CN105969753B - 一种提高黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中热稳定性的方法 - Google Patents
一种提高黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中热稳定性的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中热稳定性的方法，属于基因工程领域。本发明方法为将将黑曲霉纤维素外切酶的氨基酸序列定向改造成如SEQ ID NO.3所示的序列。改造后的黑曲霉纤维素外切酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。通过将SEQ ID NO.4所示基因构建到酵母表达载体上，再用所构建的表达载体转化酵母即可得到生产改造后的黑曲霉纤维素外切酶的酵母菌株。改造后的黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中的热稳定性得到了提高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种提高黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中热稳定性的方法。
背景技术
黑曲霉纤维素酶是一种广泛使用的纤维素酶。在纤维素酶的作用下，纤维素被降解成可以利用的糖类。自然界里面有大量的纤维素在高盐环境之下，比如海藻、海洋垃圾中的纤维素、造纸废水中的纤维素等。高盐环境下纤维素的降解需要能够耐受高盐度的纤维素酶，因为高盐度会降低普通纤维素酶的热稳定性，耐盐的纤维素酶在高盐度下要具有更高的热稳定性。
黑曲霉纤维素酶是一种具有较好热稳定性的纤维素酶，然而其在高盐度下的热稳定性有待进一步提高，提高其在高盐度下的热稳定性有利于降低纤维素的降解成本，从而提升纤维素利用的价值。
提升纤维素酶的热稳定性或者提升纤维素酶高盐度下热稳定性的方法较多：化学修饰，物理固定，基因工程技术改造纤维素酶的一级序列等。基因工程技术改造纤维素酶的一级序列是一种较为可行的方案，一级序列改造后耐盐性能更好的酶具有更便利的利用方式。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种提高黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中热稳定性的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中热稳定性的方法，为将黑曲霉纤维素外切酶的氨基酸序列定向改造成如SEQ ID NO.3所示的序列。改造前，黑曲霉纤维素外切酶的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、2所示。改造后的黑曲霉纤维素外切酶与改造前相比，第311位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸，其在高盐溶液中的热稳定性得到了提高。改造后的黑曲霉纤维素外切酶编码基因的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.4所示。
一种生产黑曲霉纤维素外切酶的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：将SEQ IDNO.4所示的黑曲霉纤维素外切酶编码基因构建到酵母表达载体上，再用所构建的表达载体转化酵母。所述的表达载体优选为pPIC9K。
本发明通过基因工程技术，改变了纤维素外切酶的氨基酸序列，提高了纤维素外切酶在高盐溶液中的热稳定性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所用到的部分实验材料如下：限制性内切酶、胶回收试剂盒（Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0）、T4 DNA Ligase购自Takara；质粒pPIC9K、SMD1168酵母、大肠杆菌DH5α均为商业化产品，实验室保藏；质粒提取试剂盒（B518188）购自上海生工。SEQ IDNO.5所示的合成序列1、SEQ ID NO.6所示合成序列2为全合成序列，实验室保藏；合成序列1包含了酶切位点和改造前黑曲霉纤维素外切酶的编码基因（SEQ ID NO.2）序列，合成序列2包含了酶切位点和改造后黑曲霉纤维素外切酶的编码基因（SEQ ID NO.4序列。
实施例1
1、质粒pPIC9K的提取
含有质粒pPIC9K的大肠杆菌DH5α在含有氨苄青霉素50µg/mL的LB培养基中（50mL培养基装入150三角瓶中）37℃培养12h。用质粒提取试剂盒（B518188）提取质粒。提取步骤如下：
（1）取0.5mL菌液，10000rpm离心3min收集菌体，倒尽或吸干培养基。
（2）在菌体沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振荡至彻底悬浮菌体，室温放置3min。
（3）将裂解液全部小心移入吸附柱，室温放置1min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（4）向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（6）重复向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm 离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
（7）将吸附柱和收集管放入离心机，8000rpm离心2min。
（8）将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL ElutionBuffer，室温静置2min，8000 rpm离心2min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存。
