CN113897395B - 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗是通过构建非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，并经293TD37细胞包装而获得。其中，非洲猪瘟病毒的四种抗原基因分别为EP402R、EP153R、I177L和K205Rubiqutin。非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建，主要通过CRISPR/cas9敲除腺病毒载体的E1、E3、E2a和E4基因，构建了E1、E4区域的穿梭质粒，分别用于表达EP402R和EP153R、I177L和K205Rubiqutin基因，从而获得全新的腺病毒载体。该载体相对于第一代腺病毒载体，增加了约3kb的载体容量，再通过293TD37细胞系进行包装，获得滴度较高的重组腺病毒，用于制作非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗。本发明可以极大地提高腺病毒载体疫苗的容量，使用在一个腺病毒载体上同时表达非洲猪瘟四个独立抗原的方式，增强对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。

Description

一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
本申请主张中国在先申请,申请号:2020106427449，申请日2020年7月6日的优先权；其所有的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域和免疫学领域，具体而言，涉及一种非洲猪瘟病毒的重组腺病毒疫苗及其构建方法。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)是一种具有高度传染性的猪病毒病。在家猪中可导致接近100％的高死亡率。ASF是由ASF病毒(ASFVirus,ASFV)引起，ASFV是一种较大的双链DNA病毒,主要在巨噬细胞的细胞质中复制，具有20面体结构，直径为175～215nm,基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。构成ASFV病毒粒子的结构蛋白有P30、P72、P49、P54、P220、P62、pB602L、CD2v蛋白等，基于一个或两个亚单位疫苗迄今未能诱导免疫强大到足以对疫苗接种者具有显著保护作用。
我国已于2018年发现ASF疫情，带来了巨大的直接和间接经济损失。因此，迫切需要开发针对ASFV的疫苗。有报道，ASFV疫苗的先前的研究主要集中灭活疫苗和减毒疫苗。然而，灭活疫苗不能诱导有效的保护性应答；减毒疫苗的生物安全是其使用的主要限制因素，减毒毒株在我国是不允许研究的。然而在现阶段不能进行活病毒实验的情况下，需要提供疫苗以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。
因此需要开发新型的ASFV疫苗。潜在的候选疫苗是活载体疫苗。与其他疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在：(1)能主动感染靶组织或细胞，提高了外源基因进入细胞的效率；(2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子的产生；(3)多数能诱导长期的免疫应答。有利的是，需要用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质。
活载体疫苗是指将病原体的蛋白质编码基因克隆到活病毒载体，然后用于免疫动物，在动物体内表达所述蛋白质，从而诱导针对所述蛋白质的免疫应答。腺病毒5型作为表达非洲猪瘟抗原蛋白的载体具有很多优势：①腺病毒表达载体是复制缺陷型的，只能在其独特的互补细胞系中生产制备，同时腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低，制备疫苗安全性好；②重组的腺病毒载体可获得较高的滴度，利于大规模生产，工厂化效率高，生产成本低；③目前对腺病毒5型的结构、特性、功能的研究较为深入，腺病毒载体容易复制，操作简单，利于研究；④普通的一代腺病毒载体基因组敲除了6K的基因，能插入外源基因7.5k，具有较大的容量；⑤腺病毒相对稳定，经得起纯化、浓缩、保存。
现有技术报道了一些活载体疫苗。例如将ASFV p32、p54、p72和pp62基因分别重组入人腺病毒Ad5载体中进行“鸡尾酒”式免疫,获得了良好的抗原特异性CTL反应；之后他们又将ASFV A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L和K205R-A104R共7个ASFV抗原基因,重组入复制缺陷型腺病毒载体,通过“鸡尾酒”式混合免疫后能够诱导强烈体液免疫反应和细胞免疫应答。但“鸡尾酒”式免疫，每个ASFV抗原基因都必须重组入一个复制缺陷型腺病毒载体，因此需要的载体数量非常多，有在免疫过程中受到针对腺病毒载体的免疫反应的风险。CN108504686A和CN108504687A分别提供了表达ASFV的EP153R和EP402R基因的重组腺病毒载体。CN109652449A公开了EP153R与EP402R两种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，CN109735567A公开了EP153R与P54两种抗原基因共表达的重组腺病毒载体。
但为了进一步增强对ASF的特异性免疫反应，还需进一步提高腺病毒载体的抗原基因容量，需用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质，以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。
CN110269932A公开了将ASFV的A104R、A151R、B119L、B602L、CD2v、K205R、P49等5-7种抗原基因基于腺病毒载体融合在一起用于制备活载体疫苗。但多个抗原基因融合存在降低免疫原性和可能导致免疫失效的风险，因此要提高疫苗活性，还是必须要在每一个腺病毒载体上表达完全独立的抗原基因。
但目前现有技术中还没有四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，也没有关于ASFV的EP402R、EP153R、I177L和K205Rubiqutin四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体并运用于活载体疫苗的开发。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；所述四种抗原基因分别为EP402R、EP153R、I177L和K205Rubiqutin，其中K205Rubiqutin是为了提高疫苗的免疫应答反应，在K205R上添加了分子佐剂ubiqutin而获得，EP402R和EP153R表达在E1区，I177L和K205Rubiqutin表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin。
其中，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin必须通过由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞才能实现重组腺病毒包装，293TD37细胞的细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
普通的293细胞中含有腺病毒5型的E1基因，敲除E1、E3的腺病毒能在该细胞系中复制，但敲除了E4、E2a基因的腺病毒则不能在293细胞中复制。
293TD37细胞株由本发明小组发明，并已申请发明专利CN201911033247.2，于2019年5月8日保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201996，分类命名是人胚肾转化细胞AY293-TD-37，该细胞株包含腺病毒的E2a-DBP基因和E4-ORF6/7基因，能够用于包装E2a-DBP基因和E4基因缺乏的二代腺病毒而形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒，该二代腺病毒与第一代腺病毒相比，出现RCA的几率大大降低，为制备活载体疫苗奠定了基础，并且由于E2a-DBP和E4基因的同时缺失使得包装容量相较与E2a突变或E4缺失的二代腺病毒再次增加，进一步提高了腺病毒载体外源基因的插入量，对增强腺病毒载体的应用水平具有重要意义。
其中，EP402R、EP153R、I177L、K205R、ubiqutin、pAd5LCL3分别具有如序列表中SeqID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。
非洲猪瘟病毒的抗原基因共计有160多种，发明人经过大量筛选实验，从中选出了20种免疫效果更强的抗原基因，分别为：P72、B602L、P30、P54、CP129R、MGF5L6L、CP312R、MGF110-4L、L8L、I215L、I73R、E146L、EP402R、EP153R、I177L、K205R、F317L、A151R、P34、pp62；这20种抗原基因根据基因片段大小，被分成五组，每组的4种抗原基因能在本发明提供的重组腺病毒载体pAd5LCL3中得以共表达，即能在同一载体中完全独立表达四种抗原基因。这五组抗原基因疫苗(包括了5个重组腺病毒载体pAd5LCL3)组成了完整的非洲猪瘟病毒疫苗，取得了非常好的免疫效果。本发明选取了EP402R、EP153R、I177L、K205R四种抗原基因，可以很好地搭配组装在同一重组腺病毒载体中，从而得以完全独立表达这四种抗原基因。
研究证明，表E3区对于外源蛋白的表达水平不高，而在E1和E4区进行抗原基因的表达，表达水平更高，因此可以将四个抗原分别表达在E1区和E4区。
E3基因由于跟复制相关，需要敲除，让其复制缺陷；E3的作用是与腺病毒的免疫逃逸相关；敲除E3区可以增加腺病毒载体的容量；并使腺病毒载体能够正常包装。
另一方面，本发明还提供一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，包含以下步骤：
1)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5。
2)再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5的E4基因，使用PCR扩增并引入I-sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4。
在已经敲除了E1、E3基因的基础上，敲除E4基因，能提高腺病毒载体的容量，降低其免疫原性，同时可以在E4区域插入外源基因，外源基因可以在E4位置大量表达，而不影响腺病载体的包装。在E1、E4基因处表达外源基因，能避免多个外源基因在同一区域表达的相互干扰，更利于表达，同时减少了不必要的E4相关基因，降低了腺病毒的免疫原性，使腺病毒能较为长期得存在于宿主细胞中，使外源基因更长期表达。
E4区基因在免疫原性中起着关键作用，大量E4区域基因的表达会使宿主产生较为强烈的免疫反应，诱导抗体的产生，不利于是腺病毒载体在宿主中长期表达目的蛋白，因此在E4区域敲除不必要的基因可以降低腺病毒载体的免疫原性，使载体能够在较长时间内进行表达。
为了使E4基因能敲除完全，便于大载体质粒的连接，使用CRISPR/cas9方法将E4区域的上游Fiber基因、以及E4的基因，进行敲除，使用PCR的方法扩增部分fiber以及引入I-sceI单酶切位点，再使用Gibson的无缝克隆方法，将多余切除的片段连接至载体上，重新获得E4敲除引进了I-sceI单酶切位点的载体质粒。使用I-sceI将载体质粒线性化，构建E4区域的穿梭质粒，使外源基因重组到E4区域，并在E4区域大量表达。
3)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5△E4的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3。
E4区域的ORF1～ORF5的序列进行敲除，保留E4 promoter、ORF6、ORF7、polyA序列，并将其插入E2a位置，因此E4位置可以进行表达外源基因。同时还敲除了E2a区的DBP序列。腺病毒E2a基因是一个DNA binding protein，与腺病毒的复制相关，敲除这个基因并不影响腺病毒的结构蛋白以及腺病毒的包装。DBP缺失可以阻止或极大减低回复突变。E2a和E4部分序列的敲除，增加了约3kb的载体容量。
研究发现腺病毒复制相关的基因为E1、E2、E3、E4，缺失这些基因，并不影响腺病毒结构蛋白的表达，不妨碍腺病毒的包装，但是会使腺病毒无法复制；因此构建这些复制相关的细胞系，能使敲除复制基因的复制缺陷型的腺病毒载体能够在其特有的细胞系中进行复制包装。同时，研究发现，只要表达腺病毒的E4基因中ORF6或是ORF3均能够代替整个E4基因，使敲除了E4的腺病毒能够复制包装。通过进一步对E4、E2a基因进行序列的研究分析，E4基因能够在E2a处表达。因此，本发明对E4基因进行序列分析，找出了E4的promoter、ORF6/7、polyA这几个基本元素，将其整合成一个完整的表达框，将其构建在敲除了E2a基因的序列位置，使ORF6、ORF7基因正常表达，最终获得了敲除E1、E3、E4、E2a，并将E4表达框置于E2a位置的复制缺陷型腺病毒5型载体，能在含有DBP序列的293TD37细胞中进行复制包装。
研究发现，E4基因中含有ORF1,2,3,4,5,6,7共7个表达框，其中ORF6/7是不能缺失的，一旦缺失了，将会明显影响腺病毒的包装和抗原基因的表达，因此需要将ORF6/7补回，同时为了获得更大的载体空间，需要将ORF6/7在E2a处表达，从而制得容量更大、表达效果更好的腺病毒载体。
4)构建腺病毒E1区域穿梭质粒pS5E1，通过DNA连接酶分别与EP402R、IRES、EP153R基因片段连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R。
穿梭质粒pS5E1先与核糖体进入位点IRES片段连接得到pS5E1-IRES载体，再与EP402R片段连接，得到pS5E1-EP402R-IRES，pS5E1-EP402R-IRES与EP153R片段进行酶切并连接，获得E1区域穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R，并进行菌落PCR验证。
5)构建腺病毒E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP，I177L、2A、K205Rubiqutin基因通过融合PCR技术得到I177L-2A-K205Rubiqutin基因片段，通过对穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP，并通过DNA连接酶与I177L-2A-K205Rubiqutin连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin。
通过对E4的穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP替换为pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin。I177L-2A-K205Rubiqutin为I177L、K205Rubiqutin通过2A序列连接。2A序列的加入是为了蛋白的裂解，EF1α启动子串联表达，2A序列又进一步裂解获得的I177L、K205Rubiqutin抗原。
K205Rubiqutin是通过在K205R上添加分子佐剂ubiqutin，形成K205Rubiqutin，分子佐剂ubiqutin可以帮助提高疫苗的免疫应答反应。
6)将穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，得到腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R。
7)将穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R同源重组，获得四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin，pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin具有如序列表中Seq ID NO.7所示的核苷酸序列。
现有的腺病毒载体构建普遍采用穿梭质粒，需要寻找单一的酶切位点。本发明创造性地采用CRISPR/cas9来构建重组腺病毒载体，通过比对，选择合适的E1、E3、E4、E2a敲除位点，根据E1、E3、E4、E2a序列的位置，敲除的基因碱基的数量，选择CRISPR位点，并设计了最佳的gRNA，从而完成重组腺病毒载体的构建。
进一步地，步骤1)所述的腺病毒环状载体质粒来源于在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构建成环状的腺病毒环状载体质粒。
进一步地，步骤3)所述的ORF6/7表达框基因具有如序列表中Seq ID NO.8所示的核苷酸序列；步骤4)所述的IRES具有如序列表中Seq ID NO.9所示的核苷酸序列；步骤5)所述的2A具有如序列表中Seq ID NO.10所示的核苷酸序列。
进一步地，步骤4)所述的穿梭质粒pS5E1骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5左臂ITR部分序列，右臂PIX、PIVa2部分序列，以及CMV-MCS SV40 early polyA；步骤5)所述的E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP的骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列，右臂部分fiber基因序列，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因；其中puc origin、amp等基本元素具有如序列表可见中Seq ID NO.11所示的核苷酸序列，EF1α-EGFP-HBVpolyA基因具有如序列表可见中Seq ID NO.12所示的核苷酸序列。
穿梭质粒pS5E1的骨架由北京博迈德基因技术有限公司合成，合成采用pucorigin、amp等基本元素(2796bp)，Ad5左臂ITR部分序列(400bp)，右臂PIX、PIVa2部分序列(2100bp)，以及CMV-MCS(944bp)SV40 early polyA(160bp)。经PCR扩增和基因片段纯化后，进行无缝克隆连接，连接产物转化至感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，培养后挑选阳性克隆进行酶切验证，获得腺病毒E1区域穿梭质粒pS5E1。
穿梭质粒pS5E4的骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列(370bp)，右臂部分fiber基因序列(1746bp)，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因。经PCR扩增和基因片段纯化后，进行无缝克隆连接，连接产物转化至感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，培养后挑选阳性克隆进行酶切验证，获得腺病毒E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP。
进一步地，步骤6)穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，是通过PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
进一步地，步骤7)穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R同源重组，是通过PacI和I-sceI对穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
另一方面，本发明提供一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；转染由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞，收集细胞悬液，实现重组腺病毒包装。其中的293TD37细胞株于2019年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019111，分类命名是人胚肾转化细胞AY293-TD37，该细胞株包含腺病毒的5型的E2a和E4-ORF6/7基因，是通过将HEK293细胞经过基因工程改造所获得，能用于包装缺失E2a基因和E4基因的二代重组腺病毒而形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒。
进一步地，所述的一种重组腺病毒载体的包装方法，由以下步骤制得：
1)将pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin共表达重组腺病毒载体用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；使用PEI转染试剂转染293TD37细胞；
2)转染后的293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中培养72-96小时后收集细胞悬液，即为TP0代腺病毒；
3)TP0代腺病毒感染293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时，收集细胞悬液即TP1代腺病毒；
4)重复3)，收集细胞悬液即TP2代腺病毒；
5)持续接种直至细胞出现病变。
另一方面，本发明还提供了293TD37细胞用于包装非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的用途，其特征在于，所述四种抗原基因分别为EP402R、EP153R、I177L和K205Rubiqutin，其中EP402R和EP153R表达在E1区，I177L和K205Rubiqutin表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin；其中，所述293TD37细胞是由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的，细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗是通过构建非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，并经293TD37细胞包装而获得。其中，非洲猪瘟病毒的四种抗原基因分别为EP402R、EP153R、I177L和K205Rubiqutin。非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建，主要通过CRISPR/cas9敲除腺病毒载体的E1、E3、E2a和E4基因，构建了E1、E4区域的穿梭质粒，分别用于表达EP402R和EP153R、I177L和K205Rubiqutin基因，从而获得全新的腺病毒载体。本发明的有益效果主要体现在：
1)供了全新的腺病毒5型载体CRISPR/cas9的构建方法，并选择了最佳敲除位点，设计了最佳gRNA，避免了过去载体构建用穿梭质粒敲除，需要找单一的酶切位点。
2)由于E4区基因在免疫原性中起着关键作用，大量E4区域基因的表达会使宿主产生较为强烈的免疫反应，诱导抗体的产生，不利于腺病毒载体在宿主中长期表达目的蛋白，本发明在E4区域敲除不必要的基因可以降低腺病毒载体的免疫原性，使载体能够在较长时间内进行表达。
3)本发明将E4区域的ORF1～ORF5的序列进行敲除，保留E4 promoter、ORF6、ORF7、polyA序列，并将其插入E2a位置，因此E4位置可以进行表达外源基因。
4)本发明还进一步敲除了DBP(E2a)序列，DBP缺失可以阻止或极大减低回复突变。④E2a和E4部分序列的敲除，相对于一代载体，增加了约3kb的载体容量。
5)腺病毒载体的E2A、E4敲除，并将E4promoter-ORF6/7-polyA放于E2A区域，由此可以用E2a互补的细胞系进行包装，同时，外源基因可以在E1、E4区域同时表达而不相互干扰，目前该腺病毒疫苗在我们公司构建的互补细胞系—293TD37细胞系中的拯救，该细胞系能够持久的表达DBP蛋白。
6)本发明构建了E1、E4区域的穿梭质粒，用于E1、E4区域外源基因表达。
