CN103525740B - 一株利用生物质原料为碳源高产γ-氨基丁酸的乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一株利用生物质原料为碳源高产γ-氨基丁酸的乳杆菌及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明公开了一株利用生物质原料为碳源高产γ-氨基丁酸的乳杆菌，其分类命名为乳杆菌（Lactobacillussp.）PZW0001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013438。并公开了用所述乳杆菌CCTCC NO:M 2013438生产γ-氨基丁酸的方法，利用富含半纤维素和/或纤维素的生物质原料的水解液为碳源发酵生产，所述乳杆菌经MRS液体培养基二次活化后，以5%的接种量接种于MRS-G培养基中，静态发酵72-96h。本发明用富含纤维素和/或半纤维素的生物质原料的水解液代替乳杆菌通用培养基MRS中的葡萄糖，并在培养基中添加一定量的谷氨酸钠，使γ-氨基丁酸产量达46.16g/L。

Description

一株利用生物质原料为碳源高产γ-氨基丁酸的乳杆菌及其应用

技术领域

本发明一株利用生物质原料为碳源高产γ-氨基丁酸的乳杆菌及其应用，具体涉及一株高产γ-氨基丁酸的乳杆菌及利用该菌株以富含纤维素和/或半纤维素的植物原料的水解液为碳源发酵生产γ-氨基丁酸的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）是一种在自然界中广泛存在并具有重要的生理功能的非蛋白类氨基酸。在人体中GABA是中枢神经系统中三大抑制性神经递质之一，具有缓解焦虑、降低血压、安眠镇定等生理功效，在医疗保健方面有广泛的应用前景。

GABA的生产方法有化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。与前两者相比，后者因条件温和，安全性好，设备要求相对简单，不受原料、环境和空间的限制等，具有明显的优势。微生物发酵法生产GABA的原理是利用微生物自身或基因工程手段引入的外援的谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15），催化谷氨酸或谷氨酸钠脱羧生成γ-氨基丁酸。此外，在众多微生物中，乳酸菌具有安全性佳、GABA可大量分泌且不被降解的优势，在药品功能性食品的开发方面具有巨大潜力。

木质纤维素类生物质原料是世界上最丰富的可再生的资源，利用木质纤维素类生物质原料发酵得到具有高价值的产物的研究具有很高的经济和社会意义。木质纤维素类生物质主要包括纤维素、半纤维素和木质素。纤维素是由葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接的大分子多糖，分布广泛，占植物界碳含量的50%以上。而半纤维素含量仅次于纤维素，一般由较短且高度分支的杂多糖组成，不同物料、同一物料的不同部分的半纤维素的单元组成和结构相差较大，其中木糖分布较为稳定，约占50%以上。

目前生物质原料在微生物领域的应用多集中于乙醇、木糖醇、乳酸等领域，尚无用于GABA生产的报道。目前除少数GABA功能性乳制品利用乳酸菌在其发酵过程中同步利用乳糖生产极少量GABA之外，供给高产GABA的微生物生长碳源的报道仅限于葡萄糖。 

发明内容

本发明目的是提供一种能够以富含纤维素和/或半纤维素的生物质原料的水解液为碳源发酵生产GABA的乳杆菌，以及该菌株利用纤维素和/或半纤维素的生物质原料的水解液为碳源发酵生产GABA的方法。

本发明的技术方案：一种利用生物质原料为碳源高产γ-氨基丁酸的乳杆菌，其分类命名为乳杆菌（Lactobacillus sp.）PZW0001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2013438。所述乳杆菌CCTCC NO：M 2013438，是从发酵香肠中分离得到的天然菌株，为兼性厌氧型，革兰氏染色呈阳性，杆菌。该菌株可高效转化谷氨酸或谷氨酸钠生成GABA，以生物质原料水解液为碳源生长良好。

用所述的乳杆菌CCTCC NO: M 2013438生产γ-氨基丁酸的方法，利用富含半纤维素和/或纤维素的生物质原料的水解液为碳源发酵生产，所述乳杆菌经MRS液体培养基二次活化后，以5%的接种量接种于MRS-G培养基中，静态发酵72-96h；

