CN108018264B - 一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法 - Google Patents

一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108018264B
CN108018264B CN201810084751.4A CN201810084751A CN108018264B CN 108018264 B CN108018264 B CN 108018264B CN 201810084751 A CN201810084751 A CN 201810084751A CN 108018264 B CN108018264 B CN 108018264B
Authority
CN
China
Prior art keywords
baculovirus
gene
cells
pfbdm
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810084751.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108018264A (zh
Inventor
刘阳坤
姚伦广
李娜
胡小敏
王铁军
谷娟娟
尹延震
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanyang Normal University
Original Assignee
Nanyang Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanyang Normal University filed Critical Nanyang Normal University
Priority to CN201810084751.4A priority Critical patent/CN108018264B/zh
Publication of CN108018264A publication Critical patent/CN108018264A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108018264B publication Critical patent/CN108018264B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，是以萤火虫荧光素酶Fluc基因为目的基因，分别构建多角体polh启动子和p10启动子控制的含有1‑3个基因拷贝数的重组杆状病毒，再感染SF9细胞系，感染后收集细胞检测萤火虫荧光素酶的活性。本发明的有益效果为：本发明提供的方法，经过检测发现，与未改造的杆状病毒相比，萤火虫荧光素酶基因表达量明显增加2‑5倍，有效提高了外源基因在杆状病毒系统中的表达量，适用于生产具有天然活性的蛋白质，其具有十分重要的意义，为利用杆状病毒多基因表达系统进行生产提供了一种新的构建重组病毒策略，实现了外源基因在杆状病毒多基因表达系统中的高效表达。

Description

一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达 方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法。
背景技术
目前，杆状病毒表达系统在药物研发、疫苗生产、基因治疗、重组杆状病毒杀虫剂等领域得到广泛应用。由于杆状病毒具有强大的多角体(polh)启动子和p10启动子，表达的外源蛋白经过修饰加工后具有良好的生物学活性，而且其基因组可以容纳较大的外源基因片段插入等，所以昆虫——杆状病毒表达系统已经成为公认的优良真核表达系统。近年来，利用重组杆状病毒生产的药物和疫苗都有成功上市的案例，例如杆状病毒表达系统生产的人乳头瘤病毒疫苗(CervarixTM，葛兰素史克)已经上市，并取得很好的免疫效果。
为了更好的利用杆状病毒表达系统生产外源蛋白，国内外许多学者致力于如何提高外源蛋白表达量的研究。研究人员一般通过抑制目的蛋白降解、优化启动子类型、合理调控目的基因转录以及通过活体昆虫而非培养细胞等技术手段对杆状病毒表达量进行优化。上述方法都能在一定程度上提高杆状病毒表达外源蛋白的表达量，但是目前杆状病毒中外源蛋白的表达量还未能达到理想的水平,因此如何提高外源蛋白的表达水平成为提高昆虫——杆状病毒表达系统效率的核心问题。
理论认为，病毒基因组中整合的外源基因拷贝数与其表达量会遵循剂量效应，即随着外源基因拷贝数的增加，外源蛋白表达量会逐渐提高。有文献指出在杆状病毒表达系统中将人乳头瘤状病毒结构蛋白L1编码的外源基因增加到2拷贝时，病毒样颗粒表达量有了显著提高。但是，也有文献报道当多拷贝外源基因进行转录翻译时，各个基因以及启动子之间会相互影响，而导致外源蛋白的表达效率下降。但是，目前尚未有杆状病毒表达系统中外源基因拷贝数与其蛋白表达量之间关系的系统研究。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法。是将多个拷贝数的外源基因表达框通过常规克隆方法同时插入一个杆状病毒载体中，得到改造的杆状病毒来提高外源蛋白在杆状病毒表达系统中的表达量。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，是以萤火虫荧光素酶Fluc基因为目的基因，分别构建多角体polh 启动子和p10启动子控制的含有1-3个基因拷贝数的重组杆状病毒，再使用重组杆状病毒感染SF9细胞系，在感染后48小时到96小时收集细胞检测萤火虫荧光素酶的活性。
进一步的，上述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，其包括以下步骤：
1)萤火虫荧光素酶基因的获得：
以质粒pET28a-Fluc为模板，设计一对特异性引物BSFlucF和XhoFlucR，其中BSFlucF 引物添加有BamHI和SmaI酶切位点，XhoFlucR引物添加有XhoI酶切位点；然后利用PCR方法扩增得到Fluc基因并测序验证；
2)p10启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建：