7)本发明经293TD37细胞系包装制备得到的重组腺病毒病毒的滴度较高。
基于以上原则，本发明可以极大地提高腺病毒载体的疫苗的容量，使用在一个腺病毒载体上同时表达非洲猪瘟四个独立抗原的方式，增强对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应，可以使家猪获得更好的免疫保护。
附图说明
图1为实施例2的Ad5-E4-up-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图2为实施例2的Ad5-E4-down-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图3为实施例2的Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒电泳检测结果，其中泳道1为Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA以及cas9“双酶切”，M为Marker
图4为实施例2含有部分敲除的fiber、ITR片段扩增电泳检测结果，其中泳道1为fiber部分片段扩增结果，泳道2为ITR部分片段扩增结果，M为Marker
图5为实施例2的Fiber-ITR融合片段电泳检测结果，其中泳道1为Fiber-ITR融合片段，M为Marker
图6为实施例2的菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-24为菌落，M为Marker
图7为实施例2对图6的阳性克隆菌落质粒进行BamHI、XhoI酶切验证的电泳检测结果，其中1-5为BamHI酶切，6-10为XhoI酶切，1、10为pAd5LCL3对照(为确实E4基因)，M为Marker
图8为实施例3的100k-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图9为实施例3的protease-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图10为实施例3的100k-gRNA、protease-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒电泳检测结果，泳道1为100k-gRNA、protease-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒结果，M为Marker
图11为实施例3的100k、E4 ORF6/7表达框、protease PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1为E4ORF6/7表达框，泳道2为100k，M为Marker
图12为实施例3的100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段的融合PCR电泳检测结果，其中泳道1为片段100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR产物，M为Marker
图13为实施例3的菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-24为菌落，M为Marker
图14为实施例3对图13的菌落挑取9、18、21、24号阳性克隆菌落进行XhoI酶切验证的电泳检测结果，其中泳道1为9号阳性克隆XhoI酶切，泳道2为18号阳性克隆XhoI酶切，泳道3为21号阳性克隆XhoI酶切，泳道4为24号阳性克隆XhoI酶切，泳道5为对照质粒pAd5LCL3的XhoI酶切，M为Marker
图15为实施例4的CMV-MCS和SV40 earlypolyA片段扩增电泳检测结果，其中泳道1为CMV-MCS片段，泳道2为SV40 earlypolyA片段，M为2000Marker
图16为实施例4的CMV-MCS-SV40 earlypolyA、PUC、Ad5右臂、Ad5左臂扩增电泳检测结果，其中泳道1为CMV-MCS-SV40 earlypolyA融合片段，泳道2为PUC，泳道3为Ad5右臂，泳道4为Ad5左臂，M为2000Marker
图17为实施例4的pS5E1骨架、Ad5左臂、Ad5右臂、CMV-MCS-SV40 earlypolyA四个片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-6为菌落，M为Marker
图18为实施例4的选取图17中的1-6号菌落酶切验证的电泳检测结果，其中左1-6为质粒pS5E1NcoI单酶切，右1-6为质粒pS5E1 PacI单酶切，M为15000bp Marker
图19为实施例4的IRES片段PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1、2为IRES片段PCR扩增产物，M为15000bp Marker
图20为实施例4的片段IRES与pS5E1载体酶切电泳检测结果，其中泳道1为片段IRES EcoRV、NotI酶切，泳道2为pS5E1 EcoRV、NotI酶切，M为15000bp Marker
图21为实施例4的pS5E1载体与IRES片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-9号为菌落，M为Marker
图22为实施例4的pS5E1-IRES质粒NotI、EcoRV酶切电泳检测验证，选取图21的2、6进行质粒提取，酶切验证，其中1号泳道为2号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定，2号泳道为6号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定
图23为实施例4的EP402R与pS5E1-IRES载体酶切电泳检测结果，其中泳道1为EP402R，BamHI和EcorV双酶切，泳道2为片段pS5E1-IRES，BamHI和EcoRV双酶切，M为15000bpMarker
图24为实施例4的EP402R与pS5E1-IRES连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-6号为菌落，M为2000bp Marker
图25为实施例4的pS5E1-EP402R-IRES质粒酶切电泳检测验证，选取图24中的1、2、4号菌落进行质粒提取，酶切验证，其中1号泳道为1号质粒酶切验证，2号泳道为2号质粒酶切验证，4号泳道为4号质粒酶切验证，M为Marker
图26为实施例4的pS5E1-EP402R-IRES载体与EP153R载体酶切产物电泳检测结果，其中泳道1为pS5E1-EP402R-IRES，NotI、XhoI酶切，泳道2为EP153R片段，NotI、XhoI酶切，M为2000bp Marker
图27为实施例4的pS5E1-EP402R-IRES载体与EP153R连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-14号为菌落，M为5000bp Marker
图28为实施例4的pS5E1-F317L-IRES-A151R质粒酶切电泳检测验证，其中1、2、3、5、11、13号泳道为选取图27中的1、2、3、5、11、13号菌落质粒BamHI、EcoRV酶切鉴定，M为15000bp Marker
图29为实施例5的pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂、EF1α-EGFP-HBV、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架扩增电泳检测结果，其中泳道1为pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂，泳道2为pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂，泳道3为EF1α-EGFP-HBV，泳道4为pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架，M为2000Marker
图30为实施例5的pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂、EF1α-EGFP-HBV、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架四个片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-20为菌落，M为Marker
图31为实施例5的选取图30中的3、4、5、6号菌落酶切验证的电泳检测结果，其中1-4为3、4、5、6号阳性克隆PacI单酶切，5-8为3、4、5、6号阳性克隆HindIII单酶切，M1、M3为15000bp Marker，M2为2000bp Marker
图32为实施例5的融合PCR扩增I177L-2A和K205Rubiqutin片段的电泳检测结果，泳道1为片段K205R；泳道2为片段ubiqutin；泳道3为片段K205Rubiqutin，M为2000bpMarker；泳道4为片段2A；泳道5为片段I177L；泳道6为片段I177L-2A，M为2000bp Marker
图33为实施例5的片段pS5E4-EGFP载体酶切电泳检测结果，其中泳道1为片段pS5E4-EGFP，BamHI和XhoI双酶切胶回收，M为15000bp Marker
图34为实施例5的pS5E4-EGFP胶回收载体与I177L-2A片段、K205Rubiqutin无缝克隆连接并转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-3号为菌落，M为15000bpMarker
图35为实施例5挑取图34的1、2、3号阳性克隆提取质粒进行BamHI、XhoI双酶切验证的电泳检测结果，其中泳道1、2、3分别为1、2、3号阳性克隆BamHI、XhoI双酶切验证，M为15000bp Marker
图36为实施例6的pAd5LCL3与pS5E1-EP402R-IRES-EP153R琼脂糖凝胶验证电泳检测结果，其中泳道1为pAd5LCL3，泳道2为pS5E1-EP402R-IRES-EP153R
图37为实施例6的穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R和腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组获得pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R质粒的电泳检测结果，其中泳道1-8为pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R克隆，M为15000bp Marker
图38为实施例6挑取图37的2号阳性质粒转化至感受态细胞，提取质粒进行酶切验证检测结果，其中1号泳道为pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R质粒XhoI酶切，2号泳道为pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R质粒PacI酶切，3号泳道为pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R质粒BamHI酶切，M为15000bp Marker
图39为实施例6的穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R同源重组获得重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin质粒的电泳检测结果，其中泳道1-7为质粒，M为15000bp Marker
图40为实施例6的挑取图39的1号阳性质粒转化至感受态细胞，提取质粒进行酶切验证检测结果，其中泳道1、2为pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin质粒XhoI酶切，泳道3为pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin质粒BamHI酶切，泳道4为pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin质粒PacI酶切，M为15000Marker
图41为实施例7的TP0引起的293TD37细胞照片
图42为实施例7的TP1引起的293TD37细胞照片
图43为实施例7的TP2引起的293TD37细胞照片
图44为实施例7的TP3引起的293TD37细胞照片
图45为实施例7的TP4引起的293TD37细胞病变照片
图46为实施例11用Western Blot检测非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-EP402R-EP153R-K205R-I177L ubiqutin中EP153R蛋白结果示意图
图47为pAd5LCL3的载体图谱
图48为pS5E1的载体图谱
图49为pS5E1-EP402R-IRES-EP153R的载体图谱
图50为pS5E4-EGFP的载体图谱
图51为pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin的载体图谱
图52为pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin的载体图谱
图53为实施例12的ELISA法检测血清中针对非洲猪瘟目的蛋白EP402R的IgG抗体滴度结果示意图
图54为实施例12的pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin诱导的CD8+T细胞反应结果示意图
图55为实施例12的pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin诱导的CD4+T细胞反应结果示意图
图56为实施例12的肌肉注射pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin后细胞免疫反应代表图
图57为实施例12的空白对照免疫反应代表图
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒的构建
在A549细胞(CCL-185)中扩增野生型人腺病毒5型(/>VR-1516，基因序列AC_000008.1)病毒，收集并进行浓缩病毒液，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒基因组，使用cosmid的方法将线性的hAd5基因组构建成环状的supercos-Ad5载体质粒，利用CRISPR/cas9对hAd5腺病毒E1区域进行切除，设计gRNA如下：
hAd5-E1上游gRNA:
GGCGGGAAAACUGAAUAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
hAd5-E1下游gRNA:
GAGAUGAUCCAGUCGUAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
在hAd5 E1区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，设计引物，通过融合PCR将ITR，PIX序列分别插入上、下游，并引入SwaI酶切位点，然后将融合后的片段与载体进行无缝克隆，获得E1敲除的supercos-Ad5ΔE1腺病毒载体，而后对supercos-Ad5△E1质粒进行E3区域的切除，设计gRNA如下：
hAd5-E3上游gRNA:
GCGGGACAUUUCAGAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
hAd5-E3下游gRNA:
GUAAGGGUACUGCUAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
在hAd5 E3区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，后设计引物，对E3上下游过多切除的Fiber，以及pVIII序列进行融合PCR，使用无缝克隆的方式连接，获得缺失E1和E3基因，并引入SwaI酶切位点的腺病毒载体质粒pAd5。
实施例2缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5△E4的构建
采用实施例1获得的已经敲除了E1、E3基因的载体质粒pAd5，进一步敲除敲除E4基因，能提高腺病毒载体的容量，降低其免疫原性，并使用PCR的方法扩增部分fiber以及引入NdeI单酶切位点，再使用Gibson的无缝克隆方法，将多余切除的片段连接至载体上，获得缺失E1、E3和E4基因，并引入SwaI和I-sceI酶切位点的载体质粒pAd5ΔE4。
1、目的基因E4 CRISPR靶序列的选择
1)E4基因上游fiber基因CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入fiber基因的前400个碱基，软件自动分析该400个碱基的序列，提供了6个潜在的CRISPR靶序列。考虑到E4基因敲除序列的长度，以及构建活载体的要求，选择GCTACTAAACAATTCCTTCC作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为Ad5-E4-up-gRNA，裂解位点和PAM位点如图1所示。
2)E4下游非编码序列CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入E4下游的300个碱基，软件自动分析，提供了6个潜在的CRISPR靶序列，选择AGGTTCGCGTGCGGTTTTCT作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为Ad5-E4-down-gRNA，裂解位点和PAM位点如图2所示。
2、Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的DNA扩增
1)Ad5-E4-up-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGTACTAAACAATTCCTTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2)Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGGTTCGCGTGCGGTTTTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
3、设计扩增Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板的上下游引物
设计上下游引物分别进行PCR扩增Ad5-E4-up-gRNA的DNA模板和Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板，使用GeneArtTMPrecision gRNA Synthesis Kit试剂盒进行扩增。
引物设计：
Ad5-E4-up-gRNA-Forward：TAATACGACTCACTATAGTACTAAACAATTCCT
Ad5-E4-up-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAACGGAAGGAATTGTTTAGTA
Ad5-E4-down-gRNA-Forward：TAATACGACTCACTATAGGTTCGCGTGCGGTTT
Ad5-E4-down-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAACAGAAAACCGCACGCGAAC
4、扩增Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板
1)准备0.3μM的Ad5-E4-up-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液
10μM的Ad5-E4-up-gRNA-Forward引物3μl，10μM的Ad5-E4-up-gRNA-Reverse引物3μl，补充水至100μl。
2)准备0.3μM的Ad5-E4-down-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液
10μM的Ad5-E4-down-gRNA-Forward引物3μl，10μM的Ad5-E4-down-gRNA-Reverse引物3μl，补充水至100μl。
3)PCR反应体系
Ad5-E4-up-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTMHigh-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5μl，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μl，0.3μM Ad5-E4-up-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1μl，补水至25μl。
Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTMHigh-FidelityPCR Master Mix(2X)12.5μl，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μl，0.3μM Ad5-E4-down-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1μl，补水至25μl。
4)PCR程序
起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火55℃，15sec，32循环；延伸72℃，1min，1循环；保持4℃。
5、体外转录获得Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA
使用TranscriptAidTMEnzyme Mix对模板DNA进行体外转录，获得Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA。
体外转录获得Ad5-E4-up-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μl，E1A-gRNA DNA模板6μl，5X TranscriptAidTMReaction Buffer 4μl，TranscriptAidTMEnzyme Mix 2μl。于37℃孵育4小时后加入1μl的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得Ad5-E4-down-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μl，E1B-gRNA DNA模板6μl，5X TranscriptAidTMReaction Buffer 4μl，TranscriptAidTMEnzyme Mix 2μl。于37℃孵育4小时后加入1μl的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA。
6、体外转录产物的纯化
1)将转录后的反应体系用无核酸酶水补充至200μl；
2)加入100μl的Binding buffer，充分混匀；
3)加入300μl的乙醇(>96％)，充分混匀；
4)将混合液转移到the Gene JETTMRNA Purification Micro Column中，14000×g离心30-60秒，弃下液；
5)加入700μl的Wash Buffer1(加入13mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液；
6)加入700μl的Wash Buffer2(加入30mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液，重复上述步骤一次；
7)14000×g空离60秒，将所有的洗脱液完全去除，将空管放置于1.5mL的收集管中；
8)在柱子中心加入10μl的无核酸酶水，14000×g离心60秒收集gRNA。
其中，Wash Buffer1和Wash Buffer2均为TranscriptAidTMEnzyme Mix试剂盒中的试剂，转录获得的Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的RNA序列如下所示：