MRS-G培养基配方以w/v计为：全部糖组分为2%的生物质原料水解液，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，牛肉浸膏1%，无水乙酸钠0.3%，柠檬酸三铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，无水硫酸镁0.01%，一水硫酸锰0.025 %，吐温80 0.1%，适量的一水合谷氨酸钠，以蒸馏水配制。

本发明的有益效果：提供了一种以富含半纤维素和/或纤维素的植物原料的水解液为碳源发酵生产GABA的方法。富含纤维素和/或半纤维素的生物质原料的水解液代替乳杆菌通用培养基MRS中的葡萄糖，并在培养基中添加一定量的谷氨酸钠，以5%的接种量接种于MRS-G培养基中，静态发酵72-96 h，GABA产量达46.16 g/L。

生物材料样品保藏：一种利用生物质原料为碳源高产γ-氨基丁酸的乳杆菌，其分类命名为乳杆菌（Lactobacillus sp.）PZW0001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国  武汉  武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2013438。保藏日期2013年9月21日。

具体实施方式

实施例1 高产γ-氨基丁酸的发酵乳杆菌的筛选方法

将发酵食品中筛选得到的乳杆菌，在添加1% MSG的MRS-G培养基中发酵72 h，取1-2 μL发酵液，用纸层析法对GABA产生菌进行初步筛选。以5%的GABA和5%的MSG溶液作为对照，GABA生产菌在GABA标样对应位点出现有紫红的斑点。

MRS-G培养基配方：葡萄糖2%（w/v，下同），蛋白胨1%，酵母提取物0.5 %，牛肉浸膏1%，无水乙酸钠0.3%，柠檬酸三铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，无水硫酸镁0.01 %，一水硫酸锰0.025%，吐温80 0.1%，谷氨酸钠（MSG）1%，以蒸馏水配制。

实施例2 以玉米芯稀酸水解液为碳源发酵生产GABA 

将干燥的玉米芯粉碎粒度至20~40目，和0.5%的稀硫酸按照1:6~1:10的质量体积比加入反应釜中，110℃高温水解1.5 h；所得水解液离心过滤，除去不溶性杂质。再用NaOH将水解液pH调整到6.5；50℃真空旋转蒸发，浓缩水解液2至3倍。浓缩后的水解液121℃ 20 min灭菌备用。

        MRS-G平板上挑取的单菌落，经MRS液体培养基二次活化后，以5%的接种量分别接种于含不同含量MSG的 MRS-G发酵培养基中，发酵72 h。

MRS-G培养基配方：全部糖组分为2%（w/v，下同）的生物质原料水解液，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，牛肉浸膏1%，无水乙酸钠0.3%，柠檬酸三铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，无水硫酸镁0.01%，一水硫酸锰0.025%，吐温80 0.1%，适量的一水合谷氨酸钠（MSG），以蒸馏水配制。

当MSG添加量为6 %时，GABA产量为34.02 g/l，MSG转化率达93.5 %；当MSG添加量为10 %时，GABA产量46.16 g/l，MSG转化率达83.8 %。

实施例3 以玉米秸秆水解液为碳源发酵生产GABA

将干燥玉米秸秆粉碎粒度至20~40目，75%浓硫酸常温处理30 min后，4%稀硫酸110℃高温处理1 h。再用NaOH将水解液pH调整到6.5；50℃真空旋转蒸发，浓缩水解液2至3倍。浓缩后的水解液121℃ 20 min灭菌备用。

      发酵方式与实施例2相同，MSG添加量为10%时，GABA产量可达43.28 g/L，MSG转化率为78.6 %。

Claims (2)

1.一株利用生物质原料为碳源高产γ-氨基丁酸的乳杆菌，其分类命名为乳杆菌（Lactobacillus sp.）PZW0001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2013438。

2.用权利要求1所述的乳杆菌CCTCC NO: M 2013438生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于利用富含半纤维素和/或纤维素的生物质原料的水解液为碳源发酵生产，所述乳杆菌经MRS液体培养基二次活化后，以5%的接种量接种于MRS-G培养基中，静态发酵72-96h；

MRS-G培养基配方以w/v计为：全部糖组分为2%的生物质原料水解液，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，牛肉浸膏1%，无水乙酸钠0.3%，柠檬酸三铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，无水硫酸镁0.01%，一水硫酸锰0.025 %，吐温80 0.1%，适量的一水合谷氨酸钠，以蒸馏水配制。