CN111549066A

CN111549066A - 表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体、重组腺病毒、方法及应用

Info

Publication number: CN111549066A
Application number: CN202010466094.7A
Authority: CN
Inventors: 陈平; 张利娟; 张婷婷; 李娜; 杨文清; 沈亚钕; 王书芳; 李楠
Original assignee: Jia Ming Guan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jia Ming Guan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体、重组腺病毒、方法及应用，其中，所述表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体包括腺病毒骨架载体和插入腺病毒骨架载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒p34基因，所述p34基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述腺病毒骨架载体为pAd5；其中，所述重组腺病毒由本发明所公开的重组腺病毒载体转染哺乳动物细胞所获得。本发明首次利用重组腺病毒表达系统表达非洲猪瘟病毒的p34蛋白，实现了p34蛋白的高水平表达，为非洲猪瘟病毒核酸疫苗的研制提供了病毒模型，为进一步开发基因工程疫苗奠定了基础。

Description

表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体、重组腺病毒、方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程和重组疫苗领域，具体涉及一种表达表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体、重组腺病毒、方法及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus,)引起猪的一种高感染性高致死率的急性、烈性传染病。其临床表现为发热、全身出血、呼吸障碍和神经症状，发病率和死亡率极高，对养猪业的危害巨大。该病被列世界卫生组织(OIE)列为A类疫病，受到世界各国的高度重视，我国已将此病规定为一类动物传染病，并作为动物外来疫病进行研究。目前尚无有效的疫苗用于该病的预防，主要通过发现后扑杀来控制其爆发和流行。

本病首次发现是在1914年东非的坦桑尼亚共和国，1921年肯尼亚发生非洲猪瘟，随后，南非和安哥拉也发生该病，之后多年，非洲猪瘟被认为仅限于东非、中非和南非地区流行。近年来，非洲猪瘟已由非洲大陆横跨到亚欧大陆的亚美尼亚、乌克兰、俄罗斯，特别是高加勒地区疫情严峻，对我国造成极大威胁。2018年8月1日，辽宁省报告沈阳市一养殖户饲养的猪陆续发生不明原因死亡，病死猪剖检发现脾脏异常肿大，疑似非洲猪瘟病毒感染，国家外来动物疫病研究中心采集病料进行检测，确诊为非洲猪瘟病毒核酸阳性，这是我国发现的首例非洲猪瘟。

ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，具有一个二十面体病毒外壳，直径约175nm～215nm。由外包膜、病毒衣壳、内包膜、核壳和病毒基因组5部分组成。病毒基因组是一条双链DNA，DNA基因组长度在170～193kb，编码150～167个开放阅读框(ORFs)，其中包括54个结构蛋白和100多个非结构蛋白，具有23种不同的基因型。AFSV是第一个合成多蛋白作为基因表达策略的例子，非洲猪瘟病毒(ASFV)编码一种名为P220的多聚蛋白，该P220多聚蛋白存在于成熟病毒粒子的核衣壳中，占病毒蛋白总量的30％左右，在病毒组装和病毒感染中发挥着重要的作用。P220多聚蛋白在蛋白酶的作用下可有序的裂解为P150、P34、P37和P14。p150、p34、p37和p14在病毒衣壳的组装过程中起着至关重要的作用，其中，P34属于P220中重要的结构蛋白之一，对病毒内核蛋白的包装起着重要的作用，具有较好的免疫原性，可以作为疫苗开发的抗原。

迄今为止，由于AFSV基因组的复杂性以及非洲猪瘟蛋白结构的多样性，一直尚未研发出十分有效的非洲猪瘟病毒疫苗，缺乏对非猪瘟病毒疫苗方法的开发研究。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体以及重组腺病毒，为ASFV的疫苗研究奠定基础。

腺病毒载体是目前应用较为广泛、研究较为深入的安全可靠的重组病毒表达载体，可用于在哺乳动物细胞中高效快速地表达目的蛋白。腺病毒的感染宿主范围广，可感染增殖细胞和非增殖细胞，具有较高的病毒滴度以及良好的生物安全性。因此利用腺病毒载体或腺病毒进行p34基因的表达，对开发非洲猪瘟病毒疫苗具有重要意义。