将测序正确的Fluc通过SmaI和XhoI进行酶切后连接进pFBDM-IG的相同酶切位点，获得载体pFBDM-p10F-IG；然后将pFBDM-p10F-IG通过PmeI和SpeI酶切获得p10F的片段，克隆到pFBDM-p10F-IG的Bstz17I和SpeI位点，获得pFBDM-2p10F-IG；最后将 pFBDM-2p10F-IG通过PmeI和SpeI酶切获得2p10F的片段，克隆到pFBDM-p10F-IG的 Bstz17I和SpeI位点，获得pFBDM-3p10F-IG；
3)polh启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建：
将测序正确的Fluc通过BamHI和XhoI进行酶切后连接进pFBDM-IG的BamHI和SalI位点，获得载体pFBDM-polhF-IG；然后将pFBDM-polhF-IG通过NruI和PstI酶切获得 polhF的片段，克隆到pFBDM-polhF-IG的Bstz17I和NsiI位点，获得pFBDM-2polhF-IG；最后将pFBDM-2polhF-IG通过NruI和PstI酶切获得2polhF的片段，克隆到 pFBDM-polhF-IG的Bstz17I和NsiI位点，获得pFBDM-3polhF-IG；
4)Tn7位点的转座：
制备AcMultiBac/rSW106-inv+asd-感受态细胞，分别加入步骤2)或步骤3)中所构建的不同重组转移载体的质粒5μL，，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2min，然后加入800μL含有DAP的LB培养基，32℃200rpm恒温摇床上振荡培养6h，涂布含Kan/Tet/Spe/Gm/ DAP/IPTG/X-gal的固体LB平板上，32℃培养箱中培养24～48h，直至出现蓝白斑；挑取3～ 5个白斑于含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的LB培养液中32℃220rpm振荡培养，然后用Fluc特异性引物进行菌液PCR验证，验证正确的菌液保存备用；
5)重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒：
将筛选的阳性重组菌液，感染Sf9细胞，感染方法为：用含8％FBS的Grace's培养基培养Sf9细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜；第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基；将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL菌液到1.5mL EP管里，5000rpm 离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5ml EP管里稀释100倍、1000 倍；将稀释成100倍、1000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育 4h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基；3d后进行荧光检测观察以确定感染是否成功；将有荧光的细胞上清收集起来即为P1代重组病毒，将P1代重组病毒感染新的Sf9细胞得到P2代重组病毒；
6)萤火虫荧光素酶表达量的测定：
收集病毒感染的Sf9细胞，将Sf9细胞悬液交替地置于干冰和37℃水浴中反复冻融3次，4℃、10000g离心2min，将上清液转移到另一离心管中备用；再利用荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶的表达量即可。
进一步的，上述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，所述步骤1)中，Fluc基因片段的扩增引物为：
BSFlucF序列如SEQ ID No.1所示；5'-aaggatcccgggccaccatggaagacgcc-3'；
XhoFlucR序列如SEQ ID No.2所示；5'-aactcgagcacggcgatctttccgccc-3'。
进一步的，上述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，所述步骤2)中，pFBDM-IG转移载体是在pFBDM原始载体的BstBI和PstI中插入IRES和GFP基因。其中，IRES基因，即内部核糖体进入位点，介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译；GFP基因表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起到报告基因的作用，IRES有助于GFP 蛋白的表达。
进一步的，上述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，所述萤火虫荧光素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
进一步的，上述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV)。
进一步的，上述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，所述目的基因表达通过杆状病毒感染细胞进行，所使用的细胞株为草地夜蛾细胞系SF9。
进一步的，上述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，所述的杆状病毒构建方法为Bac-to-Bac法。
技术关键点：本发明提供的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，包含有萤火虫荧光素酶基因片段，多角体polh启动子，p10启动子，内部核糖体进入位点IRES基因和GFP基因。其中GFP基因表达可以产生绿色荧光蛋白，主要用于在病毒转染和感染时的细胞荧光观察；方法的具体操作步骤为：萤火虫荧光素酶基因的获得，p10启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建，polh启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建，Tn7位点的转座，重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒和萤火虫荧光素酶表达量的检测。
