CN105647971B - 一种非洲猪瘟p30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法 - Google Patents

一种非洲猪瘟p30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法，其是从含ASFVP30全长基因的质粒PCR‑4TOPO‑P30中扩增出P30基因，将扩增的P30基因连接至杆状病毒载体pFastBac 1中，构建重组杆状病毒载体pFastBac1‑ASFV‑P30，转化至大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，获得重组穿梭杆粒rBacmid‑ASFV‑P30，鉴定正确后将其转染至Sf 9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，并将重组杆状病毒进行传代扩增，将高滴度的含有ASFV P30基因的杆状病毒接到High Five昆虫细胞中进行ASFV P30蛋白的真核表达。选用本发明方法构建非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体，并利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达非洲猪瘟P30蛋白，为非洲猪瘟血清学ELISA检测方法的建立奠定了基础。

Description

一种非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术中基因重组表达领域，特别涉及一种非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是猪的一种急性、高度接触性和高度致死性地传染性疾病，由非洲猪瘟病毒(African swine fever vires.ASFV)引起，强毒株感染猪的致死率高达100％。本病最初发现于肯尼亚，后来疫情在非洲、欧洲等国家扩散传播，近年来，该病的流行范围扩大蔓延至格鲁吉亚、俄罗斯等周边国家。在中国，养猪业的发展正面临着巨大的威胁。ASFV储存宿主和媒介是软蜱和非洲野猪，该病的感染和逃逸免疫机理非常复杂，目前还没有能防治的疫苗，为了避免非洲猪瘟在我国突然暴发，必须建立一种快速而又能准确检测诊断本病的方法。
P30是ASFV的主要结构蛋白和强免疫原性蛋白之一，由CP204L基因编码，有强的免疫原决定簇，可作为体液免疫反应中非常有效的诱导蛋白，并且在感染后的早期表达和分泌，常被用于感染后免疫反应的早期检测，与其他ELISA方法相比，基于P30的ELISA方法可以提前一周检测到ASFV特异性抗体。
杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体，该真核表达系统的受体是昆虫细胞或活体昆虫。杆状病毒表达系统具有的相对于其他表达系统更为特殊的优势是作为表达载体的杆状病毒基因组可以容纳更多外源基因；在昆虫细胞中进行蛋白的表达，能够很好地加工修饰外源蛋白；杆状病毒一般只感染节肢动物，对人和牲畜没有迫害。我国是国际上生猪存栏及其消费数量最大的国家，“猪粮安天下”，生猪养殖业的健康发展将对于我国的食品卫生安全和国家稳定安全具有极为重要的意义，因此我国必须要加强对该病监测防控，尽快建立对于非洲猪瘟相应的血清学检测方法，而且可以确定该检测方法是具有安全性、可靠性、适合推广性，那么它将对于防止非洲猪瘟侵入我国、保障我国生猪养殖业的健康发展具有十分重要的现实意义。本发明通过构建含ASFVP30的重组杆状病毒载体，并利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了非洲猪瘟P30蛋白，为建立安全、可靠、适合推广的非洲猪瘟血清学检测方法奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达非洲猪瘟P30重组蛋白，为建立安全、可靠、适合推广的非洲猪瘟血清学检测方法奠定基础，对防止非洲猪瘟的传入和控制具有重要的现实意义。
本发明的目的之一是提供非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体，其特征在于该重组杆状病毒表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
进一步地，其所述非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体特征包括重组修饰的昆虫杆状病毒，所述昆虫杆状病毒表面展示有非洲猪瘟P30蛋白。
所述非洲猪瘟P30蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
本发明的另一目的是提供非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体的制备方法，其具体制备步骤包括：(1)构建重组杆状病毒载体pFastBac1-ASFV-P30和重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30；和(2)在昆虫细胞中表达非洲猪瘟P30蛋白。
进一步地，构建重组杆状病毒载体pFastBac1-ASFV-P30和重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30的步骤为：