Ad5-E4-up-gRNA:GUACUAAACAAUUCCUUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
Ad5-E4-down-gRNA:GGUUCGCGUGCGGUUUUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
7、CRISPR/Cas9“酶切”
使用Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA和cas9双酶切实施例1获得载体质粒，反应体系为Cas9蛋白3μg，Ad5-E4-up-gRNA 6μg，Ad5-E4-down-gRNA 6μg，pAd5-REBP载体质粒3μg，NEB buffer3.1 5μl，补充水至50μl。
酶切反应于37℃孵育过夜。取3μl样品进行琼脂糖凝胶验证，实验结果电泳图如图3所示。泳道1为Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA以及cas9“双酶切”pAd5载体质粒结果，出现了目的大小在2500bp-5000bp的片段，可见酶切结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将载体进行纯化。
8、获得含有部分敲除的fiber、ITR片段并引入I-SceI酶切位点，敲除使用含有敲除部分fiber的引物，扩增fiber片段并引入I-SceI酶切位点
1)片段fiber的扩增
扩增引物：
Fiber-RH-F：GAGTGCTACTAAACAATTCCTTCCTGGACCCAGAATATTGG
Fiber-ISceI-ITR-R：TGGTGTTATTACCCTGTTATCCCTAGCAATTGAAAAATAAACACGTTG
扩增序列为：
TGGTGTTATTACCCTGTTATCCCTAGCAATTGAAAAATAAACACGTTGAAACATAACACAAACGATTCTTTATTCTTGGGCAATGTATGAAAAAGTGTAAGAGGATGTGGCAAATATTTCATTAATGTAGTTGTGGCCAGACCAGTCCCATGAAAATGACATAGAGTATGCACTTGGAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTGTGTACCGTTTAGTGTAATGGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTGTCTCCGTTTAAGTAAACTTGACTGACAATGTTACTTTTGGCAGTTTTACCGTGAGATTTTGGATAAGCTGATAGGTTAGGCATAAATCCAACAGCGTTTGTATAGGCTGTGCCTTCAGTAAGATCTCCATTTCTAAAGTTCCAATATTCTGGGTCCAGGAAGGAATTGTTTAGTAGCACTC
扩增体系为：10μM Fiber-RH-F引物1μl；10μM Fiber-ISceI-ITR-R引物1μl；模板pAd5(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果电泳图如图4所示，泳道1为fiber部分片段扩增结果，M为2000Marker，可见扩增结果正确，使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
2)ITR片段的扩增
扩增引物：
ISceI-ITR-F：TAGGGATAACAGGGTAATAACACCACTCGACACGGCAC
ITR-RH-R：GGCGTAGGTTCGCGTGCGGTTTTCTGGGTGTTTTTTGTGGACTT
扩增序列为：
GGCGTAGGTTCGCGTGCGGTTTTCTGGGTGTTTTTTGTGGACTTTAACCGTTACGTCATTTTTTAGTCCTATATATACTCGCTCTGCACTTGGCCCTTTTTTACACTGTGACTGATTGAGCTGGTGCCGTGTCGAGTGGTGTTATTACCCTGTTATCCCTA
扩增体系为：10μM ISceI-ITR-F引物1μl；10μM ITR-RH-R引物1μl；模板pAd5(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果如图4所示，泳道2为ITR部分片段扩增结果，M为2000Marker，可见扩增结果正确，使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
3)融合PCR获得Fiber-ITR的融合片段
扩增体系为：10μM Fiber-RH-F引物1μl，10μM Fiber-ISceI-ITR-R引物1μl，模板pAd5(100ng/μl)0.5μl，Q5高保真酶25μl，补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果如图5所示，泳道1为Fiber-ITR的融合片段，M为2000Marker，可见融合结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
9、载体连接
使用NEB的Gibson使Fiber-ITR片段与敲除E4后的载体质粒连接，连接体系如下所示：胶回收产物载体质粒片段100ng，胶回收产物fiber-ITR片段50ng，Gibson预混液10μl，补水至20μl。于50℃，孵育40分钟。
10、转化
取出卡那抗性培养基平板，将制备好的NEB 10β感受态细胞放在冰上融化后，加入10μl连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；将离心管放置42℃水浴，热击90秒，利用卡那青霉素抗性筛选转化子。
11、菌落PCR进行转化子筛选
使用PCR扩增方式对转化子进行菌落PCR验证。
设计菌落PCR的下游引物
E4-cexu-F：AGTGACGATTTGAGGAAGTTG
E4-cexu-R：TCAATTGCAGAAAATTTCAAGTC
反应体系为：10μM E4-cexu-F引物1μl，10μM E4-cexu-R引物1μl，Q5高保真酶10μl，补水至20μl，挑取单克隆菌落于反应体系中。PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。进行琼脂糖凝胶电泳验证，如图6所示，除了2、8、11、17号，大部分菌落出现了阳性条带。
12、质粒酶切验证
挑取4个阳性克隆菌落，提取质粒，进行BamHI、XhoI酶切验证，酶切结果如图7所示，从图7可以看出，2-5号质粒BamHI、XhoI酶切结果均正确，同时测序结果正确，即获得了缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4。
实施例3缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3的构建
1、目的基因E2a CRISPR靶序列的选择
1)E2a基因上游100k基因CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入100k基因的前400个碱基，软件自动分析该400个碱基的序列，提供了6个潜在的CRISPR靶序列。考虑到E2a基因敲除序列的长度，以及构建活载体的要求，选择ATAGGTGGCGTTCGTAGGCA作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为100k-gRNA，裂解位点和PAM位点如图8所示。
2)E2a下游非编码序列CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入E4下游的300个碱基，软件自动分析，提供了6个潜在的CRISPR靶序列，选择TACCCCGGTAATAAGGTTCA作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为protease-gRNA，裂解位点和PAM位点图9所示。
2、100k-gRNA和protease-gRNA的DNA扩增
1)100k-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGAGGTGGCGTTCGTAGGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC GTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2)protease-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGCCCCGGTAATAAGGTTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC GTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
3、设计扩增100k-gRNA和protease-gRNA的DNA模板的上下游引物
设计上下游引物分别进行PCR扩增100k-gRNA的DNA模板和protease-gRNA的DNA模板，使用GeneArtTMPrecision gRNA Synthesis Kit试剂盒进行扩增。
1)引物设计
100k-gRNA-Foward：TAATACGACTCACTATAG AGGTGGCGTTCGTAG
100k-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAAC TGCCTACGAACGCCACCT
protease-gRNA-Foward：TAATACGACTCACTATAG CCCCGGTAATAAGGT
protease-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAAC TGAACCTTATTACCGGGG
2)扩增100k-gRNA和protease-gRNA的DNA模板
①准备0.3μM的100k-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液，包括10μM的100k-gRNA-Forward引物3μl，10μM的100k-gRNA-Reverse引物3μl，补充水至100μl。
②准备0.3μM的Aprotease-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液，包括10μM的protease-gRNA-Forward引物3μl，10μM的protease-gRNA-Reverse引物3μl，补充水至100μl。
③PCR反应体系
100k-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTMHigh-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5μl，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μl，0.3μM 100k-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1μl，补水至25μl。
protease-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTMHigh-Fidelity PCRMaster Mix(2X)12.5μl，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μl，0.3μM protease-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1μl，补水至25μl。
④PCR程序
起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火55℃，15sec，32循环；延伸72℃，1min，1循环；保持4℃。
3、体外转录获得100k-gRNA和protease-gRNA
使用TranscriptAidTMEnzyme Mix对模板DNA进行体外转录，获得100k-gRNA和protease-gRNA。
1)体外转录获得100k-gRNA、protease-gRNA
体外转录获得100k-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μl，100k-gRNA DNA模板6μl，5XTranscriptAidTMReaction Buffer 4μl，TranscriptAidTMEnzyme Mix 2μl。于37℃孵育4小时后加入1μl的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得protease-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μl，protease-gRNA DNA模板6μl，5X TranscriptAidTMReaction Buffer 4μl，TranscriptAidTMEnzyme Mix 2μl。于37℃孵育4小时后加入1μl的DNase I，于37℃孵育15分钟。
2)体外转录产物的纯化
将转录后的反应体系用无核酸酶水补充至200μl，加入100μl的Binding buffer，充分混匀，加入300μl的乙醇(>96％)，充分混匀，将混合液转移到the Gene JETTMRNAPurification Micro Column中，14000×g离心30-60秒，弃下液；加入700μl的WashBuffer1(加入13mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液；加入700μl的Wash Buffer2(加入30mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液，重复上述步骤一次。14000×g空离60秒，将所有的洗脱液完全去除，将空管放置于1.5mL的收集管中，在柱子中心加入10μl的无核酸酶水，14000×g离心60秒收集gRNA。
其中，Wash Buffer1和Wash Buffer2均为TranscriptAidTMEnzyme Mix试剂盒中的试剂，转录获得的100k-gRNA和protease-gRNA的RNA序列如下所示：
100k-gRNA:GAGGUGGCGUUCGUAGGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
protease-gRNA:GCCCCGGUAAUAAGGUUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
4、CRISPR/Cas9“酶切”
使用100k-gRNA、protease-gRNA和cas9双酶切实施例2获得的缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒，反应体系为Cas9蛋白3μg；100k-gRNA 6μg；protease-gRNA 6μg；实施例2获得的载体质粒3μg；NEB buffer 3.1 5μl；补充水至50μl。
上述酶切反应分别于37℃孵育过夜。取3μl样品进行琼脂糖凝胶验证，实验结果如图10所示。泳道1为100k-gRNA、protease-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒结果，出现了目的大小在1000-2500bp的片段，可见酶切结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将载体进行纯化。
5、获得含有部分敲除的100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段
1)部分敲除的100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段的扩增
①部分敲除的100k扩增引物：
100k-F：TGAGAATAGGTGGCGTTCGTAGGCAAGGCTGACATCCGCTATGG
100k-ORF6/7-R：TACAATTCCCAACACATACAAGTTTCCTTCTCCTATAGGCAGAA
扩增体系为：10μM 100k-F引物1μl；10μM 100k-ORF6/7-R引物1μl；模板pAd5ΔE4(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
②E4 ORF6/7表达框扩增引物：
ORF6/7-F：ACTTGTATGTGTTGGGAATTGTA
ORF6/7-R：ATCGTTTGTGTTATGTTTCAACG
扩增体系为：ORF6/7-F引物1μl；10μM ORF6/7-R引物1μl；模板ORF6/7表达框基因(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
③部分敲除的Protease片段的扩增
ORF6/7-Protease-F：CCCACCCTTGCCGTCTGCGCCGTATCGTTTGTGTTATGTTTCAACG
Protease-R：ATGGATCACAACCCCACCATGAACCTTATTACCGGGGTACCCA
扩增体系为：10μM ORF6/7-Protease-F引物1μl；10μM Protease-R引物1μl；模板pAd5ΔE4(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
④100k、E4 ORF6/7表达框、protease PCR扩增结果如图11所示，其中泳道1为E4ORF6/7表达框，泳道2为100k，M为15000bpMarker
可见扩增结果正确，使用Axygen胶回收试剂盒将片段分别进行胶回收纯化。
6、融合PCR获得100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段的融合片段
扩增体系为：10μM 100k-F引物1μl；10μM Protease-R引物1μl；模板100k胶回收产物(50ng/μl)1μl模板E4 ORF6/7表达框胶回收产物(50ng/μl)1μl模板E4 ORF6/7表达框胶回收产物(50ng/μl)1μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，50sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果如图12所示，其中泳道1为片段100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR产物，可见扩增结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
7、载体连接
使用NEB的Gibson使100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR胶回收产物与步骤4中敲除E2a后的载体连接，连接体系如下所示：胶回收产物敲除E2a后的载体片段100ng，胶回收产物100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR片段50ng，Gibson预混液10μl，补水至20μl。于50℃，孵育40分钟。
8、转化
取出卡那抗性培养基平板，将制备好的NEB 10β感受态细胞放在冰上融化后，加入10μl连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；将离心管放置42℃水浴，热击90秒，利用卡那青霉素抗性筛选转化子。
9、菌落PCR进行转化子筛选
使用PCR扩增方式对转化子进行菌落PCR验证。
设计菌落PCR的下游引物
DBP-upsteam-F：GTTGGGCTCGCATGTGCCG
DBP-downsteam-R：ACTCCCATGGATCACAACCC
反应体系为：10μM DBP-upsteam-F引物1μl，10μM DBP-downsteam-R引物1μl，Q5高保真酶10μl，补水至20μl，挑取单克隆菌落于反应体系中。PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。进行琼脂糖凝胶电泳验证，如图13所示，在9、18、21、24出现阳性条带。
10、质粒酶切验证
挑取9、18、21、24这4个阳性克隆菌落，提取质粒，进行XhoI酶切验证，酶切结果如图14所示，其中泳道1为9号阳性克隆XhoI酶切，泳道2为18号阳性克隆XhoI酶切，泳道3为21号阳性克隆XhoI酶切，泳道4为24号阳性克隆XhoI酶切，泳道5为对照质粒pAd5LCL3的XhoI酶切。从图14可以看出，质粒XhoI酶切结果均正确，同时测序结果正确，即获得了缺失E1、E3、E4和E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置的pAd5LCL3质粒，其载体图谱如图47所示。
实施例4非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R的构建
1、人类腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒的构建
穿梭质粒pS5E1的骨架采用puc origin、amp等基本元素(2796bp)(pS5E1骨架由北京博迈德基因技术有限公司合成)，Ad5左臂ITR部分序列(355bp)，右臂PIX、PIVa2部分序列(2100bp)，以及CMV-MCS(Seq ID NO.13)(944bp)SV40 early polyA(Seq ID NO.14)(160bp)。
1)引物设计
puc-Ad5-right arm-F：TAATGCAGCTGGCTTATCGAAACGTGGAATGCGAGACCGTCT
Ad5-right arm-CMV-R：ACACACAAGCAGGGAGCAGATACAAGGGTGGGAAAGAATATATAAG
CMV-F：GTATCTGCTCCCTGCTTGTG
CMV-SV40-R：TAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGTGATCAGCGGGTTTAAACGGG
SV40-F：CTTCGCCCACCCCAACTTGT
SV40-R：AGAGGTCGACGGTATACAGAC
SV40-Ad5-left arm-F：TGTCTGTATACCGTCGACCTCTCCGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCC
Ad5-left arm-puc-R：
ACACTATAGAATACACGGAATTCTTAATTAAATCATCAATAATATACCTTATTTTG
puc-F：GAATTCCGTGTATTCTATAGTGT
puc-R：TTTCGATAAGCCAGCTGCATTA
2)目的片段的扩增
①以pCDNA3.1(+)为模板(该质粒购自赛默飞公司)，以CMV-F和CMV-SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的CMV启动子MCS片段；扩增体系：pCDNA3.1(+)质粒50ng，10uM CMV-F引物1ul，10uM CMV-SV40-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃，5min。
②以pCDNA3.1(+)为模板(该质粒购自赛默飞公司)，以SV40-F和SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的SV40-earlypolyA片段；扩增体系：pCDNA3.1(+)质粒50ng，10uM SV40-F引物1ul，10uM SV40-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、10sec，35个循环；72℃，5min。
扩增产物琼脂糖验证如图15所示，其中泳道1为CMV-MCS片段，泳道2为SV40earlypolyA片段，M为2000Marker。由图15可见，扩增结果正确。
③使用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
④以博迈德公司合成的pS5E1骨架质粒为模板，以puc-F和puc-R为引物，PCR扩增pS5E1穿梭质粒骨架，扩增体系：pS5E1骨架质粒50ng，10uM puc-F引物1ul，10uM puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min20sec，35个循环；72℃，5min。