2、质粒pPIC9K及SEQ ID NO.5所示合成序列1的酶切
质粒pPIC9K用EcoRI和NotI酶切，酶切为加入质粒25µL，加入两种限制性内切酶EcoRI和NotI酶切酶各0.2µL，加入酶切缓冲液及ddH2O 24.6µL，在30℃保温60min，加入5µLLoading Buffer，60℃保温10min，得到质粒pPIC9K酶切液。
合成序列1 25µL，加入酶切缓冲液及ddH2O 24.6µL，加入两种限制性内切酶EcoRI和NotI内切酶各0.2µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到合成序列1酶切液。
质粒pPIC9K和合成序列1分别酶切后，各自取酶切液进行电泳。
3、酶切液电泳
（1）电泳试剂配制
1）5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制（1000mL）：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L
EDTA 20mL，将pH调到8.0，定容至1000mL。4℃冰箱保存，用时稀释5倍。
2）加样缓冲液的配制：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。
3）溴化乙锭的配制：称取0.1g溴化乙锭，溶于10mL水，配成终浓度为10mg/mL的母液，4℃冰箱保存。染色时，吸取12.5μL的母液，加入250mL的水中，使其终浓度为0.5μg/mL，混合均匀。
4）100×TE缓冲液的配制：1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA。称取Tris121.1g，EDTA-Na 237.23g，先用800mL双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至8.0（大约加入盐酸20mL），然后定容至1000mL。
5）100×电泳缓冲液的配制：4mol/L Tris-HCl（pH8.0），2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTA。称取Tris 242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至8.0（大约加入冰乙酸50mL），然后定容至500mL。用时稀释100倍。
（2）电泳方法
1）安装电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。
2）1%琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化，取出摇匀。
3）灌胶：将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
4）待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。
5）加样：将DNA样品与加样缓冲液按体积比4:1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加20μL，记录样品的点样次序和加样量。
6）电泳：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。
7）染色和观察：取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带。
4、酶切片段的回收和纯化
使用Takara的胶回收试剂盒回收纯化酶切的DNA片段。在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
称量胶块重量，计算胶块体积。向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量3凝胶体积。均匀混合后室温25℃溶解胶块10min。当凝胶完全溶解后，加入3M醋酸钠溶液（pH5.2）10μL，均匀混合至溶液恢复黄色。将试剂盒中的Spin Column安置于CollectionTube上。0.2mL胶溶解液转移至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000rpm离心30秒钟，弃滤液。再次将700μL的BufferWB加入Spin Column中，室温12000rpm离心30秒钟，弃滤液。将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12000rpm离心1min。将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μL灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。室温12000rpm离心1min洗脱DNA。
5、连接与转化
连接体系为：酶切回收的合成序列1 7µL，酶切回收的pPIC9K质粒1µL，T4 DNAligase 1µL，Buffer 1µL。4℃连接24小时。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子培养，提质粒进行酶切、测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pPIC9K-1。
6、酵母菌感受态制备
（1）从平板上或保种管中，挑少许SMD1168酵母，在YPDA平板（YPDA培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，琼脂20g/L（固体），腺嘌呤15mL/L 0.2%腺嘌呤，调节pH=7.5，121℃灭菌15min）上划单克隆，30℃培养3天左右。