a、根据ASFV基因组序列(GenBank登陆号：FN557520.1)中的CP204L基因设计设计特异性引物对；
b、采用PCR技术，从含有非洲猪瘟病毒P30全长基因序列的克隆质粒PCR-4TOPO-P30中扩增出ASFV P30基因序列，将扩增的PCR产物进行胶回收得到包含序列为SEQ ID NO：2的基因片段1，将杆状病毒载体pFastBac1经BamH1/Xho I双酶切后进行胶回收得到载体基因片段2，将基因片段1插入到载体基因片段2中，转化至E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养，挑取菌落于卡那霉素抗性的培养基中培养，提取质粒，进行BamH1/Xho I双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，测序鉴定正确，获得重组杆状病毒载体pFastBac1-ASFV-P30；
c、将重组杆状病毒载体pFastBac1-ASFV-P30转化至含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac中，构建重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30。
其中，所述特异性引物对序列为：
ASFV-P30-Fwd:5’-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATATGGATTTTATTTTAAATATATC-3’SEQ ID NO：3，
ASFV-P30-Rev:5’-CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTTTTTTAAAAGTTTAATG-3’SEQ ID NO：4。
其中，在上游引物ASFV-P30-Fwd的5’端引入BamH1限制性内切酶位点和6个组氨酸His序列，在下游引物ASFV-P30-Rev的5’端引入Xho I限制性内切酶位点和6个组氨酸His序列。
进一步地，在昆虫细胞中表达非洲猪瘟P30蛋白的步骤为：
a、将状态较好的Sf9细胞铺于六孔板中，细胞密度约为2×106/ml，将重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30转染至Sf9昆虫细胞，27℃培养，3～5d后离心收集上清，标记为P1代重组杆状病毒，同时设未转染的空细胞对照，将P1代重组杆状病毒液按1％的体积分数进行传代，得到P2、P3代重组杆状病毒；
b、将上述P3代重组杆状病毒上清以1％-5％体积分数接种至HighFive昆虫细胞单层，同时设置未接毒的空白对照，27℃培养3～4d，将细胞裂解后离心收集ASFVP30重组蛋白；
c、将细胞裂解后离心收集的ASFVP30重组蛋白进行间接免疫荧光试验和WesternBlotting分析。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1：为根据设计的特异性引物，从含非洲猪瘟病毒P30基因的克隆质粒PCR-4TOPO-P30(瑞典馈赠)扩增出ASFV P30基因的PCR产物的PCR结果。其中M为DL2,000DNAMarker，1为扩增ASFV P30基因的PCR结果，2为阴性对照。
图2：为重组供体质粒pFastBac1-ASFV-P30的BamH1/Xho I双酶切鉴定图谱，其中M为DL10,000DNA Marker，1─3为重组阳性质粒pFastBac1-ASFV-P30的BamH1/Xho I双酶切鉴定结果。
图3：为以重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30为模板，用M13正反引物、P30特异性引物分别进行PCR鉴定的结果，其中图3a中M为DL10,000DNA Marker，1为阴性对照，2为重组杆粒rBacmid-P30用M13引物的鉴定结果。图3b中M为DL2,000DNA Marker，1为重组杆粒rBacmid-ASFV-P30用P30特异性引物的鉴定结果，2为阳性对照。
图4：为间接免疫荧光试验验证结果。其中A为转染了重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞，B为正常的Sf9昆虫细胞。
图5：为Western Blotting检测的鉴定结果，其中M为蛋白Marker，1为无重组杆状病毒的空细胞裂解产物对照，2为转染重组杆状病毒的HighFive昆虫细胞裂解物。
具体实施方式
实施例1：构建含ASFV P30基因的重组杆状病毒载体及重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30的获得。
1.1根据GenBank公布的ASFV基因组序列(登陆号：FN557520.1)中的CP204L基因设计引物，从非洲猪瘟病毒P30基因的克隆质粒PCR-4TOPO-P30中扩增出ASFV P30基因的PCR产物。其中上游引物p30F加入BamH1酶切位点后序列为：5’-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATATGGATTTTATTTTAAATATATC-3’，下游引物p30R加入Xho1酶切位点后序列为：5’-CCGCTC GAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTTTTTTAAAAGTTTAATG-3’，划线部分为酶切位点，同时在蛋白质序列的两端各加入6个组氨酸标签。以PCR-4TOPO-P30重组质粒为模板，扩增出两端带有His的P30全长基因，约为639bp，与预期结果相符。PCR结果如图1所示。
