml的三角瓶装入去琼脂的PDA-1培养基50ml，37℃，150r/m，培养24h，得到菌丝球的悬浮液5ml，该悬浮液5000r/m离心，去掉上清夜，60℃干燥至恒重，称量得到菌体的质量分别为0.128mg、0.148mg、0.203mg、0.156mg。
Claims (1)
1.一种海洋黑曲霉生产耐盐纤维素酶的固体发酵方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将保藏编号为CCTCC NO：M2010132的海洋黑曲霉接种于PDA培养基上，40℃下培养90h，得到斜面孢子，斜面孢子保藏于4℃；
2)斜面孢子接种于PDA-1培养基，在40℃下培养90h，得到活化的孢子；
3)60g茄子瓶斜面培养基装入250ml茄子瓶后压实成斜面，瓶口用8层纱布封口，得到茄子瓶斜面，活化的孢子接种于茄子瓶斜面，42℃培养74h，得到扩培的茄子瓶斜面孢子；
4)400ml人工海水装入500ml容量瓶内，放入灭菌锅，在121℃，灭菌20min，得到灭菌的人工海水，扩培得到的茄子瓶斜面孢子用灭菌的人工海水稀释到108个孢子/ml，接种于固体发酵产酶培养基，在250ml锥形瓶内，接种量0.1～0.7ml、起始pH 6.0～7.0、温度42～44℃和发酵8～12天，得到纤维素酶；
所述的PDA培养基的组成为：葡萄糖20g和马铃薯200g添加水煮沸30min三层纱布过滤的滤液1L；所述的PDA-1培养基的组成为：200g马铃薯经人工海水煮沸30min后的滤液1L，葡萄糖20g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L；所述的茄子瓶斜面培养基的组成为：200g马铃薯人工海水煮沸30min的滤液130ml，葡萄糖7～9g，稻草粉70～90g，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl20.8306g和蒸馏水1.0L；所述的固体发酵产酶培养基以质量比计的组成为：稻草和麸皮10～25％，NH4C10.10～0.15％、NaCl 1.0～3.0％、Na2SO4 0.05～1％、其余为人工海水，稻草和麸皮的质量比为3∶2，人工海水的组成为：NaCl 29.8g、MgSO4 5.4g、KCl 0.73g、MgCl2.6H2O 10.7g、CaCl2 0.8306g和蒸馏水1.0L。
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