作为本发明的第一方面，本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体。

作为优选，重组腺病毒载体包括腺病毒骨架载体和插入腺病毒骨架载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒p34基因，其中，所述p34基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

作为优选，所述腺病毒骨架载体为pAd5。

作为本发明的第二方面，本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体的制备方法。

作为优选，所述方法包括如下步骤：

1)采用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所述的引物扩增获得非洲猪瘟病毒p34基因片段，其中，所述非洲猪瘟病毒p34基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2)将扩增获得的非洲猪瘟病毒p34基因片段连接到穿梭质粒中，将所得连接产物导入大肠杆菌中进行扩增，提取获得重组穿梭质粒；

3)将步骤2)提取获得的重组穿梭质粒进行单酶切，获得线性化重组穿梭质粒；将腺病毒骨架载体进行单酶切，获得线性化腺病毒骨架载体；将所得线性化重组穿梭质粒和线性化腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌，进行同源重组，获得所述重组腺病毒载体。

作为优选，步骤2)中，所述穿梭质粒为pS5E1，所述大肠杆菌为DH5α大肠杆菌。

其中，穿梭质粒pS5E1可用质粒pADeasy或pShuttle代替。

其中，pS5E1携带有CMV强启动子，能够在真核细胞中高表达其携带的基因，同时该穿梭质粒携带HA标签，便于后期蛋白表达的鉴定。

作为优选，步骤3)中，所述腺病毒骨架载体为pAd5，所述大肠杆菌为BJ5183大肠杆菌。

在本申请中，转染可以采用PEI、磷酸钙、二乙胺乙基葡萄糖、聚凝胺与DNA的共沉淀，电穿孔，显微注射，脂质体介导的融合，反转录和biolistic转染等方式进行转染，本申请并不予以限制。

作为优选，步骤3)中，在进行同源重组之前，还包括对线性化重组腺病毒穿梭质粒和线性化腺病毒骨架载体进行去磷酸化处理的步骤，通过去磷酸化处理能将N端或C端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不能形成闭合的环状结构，防止单酶切漏出的黏性末端发生载体自连，提高重组的效率，增加阳性克隆率。

作为本发明的第三方面，本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒。

作为优选，所述重组腺病毒由本申请第一方面所述的重组腺病毒载体转染哺乳动物细胞所获得，所述重组腺病毒含有非洲猪瘟病毒p34基因。

作为本发明的第四方面，本发明提供一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒的制备方法。

作为优选，所述方法包括如下步骤：

将本申请第一方面所述的重组腺病毒载体线性化后转染哺乳动物细胞，进行重组腺病毒的包装和扩增，得到所述重组腺病毒。

作为优选，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。

作为本发明的第五方面，本发明提供了本申请第一方面所述的重组腺病毒载体或第二方面所述的重组腺病毒在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用。

本申请的有益效果：

本发明首次利用重组腺病毒表达系统表达非洲猪瘟病毒的p34蛋白，实现了p34蛋白的高水平表达，为非洲猪瘟病毒核酸疫苗的研制提供了病毒模型，为进一步开发基因工程疫苗奠定了基础。

附图说明

图1是本发明实施例的p34基因片段的扩增结果图；

图2是本发明实施例的重组穿梭质粒pS5E1-p34的载体图谱；

图3是本发明实施例的重组腺病毒载体pAd5-p34的XhoI酶切结果图；

图4是本发明实施例的重组腺病毒载体pAd5-p34的载体图谱；

图5是本发明实施例的重组腺病毒载体pAd5-p34感染HEK293的细胞病变图；

图6是本发明实施例的重组腺病毒表达p34蛋白的Western Blot检测图；

图7是本发明实施例的CMV-MCS片段和SV40 earlypolyA片段的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图8是本发明实施例的CMV-MCS-SV40 earlypolyA融合片段、PUC片段、Ad5右臂和Ad5左臂的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图9是本发明实施例的菌落PCR扩增CMV-MCS-SV40 polyA和Ad5左臂的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图10是本发明实施例的穿梭质粒pS5E1的单酶切验证结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