（2）从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3mL YPDA的玻璃试管中（平行做3管）。
（3）30℃、50rpm培养8-12h。取200µL菌液，测OD600。选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5µL转移至50mL新鲜的YPDA培养基中（培养基装在250mL三角瓶中）。
（4）30℃、230rpm培养16-20h，直至OD600=0.15-0.3。
（5）将培养好的菌液转入2个50mL离心管，室温3000g离心3min，弃上清，用100mL新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。30℃、230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）。
（6）将菌液倒入2个50mL离心管，室温3000g离心3min，弃上清，每个离心管用30mLmilipore水重悬。
（7）再次3000g离心3min，弃上清，每管用1.4mL 1.1×TE/LiAc重悬。
（8）将重悬的菌液转移到2个EP管中，12000rpm离心15s。
（9）弃上清，每管用600µL 1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，得到酵母感受态细胞。
7、质粒pPIC9K-1转化酵母菌
质粒pPIC9K-1用SacI线性化，往25µL pPIC9K-1中加入限制性内切酶SacI酶0.2µL、酶切缓冲液及ddH2O 24.8µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到pPIC9K-1酶切液。pPIC9K-1酶切液通过电泳回收纯化得到线性化的pPIC9K-1质粒。
往离心管中加入线性化的pPIC9K-1质粒10µL、鲑鱼精DNA（变性的，10mg/mL）5µL，加入酵母感受态细胞50µL，轻弹混匀；加入500µL PEG/LiAc轻弹混匀。30℃水浴30min，每10-15min轻弹混匀；加入20µL DMSO，轻弹混匀；42℃水浴15min，每5-10min轻弹混匀；12000rpm离心0.5min，弃上清；用1mL液体PDA培养基重悬；30℃、200rpm培养90min；12000r/m离心0.5min，弃上清；加入液体PDA培养基（含有0.9% NaCl）重悬，涂布含氨苄青霉素50µg/mL的PDA平板。
8、筛选
在含氨苄青霉素50µg/mL的PDA平板上筛选转化成功的转化子，接种于产酶培养基（产酶培养基为含葡萄糖8g/L、甲醇3g/L的YPDA培养基）。
250mL三角瓶中装入产酶培养基50mL，30℃、50rpm培养12h得到发酵醪液，测定发酵醪液中纤维素外切酶的酶活，酶活为0.005U/mL。
纤维素外切酶酶活测定方法为：取2g微晶纤维素粉末，溶于20mL 0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.8）中，加入发酵醪液0.5mL，50℃水浴30min，DNS法[见文献，甄静, 王继雯,谢宝恩, 等. 一株纤维素降解真菌的筛选、鉴定及酶学性质分析[J]. 微生物学通报,2011, 38(5): 709−714.]测定生成还原糖的量。酶活定义：每分钟水解微晶纤维素生成1µM还原糖所需酶的量为1U。
9、纤维素外切酶在高盐溶液中的热稳定性
取2g微晶纤维素粉末，溶于20mL 0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.8）中，加入NaCl，NaCl最终浓度为8%（w/w），加入上述步骤8中的发酵醪液0.5mL，测定酶活，酶活记为A，A=0.0052U/mL。
取2g微晶纤维素粉末，溶于20mL 0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.8）中，加入NaCl，NaCl最终浓度为8%（w/w），加入上述步骤8中的发酵醪液0.5mL，52℃水浴45min后再测定酶活，酶活记为B，B=0.004628U/mL。
热稳定性用B/A表示，值越大，热稳定性越好，测定B/A=89%。
实施例2
具体操作同实施例1，区别是将SEQ ID NO.5所示合成序列1换成SEQ ID NO.6所示合成序列2。最后筛选到的转化成功的转化子在产酶培养基培养得到的发酵醪液的酶活为0.0051 U/mL；其在高盐溶液中的酶活A为0.0053 U/mL，酶活B为0.005194 U/mL，稳定性B/A=98%。结果表明定向改造后的SEQ ID NO.4所示序列表达的纤维素外切酶在高盐溶液中的热稳定性得到提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种提高黑曲霉纤维素外切酶在高盐溶液中热稳定性的方法，其特征在于：所述的方法为将黑曲霉纤维素外切酶的氨基酸序列定向改造成如SEQ ID NO.3所示的序列。
2.一种改造后的黑曲霉纤维素外切酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.编码权利要求2所述的黑曲霉纤维素外切酶的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
4.一种生产黑曲霉纤维素外切酶的酵母菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：将权利要求3所述的基因构建到酵母表达载体上，再用所构建的表达载体转化酵母。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述的表达载体为pPIC9K。
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