⑤以pAd5LCL3质粒为模板，以SV40-Ad5-left arm-F和Ad5-left arm-puc-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的左臂，扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM SV40-Ad5-left arm-F引物1ul，10uM Ad5-left arm-puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul，补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。
⑥以pAd5LCL3质粒为模板，以puc-Ad5-right arm-F和Ad5-right arm-CMV-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的右臂，扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM puc-Ad5-right arm-F引物1ul，10uM Ad5-right arm-CMV-R引物1ul，Q5高保真酶20ul，补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、15s，35个循环；72℃，5min。
⑦以胶回收产物CMV-MCS为模板，以CMV-F和SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的CMV-MCS-SV40 earlypolyA片段，扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM CMV-F引物1ul，10uMSV40-R引物1ul，Q5高保真酶20ul，补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40s，35个循环；72℃，5min。
扩增产物琼脂糖验证如图16所示，其中泳道1为CMV-MCS-SV40 earlypolyA融合片段，泳道2为PUC，泳道3为Ad5右臂，泳道4为Ad5左臂。
3)片段的连接转化
使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化，然后使用博迈德公司无缝克隆试剂盒将pS5E1骨架、Ad5左臂、Ad5右臂、CMV-MCS-SV40 earlypolyA这四个片段连接，连接体系为2×Smealess Cloning Mix10μl、pS5E1骨架片段50ng、Ad5左臂50ng、Ad5右臂50ng、CMV-MCS-SV40 polyA 50ng、补水至20μl，50℃保温40分钟，获得连接产物质粒pS5E1。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
4)质粒的验证
①菌落PCR验证
挑选菌落进行琼脂糖凝胶验证，结果如图17所示，出现阳性条带。
②酶切验证
挑取阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行酶切验证，电泳结果如图18所示，其中左1-6为质粒pS5E1 NcoI单酶切，右1-6为质粒pS5E1 PacI单酶切，M为15000bp Marker，酶切结果正确，成功构建人类腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1，其载体图谱如图48所示。
2、非洲猪瘟腺病毒5型载体穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R构建
1)pS5E1与IRES片段的连接
①引物合成
IRES-EcoRV-F：ccg GATATC TGTCGTCATCATCCTTATAGTCC
IRES-NotI-R：aaatat GCGGCCGC GGTTGTGGCCATTATCATCGTG
②扩增IRES片段
扩增体系：Q5酶25ul，10uM引物IRES-EcoRV-F 1ul，10uM引物IRES-NotI-R 1ul，模板IRES模板2ul，补水至50ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。扩增结果电泳检测如图19所示，其中泳道1、2为IRES片段PCR扩增产物，M为15000bp Marker，可见扩增结果正确。
③使用Axygen PCR纯化试剂盒纯化IRES片段。
④目的片段IRES与pS5E1载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E1、IRES片段～2ug，EcoRV和NotI各1ul；10×cutsmartbuffer 5ul；补水至50ul；反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活；胶回收纯化。酶切产物电泳检测如图20所示，其中泳道1为片段IRES EcoRV、NotI酶切，泳道2为pS5E1 EcoRV、NotI酶切，M为15000bp Marker。
⑤pS5E1载体与IRES片段连接
连接体系：pS5E1(100ng)；IRES片段(载体：片段＝1：5,摩尔比)；T4 DNA连接酶1ul；10×ligase buffer1ul；补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
⑥菌落PCR验证
扩增体系：Q5酶10ul，10uM引物IRES-EcoRV-F 1ul，10uM引物IRES-NotI-R 1ul，补水至20ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。进行电泳验证，如图21所示，其中1-9号为菌落，M为Marker，由图21可见，2和6号出现阳性条带。
⑦质粒NotI、EcoRV酶切验证，选取2、6进行质粒提取，酶切验证，结果如图22所示，其中2号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定，6号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定，可见酶切结果正确。
2)pS5E1-IRES与EP402R片段的连接
①引物合成
EP402R-BamHI-F：cgc GGATCC gccaccATGATCATCATCGTGATCTTCC
EP402R-EcoRV：ccg GATATC ttaAGCGTAGTCTGGGACGTCGT
②PCR扩增EP402R片段
扩增体系：Q5酶25ul，10uM引物EP402R-BamHI-F 1ul，10uM引物EP402R-EcoRV1ul，模板EP402R1ul，补水至50ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、45s，35个循环；72℃，5min。
③使用Axygen PCR纯化试剂盒纯化EP402R片段。
④目的片段EP402R与pS5E1-IRES载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E1-IRES、EP402R片段～2ug，EcoRV和BamHI各1ul；10×cutsmart buffer5ul；补水至50ul。反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。胶回收纯化。酶切产物电泳检测如图23所示，其中泳道1为片段EP402R，BamHI、EcoRV双酶切，泳道2为pS5E1-IRES，BamHI、EcoRV双酶切，M为15000bp Marker。
⑤目的片段EP402R与pS5E1-IRES连接
连接体系：pS5E1-IRES(100ng)；EP402R片段(载体：片段＝1：3摩尔比)；T4 DNA连接酶1ul；10×ligase buffer 1ul；补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
⑥菌落PCR验证
扩增体系：Q5酶10ul，10uM引物EP402R-BamHI-F 1ul，10uM引物EP402R-EcoRV-R1ul，补水至20ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃，5min。进行电泳验证，如图24所示，其中1-6号为菌落，M为2000bp Marker。
⑦质粒酶切验证(BamHI&EcoRV)，选取1、2、4菌落进行质粒提取，酶切验证。结果如图25所示，均为阳性质粒。
3)pS5E1-EP402R-IRES与片段EP153R的连接
①引物合成
EP153R-NotI-F：ATAAGAAT GCGGCCGCgccaccATGTTCAGCAACAAGAAGTACAT
EP153R-XhoI-R：AAACTCGAGTCACTTGCTACAGATGTACAG
②PCR扩增EP153R片段
扩增体系：Q5酶25ul，10uM引物EP153R-NotI-F 1ul，10uM引物EP153R-XhoI-R1ul，模板EP153R1ul，补水至50ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。
③使用Axygen PCR纯化试剂盒纯化EP153R片段。
④目的片段EP153R与pS5E1-EP402R-IRES载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E1-EP402R-IRES、EP153R片段～2ug，NotI和XhoI各1ul；10×cutsmart buffer5ul；补水至50ul。反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。胶回收纯化。酶切产物电泳检测如图26所示，其中泳道1为pS5E1-EP402R-IRES，NotI、XhoI酶切，泳道2为EP153R片段，NotI、XhoI酶切，M为2000bp Marker。
⑤pS5E1-EP402R-IRES载体与EP153R片段连接
连接体系：pS5E1-EP402R-IRES 100ng；EP153R片段50ng；T4 DNA连接酶1ul；10×ligase buffer1ul；补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
⑥菌落PCR验证
扩增体系：Q5酶10ul，10uM通用引物CMV-F 1ul，10uM引物EP153R-XhoI-R 1ul，补水至20ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、2min30s，35个循环；72℃，5min；进行电泳验证，如图27所示，其中1-14号为菌落，M为5000bp Marker。
⑦质粒BamHI、XhoI酶切验证，选取1、2、3、11、13进行质粒提取，酶切验证，结果如图28所示，其中1、2、4、6号泳道为1、2、4、6质粒BamHI、XhoI酶切鉴定，M为15000bp Marker。由图28可见，酶切结果正确，成功构件非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R，其载体图谱如图49所示。
实施例5非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin构建
1、人类腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒的构建
穿梭质粒pS5E4的骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列(370bp)，右臂部分fiber基因序列(1746bp)，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因。
1)基因合成
EF1α-EGFP-HBV polyA基因由博迈德公司合成。
2)引物设计
puc-Ad5E4-left arm-F：
AGGTGACACTATAGAATACACGTTAATTAAATCATCAATAATATACCTTATTTTG
Ad5E4-left arm-EF1α-R：caatccccccttttcttttaaaaAACACCACTCGACACGGCAC
EF1α-F：ttttaaaagaaaaggggggattg
EF1α-R：TAGAGCCCCAGCTGGTTCTTT
EF1α-Ad5E4-right arm-F：GGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGCAATTGAAAAATAAACACGTTGA
Ad5E4-right arm-puc-R：TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAAATGTAACCACTGTGAG
puc-F：TCTCCCTATAGTGAGTCGTATT
puc-R：CGTGTATTCTATAGTGTCACCT
ORF6/7-Protease-F：CGTTGAAACATAACACAAACGATACGGCGCAGACGGCAAGGGTGGG
3)目的片段的扩增
①以EF1α-EGFP-HBV基因合成片段为模板，以EF1α-F和EF1α-R为引物，扩增pS5E4-EGFP穿梭质粒的EF1α-EGFP-HBV polyA片段；扩增体系：EF1α-EGFP-HBV基因合成片段50ng，10uM EF1α-F引物1ul，10uM EF1α-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、40sec，35个循环；72℃，5min。
②以pAd5LCL3为模板，以puc-Ad5E4-left arm-F和Ad5E4-left arm-EF1α-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的左臂片段。扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM puc-Ad5E4-leftarm-F引物1ul，10uM Ad5E4-left arm-EF1α-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、10sec，35个循环；72℃，5min。
③以pAd5LCL3为模板，以EF1α-Ad5E4-right arm-F和Ad5E4-right arm-puc-R为引物，扩增pS5E4-EGFP穿梭质粒的右臂片段；扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM EF1α-Ad5E4-right arm-F引物1ul，10uM Ad5E4-right arm-puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。
PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40sec，35个循环；72℃，5min。
④以pS5E1质粒为模板，以puc-F和puc-R为引物，PCR扩增pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架；扩增体系：pS5E1骨架质粒50ng，10uM puc-F引物1ul，10uM puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min20sec，35个循环；72℃，5min。扩增产物琼脂糖验证如图29所示，其中泳道1为pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂，泳道2为pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂，泳道3为EF1α-EGFP-HBV，泳道4为pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架，M为2000Marker。由图29可见，扩增结果正确。
4)使用Axygen胶回收试剂盒纯化目的片段。
5)片段的连接转化
使用博迈德公司无缝克隆试剂盒将pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂、EF1α-EGFP-HBV、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架这四个片段连接，连接体系为2×Smealess Cloning Mix10μl、pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂片段50ng、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂片段50ng、EF1α-EGFP-HBV片段50ng、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架片段50ng、补水至20μl，50℃保温40分钟；将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
6)质粒的验证
①菌落PCR验证
用引物puc-Ad5E4-left arm-F/ER1a-R为引物菌落PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶验证，结果如图30所示，出现阳性条带。
②酶切验证
挑取3、4、5、6号阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行酶切验证，电泳结果如图31所示，其中1-4为3、4、5、6号阳性克隆PacI单酶切，5-8为3、4、5、6号阳性克隆HindIII单酶切，M1、M3：15000bp Marker；M2：2000bp Marker；酶切结果正确，测序正确；成功构建人类腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP，其载体图谱如图50所示。
2、非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin构建
1)引物设计
EF1α-BamHI-I177L-F：ccaagctgtgaccggcgcctacGGATCCGCCACCATGTGGAAGGTGAA
I177L-R：GGCGTAATCGGGCACGTCG
I177L-2A-F：CTACGACGTGCCCGATTACGCCGGAAGCGGAGCTACTAACTTC
2A-K205R-R：AACTGCTCTCTGGGCTCCACCATAGGTCCAGGGTTCTCCTCCA
K205R-F：ATGGTGGAGCCCAGAGAGCA
K205R-ubiqutin-R：GGGTTTTCACGAAAATCTGCATGGCGTAATCGGGCACATCGT
ubiqutin-F：ATGCAGATTTTCGTGAAAACCC
ubiquitin-XhoI-HBV-R：GGGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGTTACTTGTCTTCTGGTTTGTTGA
2)目的片段I177L-K205Rubiqutin的扩增
①以I177L基因合成片段为模板，以EF1α-BamHI-I177L-F和I177L-R为引物，扩增I177L片段；扩增体系：I177L基因合成片段50ng，10uM EF1α-BamHI-I177L-F引物1ul，10uMI177L-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、30sec，35个循环；72℃，5min。
②以2A基因合成片段为模板，以I177L-2A-F和2A-K205R-R为引物，扩增2A片段；扩增体系：2A基因合成片段50ng，10uM I177L-2A-F引物1ul，10uM 2A-K205R-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、20sec，35个循环；72℃，5min。
③以K205R基因合成片段为模板，以K205R-F和K205R-ubiqutin-R为引物，扩增K205R片段；扩增体系：K205R基因合成片段50ng，10uM K205R-F引物1ul，10uM K205R-ubiqutin-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、30sec，35个循环；72℃，5min。
④以ubiqutin基因合成片段为模板，以ubiqutin-F和ubiquitin-XhoI-HBV-R为引物，扩增ubiqutin片段；扩增体系：ubiqutin基因合成片段50ng，10uM ubiqutin-F引物1ul，10uM ubiquitin-XhoI-HBV-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、40sec，35个循环；72℃，5min。
3)使用Axygen胶回收试剂盒纯化目的片段。
4)融合PCR扩增I177L-2A片段、K205Rubiqutin片段
扩增体系：I177L胶回收片段50ng、2A胶回收片段50ng，10uM EF1α-BamHI-I177L-F引物1ul，10uM 2A-K205R-R引物1ul，Q5高保真酶25ul；补水至50ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、40sec，35个循环；72℃，5min。
扩增体系：K205R胶回收片段50ng、ubiqutin胶回收片段50ng，10uM K205R-F引物1ul，10uM2A-K205R-R引物1ul，Q5高保真酶25ul；补水至50ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、40sec，35个循环；72℃，5min。
PCR产物电泳检测如图32所示，其中泳道1为片段K205R；泳道2为片段ubiqutin；泳道3为片段K205Rubiqutin，M为2000bp Marker；泳道4为片段2A；泳道5为片段I177L；泳道6为片段I177L-2A，M为2000bp Marker。
5)pS5E4-EGFP载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E4-EGFP 2ug，BamHI和XhoI各1ul；10×cutsmart buffer5ul；补水至50ul。反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。Axygen试剂盒胶回收纯化。
6)使用Axygen胶回收试剂盒纯化载体片段
胶回收结果如图33所示，其中泳道1为片段pS5E4-EGFP，BamHI、XhoI双酶切胶回收，M为15000bp Marker。
7)pS5E4-EGFP胶回收载体与I177L-2A片段、K205Rubiqutin无缝克隆连接与转化
连接体系：pS5E4-EGFP胶回收产物(100ng)，I177L-2A片段(50ng)，K205Rubiqutin片段(50ng)，2×Smealess Cloning Mix 5ul，补水至10ul。反应条件：50℃，40min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
8)质粒的验证
①菌落PCR验证
用引物以EF1α2(jd)-F、HBV(jd)-R为引物，菌落PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶验证，结果如图34所示，其中1-3号为菌落，M为15000bp Marker。
②酶切验证
挑取1、2、3号阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行BmHI、XhoI双酶切验证；酶切结果如图35所示，其中泳道1、2、3为阳性克隆BamHI、XhoI双酶切验证，M为15000bp Marker。酶切结果正确，测序正确，成功构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin，测序正确，其载体图谱如图51所示。
实施例6穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R、pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin与pAd5LCL3重组构建pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin质粒
1、穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R与腺病毒载体质粒pAd5LCL3的同源重组
1)PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切反应体系如下：
A、穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R 3μg；PacI 2μl；buffer cutsmart 4μl；补水至40μl。