1.2构建重组杆状病毒载体pFastBac1-ASFV-P30。将扩增的PCR产物进行胶回收得到包含序列2的基因片段1，将杆状病毒载体pFastBac1经BamH1/Xho I双酶切并胶回收得到载体基因片段2，将基因片段1和载体基因片段2连接，转化至感受态细菌，37℃培养，挑取菌落于卡那霉素抗性的培养基中培养，提取质粒，进行BamH1/Xho I双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，得pFastBac1-ASFV-P30，真核质粒pFastBac1中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示。双酶切鉴定结果如图2所示。
1.3重组供体质粒pFastBac1-ASFV-P30转化至含有穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac中，37℃条件下震荡培养4h，涂布于含X-gal、IPTG、及四环素、卡那霉素、庆大霉素的LB琼脂平板上，37℃培养 48h，经2次蓝白斑筛选并挑取单个白色菌落于含四环素、卡那霉素、庆大霉素的LB培养液中进行扩大培养。根据Invitrogen公司Bac to BacBaculovirus Expression Systems使用手册提取重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30并以之为模板，用M13正反引物、P30特异性引物分别进行PCR鉴定。
M13正反引物序列为上游引物为M13F：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’；下游引物为M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’。鉴定结果如图3所示。
实施例2：在昆虫细胞中表达非洲猪瘟P30蛋白。
2.1转染昆虫细胞
(1)将生长良好的Sf9昆虫细胞，取2ml计数约为2×106个细胞加到六孔板中，允许细胞贴壁3小时；
(2)准备两个1.5ml灭菌离心管，做好标记，一个离心管中加入5μL Bacmid-ASFV-P30和100μL的不含抗生素和FBS的Grace培养基，轻轻混匀。另一个离心管中6μL的Cellfectin Reagent和100μl的不含抗生素和FBS的Grace培养基，将其混匀。CellfectinReagent是脂溶性的，长时间放置会出现沉淀，用之前最好要振摇均匀。
(3)将两个管中的溶液混合，置于室温下抚育45min。
(4)加入800μL的Grace培养基。然后将六孔板中Grace培养基去掉，并用Grace培养基(不含抗生素和FBS)轻轻地清洗一次，弃去。向六孔板中加入混合好的溶液。设置一个空白对照。置于28℃培养5h。
(5)去掉六孔板中的溶液，加入Grace完全培养基(含抗生素和FBS)，置于28℃细胞培养箱中培养3-5d。3～5d后收集上清为P1，标记为P1代重组病毒，同时设空细胞对照。将P1代重组病毒液按1％的体积分数进行传代，得到P2、P3代重组病毒。
2.2将上述P3代重组杆状病毒上清以1％-5％体积分数接种High Five昆虫细胞单层，27℃培养72～96h，同时设置未接毒的空白对照，细胞裂解后离心收集非洲猪瘟P30重组蛋白。
2.3间接免疫荧光检测重组杆状病毒P30蛋白的表达，将重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞，在28℃细胞培养箱中培养48h，然后用4％的甲醛来固定昆虫细胞，以非洲猪瘟阳性血清为一抗，以荧光素标记抗体羊抗猪IgG-FITC为二抗进行间接免疫荧光试验，结果显示接种重组杆状病毒的昆虫细胞在荧光显微镜下呈现绿色的荧光，而对照组的昆虫细胞没有呈现绿色的荧光，结果如图4所示，说明非洲猪瘟病毒P30基因在昆虫细胞中得到了表达。
2.4进行Western Blotting检测，将上述细胞裂解产物进行SDS-PAGE，电泳产物转印至硝酸纤维素膜，用ASFV阳性血清作为一抗，以HRP标记的羊抗猪IgG作为二抗，经二氨基联苯胺(DAB)显色，观察特异性条带。鉴定结果如图5所示。
本发明的有益结果是：
(1)本研究选用的杆状病毒载体pFastBac1具有高水平表达的强AcMNPV聚乙烯(PH)启动子，和用于简单克隆的大量克隆位点，可保证外源基因的高效表达。相对于其他表达载体，杆状病毒表达载体对外源基因的容纳能力更强，而且杆状病毒一般只感染节肢动物，不会感染人，所以对试验人员不会构成威胁。
(2)大肠杆菌表达系统不能对表达的蛋白进行加工和修饰，不能有效地折叠翻译的蛋白质，且表达的蛋白中会残留大肠杆菌的菌体蛋白，进而干扰目标蛋白的检测。本研究构建重组杆状病毒载体，利用重组杆状病毒转染至昆虫细胞进行非洲猪瘟P30蛋白的表达，通过在杆状病毒表达系统表达的非洲猪瘟P30蛋白，不仅突破了通过原核表达ASFV P30过程中遇到的表达蛋白活性较差的局限性，还可以避免使用ASFV感染细胞生产抗原可能导致病毒扩散的风险。
