CN110204598B - 一种猪圆环病毒ⅲ型病毒样颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒的制备方法包括扩增猪圆环Ⅲ型Cap蛋白基因，并利用所述基因构建重组穿梭质粒pFB‑Cap，利用所述重组穿梭质粒pFB‑Cap构建rB‑Cap重组杆粒，将所述rB‑Cap重组杆粒转染SF9细胞，得到表达猪圆环病毒Ⅲ型Cap基因的重组杆状病毒rBV‑PCV3 Cap，将所述重组杆状病毒rBV‑PCV3 Cap感染High Five细胞，纯化，得到猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒PCV3 VLP过程；其中，所述Cap蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明实施例基于杆状病毒‑昆虫细胞表达系统，使用无血清悬浮培养的High Five细胞表达制备，结合蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心纯化获得PCV3病毒样颗粒。本发明实施例的病毒样颗粒免疫原性好，安全性高，具有良好的开发与应用前景。

Description

一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒及其制备方法
技术领域
本发明实施例涉及生物制药技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒的制备方法。
背景技术
临床上，猪圆环病毒Ⅲ型(porcine circovirus 3，PCV3)感染的猪多会出现腹下黑斑、产死胎或木乃伊肽，但种猪采食量和精神状态良好；保育猪多发生混合感染，精神状态极差、高烧扎堆、腹式呼吸等，发病严重的猪场死亡率超过15％，已给养殖业带来了一定的经济损失。
PCV3是单股环状的DNA病毒，基因组长度约为2.0kb，病毒离子直径约17-20nm，无囊膜。PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性仅为30％，而Cap蛋白是PCV诱导动物机体产生特异性免疫应答的主要蛋白，因此PCV2疫苗对于PCV3所能提供的保护非常有限。PCV3作为一种新型病毒，该病毒的病原学研究尚不明确，国内外尚未有分离纯化PCV3的报道，因此制约了利用灭活疫苗进行防控的思路。
病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是一类由病毒的部分或全部结构蛋白自动组装成的具有与天然病毒结构基本一致的空心蛋白颗粒，不具有病毒的遗传物质，不能自主复制，作用于机体后能够引起机体产生类似于天然病毒感染的免疫应答反应。因其具有良好的免疫原性、较高的安全性等特点，目前已经成为研制用于人或动物病毒性感染疾病的潜在的安全高效候选疫苗之一。
根据VLPs的理化特性及用途通常可采用大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统等原核表达系统，或酵母表达系统及哺乳动物细胞表达系统(如CHO、HEK293)等真核细胞表达系统进行制备。
综上所述，目前尚未通过上述表达系统制备出猪圆环病毒PCV3的病毒样颗粒，亟待研发一种能够高效、安全、低成本地制备猪圆环病毒PCV3的病毒样颗粒的方法。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒及其制备方法，以解决现有技术制备的病毒样颗粒免疫原性差以及不适合大规模生产的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒颗粒的制备方法包括扩增猪圆环Ⅲ型Cap蛋白基因，并利用所述基因构建重组穿梭质粒pFB-Cap，利用所述重组穿梭质粒pFB-Cap构建rB-Cap重组杆粒，将所述rB-Cap重组杆粒转染SF9细胞，得到表达猪圆环病毒Ⅲ型Cap蛋白的重组杆状病毒rBV-PCV3 Cap，将所述重组杆状病毒rBV-PCV3 Cap感染HighFive细胞，纯化，得到猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒PCV3 VLP过程；
其中，所述Cap蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述猪圆环Ⅲ型Cap蛋白基因核苷酸序列，在所述核苷酸序列起始密码子ATG前设有EcoRⅠ酶切位点序列，ATG后设有His标签序列，终止密码子后设有NotⅠ酶切位点序列。
优选的，所述病毒样颗粒的纯化采用蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心法。
优选的，所述病毒样颗粒纯化时，先采用20％蔗糖进行超速离心浓缩，然后通过40％、60％、80％蔗糖密度梯度离心进行纯化，PCV3病毒样颗粒存在于60-80％蔗糖层之间。
优选的，所述重组穿梭质粒pFB-Cap是将猪圆环病毒Ⅲ型的Cap蛋白基因插入到pFastBac 1载体形成的。
优选的，所述rB-Cap重组杆粒是将所述的pFB-Cap重组载体转化至DH10Bac感受态细胞发生转座所得到的。
优选的，所述Cap蛋白基因的核苷酸序列的扩增正向引物PCV3F序列如SEQ IDNO.3所示；反向引物PCV3R序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明实施例另一方面还提供所述的猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒在制备治疗猪圆环病毒Ⅲ型病毒引起的猪的皮炎、肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症疾病的药物的应用。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例的猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒及其制备方法，该制备方法基于杆状病毒-昆虫细胞表达系统(Bac-to-Bac)，使用无血清悬浮培养的High Five细胞表达制备，结合蔗糖垫超速离心和蔗糖密度梯度离心纯化获得PCV3病毒样颗粒。该方法适合于进行大规模制备猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒可作为候选疫苗，免疫原性好，安全性高，具有良好的开发与应用前景。
本发明实施例制备的猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒，Western Blot结果显示可与Anti-His抗体发生特异性结合，表明重组Cap蛋白在昆虫细胞中成功表达。猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒通过透射电镜可见直径约为17-22nm左右的球形病毒样颗粒。
附图说明
图1为本发明实施例的pFB-Cap重组载体的酶切鉴定核酸电泳图；其中泳道1为重组质粒电泳图，泳道2为重组质粒经限制性核酸内切酶作用后的电泳图，泳道M为核酸分子量；
图2为本发明实施例的Cap蛋白WesternBlot鉴定结果图；其中泳道1为Cap蛋白样品，泳道2为阴性对照，M为蛋白标准分子质量，His单克隆抗体作为一抗。
图3为本发明实施例的猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒PCV3 VLP电镜图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1猪圆环病毒Ⅲ型Cap蛋白基因的设计与合成
根据已发表的猪圆环病毒Ⅲ型Cap蛋白的核苷酸序列(GenBank登录号:KX966193.1)，在猪圆环病毒Ⅲ型Cap蛋白核苷酸序列的起始密码子ATG前添加EcoRⅠ酶切位点：gaattc，ATG后添加His标签序列，如SEQ ID NO.2所示，终止密码子后添加NotⅠ酶切位点：gcggccgc，优化设计后的Cap蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示。Cap蛋白基因的核苷酸序列的扩增正向引物PCV3F序列如SEQ ID NO.3所示；反向引物PCV3R序列如SEQ ID NO.4所示。该基因委托金唯智生物科技有限公司合成，并克隆至pUC57载体上，命名为pUC57-Cap。
实施例2重组穿梭质粒pFB-Cap的构建与鉴定
使用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pUC57-Cap和pFastBac 1质粒，37℃反应2h，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收Cap蛋白基因片段与线性化的pFastBac 1；取T4 DNA连接酶、T4 Buffer、线性化的pFastBac1各1μL加入到7μL的Cap蛋白基因片段中，轻轻混匀，25℃孵育10min，将混合物加入到刚刚融化的Trans5α感受态细胞中，冰上孵育20min，42℃热激45s，立即冰浴5min，37℃活化5min后均匀的涂布在含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养平板上，37℃倒置培养12h，获得重组穿梭质粒pFB-Cap菌落。
挑取单个菌落，接种在含氨苄青霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养12h，使用Axygen质粒小量提取试剂盒提取质粒，将获得的质粒使用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切进行鉴定，如图1所示，pFB-Cap重组质粒的酶切鉴定核酸电泳结果，鉴定表明获得构建正确的重组穿梭质粒pFB-Cap。
实施例3rB-Cap重组杆粒构建与rB-Cap重组杆粒的提取
取1ng实施例2中的重组穿梭质粒pFB-Cap加入到刚刚冰上融化的DH10Bac感受态细胞中，轻轻混匀冰浴20min，42℃热激45s，立即冰浴5min，使用无抗生素的SOC培养基37℃震荡活化4h，取80μL均匀涂布在含卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、X-Gal(100μg/mL)、IPTG(40μg/mL)的LB蓝白斑筛选平板上，37℃倒置培养48h，挑取白色菌落进行PCR鉴定，将含有目的条带的菌液采用三线法在上述LB蓝白斑筛选平板上划线，37℃倒置培养36h后，挑取白色菌落进行PCR鉴定，获得rB-Cap重组载体，选取仅含有目的条带的菌液进行扩大培养。
菌液在37℃，220rpm震荡培养12h后，4000rpm，4℃离心1min收集菌体，使用溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-Hcl pH 8.0、10mmol/L EDTA pH 8.0)重悬沉淀，加入溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH、1％SDS)轻轻颠倒裂解菌体，加入溶液Ⅲ(60％5mol/L乙酸钾、11.5％冰乙酸)，轻轻上下颠倒，12000rpm，4℃离心10min弃掉沉淀，将上清转移至新的EP管中，加入等量的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置20min，12000rpm，4℃离心10min弃掉上清，加入70％无水乙醇，轻轻颠倒，离心弃掉上清，并重复一次。将沉淀使用无菌风吹干，至半透明状，加入适量的无菌水，静置使其自然溶解，即为重组杆粒rB-Cap。
实施例4表达猪圆环病毒Ⅲ型Cap蛋白的重组杆状病毒rBV-PCV3 Cap的拯救
将SF9细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁且汇合度达50％以上时，使用双无Grace昆虫细胞培养基替换原有培养基(SF900Ⅱ)。取8μL
Figure GDA0002824171350000051
Ⅱ转染试剂加入到100μL双无Grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀。
另将3μg实施例3中的重组杆粒rB-Cap加入到100μL双无Grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀；将稀释的重组杆粒加入到稀释后的转染试剂中，混合均匀，室温孵育20min，将混合物均匀的滴加到6孔板中。4h后弃掉转染混合物，换为添加有青霉素(0.1mg/ml)、链霉素(0.1mg/ml)、10％(V:V)FBS的
Figure GDA0002824171350000061
Ⅱ完全培养基。27℃继续培养，持续观察直至出现病毒感染征象。
待细胞出现脱落或裂解时，收集培养上清，4000rpm，4℃离心5min去掉上清中的大分子物质，使用0.22μm低蛋白结合滤器过滤，滤出液即为第一代重组杆状病毒rBV-Cap，即表达猪圆环病毒Ⅲ型Cap蛋白的重组杆状病毒rBV-PCV3 Cap。重组杆状病毒盲传至第三代，-80℃保存。
实施例5重组杆状病毒rBV-PCV3 Cap滴度测定
将SF9细胞接种在96孔板的12个孔中，6.5×104cells/well。将实施例4中的第三代重组杆状病毒稀释至至终浓度分别为10-3、10-4、10-5三个梯度。弃掉96孔板中的液体，每孔加入25μL/well连续稀释的病毒液，在阴性对照孔中加入25μL/well的培养基。27℃孵育1h，将96孔板中的病毒液甩掉，并在无菌纸巾上轻轻拍干，加入50μL/well的甲基纤维素，27℃孵育43-47h。在含有甲基纤维素的孔中直接加入150μL/well的4％多聚甲醛，室温固定30min；弃掉液体，使用200μL Wash Buffer(含CaCl2和MgCl2的PBS+0.05％Tween 20)清洗细胞3次，每次5min；加入50μL/well山羊血清(80μL山羊血清加入2.3mL PBS+0.05％Tween20)，室温封闭10min；弃掉封闭液，加入25μL/well稀释的Mouse gp64 Antibody，37℃孵育25min；弃掉液体，使用200μL Wash Buffer清洗细胞2次，每次5min；加入50μL/well HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育25min；弃掉液体，使用200μL Wash Buffer清洗细胞3次，每次5min；加入50μL/well蓝色过氧化物酶底物，室温孵育3h，显微镜下观察统计。最早可在染色10min后进行观察。统计最高稀释倍数下的染色斑点数，并计算平均数，病毒滴度(IFU/ml)＝最高稀释度的斑点平均数×稀释倍数×40。
实施例6Western Blot鉴定重组杆状病毒Cap蛋白的表达
将实施例4中剩余的细胞中入适量的裂解液，冰上裂解15min后，制备蛋白样品。蛋白样品经12％SDS-PAGE，半干法将蛋白转印至NC膜上，5％脱脂乳室温封闭1h，使用MouseHis Antibody抗体室温孵育2h，TBST清洗NC膜8min×3次，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG室温孵育1h，TBST清洗NC膜10min×3次，将化学发光液ECL均匀的滴加在NC膜上，使用AmershamImager 600进行曝光，如图2所示，重组猪圆环病毒Ⅲ型病毒的Cap蛋白WesternBlot鉴定结果。
实施例7猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒PCV3 VLP纯化与鉴定
优选的按4MOI实施例4中的重组杆状病毒感染High Five细胞48h。3500rpm，4℃离心20min，取上清，0.45μm低蛋白结合滤器过滤，20％(M:V)蔗糖垫35 000rpm，4℃离心2h，使用2mL PBS重悬沉淀，进行40-60-80％(M:V)蔗糖密度梯度离心，缓慢取出60-80％蔗糖层之间的乳白色环状部分，使用PBS稀释至40mL，35 000rpm/min，4℃离心2h，去掉蔗糖，使用适量PBS重悬沉淀，进行1％磷钨酸负染，透射电镜观察PCV3 VLPs的结构，如图3所示，猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒PCV3 VLP电镜图，图中箭头所指为猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure GDA0002824171350000081
Figure GDA0002824171350000091
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒及其制备方法
<130> GG19533632A
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcatgc atcaccatca ccatcacaga cacagagcta tattcagaag aagaccccgc 60
ccaaggagac gacgacgcca caggaggcgc tatgtcagaa gaaaactatt cattaggagg 120
cccacagctg gcacatacta cacaaagaaa tactccacca tgaacgtcat ttccgttgga 180
acccctcaga ataacaagcc ctggcacgcc aaccacttca ttacccgcct aaacgaatgg 240
gaaactgcga ttagctttga atattataag atactaaaga tgaaagttac actcagccct 300
gtaatttctc cggctcagca aacaaaaact atgttcgggc acacagccat agatctagac 360
ggcgcctgga ccacaaacac ttggctccaa gacgaccctt atgcggaaag ttccactcgt 420
aaagttatga cttctaaaaa aaaacacagc cgttacttca cccccaaacc aattctggcg 480
ggaactacca gcgctcaccc aggacaaagc ctcttctttt tctccagacc caccccatgg 540
ctcaacacat atgaccccac cgttcaatgg ggagcactgc tttggagcat ttatgtcccg 600
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catcaccatc accatcac 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggccgcct agagaacgga c 21

Claims (2)

1.一种猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒，所述病毒样颗粒的制备方法包括扩增猪圆环Ⅲ型Cap蛋白基因，并利用所述基因构建重组穿梭质粒pFB-Cap，利用所述重组穿梭质粒pFB-Cap构建rB-Cap重组杆粒，将SF9细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁且汇合度达50%以上时，使用双无Grace昆虫细胞培养基替换原有培养基，取8 μL Cellfectin®Ⅱ转染试剂加入到100 μL双无Grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀，将3 μg所述重组杆粒rB-Cap加入到100 μL双无Grace昆虫细胞培养中，轻轻混匀；将稀释的重组杆粒rB-Cap加入到稀释后的转染试剂中，混合均匀，室温孵育20 min，将混合物均匀的滴加到6孔板中，4h后弃掉转染混合物，换为添加有青霉素、链霉素、10%（V:V）FBS的SF900®Ⅱ完全培养基，27℃继续培养，持续观察直至出现病毒感染征象，待细胞出现脱落或裂解时，收集培养上清，4000 r/min，4℃离心5min去掉上清中的大分子物质，使用0.22 μm低蛋白结合滤器过滤，滤出液，所述滤出液含表达猪圆环病毒Ⅲ型Cap蛋白的重组杆状病毒rBV-PCV3 Cap，将所述重组杆状病毒感染High Five细胞48h，3 500 r/min，4℃离心20 min，取上清，0.45μm低蛋白结合滤器过滤，20%（M:V）蔗糖垫35 000 r/min，4℃离心2 h，使用2 mL PBS重悬沉淀，进行40-60-80%（M:V）蔗糖密度梯度离心，缓慢取出60-80%蔗糖层之间的乳白色环状部分，使用PBS稀释至40 mL，35 000 r/min，4℃离心2 h，去掉蔗糖，得到猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒PCV3 VLP；其中，所述Cap蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组穿梭质粒pFB-Cap是将猪圆环病毒Ⅲ型的Cap蛋白基因插入到pFastBac 1载体形成的；所述rB-Cap重组杆粒是将所述的pFB-Cap重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞发生转座所得。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒Ⅲ型病毒样颗粒，其特征在于，所述Cap蛋白基因的核苷酸序列的扩增正向引物PCV3F序列如SEQ ID NO.3所示；反向引物PCV3R序列如SEQ IDNO.4所示。
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