本发明的有益效果为：本发明提供的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，是将多个拷贝数的外源基因表达框通过常规克隆方法同时插入一个杆状病毒载体中，得到改造的杆状病毒，用改造后的杆状病毒感染适当的细胞，在感染后48小时到96小时收集细胞，检测发现与未改造的杆状病毒相比，目的蛋白的表达量(即萤火虫荧光素酶基因表达量)明显增加2-5倍，有效提高了外源基因在杆状病毒系统中的表达量，适用于生产具有天然活性的蛋白质。本发明利用多拷贝基因共表达提高杆状病毒外源蛋白表达量的方法具有十分重要的意义，为以后在利用杆状病毒多基因表达系统进行生产时提供了一种新的构建重组病毒策略，在表达生产外源蛋白或者疫苗时，可以通过构建合理的基因拷贝数进行表达，从而实现外源基因在杆状病毒多基因表达系统中的高效表达。
附图说明
图1显示为萤火虫荧光素酶Fluc基因的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果图。
其中，1为Fluc基因片段，M为DL2000 DNA Marker。
图2显示为使用p10启动子的不同拷贝数杆状病毒基因结构示意图。
其中，Ac-p10F-IG为含有1个拷贝数的p10启动子驱动的Fluc基因表达框的重组杆状病毒， Ac-2p10F-IG为含有2个拷贝数的p10启动子驱动的Fluc基因表达框的重组杆状病毒， Ac-3p10F-IG为含有3个拷贝数的p10启动子驱动的Fluc基因表达框的重组杆状病毒。
图3显示为使用polh启动子的不同拷贝数杆状病毒基因结构示意图。
其中，Ac-polhF-IG为含有1个拷贝数的polh启动子驱动的Fluc基因表达框的重组杆状病毒，Ac-2polhF-IG为含有2个拷贝数的polh启动子驱动的Fluc基因表达框的重组杆状病毒， Ac-3polhF-IG为含有3个拷贝数的polh启动子驱动的Fluc基因表达框的重组杆状病毒。
图4显示为使用p10启动子的不同拷贝数病毒在Sf9细胞表达的Fluc的表达量。
其中，每个重组病毒均按照MOI＝5的比例感染SF9昆虫细胞，96小时后收集细胞，利用荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶活性。每个病毒做3个重复，a、b、c不同字母代表不同病毒之间的蛋白表达量差异显著性P＜0.05。
图5显示为使用polh启动子的不同拷贝数病毒在Sf9细胞表达的Fluc的表达量。
其中，每个重组病毒均按照MOI＝5的比例感染SF9昆虫细胞，96小时后收集细胞，利用荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶活性。每个病毒做3个重复，a、b、c不同字母代表不同病毒之间的蛋白表达量差异显著性P＜0.05。
具体实施方式
实施例1：
一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，包括以下步骤：
1、萤火虫荧光素酶基因的PCR扩增：
以质粒Pet28a-Fluc为模板，设计一对特异性引物BSFlucF和XhoFlucR，其中BSFlucF 引物添加有BamHI和SmaI酶切位点，XhoFlucR引物添加有XhoI酶切位点。然后利用PCR方法扩增得到Fluc基因片段，基因序列长度为1671bp(结果见图1)，PCR扩增结束后将PCR 产物送北京华大基因测序验证。
2、p10启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建：
将测序正确的Fluc基因片段通过SmaI和XhoI进行酶切后连接进pFBDM-IG的相同酶切位点，获得载体pFBDM-p10F-IG；然后将pFBDM-p10F-IG通过PmeI和SpeI酶切获得p10F的片段，克隆到pFBDM-p10F-IG的Bstz17I和SpeI位点，获得pFBDM-2p10F-IG；最后将pFBDM-2p10F-IG通过PmeI和SpeI酶切获得2p10F的片段，克隆到pFBDM-p10F-IG的 Bstz17I和SpeI位点，获得pFBDM-3p10F-IG(见图2)。
3、polh启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建：
将测序正确的Fluc基因片段通过BamHI和XhoI进行酶切后连接进pFBDM-IG的BamHI和SalI位点，获得载体pFBDM-polhF-IG；然后将pFBDM-polhF-IG通过NruI和PstI 酶切获得polhF的片段，克隆到pFBDM-polhF-IG的Bstz17I和NsiI位点，获得 pFBDM-2polhF-IG；最后将pFBDM-2polhF-IG通过NruI和PstI酶切获得2polhF的片段，克隆到pFBDM-polhF-IG的Bstz17I和NsiI位点，获得pFBDM-3polhF-IG(见图3)。
4、Tn7位点的转座：
1)AcMulitBac/SW106-inv+asd-感受态细胞的制备方法采用CaCl2法，制备过程大致如下：将保存于-80℃冰箱的菌种划线培养于Kan/Tet/Spe/DAP/IPTG/X-Gal的LB固体培养基上 32℃培养48h左右，然后挑取蓝色单菌落放于相应抗性的LB培养液中32℃摇菌过夜。第二天，取菌液按照1:100的比例加入到新鲜的LB培养液中振荡培养至OD600达到0.2时加入终浓度为0.1％的L-阿拉伯糖继续培养，待OD600达到0.4～0.6时，转移菌液于干净的EP 管中，冰置30min，然后4℃3000g离心10min；将细胞沉淀用25mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬起来，冰置30min，4℃3000g离心10min；再依次用10mL和1mL预冷的0.1 mol/LCaCl2溶液重悬离心，最后加入终浓度为15％的甘油混匀，分装并立即冻存于-80℃超低温冰箱中备用。
2)质粒的转座：从-80℃超低温冰箱中取1支AcMulitBac/SW106-inv+asd-感受态细胞放于冰上解冻，待感受态细胞溶化后加入1ng质粒轻轻混匀，然后冰浴30min后在42℃水浴锅中热激90s，加入800μL新鲜的含DAP营养素的LB培养液，32℃摇床上活化复苏6h左右，然后涂于含有合适抗生素的LB固体培养基上，然后放于32℃恒温培养箱中培养。24～48h后挑取白色单克隆摇菌并进行菌液PCR鉴定，PCR扩增得到1671bp的特异性条带。