B、腺病毒载体质粒pAd5LCL3 3ug；SwaI 2μl；Buffer 3.1 4μl；补水至40μl。
反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活。
取2ul琼脂糖凝胶验证，验证结果如图36所示，其中，泳道1为pAd5LCL3，泳道2为pS5E1-EP402R-IRES-EP153R。
2)酶切产物去磷酸化
反应体系：酶切反应液37.5μl；去磷酸化酶1μl；去磷酸化buffer 5μl；补水至50μl。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活。
3)使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段。
4)取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng纯化后的腺病毒载体共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h。
5)挑取菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行XhoI酶切验证；结果如图37所示，其中泳道1-8为pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R克隆，M：15000bp Marker，从图37可以看出，2、3、8号克隆酶切正确。
6)将2号阳性质粒转化至DH5α感受态，挑取一个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒再次进行XhoI酶切验证，酶切结果如图38所示，由图38可知，其中1号泳道为pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R质粒XhoI酶切，2号泳道为pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R质粒PacI酶切，3号泳道为pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R质粒BamHI酶切，酶切结果正确，成功构建腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R。
2、穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R同源重组获得pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin
1)PacI和I-sceI对穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R进行酶切，酶切反应体系如下：
A、穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin 3μg；PacI 2μl；10×cutsmartbuffer 4μl；补水至40μl。
B、腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R 3ug；I-sceI 2μl；Buffercutsmart 4μl；补水至40μl。
反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活。
2)酶切产物去磷酸化
反应体系：酶切反应液37.5μl；去磷酸化酶1μl；去磷酸化buffer 5μl；补水至50μl。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活。
3)使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段。
4)取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng纯化后的腺病毒载体共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h。
5)挑取6个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行XhoI酶切验证，结果如图39所示，其中泳道1-7为质粒，M为15000Marker，可以看出，1、7号质粒正确。
6)将1号阳性质粒转化至DH5α感受态；挑取1个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒再次进行XhoI酶切验证；酶切结果如图40所示，其中泳道1、2为pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin质粒XhoI酶切，泳道3为pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin质粒BamHI酶切，泳道4为pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin质粒PacI酶切，M为15000Marker，由图40可知，酶切结果正确，成功构建腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin，酶切结果正确，其载体图谱如图52所示。
实施例7重组腺病毒的包装
使用293TD37细胞包装pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin质粒，操作步骤如下所示：
准备293TD37细胞：转染前一天准备细胞，将待转染的293TD37细胞接种到6孔板中，0.5×106/孔，于37℃，5％CO2静置培养24小时，转染当天细胞有40-50％汇合率。
质粒pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin线性化：将待转染的质粒用PacI酶切，于37℃孵育40min后，65℃灭活20min。
转染：用100μl无血清培养基将线性化的2μg质粒和PEI分别稀释；向PEI稀释液中加入质粒稀释液，反复吸取5次或涡旋10秒钟混匀，室温下孵育10分钟后形成转染复合物。孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出细胞培养液，加入新鲜的生长培养基2mL，10分钟后将转染复合物加到换了新鲜培养基的细胞中。
细胞培养：将转染后的293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中静置培养72-96小时；病毒质粒转染72-96小时后收集6孔板细胞悬液于1.5ml离心管中即TP0。
持续接毒：将收集的细胞悬液在-80℃反复冻融3次，4℃、2000g离心10分钟，取上清500μl感染293TD37细胞(293TD37细胞需要提前一天准备)，37℃、5％CO2孵育60分钟，补充2mL的FBS的培养基，37℃、5％CO2培养培养72小时，收集细胞悬液即TP1；重复之前的步骤，收集细胞悬液即TP2。持续接毒直至细胞出现病变。
细胞病变：当293TD37细胞培养从TP0至TP4后，细胞逐渐病变，直至TP4293TD37细胞完全病变。TP0至TP4引起的细胞病变情况分别如图41-45所示，TP4已完全病变。
实施例8非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗滴度的检测
准备293TD37细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，接种6孔板中(5×105活细胞/mL，每孔2ml)，于37℃，5％CO2二氧化碳培养箱中静置培养。24小时后，待细胞贴壁生长成单层细胞，弃去培养基，用无血清DMEM维持液对重组的腺病毒作10-3～10-6倍连续稀释，每个稀释度接种2孔，每孔250uL，感染1小时后，弃上清，补充完全培养基，然后于37℃，5％二氧化碳培养箱中静置培养。24h后，弃上清，用PBS洗细胞，每孔1mL，弃PBS后，每孔加1mL冷甲醛固定，室温10min，弃甲醛，再用PBS冲洗细胞，每孔1mL，加腺病毒抗体-FITC，每孔1ml，室温1h后，再次用PBS冲洗细胞，每孔1mL，两遍后每孔加1mL PBS，荧光显微镜下计数(200倍,10个连续视野)。计算：病毒滴度(FFU/mL)＝平均数×1013×4×10(-n)。pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin病毒的FFU为1.8×108FFU/mL，滴度较高。
实施例9非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin稳定性的检测
准备293TD37细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，将293TD37细胞种入6孔板中(5×105cells/mL，2mL/孔)，室温孵育1小时使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度。用pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin病毒颗粒进行感染，感染的滴度为5MOI/孔。293TD37细胞48小时后发生病变后，收集细胞，反复冻融3次后2000g离心，收集上清，将收集的上清检测FFU，后重新感染新的293TD37细胞，直至30代。将收集的第5、10、15、20、25、30代次的病毒液进行检测，发现病毒的基因组仍然完整，说明复制缺陷型pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin病毒能够在293TD37细胞中稳定包装。
实施例10非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin恢复突变(RCA)的检测
pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin病毒RCA检测，检测方法如下：
1、准备pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin病毒液，并测其病毒滴度，测定病毒颗粒浓度，病毒液加1％Universal nuclease(Universal nuclease 7.5～15units/mL病毒液)消化宿主细胞的DNA，37℃水浴40min。用300Kd的超滤离心管，经1000g，30min离心，1×PBS洗脱收集病毒颗粒，测A260，颗粒浓度＝A260*1.1*10^12VP/mL。
2、病毒感染，准备A549细胞的6孔板，每孔细胞为2.5×105/孔，弃培养基，PBS清洗一次，将腺病毒按照1×109vp/孔接种病毒，感染A549细胞，野生型腺病毒5型为对照，37℃，5％CO2，1h后，弃去病毒液，补足5％完全培养基，37℃，5％CO2培养48h。
3、免疫染色，弃细胞上清，PBS表面冲洗细胞，用冰甲醛固定，放置-20℃，20min，1×PBS清洗三遍，每遍5min，每孔加入2ml 1％BSA-PBS溶液，放置摇床，孵育1h。弃去上清，加入腺病毒5型荧光抗体(1:500稀释)，孵育1h，1×PBS清洗三遍，每遍5min。
用10倍荧光显微镜观察，使用公式计算RCA
RCA＝(average positive cell field)×(374field/well)×(dilutionfactor))/Total VPs in 0.5ml viral sample
判断标准为RCA的水平小于1RCA/3×1010vp。经过统计pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin的RCA的水平小于1RCA/3×1010vp，说明本发明所制备的复制缺陷型pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin病毒在293TD37细胞中能够稳定包装，不会转化为野生型或转化为野生型的几率较低。
实施例11非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin蛋白表达检测
提前一天准备293TD37细胞，置于12孔细胞培养板中，使用非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin病毒感染293TD37细胞，48小时后细胞发生病变，收集全部的1ml细胞，使用PBS洗涤，制样，用于Western Blot检测；使用本公司制备的EP153R鼠多抗血清检测目的蛋白，EP153R鼠多抗血清是由大肠杆菌系统表达的EP153R蛋白免疫小鼠获得。EP153R蛋白的大小为15kda。实验结果如图46所示，泳道1为293TD37细胞感染pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin的样品；可以清晰可见EP153R蛋白有正常表达，由此可见pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin疫苗能够在293细胞中表达目的蛋白。
同时，使用本公司制备的EP153R鼠多抗血清检测目的蛋白，EP153R鼠多抗血清是由大肠杆菌系统表达的EP153R蛋白免疫小鼠获得。EP153R蛋白的大小为15kda。
实施例12非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin在小鼠模型上的免疫学评价
12.1疫苗体液免疫反应检测
20只SPF级小鼠(6-8周龄)，随机分成4组，每组5只。根据表1所示分组情况对小鼠进行pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin免疫。注射方式为：后大腿内侧肌肉注射；注射剂量：100ul。
表1：疫苗免疫检测小鼠分组情况
小鼠于免疫后14天采血，分离血清，使用间接ELISA法检测血清中针对非洲猪瘟目的蛋白EP402R(EP402R蛋白是由本公司在昆虫细胞中制备并免疫小鼠后获得)的IgG抗体滴度。检测结果如图53所示(ns,P≥0.05；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001)：小鼠肌肉注射pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin后，针对EP402R蛋白，能够产生较高浓度的IgG抗体。高剂量组抗体滴度平均值达70000以上，中剂量组的滴度平均值也达50000，与对照组有显著差异。
12.2细胞免疫反应检测
10只SPF级小鼠(6-8周龄)，随机分成2组，每组5只。根据表2所示分组情况对小鼠进行pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin免疫。注射方式为：后大腿内侧肌肉注射；注射剂量：100ul。
表2：疫苗免疫检测小鼠分组情况
免疫后14天处死小鼠，分离脾淋巴细胞，使用穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R和pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin转染的PK15细胞刺激培养6小时，同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。6小时后，阻断Fc受体，对死细胞和细胞表面分子标志物进行染色，细胞经固定和穿孔之后，对细胞内细胞因子进行染色。细胞表面标志物包括CD4、CD8，细胞内细胞因子包括IFNγ、IL2。使用流式细胞仪(CyExpert)分析CD4+T细胞和CD8+T细胞经目的蛋白刺激后表达IFNγ、IL2的水平。
pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin诱导的CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫反应如图54、图55所示，代表性结果如图56至图57所示，其中图56为肌肉注射pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin后细胞免疫反应代表图，图57为空白对照免疫反应代表图。结果表示：小鼠免疫后14天，脾细胞经目的蛋白刺激后，CD8+T细胞，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于Ad5载体对照组(Control)(P<0.05)。CD4+T细胞经过刺激后，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于Ad5载体对照组(Control)(P<0.05)。
12.3小鼠模型免疫原性评价小结
pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin重组腺病毒具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高水平的血清IgG抗体。其中高剂量的1*10^8FFU和中剂量1*10^7FFU的免疫方式诱导的滴度都很高。细胞免疫反应检测结果说明肌肉注射免疫1*10^7FFU的腺病毒载体疫苗，可诱导其免疫的小鼠产生特异性细胞免疫反应。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
<110> 嘉兴安宇生物科技有限公司
<120> 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
<150> 2020106427449
<151> 2020-07-06
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1236
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatcatca tcgtgatctt cctgatgtgc ctgaagatcg tgctgaacaa catcatcatc 60
tggagcaccc tgaaccagac cgtgttcctg aacaacatct tcaccatcaa cgacacctac 120
ggcggcctgt tctggaacac ctactacgac aacaacagaa gcaacttcac ctactgcggc 180
atcgccggca actactgcag ctgctgcggc cacaacatca gcctgtacaa caccaccaac 240
aactgcagcc tgatcatctt ccccaacaac accgagatct tcaacagaac ctacgagctg 300
gtgtacctgg acaagaagat caactacacc gtgaagctgc tgaagagcgt ggacagcccc 360
accatcacct acaactgcac caacagcctg atcacctgca agaacaacaa cggcaccaac 420
gtgaacatct acctgatcat caacaacacc atcgtgaacg acaccaacgg cgacatcctg 480
aactactact ggaacggcaa caacaacttc accgccacct gcatgatcaa caacaccatc 540
agcagcctga acgagaccga gaacatcaac tgcaccaacc ccatcctgaa gtaccagaac 600
tacctgagca ccctgttcta catcatcatc ttcatcgtga gcggcctgat catcggcatc 660
ttcatcagca tcatcagcgt gctgagcatc agaagaaaga gaaagaagca cgtggaggag 720
atcgagagcc caccacccag cgagagcaac gaggaggaca tcagccacga cgacaccacc 780
agcatccacg agccaagccc cagagaacca ctgctgccta agccctacag cagataccag 840
tacaacaccc ccatctacta catgagaccc agcacccagc ccctgaaccc cttccccctg 900
cccaagccat gcccgccacc taaaccatgc cctccaccca agccttgccc gcccccaaag 960
ccatgtccac cacccaaacc ttgctctcca cccaagccgt gtcgtccccc caaaccatgt 1020
cctccaccaa aaccatgtcc tccgccgaag ccatgcccac ctcctaagcc atgccccccc 1080
agcaagccct gccccagccc cgagagctac agccccccca agcccctgcc cagcatcccc 1140
ctgctgccca acatcccccc cctgagcacc cagaacatca gcctgatcca cgtggacaga 1200
atcatctacc catacgacgt cccagactac gcttaa 1236
<210> 2
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttcagca acaagaagta catcggcctg atcaacaaga aggagggcct gaagaagaag 60
atcgacgact acagcatcct gatcatcggc atcctgatcg gcacaaacat cctgtccctg 120
atcatcaaca tcatcggcga gatcaataag cctatctgct accagaacga tgacaagatc 180
ttctactgtc ctaaggactg ggtgggctac aacaatgtgt gctactactt cggcaacgag 240
gagaagaatt acaacaatgc cagcaactac tgtaagcagc tgaatagcac cctgaccaat 300
aataacacaa tcctggtgaa cctgacaaag acactgaacc tgacaaaaac atacaaccac 360
gagagcaatt actgggtgaa ctacagcctg atcaagaacg agagcgtgct gctgagggat 420
tccggctact acaagaagca gaagcacgtg agcctgctgt acatctgtag caagtga 477
<210> 3
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtggaagg tgaacgacca gggcttcctg aacatctccg tgacaggcac caagtttaat 60
ctgatcgcca tcacaggcaa gctgggcttc tacacagacc ctcctagcca cctgatcatc 120
atgcccctga agtttttccc cgtgcacaag ttcagcaaga acgagcctaa taagaagcag 180
aagaggttca tctactttta cccctacgac gtgcccgatt acgcc 225
<210> 4
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggtggagc ccagagagca gttttttcag gatctgctga gcgccgtgga tcagcagatg 60
gacaccgtga agaatgacat caaggatatt atgaaggaga agacatcctt catggtgagc 120
tttgagaatt ttatcgagag atacgataca atggagaaga acatccagga tctgcagaac 180
aagtacgagg agatggccgc caacctgatg accgtgatga ccgacaccaa gatccagctg 240
ggcgccatca tcgcccagct ggagatcctg atgatcaatg gcacacctct gcctgccaag 300
aagacaacca tcaaggaggc catgcccctg cccagctcca ataccaataa cgagcagacc 360
tccccccctg cctccggcaa gacaagcgag acacccaaga agaaccccac caacgccatg 420
ttttttacaa gaagcgagtg ggcctcctcc aataccttta gagagaagtt cctgacacct 480
gagatccagg ccatcctgga tgagcagttt gccaataaga caggcatcga gagactgcac 540
gccgagggcc tgtacatgtg gagaacacag ttcagcgacg agcagaagaa gatggtgaag 600