在本发明中，若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术，所有的设备和原料等均为本行业常用产品，可从市场中购得。

实施例1表达p34基因的重组腺病毒载体和重组腺病毒的构建

一、重组穿梭质粒pS5E1-p34的构建

1、根据GenBank中非洲猪瘟(ASFV)p34基因序列，p34基因序列如SEQ ID No.1所示，并委托生物公司合成基因片段。

ATGGGGAATCGCGGGTCTTCTACCTCCTCTCGCCCCCTGCCCTCCTCCGAAGCCAATATCTATGCCAAGCTGCAGGACCATATCCAGCGCCAGACCCGCCCCTTCTCCGGAGGAGGATACTTTAACGGAGGCGGCGACAAAAACCCCGTGCAGCACATCAAGGACTACCACATCGACAGCGTGAGCTCCAAAGCCAAGCTCAGAATCATCGAAGGAATTATCCGCGCCATCGCCAAGATCGGCTTTAAGGTGGACACAAAACAGCCCATCGAAGACATCCTCAAGGACATCAAGAAACAGCTGCCCGACCCCCGCGCCGGCTCTACCTTTGTGAAGAACGCCGAAAAACAGGAAACCGTCTGCAAGATGATTGCCGACGCCATCAACCAGGAATTCATCGACCTGGGCCAGGACAAGCTGATCGACACCACCGAAGGGGCCGCCTCCATCTGCCGCCAGATCGTCCTCTATATCAATAGCCTGACCCACGGACTGCGGGCCGAATACCTGGACGTGCACGGCAGCATCGAGAACACCCTGGAAAACATCAAACTGCTGAACGACGCCATCAAACAGCTGCACGAACGGATGGTGACCGAAGTGACCAAGGCCGCCCCCAACGAGGAAGTGATTAACGCTGTGACAATGATCGAAGCCGTGTACCGCCGCCTGCTCAACGAGCAGAACCTCCAGATCAACATCCTCACCAACTTCATCGACAACATCCTGACCCCCACCCAGAAAGAACTGGACAAGCTCCAGACCGACGAAGTCGACATCATCAAACTCCTCAACGACACCAACAGCGTCCTCGGCACCAAAAACTTCGGCAAAGTGCTGAGCTACACCCTCTGCAACCTGGGCATCGCCGCCAGCGTCGCCAACAAGATCAACAAGGCCCTCCAGAAAGTGGGACTGAAGGTGGAGCAGTATCTCCAGAGCAAGAACTGGGCCGAATTCGACAAAGAACTCGACCTGAAACGCTTCTCCGGCCTGGTGAGCGCCGAGAACATCGCCGAATTCGAGAAGGCTGTGAACCTGCTGAGGCAGACCTTCAACGAAAGGCACAAGATCCTGGAGAACAGCTGCGCCAAAAAGGGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTATGCCTGA(SEQ ID No.1)

2、根据GenBank中非洲猪瘟(ASFV)p34基因序列设计p34的上下游引物，所述引物委托生物公司合成，引物序列如下所示。

p34-BamHI-F:CGCggatccgccaccATGGGGAATCGCGGGTCTTCTAC(SEQ ID No.2)；

p34-EcoRV-R：CGgatatcTCAGGCATAGTCGGGCACGTCGT(SEQ ID No.3)；

分别在上游引物P34-BamHI-F和下游引物P34-EcoRV-R的下划线部分引入酶切位点，其中，酶切位点分别为BamHI、EcoRV。

3、以合成的p34基因片段为模板，以p34-BamHI-F/p34-EcoRV-R为引物，扩增p34基因，得到p34目的基因片段，扩增结果如图1所示。

4、将扩增得到的p34目的基因片段利用Axygen PCR纯化试剂盒进行PCR产物纯化(具体操作参见其说明书)。

5、用限制性内切酶BamHI和EcoRV对步骤4的纯化产物进行双酶切，得到线性化p34基因片段；将穿梭质粒pS5E1用限制性内切酶BamHI和EcoRV进行双酶切，获得pS5E1载体片段，双酶切体系如下：

P34基因片段或pS5E1载体(2μg)	4-8μL
		10×Buffer	5μL
BamHI	1μL
		EcoRV	1μL
ddH<sub>2</sub>O	补足
		总计	50μL

反应条件：温度为37℃，30分钟；

6、将所述步骤5得到的线性化p34基因片段和pS5E1载体片段利用Omega胶回收纯化试剂盒进行胶回收纯化，将p34基因片段和pS5E1载体片段的纯化产物进行连接，连接比例为p34基因片段:pS5E1载体片段(摩尔比)＝1：3，得到pS5E1-p34，将其转化到感受态DH5a中(感受态的制备和转化方法参见《分子克隆实验实验指南第三版》)，涂布于Amp抗性的平板上，进行阳性克隆筛选，连接体系如下：

目的基因p34片段	2-5μL
		载体pS5E1-p34片段	2-4μL
10×T4 Buffer	1μL
		T4连接酶	1μL
共计	10μL

连接条件：常温连接，60分钟；

7、对所述步骤6得到阳性菌落进行菌落PCR筛选，挑取筛选的阳性克隆于5ml的LB液体培养基(含Amp抗性)中，进行过夜振荡培养，提质粒，进行BamHI和EcoRV酶切验证，验证正确后，送生物公司测序，经序列比对，与预期基因序列完全一致，表明重组穿梭质粒pS5E1-p34构建成功，pS5E1-p34载体图谱如图2所示。

二、重组腺病毒载体pAd5-p34的构建

1、用限制性内切酶PacI对上述得到的重组穿梭质粒pS5E1-p34进行单酶切，得到线性化重组穿梭质粒pS5E1-p34，单酶切体系如下所示：

重组穿梭质粒pS5E1-p34(2～3ug)	10-12μL
		限制性内切酶PacI	1μL
10×Buffer	4μL
		蒸馏水	补足
总计	40μL

反应条件：温度为37℃，30分钟；65℃灭活，20分钟；

进一步地，用限制性内切酶SwaI对腺病毒骨架载体pAd5(人5型腺病毒载体)进行单酶切，得到线性化pAd5，单酶切体系如下所示：

腺病毒骨架载体pAd5(2～3ug)	10-15ul
		限制性内切酶SwaI	1ul
10×Buffer3.1	4ul
		蒸馏水	补足
总计	40μL

反应条件：温度为25℃，30分钟；65℃灭活，20分钟；

2、将步骤1)得到的线性化重组穿梭质粒pS5E1-p34和腺病毒骨架载体pAd5分别进行去磷酸化，去磷酸化体系如下所示：

线性化重组穿梭质粒pS5E1-p34或线性化腺病毒骨架载体pAd5	40μL
		去磷酸化酶	1μL
去磷酸化酶Buffer	5μL
		蒸馏水	4μL
共计	50μL

反应条件：温度为37℃，60分钟；65℃灭活，5分钟；

3、使用苯酚氯仿异戊醇(PCI)方法对步骤2)去磷酸化后的产物进行纯化；

4、取100ng纯化后的重组穿梭质粒pS5E1-p34和100ng纯化后的腺病毒骨架载体pAd5共转化BJ5813感受态细胞(购自博迈德生物科技有限公司)，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h；

5、挑取菌落PCR鉴定阳性的菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h；

6、提质粒，对质粒进行质粒PCR鉴定和PacⅠ、XhoⅠ的单酶切鉴定，挑取重组阳性质粒，获得重组腺病毒载体pAd5-p34，用于后续实验。重组腺病毒载体pAd5-p34的XhoI酶切结果如图3所示，其中，泳道M为15000DNA Marker，泳道1和2为pAd5-p34 XhoI单酶切，泳道3为pAd5 XhoI单酶切,说明载体构建准确。重组腺病毒载体pAd5-p34的载体图谱如图4所示。

三、表达p34基因的重组腺病毒的构建

1、转染

a)将HEK293细胞按照6×10⁵细胞/mL密度接种于6孔板；

b)待细胞融合率在60～70％时，将2μg重组腺病毒载体pAd5-p34载体DNA通过PacI内切酶线性化灭活后，采用PEI方法转染至上述接种于6孔板的HEK293细胞中；

2、病毒传代

a)前一日准备HEK293细胞，按照7×10⁵细胞/孔，接种6孔板，每孔2mL；

b)72～96小时后收集培养细胞悬液，37℃和-80℃反复冻融3次，4℃，350g，离心5min；

c)接种：弃细胞上清，用PBS洗细胞，然后接种离心上清，2小时后补充4％FBS培养基；

d)72～96小时后收集培养细胞悬液，继续接种，直至出现明显CPE(图5)，收集细胞，获得重组腺病毒；

3、测定病毒滴度

通过间接免疫荧光检测腺病毒的滴度，测得病毒的滴度为1.0×10⁷；滴度的测定方法如下：

a)第一天准备细胞，分离1个10cm的平皿或T75方瓶(100％融合率)到2个12孔板中，每孔1mL，37℃，5％CO₂条件下培养24小时；

b)第二天感染，90％细胞融合时，感染；

c)无血清培养基倍比稀释病毒，用250μL稀释的病毒感染细胞，37℃，孵育60分钟，

d)每15分钟轻轻摇晃一次，确保单层覆盖，60分钟后吸取病毒液，补充1mL 5％FBS的生长培养基，37℃，5％CO₂条件下培养24小时；

e)第三天细胞固定，染色，吸出培养基，用PBS洗一次，加0.5mL冰浴的甲醇固定10分钟，弃甲醇，用PBS洗两次；

f)每孔加0.25ml血清，室温孵育60分钟；

g)PBS洗两次，之后每孔加0.25mL荧光二抗，室温孵育60分钟；

h)PBS洗两次，每孔加0.5mL PBS；

i)荧光显微镜下计数；

j)计算公式：

病毒滴度(FFU/mL)＝每孔细胞数(平均数)×594×4×10ⁿ

4、蛋白水平检测：

a)接种HEK293细胞在6孔板，以0.6×10⁶细胞/孔，次日以MOI＝3病毒感染细胞，感染2小时后，再补加2mL 4％FBS的完全培养基

b)24、48小时后观察细胞病变情况，出现CPE收集病毒，经过1000rpm，2min离心(注意观察细胞是否全部离下来)，分别收集上清和细胞，再用PBS洗细胞，1000rpm，2min离心，弃上清，细胞用200μL PBS重悬细胞，加50μL 5×蛋白Loading Buffer，沸水煮样，第一步收集的上清也制备样品

c)SDS-Page蛋白凝胶电泳，具体操作参照《基因操作技术》；

d)蛋白印迹(Western Blot)检测操作流程参照《基因操作技术》。

Western Blot检测结果如图6所示，其中，泳道M为蛋白Marker，泳道1和2分别为24h、48h所收集的病毒中p34蛋白的检测结果，泳道3为阴性对照，实验结果说明本发明的腺病毒能够大量表达非洲猪瘟病毒p34蛋白。

实施例2穿梭质粒pS5E1的构建

穿梭质粒pS5E1的骨架采用puc origin、amp等基本元素(2796bp)，以及Ad5左臂ITR部分序列(355bp)，右臂PIX、PIVa2部分序列(2100bp)，以及CMV-MCS(944bp)SV40 earlypolyA(160bp)。

一、基因合成

pS5E1骨架(2796bp)、CMV启动子、MCS、SV40 early polyA终止子(957bp)委托博迈德公司合成，pS5E1骨架的碱基序列如SEQ ID No.4所示。

GAATTCCGTGTATTCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGTGTATGATACATAAGGTTATGTATTAATTGTAGCCGCGTTCTAACGACAATATGTACAAGCCTAATTGTGTAGCATCTGGCTTACTGAAGCAGACCCTATCATCTCTCTCGTAAACTGCCGTCAGAGTCGGTTTGGTTGGACGAACCTTCTGAGTTTCTGGTAACGCCGTTCCGCACCCCGGAAATGGTCAGCGAACCAATCAGCAGGGTCATCGCTAGCCAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCATTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCTTATCGAAA(SEQ IDNo.4)。

二、引物设计

puc-Ad5-right arm-F：TAATGCAGCTGGCTTATCGAAACGTGGAATGCGAGACCGTCT(SEQ IDNo.5)；

Ad5-right arm-CMV-R：ACACACAAGCAGGGAGCAGATACAAGGGTGGGAAAGAATATATAAG(SEQ ID No.6)；

CMV-F：GTATCTGCTCCCTGCTTGTG(SEQ ID No.7)；

CMV-SV40-R：TAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGTGATCAGCGGGTTTAAACGGG(SEQ ID No.8)；

SV40-F：CTTCGCCCACCCCAACTTGT(SEQ ID No.9)；

SV40-R：AGAGGTCGACGGTATACAGAC(SEQ ID No.10)；

SV40-Ad5-left arm-F：TGTCTGTATACCGTCGACCTCTCCGGGCCCTAGACAAATATTA(SEQID No.11)；

Ad5-left arm-puc-R：ACACTATAGAATACACGGAATTCTTAATTAAATCATCAATAATATACCTTATTTTG(SEQ ID No.12)；

puc-F：GAATTCCGTGTATTCTATAGTGT(SEQ ID No.13)；

puc-R：TTTCGATAAGCCAGCTGCATTA(SEQ ID No.14)；

三、目的片段的扩增

1、以pCDNA3.1(+)为模板(该质粒购自赛默飞公司)，以CMV-F和CMV-SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的CMV启动子MCS片段；

扩增体系：pCDNA3.1(+)质粒50ng，10μM CMV-F引物1μL，10μM CMV-SV40-R引物1μL，Q5高保真酶20μL；补水至40μL；

PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃，5min。

2、以pCDNA3.1(+)为模板，以SV40-F和SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的SV40-earlypolyA片段；

扩增体系：pCDNA3.1(+)质粒50ng，10μM SV40-F引物1μL，10μM SV40-R引物1μL，Q5高保真酶20μL，补水至40μL；

PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、10sec，35个循环；72℃，5min；

扩增产物琼脂糖验证如图7所示，其中，M为2000Marker，1为CMV-MCS片段，2为SV40-earlypolyA片段。

3、使用Axygen胶回收试剂盒对上述片段进行纯化。

4、以博迈德公司合成的pS5E1骨架为模板，以puc-F和puc-R为引物，PCR扩增pS5E1穿梭质粒骨架PUC；

扩增体系：pS5E1骨架质粒50ng，10μM puc-F引物1μL，10μM puc-R引物1μL，Q5高保真酶20μL，补水至40μL；

PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min20sec，35个循环；72℃，5min。

5、以pAd5质粒为模板，以SV40-Ad5-left arm-F和Ad5-left arm-puc-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的左臂；

扩增体系：pAd5质粒50ng，10μM SV40-Ad5-left arm-F引物1μL，10μM Ad5-leftarm-puc-R引物1μL，Q5高保真酶20μL，补水至40μL；

PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。

6、以pAd5质粒为模板，以puc-Ad5-right arm-F和Ad5-right arm-CMV-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的右臂；

扩增体系：pAd5质粒50ng，10μM puc-Ad5-right arm-F引物1μL，10μM Ad5-rightarm-CMV-R引物1μL，Q5高保真酶20μL，补水至40μL；

PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、15s，35个循环；72℃，5min。

7、以胶回收产物CMV-MCS为模板，以CMV-F和SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的CMV-MCS-SV40 earlypolyA片段；

扩增体系：pAd5质粒50ng，10μM CMV-F引物1μL，10μM SV40-R引物1μL，Q5高保真酶20μL，补水至40μL；

PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40s，35个循环；72℃，5min；

扩增产物琼脂糖验证如图8所示，其中，M为2000Marker，1为CMV-MCS-SV40earlypolyA融合片段，2为PUC，3为Ad5右臂，4为Ad5左臂。

四、片段的连接转化

使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化，然后使用博迈德公司无缝克隆试剂盒将pS5E1骨架PUC片段、Ad5左臂、Ad5右臂、CMV-MCS-SV40 earlypolyA这四个片段连接，连接体系为2×Smealess Cloning Mix 10μL、pS5E1骨架PUC片段50ng、Ad5左臂50ng、Ad5右臂50ng、CMV-MCS-SV40 polyA50ng、补水至20μL，50℃保温40分钟；将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。

五、质粒验证

1、菌落PCR验证

用引物CMV-F、Ad5-left arm-puc-R为引物菌落PCR扩增CMV-MCS-SV40 polyA和Ad5左臂，琼脂糖凝胶验证结果如图9所示，结果表明，其片段的大小与预期的理论分子量大小基本一致，初步表明该质粒构建成功，待挑取阳性克隆，提质粒，进行酶切，做进一步验证。

2、酶切验证

挑取阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行酶切验证，实验结果如图10所示，其中，M为15000bp marker，图左侧的泳道1-6为NcoI单酶切，图右侧的泳道1-6为PacI单酶切，可以看出穿梭质粒pS5E1构建准确。

实施例3：腺病毒骨架载体pAd5的构建

在A549细胞

中扩增野生型人腺病毒5型(

VR-5)，基因序列AC_000008.1)病毒，收集并进行病毒液浓缩，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒基因组，使用cosmid的方法将线性的hAd5基因组构建成环状的supercos-Ad5载体质粒，并利用CRISPR/cas9对hAd5腺病毒E1区域进行切除，设计gRNA如下：

hAd5-E1上游gRNA:

GGCGGGAAAACUGAAUAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

hAd5-E1下游gRNA:

GAGAUGAUCCAGUCGUAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

在hAd5 E1区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，设计引物，通过融合PCR将ITR，PIX序列分别插入上、下游，并引入SwaI酶切位点，然后将融合后的片段与载体进行无缝克隆，获得E1敲除的supercos-Ad5△E1腺病毒载体，而后对supercos-Ad5△E1质粒进行E3区域的切除，设计gRNA如下：

hAd5-E3上游gRNA:

GCGGGACAUUUCAGAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

hAd5-E3下游gRNA:

GUAAGGGUACUGCUAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

在hAd5 E3区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，后设计引物，对E3上下游过多切除的Fiber，以及pVIII序列进行融合PCR，使用无缝克隆的方式连接，得到E3敲除的载体，并将其命名为pAd5。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，而不是本发明全部的实施例。上述实施例并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则范围内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 表达非洲猪瘟病毒 p34基因的重组腺病毒载体、重组腺病毒、方法及应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggaatc gcgggtcttc tacctcctct cgccccctgc cctcctccga agccaatatc 60

tatgccaagc tgcaggacca tatccagcgc cagacccgcc ccttctccgg aggaggatac 120

tttaacggag gcggcgacaa aaaccccgtg cagcacatca aggactacca catcgacagc 180

gtgagctcca aagccaagct cagaatcatc gaaggaatta tccgcgccat cgccaagatc 240

ggctttaagg tggacacaaa acagcccatc gaagacatcc tcaaggacat caagaaacag 300

ctgcccgacc cccgcgccgg ctctaccttt gtgaagaacg ccgaaaaaca ggaaaccgtc 360

tgcaagatga ttgccgacgc catcaaccag gaattcatcg acctgggcca ggacaagctg 420

atcgacacca ccgaaggggc cgcctccatc tgccgccaga tcgtcctcta tatcaatagc 480

ctgacccacg gactgcgggc cgaatacctg gacgtgcacg gcagcatcga gaacaccctg 540

gaaaacatca aactgctgaa cgacgccatc aaacagctgc acgaacggat ggtgaccgaa 600

gtgaccaagg ccgcccccaa cgaggaagtg attaacgctg tgacaatgat cgaagccgtg 660

taccgccgcc tgctcaacga gcagaacctc cagatcaaca tcctcaccaa cttcatcgac 720

aacatcctga cccccaccca gaaagaactg gacaagctcc agaccgacga agtcgacatc 780

atcaaactcc tcaacgacac caacagcgtc ctcggcacca aaaacttcgg caaagtgctg 840

agctacaccc tctgcaacct gggcatcgcc gccagcgtcg ccaacaagat caacaaggcc 900

ctccagaaag tgggactgaa ggtggagcag tatctccaga gcaagaactg ggccgaattc 960

gacaaagaac tcgacctgaa acgcttctcc ggcctggtga gcgccgagaa catcgccgaa 1020

ttcgagaagg ctgtgaacct gctgaggcag accttcaacg aaaggcacaa gatcctggag 1080

aacagctgcg ccaaaaaggg ctacccctac gacgtgcccg actatgcctg a 1131

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatccg ccaccatggg gaatcgcggg tcttctac 38

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggatatctc aggcatagtc gggcacgtcg t 31

<210> 4

<211> 2796

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaattccgtg tattctatag tgtcacctaa atcgtatgtg tatgatacat aaggttatgt 60

attaattgta gccgcgttct aacgacaata tgtacaagcc taattgtgta gcatctggct 120

tactgaagca gaccctatca tctctctcgt aaactgccgt cagagtcggt ttggttggac 180

gaaccttctg agtttctggt aacgccgttc cgcaccccgg aaatggtcag cgaaccaatc 240

agcagggtca tcgctagcca gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc 300

gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct 360

cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc 420

gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac 480

ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga 540

tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 600

cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 660

aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcattcacc gtcatcaccg 720

aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 780

ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 840

tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 900

atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 960

attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 1020

gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 1080

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 1140

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 1200

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 1260

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 1320

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 1380

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 1440

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 1500

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 1560

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 1620

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 1680

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 1740

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 1800

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 1860

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 1920

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 1980

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 2040

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 2100

ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 2160

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 2220

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 2280

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 2340

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 2400

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 2460

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 2520

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 2580

ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 2640

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 2700

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 2760

gttggccgat tcattaatgc agctggctta tcgaaa 2796

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatgcagct ggcttatcga aacgtggaat gcgagaccgt ct 42

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acacacaagc agggagcaga tacaagggtg ggaaagaata tataag 46

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtatctgctc cctgcttgtg 20

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taaacaagtt ggggtgggcg aagtgatcag cgggtttaaa cggg 44

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttcgcccac cccaacttgt 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agaggtcgac ggtatacaga c 21

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtctgtata ccgtcgacct ctccgggccc tagacaaata tta 43

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acactataga atacacggaa ttcttaatta aatcatcaat aatatacctt attttg 56

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaattccgtg tattctatag tgt 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttcgataag ccagctgcat ta 22

Claims

1.一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体，其特征在于，包括腺病毒骨架载体和插入腺病毒骨架载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒p34基因，其中，所述p34基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒骨架载体为pAd5。

3.一种如权利要求1或2所述的表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述穿梭质粒为pS5E1，所述大肠杆菌为DH5α大肠杆菌。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述腺病毒骨架载体为pAd5，所述大肠杆菌为BJ5183大肠杆菌。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，在进行同源重组之前，还包括对所述线性化重组穿梭质粒和线性化腺病毒骨架载体进行去磷酸化处理的步骤。

7.一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒由权利要求1或2所述的重组腺病毒载体转染哺乳动物细胞所获得，所述重组腺病毒含有非洲猪瘟病毒p34基因。

8.一种如权利要求7所述的表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1或2所述的重组腺病毒载体线性化后转染哺乳动物细胞，进行重组腺病毒的包装和扩增，得到所述重组腺病毒。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。

10.如权利要求1或2所述的重组腺病毒载体或权利要求7所述的重组腺病毒在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用。