5、重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒：
用含8％FBS的Grace's培养基培养Sf9细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜。第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基。将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL 菌液到1.5mL EP管里，5 000rpm离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5 000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5mlEP管里稀释100倍、1 000倍。将稀释成100倍、1 000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500 μL完全培养基，3d后观察荧光。
6、萤火虫荧光素酶表达量的检测：
收集病毒感染的Sf9细胞，将上述悬液交替地置于干冰和37℃水浴中反复冻融3次， 4℃、10 000g离心2min，将上清转移到一新的离心管中备用。将100μL平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent加入试管中，再小心吸取20μL细胞裂解物至试管中，轻弹混匀，然后于化学发光仪(luminometer)中检测萤火虫荧光素酶的活性(如图4、5所示)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> BSFlucF引物序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
aaggatcccg ggccaccatg gaagacgcc 29
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> XhoFlucR引物序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
aactcgagca cggcgatctt tccgccc 27
<210> 3
<211> 1653
<212> DNA
<213> 萤火虫荧光素酶基因核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatccgct ggaagatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtggac atcacttacg ctgagtactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgggcatt 360
tcgcagccta ccgtggtgtt cgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaagctcc caatcatcca aaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtgccag agtccttcga tagggacaag acaattgcac tgatcatgaa ctcctctgga 600
tctactggtc tgcctaaagg tgtcgctctg cctcatagaa ctgcctgcgt gagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttc tgaggagcct tcaggattac 840
aagattcaaa gtgcgctgct ggtgccaacc ctattctcct tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctggtggcgc tcccctctct 960
aaggaagtcg gggaagcggt tgccaagagg ttccatctgc caggtatcag gcaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcaaag aggcgaactg tgtgtgagag gtcctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tcgttgaccg cctgaagtct 1320
ctgattaagt acaaaggcta tcaggtggct cccgctgaat tggaatccat cttgctccaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc aggtgtcgca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taa 1653

Claims (3)

1.一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，其特征在于，是以萤火虫荧光素酶Fluc基因为目的基因，分别构建多角体polh启动子和p10启动子控制的含有1-3个基因拷贝数的重组杆状病毒，再使用重组杆状病毒感染SF9细胞系，在感染后48小时到96小时收集细胞检测萤火虫荧光素酶的活性；
包括以下步骤：
1）萤火虫荧光素酶基因的获得：
以质粒 pET28a-Fluc为模板，设计一对特异性引物BSFlucF和XhoFlucR，其中BSFlucF引物添加有BamHI和SmaI酶切位点，XhoFlucR引物添加有XhoI酶切位点；然后利用PCR方法扩增得到Fluc基因并测序验证；
2）p10 启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建：
将测序正确的Fluc通过 SmaI 和 XhoI 进行酶切后连接进 pFBDM-IG的相同酶切位点，获得载体pFBDM-p10F-IG；然后将pFBDM-p10F-IG通过 PmeI 和 SpeI 酶切获得 p10F的片段，克隆到pFBDM-p10F-IG的 Bstz17I 和 SpeI 位点，获得pFBDM-2p10F-IG；最后将pFBDM-2p10F-IG通过 PmeI 和 SpeI 酶切获得 2p10F 的片段，克隆到pFBDM-p10F-IG的Bstz17I 和 SpeI 位点，获得pFBDM-3p10F-IG；