gagatgatga agaagtaccc ttacgatgtg cccgattacg cc 642
<210> 5
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcagattt tcgtgaaaac ccttacgggg aagaccatca ccctcgaggt tgaaccctcg 60
gatacgatag aaaatgtaaa ggccaagatc caggataagg aaggaattcc tcctgatcag 120
cagagactga tctttgctgg caagcagctg gaagatggac gtactttgtc tgactacaat 180
attcaaaagg agtctactct tcatcttgtg ttgagacttc gtggtggtgc taagaaaagg 240
aagaagaagt cttacaccac tcccaagaag aataagcaca agagaaagaa ggttaagctg 300
gctgtcctga aatattataa ggtggatgag aatggcaaaa ttagtcgcct tcgtcgagag 360
tgcccttctg atgaatgtgg tgctggggtg tttatggcaa gtcactttga cagacattat 420
tgtggcaaat gttgtctgac ttactgtttc aacaaaccag aagacaagta a 471
<210> 6
<211> 32619
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 60
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 120
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 180
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 240
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 300
gcattacgct gacttgacgg gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt 360
gaaggatcag atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt 420
caaaatcacc aactggtcca cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt 480
ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg 540
cagacctcag cgctcaaaga tgcaggggta aaagctaacc gcatctttac cgacaaggca 600
tccggcagtt caacagatcg ggaagggctg gatttgctga ggatgaaggt ggaggaaggt 660
gatgtcattc tggtgaagaa gctcgaccgt cttggccgcg acacgccgac atgatccaac 720
tgataaaaga gtttgatgct cagggtgtag cggttcggtt tattgacgac gggatcagta 780
ccgacggtga tatggggcaa atggtggtca ccatcctgtc ggctgtggca caggctgaac 840
gccggaggat cctagagcgc acgaatgagg gccgacagga agcaaagctg aaaggaatca 900
aatttggccg caggcgtacc gtggacagga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 960
gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 1020
gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 1080
cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 1140
gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat 1200
tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc 1260
aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 1320
tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca 1380
tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgatcgatta attaacgacc catcatcaat 1440
aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt ttgtgacgtg 1500
gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg taggttttag ggcggagtaa cttgtatgtg 1560
ttgggaattg tagttttctt aaaatgggaa gttacgtaac gtgggaaaac ggaagtgacg 1620
atttgaggaa gttgtgggtt ttttggcttt cgtttctggg cgtaggttcg cgtgcggttt 1680
tctgggtgtt ttttgtggac tttaaccgtt acgtcatttt ttagtcctat atatactcgc 1740
tctgcacttg gccctttttt acactgtgac tgattgagct ggtgccgtgt cgagtggtgt 1800
tattaccctg ttatccctag caattgaaaa ataaacacgt tgaaacataa cacaaacgat 1860
tctttattct tgggcaatgt atgaaaaagt gtaagaggat gtggcaaata tttcattaat 1920
gtagttgtgg ccagaccagt cccatgaaaa tgacatagag tatgcacttg gagttgtgtc 1980
tcctgtttcc tgtgtaccgt ttagtgtaat ggttagtgtt acaggtttag ttttgtctcc 2040
gtttaagtaa acttgactga caatgttact tttggcagtt ttaccgtgag attttggata 2100
agctgatagg ttaggcataa atccaacagc gtttgtatag gctgtgcctt cagtaagatc 2160
tccatttcta aagttccaat attctgggtc caggaaggaa ttgtttagta gcactccatt 2220
ttcgtcaaat cttataataa gatgagcact ttgaactgtt ccagatattg gagccaaact 2280
gcctttaaca gccaaaactg aaactgtagc aagtatttga ctgccacatt ttgttaagac 2340
caaagtgagt ttagcatctt tctctgcatt tagtctacag ttaggagatg gagctggtgt 2400
ggtccacaaa gttagcttat cattattttt gtttcctact gtaatggcac ctgtgctgtc 2460
aaaactaagg ccagttccta gtttaggaac catagccttg tttgaatcaa attctaggcc 2520
atggccaatt tttgttttga ggggatttgt gtttggtgca ttaggtgaac caaattcaag 2580
cccatctcct gcattaatgg ctatggctgt agcgtcaaac atcaacccct tggcagtgct 2640
taggttaacc tcaagctttt tggaattgtt tgaagctgta aacaagtaaa ggcctttgtt 2700
gtagttaata tccaagttgt gggctgagtt tataaaaaga gggccctgtc ctagtcttag 2760
atttagttgg ttttgagcat caaacggata actaacatca agtataaggc gtctgttttg 2820
agaatcaatc cttagtcctc ctgctacatt aagttgcata ttgccttgtg aatcaaaacc 2880
caaggctcca gtaactttag tttgcaagga agtattatta atagtcacac ctggaccagt 2940
tgctacggtc aaagtgttta ggtcgtctgt tacatgcaaa ggagccccgt actttagtcc 3000
tagttttcca ttttgtgtat aaatgggctc tttcaagtca atgcccaagc taccagtggc 3060
agtagttaga gggggtgagg cagtgatagt aagggtactg ctatcggtgg tggtgagggg 3120
gcctgatgtt tgcagggcta gctttccttc tgacactgtg aggggtcctt gggtggcaat 3180
gctaagtttg gagtcgtgca cggttagcgg ggcctgtgat tgcatggtga gtgtgttgcc 3240
cgcgaccatt agaggtgcgg cggcagccac agttagggct tctgaggtaa ctgtgagggg 3300
tgcagatatt tccaggttta tgtttgactt ggtttttttg agaggtgggc tcacagtggt 3360
tacattttgg gaggtaaggt tgccggcctc gtccagagag aggccgttgc ccattttgag 3420
cgcaagcatg ccattggagg taactagagg ttcggatagg cgcaaagaga gtaccccagg 3480
gggactctct tgaaacccat tgggggatac aaagggagga gtaagaaaag gcacagttgg 3540
aggaccggtt tccgtgtcat atggatacac ggggttgaag gtatcttcag acggtcttgc 3600
gcgcttcatc tgcaacaaca tgaagatagt gggtgcggat ggacaggaac aggaggaaac 3660
tgacattcca tttagattgt ggagaaagtt tgcagccagg aggaagctgc aataccagag 3720
ctgggaggag ggcaaggagg tgctgctgaa taaactggac agaaatttgc taactgattt 3780
taagtaagtg atgctttatt attttttttt attagttaaa gggaataaga tctttgagac 3840
cgcacagggt cttaataagg gtgcagagat cctcaggtcc ttgacaaggt gagtgaatgc 3900
agccttcggt ttctaccgag tgctgagtta tggtaatggg cttttctccc accatgacca 3960
ccaatttctg acgcttggtt ggcaacttgt agctaaggcg gtgtccggtg gtattactgt 4020
cgtaggtgac tttggcctgc tttaccagac aaaagatacc ccttttgcac tggtgcaagt 4080
taaccatgtc ttggagctct tgattcatgc gctgttgctc ggccgctgcc ctgcgtcttt 4140
ctagcaggcg ctgctctgta ataattccgt ccatttctag ctagagaaac ctgaattaga 4200
atagcccgta gagttgcttg aattgttcat aaaccccaca gtagctgcgc ctttggccta 4260
ataccctaag ggttttctaa gctcacctcc tgttctggta aacagagtta ttgaggtctg 4320
tccggaaaaa gtctggttta cggtcaggcg gtaggtgtgg tgcagcggcc ggtgacgcac 4380
tcgtacgttc ccggcaggta aggagggtgg tgttttttct gatggagtag ctgagctcgg 4440
agaggttctc tcgtagactc actccgtctg ggttgaaact gttgtaaatc acagagggag 4500
agatgttaaa agtaccaggt aaggttcgcc ttggtttgct tgggcgggtg aagacggtgg 4560
cgtttacagg atggcgatag gagccccagt atattttaat ttctgtattt attatactca 4620
gcacagagat ggcaacaaag atcttgatgt aatccagggt taggacagtt gcaaatcaca 4680
gtgagaacac agggtcccct gtcccgctca actagcaggg ggcgctgggt aaactcccga 4740
atcaggctac gggcaagctc tccctgggcg gtaagccgga cgccgtgcgc cgggccctcg 4800
atatgatcct cgggcaattc aaagtagcaa aactcaccgg agtcgcgggc aaagcacttg 4860
tggcggcgac agtggaccag gtgtttcagg cgcagttgct ctgcctctcc acttaacatt 4920
cagtcgtagc cgtccgccga gtcctttacc gcgtcaaagt taggaataaa ttgatccgga 4980
tagtggccgg gaggtcccga gaaggggtta aagtagaccg atggcacaaa ctcctcaata 5040
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attgcctgac gaggcgtgaa tgaagagcgg ccggcgccgc cgatctgaaa tgtcccgtcc 5160
ggacggagac caagcgagga gctcaccgac tcgtcgttga gctgaatacc tcgccctctg 5220
attgtcaggt gagttatacc ctgcccgggc gaccgcaccc tgtgacgaaa gccgcccgca 5280
agctgcgccc ctgagttagt catctgaact tcggcctggg cgtctctggg aagtaccaca 5340
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ttattacgag gtgtggtggt aatagccgcc tgttccagga gaattcggtt tcggtgggcg 5460
cgtattccgt tgacccggga tatcatgtgg ggtcccgcgc tcatgtagtt tattcgggtt 5520
gagtagtctt gggcagctcc agccgcaagt cccatttgtg gctggtaact ccacatgtag 5580
ggcgtgggaa tttccttgct cataatggcg ctgacaacag gtgctggcgc cgggtgtggc 5640
cgctggagat gacgtagttt tcgcgcttaa atttgagaaa gggcgcgaaa ctagtcctta 5700
agagtcagcg cgcagtattt actgaagaga gcctccgcgt cttccagcgt gcgccgaagc 5760
tgatcttcgc ttttgtgata caggcagctg cgggtgaggg atcgcagaga cctgtttttt 5820
attttcagct cttgttcttg gcccctgctc tgttgaaata tagcatacag agtgggaaaa 5880
atcctgtttc taagctcgcg ggtcgatacg ggttcgttgg gcgccagacg cagcgctcct 5940
cctcctgctg ctgccgccgc tgtggatttc ttgggctttg tcagagtctt gctatccggt 6000
cgcctttgct tctgtgtggc cgctgctgtt gctgccgctg ccgccggtgc agtatgggct 6060
gtagagatga cggtagtaat gcaggatgtt acgggggaag gccacgccgt gatggtagag 6120
aagaaagcgg cgggcgaagg agatgttgcc cccacagtct tgcaagcaag caactatggc 6180
gttcttgtgc ccgcgccatg agcggtagcc ttggcgctgt tgttgctctt gggctaacgg 6240
cggcggctgc ttggacttac cggccctggt tccagtggtg tcccatctac ggttgggtcg 6300
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tgccgatttc tggggcgccg gcgaggggaa tgcgaccgag ggtgacggtg tttcgtctga 6420
cacctcttcg acctcggaag cttcctcgtc taggctctcc cagtcttcca tcatgtcctc 6480
ctcctcctcg tccaaaacct cctctgcctg actgtcccag tattcctcct cgtccgtggg 6540
tggcggcggc agctgcagct tctttttggg tgccatcctg ggaagcaagg gcccgcggct 6600
gctgctgata gggctgcggc ggcgggggga ttgggttgag ctcctcgccg gactgggggt 6660
ccaagtaaac cccccgtccc tttcgtagca gaaactcttg gcgggctttg ttgatggctt 6720
gcaattggcc aagaatgtgg ccctgggtaa tgacgcaggc ggtaagctcc gcattaggcg 6780
ggcgggattg gtcttcgtag aacctaatct cgtgggcgtg gtagtcctca ggtacaaatt 6840
tgcgaaggta agccgacgtc cacagccccg gagtgagttt caaccccgga gccgcggact 6900
tttcgtcagg cgagggaccc tgcagctcaa aggtaccgat aatttgactt tcgttaagca 6960
gctgcgaatt gcaaaccagg gagcggtgcg gggtgcatag gttgcagcga cagtgacact 7020
ccagtagacc gtcaccgctc acgtcttcca ttatgtcaga gtggtaggca aggtagttgg 7080
ctagctgcag aaggtagcag tggccccaaa gcggcggagg gcattcgcgg tacttaatgg 7140
gcacaaagtc gctaggaagt gcacagcagg tggcgggcaa gattcctgag cgctctagga 7200
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gggttttaag caggcgttcg gggaaaatga tgtccgccag gtgcgcggcc acggagcgct 7320
cgttgaaggc cgtccatagg tccttcaagt tttgctttag cagtttctgc agctccttga 7380
ggttgcactc ctccaagcac tgctgccaaa cgcccatggc cgtctgccag gtgtagcata 7440
gaaataagta aacgcagtcg cggacgtagt cgcggcgcgc ctcgcccttg agcgtggaat 7500
gaagcacgtt ttgcccaagg cggttttcgt gcaaaattcc aaggtaggag accaggttgc 7560
agagctccac gttggagatc ttgcaggcct ggcgtacgta gccctgtcga aaggtgtagt 7620
gcaatgtttc ctctagcttg cgctgcatct ccgggtcagc aaagaaccgc tgcatgcact 7680
caagctccac ggtaacgagc actgcggcca tcattagttt gcgtcgctcc tccaagtcgg 7740
caggctcgcg cgtttgaagc cagcgcgcta gctgctcgtc gccaactgcg ggtaggccct 7800
cctctgtttg ttcttgcaaa tttgcatccc tctccagggg ctgcgcacgg cgcacgatca 7860
gctcactcat gactgtgctc atgaccttgg ggggtaggtt aagtgccggg taggcaaagt 7920
gggtgacctc gatgctgcgt tttagtacgg ctaggcgcgc gttgtcaccc tcgagttcca 7980
ccaacactcc agagtgactt tcattttcgc tgttttcctg ttgcagagcg tttgccgcgc 8040
gcttctcgtc gcgtccaaga ccctcaaaga tttttggcac ttcgttgagc gaggcgatat 8100
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ggcaggatag gggtatcttg cagttttgga aaaagatgtg ataggtggca agcacctctg 8220
gcacggcaaa tacggggtag aagttgaggc gcgggttggg ctcgcatgtg ccgttttctt 8280
ggcgtttggg gggtacgcgc ggtgagaata ggtggcgttc gtaggcaagg ctgacatccg 8340
ctatggcgag gggcacatcg ctgcgctctt gcaacgcgtc gcagataatg gcgcactggc 8400
gctgcagatg cttcaacagc acgtcgtctc ccacatctag gtagtcgcca tgcctttcgt 8460
ccccccgccc gacttgttcc tcgtttgcct ctgcgttgtc ctggtcttgc tttttatcct 8520
ctgttggtac tgagcggtcc tcgtcgtctt cgcttacaaa acctgggtcc tgctcgataa 8580
tcacttcctc ctcctcaagc gggggtgcct cgacggggaa ggtggtaggc gcgttggcgg 8640
catcggtgga ggcggtggtg gcgaactcag agggggcggt taggctgtcc ttcttctcga 8700
ctgactccat gatctttttc tgcctatagg agaaggaaac ttgtatgtgt tgggaattgt 8760
agttttctta aaatgggaag ttacgtaacg tgggaaaacg gaagtgacga tttgaggaag 8820
ttgtgggttt tttggctttc gtttctgggc gtaggttcgc gtgcggtttt ctgggtgttt 8880
tttgtggact ttaaccgtta cgtcattttt tagtcctata tatactcgct ctgcacttgg 8940
ccctttttta cactgtgact gattgagctg gtgccgtgtc gagtggtgtt tttttaatag 9000
gttttctttt ttactggtaa ggctgactgt tatgactacg tccggcgttc catttggcat 9060
gacactacga ccaacacgat ctcggttgtc tcggcgcact ccgtacagta gggatcgtct 9120
acctcctttt gagacagaaa cccgcgctac catactggag gatcatccgc tgctgcccga 9180
atgtaacact ttgacaatgc acaacgtgag ttacgtgcga ggtcttccct gcagtgtggg 9240
atttacgctg attcaggaat gggttgttcc ctgggatatg gttctaacgc gggaggagct 9300
tgtaatcctg aggaagtgta tgcacgtgtg cctgtgttgt gccaacattg atatcatgac 9360
gagcatgatg atccatggtt acgagtcctg ggctctccac tgtcattgtt ccagtcccgg 9420
ttccctgcag tgtatagccg gcgggcaggt tttggccagc tggtttagga tggtggtgga 9480
tggcgccatg tttaatcaga ggtttatatg gtaccgggag gtggtgaatt acaacatgcc 9540
aaaagaggta atgtttatgt ccagcgtgtt tatgaggggt cgccacttaa tctacctgcg 9600
cttgtggtat gatggccacg tgggttctgt ggtccccgcc atgagctttg gatacagcgc 9660
cttgcactgt gggattttga acaatattgt ggtgctgtgc tgcagttact gtgctgattt 9720
aagtgagatc agggtgcgct gctgtgcccg gaggacaagg cgccttatgc tgcgggcggt 9780
gcgaatcatc gctgaggaga ccactgccat gttgtattcc tgcaggacgg agcggcggcg 9840
gcagcagttt attcgcgcgc tgctgcagca ccaccgccct atcctgatgc acgattatga 9900
ctctaccccc atgtagacta gggttctgtg agtttgatta aggtacggtg atctgtataa 9960
gctatgtggt ggtggggcta tactactgaa tgaaaaatga cttgaaattt tctgcaattg 10020
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aaataatcac ccgagagtgt acaaataaaa gcatttgcct ttattgaaag tgtctctagt 10140
acattatttt tacatgtttt tcaagtgaca aaaagaagtg gcgctcctaa tctgcgcact 10200
gtggctgcgg aagtagggcg agtggcgctc caggaagctg tagagctgtt cctggttgcg 10260
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gttcatggtg gggttgtgat ccatgggagt ttggggccag ttggcaaagg cgtggagaaa 10380
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cgccaaaggg tgcgatcgca aagaaacttt ttctgggtaa tgctgtcaac tgcggtcttg 11100
cctataagcg gataggggaa gttagcaggg taggcctgtc cttcgcgcat ggtgggggca 11160
aggtagccaa caaatccaga gttgttgtgt tggtgtagga tgcccacctg ttggtagtcc 11220
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tacatgcggt ccttgtagct ctctgggata tagaagccct ggtagccaat gttatagtta 11340
gctagcattt gtaccaggaa ccagtctttg gtcatgttac actgggcaac gttgtaaccc 11400
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ggccagctga cagaagagtc aaaggtaatg gccaccttct taaaggtgtg gttgaggtaa 11520
aaggttccat ctaggtaggg tatagagcca gagtaggtgt aataagggtc gtagcccgag 11580
cccagtgatg gggtttcctt agtcttaagg cgcgtgaagg cccagccgcg gaaagccgcc 11640
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gctggcgacg gcgacggcgg cggcgggttc cagtggtggt tcggcgtcgg gtagttgctc 15000
gtcttctggg gcggtaggtg tagccacgat agccgggggt aggcgcaatg gaaggatgta 15060
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ggggggctga aacgcgaaac atccacgggt ccgtttgcac ctccgtagag gtcttggacg 15180
cggccgcagc gaccgcctgc accgcggcat ccgccaccgc tgaggcaacc ggggacgttt 15240
gtgtctccat gccctctgtg gcggtggcaa tactggtgct actggtagtg ggtatctgaa 15300
cgtccacggt ctgcacgccc agtcccggcg ccacctgctt gattggccgc acgcggacct 15360
cgggctccag cccaggttcc acggtcattt tttccaagac atcttccagt cgctggcgct 15420
tgggtaccat cagctgcacg gtgggtgcca agtcaccaga ctcgcgcttt aggccgcgct 15480
tttcttcgga cggtgcaagc gcgggcagca cctgctgcag tgttacgggc tttaggctag 15540
gtgttgggtt gccctcgtcc agcggcaacg ccagcatgtc cttatgccgc tttccgtagg 15600
caaactcccc gaggcgctcg ttggcctgct caagcaggtc ctcgtcgccg tacacctcat 15660
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cgggtcgcaa aacacgtttt acgcgtcgac ctttccactg tacccgtcgc ctgggcgcgg 15780
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tctagttgcg cggggggcgg gtgcgcacgg gcacgcgcag gccgctaacc gagtcgcgca 16080
cccaatacac gttgcccctg cgaccctgag tcatagcact aatggccgcg gctgctgcgg 16140
cggccgctcg tcgcctggac ctggggggca cagtgacaat acccgcggcc agccttcgag 16200
cggcccgcat ggccgcccgt cggccggtgc gacgtgcgcg gttaagcagg gccgccgccg 16260
cgcgttgggc ggcagtgccg ggtcggcggc ggtggcgacg tgctacgcgc ctccgccgtc 16320
tcttcatttt agcatagcgc cgggctccgc gcaccacggt ctgaatggcc gcgtccactg 16380
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tcttggagtg cacgggcaac agctcggcgc ccaccaccgg aaagttgctg atctggcgcg 16980
tggagcggaa ggtcacgggg tcttgcatca tgtctggcaa cgaccagtag acctgctccg 17040
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cgccgtagtt gtatgcaagg taccagctgc ggtactgggt gaaggtgctg tcattgctta 17160
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tgatcctaaa gccctcctgg aagggttgcc gcttgcggat gcccaacaag ttgctcaggc 17580
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tgcgggtgtc aaactttacc ccgatgtcgc tttccagaac cccgttctgt ctgcccactt 17760
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tgccctcggg cagcgtgaac tccacccact cgtatttcag ctccacctga ttgtccttag 17880
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tgtccaccag gtacacacgg gtggtgtcga ataggggtgc caactcagag taacggatgc 18180
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cgcgcggcca gtggccaaaa aagctagcgc agcagccgcc gcgcctggaa ggaagccaaa 21720
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ggtggttgac ggcgggatat aacatgagct gtcttcggta tcgtcgtatc ccactaccga 29640
gatatccgca ccaacgcgca gcccggactc ggtaatggcg cgcattgcgc ccagcgccat 29700
ctgatcgttg gcaaccagca tcgcagtggg aacgatgccc tcattcagca tttgcatggt 29760
ttgttgaaaa ccggacatgg cactccagtc gccttcccgt tccgctatcg gctgaatttg 29820
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tgggcccgct aacagcgcga tttgctggtg acccaatgcg accagatgct ccacgcccag 29940
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ttccgtgtat tctatagtgt cacctaaatc gtatgtgtat gatacataag gttatgtatt 30600
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gctgaggtct gcctcgtgaa gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat 31800
catccagcca gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt 31860
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atctctgatg ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg 32040
cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct 32100
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gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc 32340
ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc caggtattag 32400
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aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 32580
atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcata 32619
<210> 7
<211> 38677
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 60
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 120
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tatcctctgt tggtactgag cggtcctcgt cgtcttcgct tacaaaacct gggtcctgct 10920
cgataatcac ttcctcctcc tcaagcgggg gtgcctcgac ggggaaggtg gtaggcgcgt 10980
tggcggcatc ggtggaggcg gtggtggcga actcagaggg ggcggttagg ctgtccttct 11040
tctcgactga ctccatgatc tttttctgcc tataggagaa ggaaacttgt atgtgttggg 11100
aattgtagtt ttcttaaaat gggaagttac gtaacgtggg aaaacggaag tgacgatttg 11160
aggaagttgt gggttttttg gctttcgttt ctgggcgtag gttcgcgtgc ggttttctgg 11220
gtgttttttg tggactttaa ccgttacgtc attttttagt cctatatata ctcgctctgc 11280
acttggccct tttttacact gtgactgatt gagctggtgc cgtgtcgagt ggtgtttttt 11340
taataggttt tcttttttac tggtaaggct gactgttatg actacgtccg gcgttccatt 11400
tggcatgaca ctacgaccaa cacgatctcg gttgtctcgg cgcactccgt acagtaggga 11460
tcgtctacct ccttttgaga cagaaacccg cgctaccata ctggaggatc atccgctgct 11520
gcccgaatgt aacactttga caatgcacaa cgtgagttac gtgcgaggtc ttccctgcag 11580
tgtgggattt acgctgattc aggaatgggt tgttccctgg gatatggttc taacgcggga 11640
ggagcttgta atcctgagga agtgtatgca cgtgtgcctg tgttgtgcca acattgatat 11700
catgacgagc atgatgatcc atggttacga gtcctgggct ctccactgtc attgttccag 11760
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ggtggatggc gccatgttta atcagaggtt tatatggtac cgggaggtgg tgaattacaa 11880
catgccaaaa gaggtaatgt ttatgtccag cgtgtttatg aggggtcgcc acttaatcta 11940
cctgcgcttg tggtatgatg gccacgtggg ttctgtggtc cccgccatga gctttggata 12000
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tgatttaagt gagatcaggg tgcgctgctg tgcccggagg acaaggcgcc ttatgctgcg 12120
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ttatgactct acccccatgt agactagggt tctgtgagtt tgattaaggt acggtgatct 12300
gtataagcta tgtggtggtg gggctatact actgaatgaa aaatgacttg aaattttctg 12360
caattgaaaa ataaacacgt tgaaacataa cacaaacgat acggcgcaga cggcaagggt 12420
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cgcactgtgg ctgcggaagt agggcgagtg gcgctccagg aagctgtaga gctgttcctg 12600
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gagaaacatg cagcagaata gtccacaggc ggccgagttg ggcccctgta cgctttgggt 12780
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tagagcatgt tggcggcgga gagatagtcg ttaaaggact ggtcgttggt gtcgtttcta 14100
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actcttattt catttttatc tgaaaattct gtagcatctt tttcccatcc attttcctga 14700
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tgatccttca actcagcaaa agttcgattt attcaacaaa gccacgttgt gtctcaaaat 38040
ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct 38100
tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg 38160
aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat 38220
aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 38280
ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga 38340
ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct 38400
gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa 38460
gaatatcctg attcaggtga aaatattgct gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg 38520
cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag 38580
gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat 38640
ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcata 38677
<210> 8
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcgtttgtg ttatgtttca acgtgtttat ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt 60
ttcattcagt agtatagccc caccaccaca tagcttatac agatcaccgt accttaatca 120
aactcacaga accctagtct acatgggggt agagtcataa tcgtgcatca ggatagggcg 180
gtggtgctgc agcagcgcgc gaataaactg ctgccgccgc cgctccgtcc tgcaggaata 240
caacatggca gtggtctcct cagcgatgat tcgcaccgcc cgcagcataa ggcgccttgt 300
cctccgggca cagcagcgca ccctgatctc acttaaatca gcacagtaac tgcagcacag 360
caccacaata ttgttcaaaa tcccacagtg caaggcgctg tatccaaagc tcatggcggg 420
gaccacagaa cccacgtggc catcatacca caagcgcagg tagattaagt ggcgacccct 480
cataaacacg ctggacataa acattacctc ttttggcatg ttgtaattca ccacctcccg 540
gtaccatata aacctctgat taaacatggc gccatccacc accatcctaa accagctggc 600
caaaacctgc ccgccggcta tacactgcag ggaaccggga ctggaacaat gacagtggag 660
agcccaggac tcgtaaccat ggatcatcat gctcgtcatg atatcaatgt tggcacaaca 720
caggcacacg tgcatacact tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta gaaccatatc 780
ccagggaaca acccattcct gaatcagcgt aaatcccaca ctgcagggaa gacctcgcac 840
gtaactcacg ttgtgcattg tcaaagtgtt acattcgggc agcagcggat gatcctccag 900
tatggtagcg cgggtttctg tctcaaaagg aggtagacga tccctactgt acggagtgcg 960
ccgagacaac cgagatcgtg ttggtcgtag tgtcatgcca aatggaacgc cggacgtagt 1020
cat 1023
<210> 9
<211> 644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggactataag gatgatgacg acaaataata gcaattcctc gacgactgca tagggttacc 60
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 120
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 180
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 240
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 300
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 360
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 420
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 480
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 540
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 600
gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatggccac aacc 644
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 11
<211> 2796
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaattccgtg tattctatag tgtcacctaa atcgtatgtg tatgatacat aaggttatgt 60
attaattgta gccgcgttct aacgacaata tgtacaagcc taattgtgta gcatctggct 120
tactgaagca gaccctatca tctctctcgt aaactgccgt cagagtcggt ttggttggac 180
gaaccttctg agtttctggt aacgccgttc cgcaccccgg aaatggtcag cgaaccaatc 240
agcagggtca tcgctagcca gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc 300
gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct 360
cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc 420
gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac 480
ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga 540
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 600
cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 660
aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcattcacc gtcatcaccg 720
aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 780
ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 840
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 900
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 960
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 1020
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 1080
gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 1140
ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 1200
gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 1260
cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 1320
cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 1380
acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 1440
caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 1500
taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 1560
ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 1620
aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 1680
agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 1740
atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 1800
tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 1860
tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 1920
gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 1980
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 2040
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 2100
ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 2160
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 2220
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 2280
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 2340
agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 2400
taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 2460
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 2520
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 2580
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 2640
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 2700
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 2760
gttggccgat tcattaatgc agctggctta tcgaaa 2796
<210> 12
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaattca aaattttatc 120
gtactagtgg atctgcgatc gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac 180
agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg 240
cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg 300
agaaccgtat ataagtgcag tagctcccta tcagtgatag agatctccct atcagtgata 360
gagattcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac agctgaagct 420
tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg 480
ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt 540
ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct 600
acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac tctacgtctt 660
tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc ctacggatcc 720
gccaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 780
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 840
acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 900
cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 960
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 1020
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 1080
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 1140
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 1200
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 1260
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 1320
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 1380
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 1440
aagtaactcg agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgat aatcatctct 1500
tgtacatgtc ccactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcatggac 1560
attgaccctt ataaagaatt tggagctact gtggagttac tctcgttttt gccttctgac 1620
ttctttcctt ccgtcagaga tctcctagac accgcctcag ctctgtatcg agaagcctta 1680
gagtctcctc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc ta 1722
<210> 13
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca aaatttaagc 60
tacaacaagg caaggcttga ccgacaattg catgaagaat ctgcttaggg ttaggcgttt 120
tgcgctgctt cgcgatgtac gggccagata tacgcgttga cattgattat tgactagtta 180
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 240
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 300
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 360
ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 420
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 480
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 540
gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 600
aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 660
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 720
ggaggtctat ataagcagag ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat 780
cgaaattaat acgactcact atagggagac ccaagctggc tagcgtttaa acttaagctt 840
ggtaccgagc tcggatccac tagtccagtg tggtggaatt ctgcagatat ccagcacagt 900
ggcggccgct cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcacttcgc ccacccc 957
<210> 14
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
tatcatgtct gtataccgtc gacctct 147

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；
所述四种抗原基因分别为EP402R、EP153R、I177L和K205Rubiqutin，其中K205Rubiqutin是在K205R上添加分子佐剂ubiqutin获得，EP402R和EP153R表达在E1区，I177L和K205Rubiqutin表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin；
其中，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin需通过由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞实现重组腺病毒包装，293TD37细胞的细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心；
其中，EP402R、EP153R、I177L、K205R、ubiqutin、pAd5LCL3的核苷酸序列如序列表中SeqID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示；
所述四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.7所示。
2.一种权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5；
2）再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5的E4基因，使用PCR扩增并引入I-sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5△E4；
3）利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5△E4的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3；
4）构建腺病毒E1区域穿梭质粒pS5E1，通过DNA连接酶分别与EP402R、IRES、EP153R基因片段连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R；
5）构建腺病毒E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP，I177L、2A、K205Rubiqutin基因通过融合PCR技术得到I177L-2A-K205Rubiqutin基因片段，通过对穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP，并通过DNA连接酶与I177L-2A-K205Rubiqutin连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin；
6）将穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，得到腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R；
7）将穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R同源重组，获得四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin，pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.7所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的腺病毒环状载体质粒来源于在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用HirtVirual DNAExtract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构建成环状的腺病毒环状载体质粒。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3）所述的ORF6/7表达框基因的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.8所示；步骤4）所述的IRES的核苷酸序列如序列表中Seq IDNO.9所示；步骤5）所述的2A的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.10所示。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4）所述的穿梭质粒pS5E1骨架采用pucorigin、amp基本元素，Ad5左臂ITR部分序列，右臂PIX、PIVa2部分序列，以及CMV-MCS SV40early polyA；步骤5）所述的E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP的骨架采用puc origin、amp基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列，右臂部分fiber基因序列，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因；其中puc origin、amp基本元素的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.11所示，EF1α-EGFP-HBV polyA基因的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.12所示。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤6）穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，是通过PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1-EP402R-IRES-EP153R和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGAUltra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤7）穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R同源重组，是通过PacI和I-sceI对穿梭质粒pS5E4-I177L-2A-K205Rubiqutin和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-EP402R-IRES-EP153R进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
8.一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；转染由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞，收集细胞悬液。
9.根据权利要求8所述的一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，由以下步骤制得：
1）将pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin共表达重组腺病毒载体用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；使用PEI转染试剂转染293TD37细胞；
2）转染后的293TD37细胞于37℃，5%CO2培养箱中培养72-96小时后收集细胞悬液，即为TP0代腺病毒；
3）TP0代腺病毒感染293TD37细胞于37℃，5%CO2培养箱中培养72小时，收集细胞悬液即TP1代腺病毒；
4）重复3），收集细胞悬液即TP2代腺病毒；
5）持续接毒直至TP4代腺病毒。
10. 293TD37细胞用于包装非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的用途，其特征在于，所述四种抗原基因分别为EP402R、EP153R、I177L和K205ubiqutin，其中EP402R和EP153R表达在E1区，I177L和K205ubiqutin表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin；所述四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-EP402R-EP153R-I177L-K205Rubiqutin的核苷酸序列如序列表中Seq ID NO.7所示；
其中，所述293TD37细胞是由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的，细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
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Non-Patent Citations (1)

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Title
Subunit Vaccine Approaches for African Swine Fever Virus;Natasha N. Gaudreault;Vaccines;第7卷(第2期);全文 *

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