(3)将获得的重组杆状病毒转染至较传统Sf9昆虫细胞表达量高的High Five昆虫细胞，进行非洲猪瘟P30蛋白的真核表达。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
Figure IDA0000933093560000011
Figure IDA0000933093560000021
Figure IDA0000933093560000031

Claims (3)

1.一种非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体的制备方法，所述重组杆状病毒表达载体为pFastBac1-ASFV-P30，其核苷酸序列包含SEQ ID NO：2，其中所述非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体是在重组修饰的昆虫杆状病毒表面展示有非洲猪瘟P30蛋白，所述非洲猪瘟P30蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第31-612位核苷酸；
所述重组杆状病毒表达载体的制备步骤包括：(1)构建重组杆状病毒载体pFastBac1-ASFV-P30和重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30；和(2)在昆虫细胞中表达非洲猪瘟P30蛋白；
所述步骤(1)为：
a、根据ASFV基因组序列，GenBank登陆号：FN557520.1中的CP204L基因设计特异性引物对；
b、采用PCR技术，从含有非洲猪瘟病毒P30全长基因序列的克隆质粒PCR-4TOPO-P30中扩增出ASFV P30基因序列，将扩增的PCR产物进行胶回收得到包含序列为SEQ ID NO：2的基因片段1，将杆状病毒载体pFastBac1经BamH1/Xho I双酶切后进行胶回收得到载体基因片段2，将基因片段1插入到载体基因片段2中，转化至E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养，挑取菌落于卡那霉素抗性的培养基中培养，提取质粒，进行BamH1/Xho I双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，测序鉴定正确，获得重组杆状病毒载体pFastBac1-ASFV-P30；
c、将重组杆状病毒载体pFastBac1-ASFV-P30转化至含有穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac中，构建重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30；
所述步骤(2)为：
a、将状态较好的Sf9细胞铺于六孔板中，细胞密度约为2×106/ml，将重组穿梭杆粒rBacmid-ASFV-P30转染至Sf9昆虫细胞，27℃培养，3～5d后离心收集上清，标记为P1代重组杆状病毒，同时设未转染的空细胞对照，将P1代重组杆状病毒液按1％的体积分数进行传代，得到P2、P3代重组杆状病毒；
b、将上述P3代重组杆状病毒上清以2％体积分数接种至High Five昆虫细胞单层，同时设置未接毒的空白对照，27℃培养3～4d，将细胞裂解后离心收集ASFV P30重组蛋白；
c、将细胞裂解后离心收集的ASFV P30重组蛋白进行间接免疫荧光试验和WesternBlotting分析。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体的制备方法，其特征在于：所述特异性引物对序列为：
ASFV-P30-Fwd:5’-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATATGGATTTTATTTTAAATATATC-3’SEQ ID NO：3，
ASFV-P30-Rev:5’-CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTTTTTTTTAAAAGTTTAAT G-3’SEQ ID NO：4；述特异性引物对中，在上游引物ASFV-P30-Fwd的5’端引入BamH1限制性内切酶位点和6个组氨酸His序列，在下游引物ASFV-P30-Rev的5’端引入Xho I限制性内切酶位点和6个组氨酸His序列。
3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟P30蛋白重组杆状病毒表达载体的制备方法，其特征在于：所述PCR反应体系为25μL：上、下游引物各0.5μL，dNTP2μL，模板1μL，rTaq酶0.5μL，10×PCR Buffer2.5μL，灭菌去离子水补足至25μL；反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性45s，53℃退火45s，72℃45s，30个循环，72℃延伸10min；PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳。
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