pFBDM-IG转移载体是在pFBDM原始载体的BstBI和PstI中插入IRES和GFP基因；
所述萤火虫荧光素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒；
所述目的基因表达通过杆状病毒感染细胞进行，所使用的细胞株为草地夜蛾细胞系SF9；
3）polh 启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建：
将测序正确的Fluc通过 BamHI 和 XhoI 进行酶切后连接进 pFBDM-IG的BamHI和SalI位点，获得载体pFBDM-polhF-IG；然后将pFBDM-polhF-IG通过 NruI 和 PstI 酶切获得polhF 的片段，克隆到pFBDM-polhF-IG的 Bstz17I 和 NsiI 位点，获得pFBDM-2polhF-IG；最后将pFBDM-2polhF-IG通过NruI 和 PstI酶切获得 2polhF 的片段，克隆到pFBDM-polhF-IG的 Bstz17I 和 NsiI位点，获得pFBDM-3polhF-IG；
4）Tn7位点的转座：
制备AcMultiBac/rSW106-inv+asd-感受态细胞，分别加入步骤2）或步骤3）中所构建的不同重组转移载体的质粒5μL，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2min，然后加入800μL含有DAP的LB培养基，32℃ 200rpm恒温摇床上振荡培养6h，涂布含Kan/Tet/Spe/Gm/
DAP/IPTG/X-gal的固体LB平板上，32℃培养箱中培养24～48h，直至出现蓝白斑；挑取3～5个白斑于含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的LB培养液中32℃ 220rpm振荡培养，然后用Fluc特异性引物进行菌液PCR验证，验证正确的菌液保存备用；
5）重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒：
将筛选的阳性重组菌液，感染Sf9细胞，感染方法为：用含8% FBS 的Grace's 培养基培养Sf9细胞于50 mL培养瓶中，当细胞生长70%到80%单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜；第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基；将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1 mL 菌液到1.5 mL EP 管里，5000 rpm 离心3 min，倒掉上清，用PBS 重悬菌体，5000 rpm 离心3 min，重复洗2次，倒掉上清，加入1 mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5 ml EP 管里稀释100倍、1000倍；将稀释成100倍、1000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4 h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基；3d 后进行荧光检测观察以确定感染是否成功；将有荧光的细胞上清收集起来即为P1代重组病毒，将P1代重组病毒感染新的Sf9细胞得到P2代重组病毒；
6）萤火虫荧光素酶表达量的测定：
收集病毒感染的Sf9细胞，将Sf9细胞悬液交替地置于干冰和37℃水浴中反复冻融3次，4℃、10000g离心2 min，将上清液转移到另一离心管中备用；再利用荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶的表达量即可。
2.根据权利要求1所述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，其特征在于，所述步骤1）中，Fluc基因片段的扩增引物为：
BSFlucF序列如SEQ ID No.1所示；5'-aaggatcccgggccaccatggaagacgcc-3'；
XhoFlucR序列如SEQ ID No.2所示；5'-aactcgagcacggcgatctttccgccc-3'。
3.根据权利要求1所述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，其特征在于，所述的杆状病毒构建方法为Bac-to-Bac法。
CN201810084751.4A 2018-01-29 2018-01-29 一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法 Active CN108018264B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810084751.4A CN108018264B (zh) 2018-01-29 2018-01-29 一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810084751.4A CN108018264B (zh) 2018-01-29 2018-01-29 一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108018264A CN108018264A (zh) 2018-05-11
CN108018264B true CN108018264B (zh) 2021-04-27

Family

ID=62074879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810084751.4A Active CN108018264B (zh) 2018-01-29 2018-01-29 一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108018264B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949666A (zh) * 2018-08-13 2018-12-07 武汉华联科生物技术有限公司 一种分离萤火虫发光囊细胞的方法
CN111593072B (zh) * 2020-05-12 2021-04-27 深圳海关动植物检验检疫技术中心 一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用
CN112852883B (zh) * 2021-03-03 2023-06-06 浙江理工大学 基于共表达分泌性荧光素酶滴定重组杆状病毒的方法
CN114369624B (zh) * 2021-12-30 2023-07-14 华南农业大学 一种降低病毒感染导致的昆虫细胞凋亡的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994550A (zh) * 2012-10-24 2013-03-27 中国农业科学院生物技术研究所 在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法
CN103740758A (zh) * 2013-12-18 2014-04-23 广东华南联合疫苗开发院有限公司 一种重组杆状病毒载体及病毒样颗粒及制备方法和用途
CN104313053A (zh) * 2014-10-24 2015-01-28 华南农业大学 一种生产人源胶原蛋白ⅱ型的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994550A (zh) * 2012-10-24 2013-03-27 中国农业科学院生物技术研究所 在动物细胞或动物组织中表达外源基因的方法
CN103740758A (zh) * 2013-12-18 2014-04-23 广东华南联合疫苗开发院有限公司 一种重组杆状病毒载体及病毒样颗粒及制备方法和用途
CN104313053A (zh) * 2014-10-24 2015-01-28 华南农业大学 一种生产人源胶原蛋白ⅱ型的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
多基因表达系统研究进展;楚素霞等;《中国生物工程杂志》;20111231;第31卷(第6期);第116页左栏倒数第3行，第118页右栏第1段第9-13行 *
荧光素酶基因的克隆表达及其产物纯化和鉴定;唐晨辉等;《病毒学报》;19960331;第12卷(第 01 期);摘要和结果部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108018264A (zh) 2018-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108018264B (zh) 一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法
CN107236747B (zh) 口蹄疫病毒重组病毒样粒子及其制备方法和应用
CN110204598B (zh) 一种猪圆环病毒ⅲ型病毒样颗粒及其制备方法
CN105200085A (zh) 重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法及其用途
CN113355292B (zh) 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用
CN101724652A (zh) 家蚕BmNPV Polh+Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建方法
CN110144334A (zh) 一种共表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白vp4和vp35的重组杆状病毒的制备方法和应用
CN104178514B (zh) 一种提高AcMNPV多角体内部外源蛋白含量的方法
CN102876700A (zh) PiggyBac转座子介导的肌肉特异表达A-FABP通用载体构建
CN102559760B (zh) 可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法
CN102286534B (zh) 表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用
CN106566829A (zh) 一种核衣壳装配必需元件及其应用
CN110541000B (zh) 一种磁性纳米颗粒介导的转抗菌肽小球藻的获得方法
CN110592139B (zh) 一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用
CN114214338A (zh) 猪源piv5全长感染性克隆及其制备方法和应用
Sun et al. Production of recombinant Bombyx mori nucleopolyhedrovirus in silkworm by intrahaemocoelic injection with invasive diaminopimelate auxotrophic Escherichia coli containing BmNPV–Bacmid
CN108148839A (zh) 家蚕30k蛋白19g1基因启动子lp19及其表达载体和应用
CN105385666A (zh) 伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建
CN1268573A (zh) 中国鸡痘病毒疫苗株表达载体
RU2009137571A (ru) Способ наращивания рекомбинантного аденовируса человека
CN105779500B (zh) 一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法
CN114606201B (zh) 重组杆状病毒基因组及其改造方法、应用以及表达外源蛋白的方法
CN104195119B (zh) 一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备方法
CN113817765B (zh) 农杆菌同源重组系统及其应用
CN112779174B (zh) 一株敲除Cln3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant