CN117417905A - 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种减毒非洲猪瘟病毒毒株，其相对于野生型II型非洲猪瘟病毒在基因组中缺失以下基因片段：CD2V和I177L基因片段。

Description

一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用
本案是申请日为2022年07月13日、申请号为202210821261.4、发明名称为“一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请属于生物制品技术领域，具体涉及一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用，尤其涉及一种同时缺失CD2v和I177L基因部分片段的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和在疫苗制备中的应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)是非洲病毒科中唯一的非洲病毒属，也是目前唯一的DNA虫媒病毒属。该病毒主要靠口或鼻腔直接接触感染，同时拥有多个循环传播方式，主要存在于血液、组织液、内脏、分泌物和排泄物中，具有感染率高，传播迅速，致死率高等特点，对全球养猪业造成了巨大经济损失。
针对病毒预防的最主要方法是疫苗接种。然而对于非洲猪瘟病毒，市场上还没有可用的疫苗产品，虽然已经尝试开发了非洲猪瘟病毒灭活疫苗、减毒活疫苗及基因工程疫苗等，但经过效果评价后，均未获得预期的免疫效果。其中灭活疫苗无法使动物体内产生中和抗体，因此不能产生抵抗强毒攻击的免疫力；减毒活疫苗免疫副作用多且易引起多重感染等问题，存在一定的生物安全隐患；通过基因工程制备的DNA疫苗可使动物获得一定的免疫保护，但并未检测到相应抗体，推测可能为细胞免疫占主导地位。
研究表明，在非洲猪瘟病毒编码的蛋白成分中，很多具有免疫抑制特性，例如已经明确的与免疫抑制有关的基因主要为CD2V、MGF、I177L和9GL等。因此，目前针对非洲猪瘟病毒疫苗的研究主要集中在利用这些免疫抑制基因缺失的毒株作为疫苗株制备疫苗。其中研究较多的为CD2v和MGF基因缺失株，然而CD2V缺失对毒株的毒力影响有限(几乎没有影响)，MGF基因缺失后不同剂量的研究会引起接种猪体温变化，并且会与非洲猪瘟流行毒株发生重组而返回毒性。专利文献CN110551695A(以下称文献1)已公开一种CD2v和MGF基因(MGF360-12L、MGF-13L和MGF-14L)同时缺失的减毒疫苗株，其毒力减弱主要是MGF-360基因缺失导致的，并且可表现出良好的免疫保护作用。然而，利用该文献1公开的基因缺失疫苗株接种仔猪后，仔猪虽然未显示异常不良反应，但会导致仔猪在接种后第2～3天出现短暂的体温升高，最高体温能达到41.3℃，有潜在的安全性问题。
另一方面由于MGF基因属于多基因家族，其中的重复序列很容易通过自身突变和同源重组缺失或回补缺失部位而导致毒力返强，并且MGF360-12L、MGF-13L和MGF-14L附近及本身就是一个比较容易重组的片段，现有研究也表明：该病毒的野生毒株在传代细胞上进行传代培养导致的缺失位点、或在自然界中直接分离到的自然缺失株所缺失的位点基本上都在这几个MGF基因附近，例如参见Chapman DA,Tcherepanov V,Upton C,DixonLK.2008.Comparison of the genome sequences of non-pathogenic andpathogenicAfrican swine fever virus isolates.J GenVirol 89:397–408；de laVegaI,Vinuela E,Blasco R.1990.Genetic variation and multigene families inAfricanswine fever virus.Virology 179:234-246；Krug PW,Holinka LG,O’Donnell V,ReeseB,Sanford B,FernandezSainz I,Gladue DP,Arzt J,Rodriguez L,Risatti GR,BorcaMV.2015.The progressive adaptation ofa Georgian isolate ofAfrican swine fevervirus to Vero cells leads to a gradual attenuation ofvirulence in swinecorresponding to major modifications of the viral genome.J Virol 89:2324-2332.)。因此，MGF360-12L、MGF-13L和MGF-14L等MGF基因片段的这种极易发生自身突变和同源重组缺失或回补缺失部位的现象，极有可能会造成由上述文献1公开的缺失CD2v和MGF360(12L,13L,14L)基因的疫苗株制备的减毒活疫苗面临潜在的毒力返强安全风险。
发明内容
鉴于上述背景，本申请希望提供一种毒力强且稳定性好的减毒非洲猪瘟病毒毒株。具体来说，本申请涉及如下内容：
1、一种减毒非洲猪瘟病毒毒株，其相对于野生型II型非洲猪瘟病毒在基因组中缺失以下基因片段：CD2V和I177L基因片段；
优选缺失序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的CD2V基因片段、以及缺失序列与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的I177L基因片段；
更优选缺失序列如SEQ ID NO:1所示的CD2V基因片段、以及序列如SEQ ID NO:2所示的I177L基因片段。
2、根据项1所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株，其中所述野生型II型非洲猪瘟病毒为选自下组的任一项：ASFV-SY18、Georgia 2008/1、Pig/HLJ/2018、Georgia 2007/1、ASFVGZ2018、ASFVAnhui 2018、ASFV GD 2019、ASFV InnerMongolia 2019。
3、根据项1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法，其包括以下步骤：通过基因工程手段使野生型II型非洲猪瘟病毒的CD2V和I177L基因片段缺失。
4、根据项3所述的构建方法，其中所述基因工程手段为同源重组技术，其具体包括以下步骤：
利用同源重组将包含有CD2V基因的左右同源臂的同源重组转移载体和包含有I177L基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体转染所述野生型II型非洲猪瘟病毒；
筛选同时缺失CD2V基因和I177L基因的减毒非洲猪瘟病毒毒株。
5、根据项4所述的构建方法，其中，所述方法包括以下步骤：S1)将CD2V基因的左右同源臂和第一筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第一同源重组转移载体；
S2)将I177L基因片段的左右同源臂和第二筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第二同源重组转移载体；
S3)将步骤S1)的第一同源重组转移载体用转染试剂转染至使用所述亲本II型非洲猪瘟病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒筛选获得缺失CD2V基因的第一重组病毒；
S4)将步骤S2)的第二同源重组转移载体用转染试剂转染至使用步骤S3)获得的第一重组病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒和第二筛选表达盒筛选获得同时缺失CD2V基因和I177L基因的第二重组病毒，作为减毒非洲猪瘟病毒毒株。
6、根据项5所述的构建方法，其中所述第一筛选表达盒和所述第二筛选表达盒为不同的筛选表达盒，且选自mCherry和EGFP表达盒的任一项。
7、根据项1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的用于制备非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的用途。
8、一种非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其由项1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株制备获得。
9、根据项8所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其中的减毒非洲猪瘟病毒的病毒含量≥107.0TCID50/ml。
10、根据项8或9所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
T1)将项1或2所述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株接种原代细胞，扩大培养，收获病毒液；
T2)以病毒含量≥107.0TCID50/ml的病毒液直接或配合佐剂制成疫苗。
11、根据项10所述的制备方法，其中所述佐剂选自下组的一项或多项：铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂和聚集体结构佐剂，优选选自下组的一项或多项：白介素或干扰素。
本申请的技术方案实现的有益技术效果
本申请通过细致研究得出下述结论：专利文献CN113122511B(以下称文献2)已公开一种I177L、CD2v和MGF基因(MGF360-12L、MGF-13L和MGF-14L)同时缺失的减毒疫苗株，其毒力减弱主要是MGF-360基因缺失和I177L基因缺失导致的，且表现出良好的免疫保护作用。然而，MGF基因为多基因家族，本身具有自身复制插入的特点，缺失后可能出现因基因家族中其他基因复制插入而导致缺失基因回补的情况，基因缺失的稳定性较差。其次，据本申请的研究表明，MGF360基因可抑制宿主产生细胞因子，缺失后可能导致被接种动物出现免疫过激或细胞因子风暴，使接种动物因过激的免疫反应而造成器官的伤害。基于以上技术方案提供的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株在CD2v基因缺失的基础上，还缺失了I177L基因部分片段，获得一种相对于野生毒株显著减毒(I177L基因部分片段缺失的减毒效果)、能够高效稳定增殖且病毒滴度较高、保持较高的毒力和免疫原性、种毒稳定性好、并可以区别于野生毒株(利用CD2v基因的缺失)的非洲猪瘟病毒毒株(rASFV GZ2018ΔCD2v/I177L)。经试验证明，利用本申请提供的rASFV GZ2018ΔCD2v/I177L毒株对实验猪进行接种后，按照低剂量(103.0TCID50/头)接种和高剂量(105.0TCID50/头)接种实验猪，均不会出现实验猪体温明显升高(不超过40.3℃)、发病或死亡现象，表现出与文献2公开的基因缺失株相同的安全性，且比文献1和文献3(Development ofa highly effectiveAfrican swine fevervirus vaccine by deletion of the I177L gene results in sterile immunityagainst the current epidemic Eurasia strain，Journal ofVirology，2020；DOI：10.1128/JVI.02017-19)公开的基因缺失株具有更好的安全性，同时还表现出良好的免疫攻毒保护效果，保护率为100％；另一方面，本申请是I177L毒力基因的缺失，I177L基因在整个基因组中仅有单个基因，其不像多基因家族基因(例如MGF360基因)一样容易被多次复制或重组而发生缺失回补的现象，并且由于I177L基因片段单独缺失时就可以表现出显著的减毒效果，因此本申请提供的基因缺失株消除了毒力返强的潜在风险。
附图说明
图1为非洲猪瘟病毒I177L基因片段缺失后的绿色蛋白表达荧光照片；
图2为非洲猪瘟病毒CD2V基因缺失后的绿色蛋白表达荧光照片；
图3为同源重组转移载体PCR鉴定电泳图；
图4为重组病毒PCR鉴定电泳图；
图5为病毒生长曲线图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本申请的具体实施例。虽然附图中显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如本文所用，就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。
如在本说明书中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”一起使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
贯穿本申请，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本申请生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本申请在第一方面提供了一种减毒非洲猪瘟病毒毒株。
在一个具体实施方式中，提供了一种减毒非洲猪瘟病毒毒株，其相对于野生型II型非洲猪瘟病毒在基因组中缺失以下基因或片段：CD2V基因和I177L基因片段。
在本说明书的上下文中，非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus，ASFV)特指非洲病毒科中唯一的非洲病毒属，也是目前唯一的DNA虫媒病毒属。该病毒主要靠口或鼻腔直接接触感染，同时拥有多个循环传播方式，主要存在于血液、组织液、内脏、分泌物和排泄物中，具有感染率高，传播迅速，致死率高等特点。在非洲猪瘟病毒野生型II型中，CD2V、MGF、I177L和9GL均是已经明确的与免疫抑制有关的基因。因此，目前针对非洲猪瘟病毒疫苗的研究主要集中在利用这些免疫抑制基因缺失的毒株作为疫苗株制备疫苗。其中研究较多的为CD2V和MGF基因缺失株，然而CD2V缺失对毒株的毒力几乎没有影响，MGF基因缺失后不同剂量的研究会引起接种猪体温变化，并且会与非洲猪瘟流行毒株发生重组而返回毒性。I117L基因则是对病毒的复制有一定的影响，缺失后不仅可大大降低该病毒的毒力，并可以提供对该母本病毒100％免疫保护效果。
本领域技术人员可以理解，在不同的病毒中CD2V基因与I117L基因可能存在一定的区别，但只要其起到相关基因的功能即可。
在一个具体的实例中，缺失的CD2V基因的序列与SEQ ID NO:1具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％同一性。在一个具体的实例中，缺失的I177L基因的序列与SEQ ID NO:2具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％同一性。在一个具体的实例中，同时缺失与SEQ ID NO:1具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％同一性的CD2V基因片段和与SEQ ID NO:2具有至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％同一性的I177L基因片段。
在一个具体的实例中，缺失序列为如SEQ ID NO:1所示的CD2V基因片段。在一个具体的实例中，缺失序列为如SEQ ID NO:2所示的I177L基因片段。在一个具体的实施方式中，减毒非洲猪瘟病毒毒株缺失序列如SEQ ID NO:1所示的CD2V基因片段、还缺失序列如SEQID NO:2所示的I177L基因片段。
在本说明书的上下文中，会使用rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L的表示法来表示本申请要求保护的减毒株，其具体含义是：重组的ASFV GZ2018病毒株，缺失CD2V和I177L基因。
在又一具体实施方式中，提供了一种减毒非洲猪瘟病毒毒株，其中所述野生型II型非洲猪瘟病毒为选自下组的任一项：ASFV-SY18、Georgia 2008/1、Pig/HLJ/2018、Georgia 2007/1、ASFV GZ2018、ASFV Anhui 2018、ASFV GD 2019、ASFV InnerMongolia2019。上面的提及都是同属于非洲猪瘟病毒属的不同的种，所有这些种均含有自然状态的CD2V和I177L基因片段，且这些基因在这些种都体现类似的生物学功能。上述病毒株均可自商业渠道获得。本申请在第二方面提供了减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法。
在一个具体实施方式中，提供了一种减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法，其包括以下步骤：通过基因工程手段使野生型II型非洲猪瘟病毒的CD2V基因和I177L基因片段缺失。
在本说明书的上下文中，术语“基因工程手段”包括各种能够实现特定基因片段敲除的生物技术。广义的基因敲除技术至少包括：同源重组方法、随机插入突变方法(包括转座子方法和基因捕获法)、基因编辑方法(包括ZFN方法、TALEN方法和Crispr-Cas9方法)以及RNAi方法。本领域技术人员可以基于需要选择合适的方法。
同源重组方法是指主要是利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。此方法的缺点主要是操作复杂，实验周期长，费用偏高。
随机插入突变方法包括转座子方法和基因捕获法：对于前者，能用于任何物种的转座子打靶载体是以两种噬菌体Mu为基础的mini-Mu转座子(每个转座子上都携带标记基因)，它们可以在拟删除基因两侧各插人一个mini-Mu转座子，然后在两个插人位点之间的制造缺失。这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移，留下一个带有选择性标记在两侧的与靶基因同源的臂。它的优点是，利用mini-Mu转座子进行基因敲除具有极大的方便性，它不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可，且载体构建迅速，技术简单，载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理多基因。然而，转座子的应用也有一定限制，比如要求转座子本身较短，容易操作，且对任何拟敲除区域有较高转座效率等。对于后者，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析；此方法基因的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。
基因编辑方法也称“基因定点敲除技术”：ZFN又名锌指蛋白核酸酶，它是一种人工改造的核酸内切酶，其由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶赋剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂；锌指核酸酶ZFNs在植物基因组定点改造上的可能前景，但由于ZFNs的合成组装技术难度大，一般实验室难以实施，而且ZFNs易于对基因组进行非特异性切割，或对靶点DNA切割效率低，一直限制其进入实际应用。TALEN的中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALEN是一种可靶向特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALEN。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。相对于ZFN技术，TALEN的优势有：(1)TALE的核酸识别单元与AGCT有恒定的对应关系；(2)靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列；(3)毒性低、脱靶情况少；(4)成对的TALE识别模块保证了基因敲除靶点的准确性；尽管如此，其仍存在一些缺点，主要在于模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司。CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromicrepeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一种广泛存在于细菌与古细菌中的，由RNA介导的可遗传的获得性免疫系统，这种免疫系统为宿主细胞提供了对外源DNA(如噬菌体质粒)的免疫功能。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(short guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。相比于前面的ZFN系统和TALEN系统，它有着突出的优点：首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多；其次，该系统更具有可拓展性，例如可以通过对Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，来在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响；第三，它的使用极为方便。
上文述及的RNAi方法是指:由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以可以利用RNAi(RNA干扰)反应用于基因敲除。
具体地，本申请的方法利用同源重组将包含有CD2V基因的左右同源臂的同源重组转移载体和包含有I177L基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体转染所述野生型II型非洲猪瘟病毒；筛选同时缺失CD2V基因和I177L基因的减毒非洲猪瘟病毒毒株。在本申请中对于转染包含有CD2V基因的左右同源臂的同源重组转移载体和包含有I177L基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体的顺序没有要求，可以先转染包含有CD2V基因的左右同源臂的同源重组转移载体，再转染包含有I177L基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体。也可以先转染包含有I177L基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体，也可以再转染包含有CD2V基因的左右同源臂的同源重组转移载体。或者可以同时转染包含有CD2V基因的左右同源臂的同源重组转移载体和包含有I177L基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体。
当所述基因工程手段为同源重组技术时，其具体包括以下步骤：
S1)将CD2V基因的左右同源臂和第一筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第一同源重组转移载体；
S2)将I177L基因片段的左右同源臂和第二筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第二同源重组转移载体；
S3)将步骤S1)的第一同源重组转移载体用转染试剂转染至使用所述亲本II型非洲猪瘟病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒筛选获得缺失CD2V基因的第一重组病毒；
在本说明书的上下文中，PAM是指猪肺泡巨噬细胞。
S4)将步骤S2)的第二同源重组转移载体用转染试剂转染至使用步骤S3)获得的第一重组病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒和第二筛选表达盒筛选获得同时缺失CD2V基因和I177L基因的第二重组病毒，作为减毒非洲猪瘟病毒毒株。
在本说明书的上下文中，“同源重组技术”特指利用同源重组现象敲除病毒基因组中特定基因片段的技术手段。选择需敲除基因左右约1000bp的基因组作为同源臂，在同源臂中加入荧光标记蛋白的表达序列，将该序列合成至噬菌体展示载体中，之后将该载体通过脂质体转化法转染感染了ASFV的猪原代巨噬细胞，经多次挑斑纯化，成功拯救出基因缺失株。
在又一具体实施方式中，提供了一种减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法，其中所述第一筛选表达盒和所述第二筛选表达盒为不同的筛选表达盒。
在本说明书的上下文中，“筛选表达盒”是指带有筛选标记(例如表达荧光标记蛋白的基因)、用于筛选同源重组是否成功的结构。
在本申请中，对于表达荧光标记蛋白的基因没有任何的限定，可以为绿色荧光蛋白、黄绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等等，具体来说，例如可以为mCherry红色荧光基因和EGFP绿色荧光基因。
在本申请中，可以使用的筛选表达盒包括但不限于：mCherry和EGFP表达盒。
本申请在第三方面提供了减毒非洲猪瘟病毒毒株的用途。
在一个具体实施方式中，提供了减毒非洲猪瘟病毒毒株的用于制备非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的用途。
针对病毒预防的最主要方法是疫苗接种。然而对于非洲猪瘟病毒，市场上还没有可用的疫苗产品，虽然已经尝试开发了非洲猪瘟病毒灭活疫苗、减毒活疫苗及基因工程疫苗等，但经过效果评价后，均未获得预期的免疫效果。其中灭活疫苗无法使动物体内产生中和抗体，因此不能产生抵抗强毒攻击的免疫力；减毒活疫苗免疫副作用多且易引起多重感染等问题，存在一定的生物安全隐患；通过基因工程制备的DNA疫苗可使动物获得一定的免疫保护，但并未检测到相应抗体，推测可能为细胞免疫占主导地位。本申请的技术方案得到的减毒毒株证明适合用于减毒活疫苗。
本申请在第四方面提供了一种非洲猪瘟病毒减毒活疫苗。
在一个具体实施方式中，提供了一种非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其由前面所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株制备获得。
在又一具体实施方式中，提供了非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其中的减毒非洲猪瘟病毒的病毒含量≥107.0TCID50/ml。
在本说明书的上下文中，TCID50是半数组织培养感染剂量的简写，其又称50％组织细胞感染量。≥107.0TCID50/ml的具体含义是病毒原液稀释107及以上倍数后可导致50％的组织细胞感染。在本说明书的上下文中，低剂量攻毒(50HAD50/头)、中剂量攻毒(100HAD50/头)、高剂量攻毒(200HAD50/头)等表述所使用的剂量单位HAD50的含义为红细胞半数凝集量(病毒感染细胞后，细胞获得吸附红细胞的能力，称为红细胞凝集)。
本申请在第五方面提供了一种非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的制备方法。
在一个具体实施方式中，提供了前述非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
T1)将本申请的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株接种原代细胞，扩大培养，收获病毒液；
T2)以病毒含量≥107.0TCID50/ml的病毒液直接或配合佐剂制成疫苗。
在再一具体实施方式中，提供了前述制备方法，其中所述佐剂选自下组的一项或多项：铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂和聚集体结构佐剂。特别优选地，佐剂选自纳米佐剂、白介素或干扰素。所述纳米佐剂例如为铝盐的纳米佐剂。
基于以上技术方案提供的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株在CD2v基因缺失的基础上，还缺失了I177L基因部分片段，获得一种相对于野生毒株显著减毒(I177L基因部分片段缺失的减毒效果)、能够高效稳定增殖且病毒滴度较高、保持较高的毒力和免疫原性、种毒稳定性好、并可以区别于野生毒株(利用CD2v基因的缺失)的非洲猪瘟病毒毒株(rASFVGZ2018ΔCD2v/I177L)。经试验证明，利用本申请提供的rASFV GZ2018ΔCD2v/I177L毒株对实验猪进行接种后，按照低剂量(103.0TCID50/头)接种和高剂量(105.0TCID50/头)接种实验猪，均不会出现实验猪体温明显升高(不超过40.3℃)、发病或死亡现象，表现出与文献2公开的基因缺失株相同的安全性，且比文献1和文献3(Development ofa highlyeffectiveAfrican swine fever virus vaccine by deletion of the I177L generesults in sterile immunity against the current epidemic Eurasia strain，Journal ofVirology，2020；DOI：10.1128/JVI.02017-19)公开的基因缺失株具有更好的安全性，同时还表现出良好的免疫攻毒保护效果，保护率为100％；另一方面，本申请是I177L毒力基因的缺失，I177L基因在整个基因组中仅有单个基因，其不像多基因家族基因(例如MGF360基因)一样容易被多次复制或重组而发生缺失回补的现象，并且由于I177L基因片段单独缺失时就可以表现出显著的减毒效果，因此本申请提供的基因缺失株消除了毒力返强的潜在风险。
实施例
实施例1：非洲猪瘟病毒毒株分离及其鉴定
1.1、毒株
实施例中使用的非洲猪瘟病毒野生毒株为由华南农业大学兽医学院禽病教研室野外分离的广东毒株，命名为ASFV GZ2018，具体操作包括以下步骤(在生物安全3级实验室中操作)：将检测为阳性ASFV感染的病死猪的脾脏组织称取0.1g，放入2.0mL的无菌EP管中，在管中加入1mL无菌PBS溶液，再放入3粒无菌的组织研磨钢珠，将EP管放入组织研磨仪里，进行震荡研磨，注意将研磨仪提前预冷至4℃并配平放置，将研磨后的组织液反复冻融3次后，用0.45μm的滤膜进行过滤后，接种到培养的原代PAM细胞(华南农业大学兽医学院禽病教研室制备，以10％FBS的PRMI1640培养基(购自Gibco)进行培养)上，能够出现细胞病变效应(CPE)，再进行病毒的分离。
1.2、毒株的鉴定
ASFV GZ2018毒株的鉴定由华南农业大学兽医学院禽病教研室完成，具体为通过基因组测序，获得该毒株的基因组数据(Genebank登录号为MT496893)，并将其基因组序列与Genebank中已有的ASFV基因组数据(例如II型ASFV毒株ASFV-SY18，其Genebank登录号为MH713612；II型ASFV毒株Georgia 2008/1，其Genebank登录号为MH910495；II型ASFV毒株Pig/HLJ/2018，其Genebank登录号为MK333180；I型ASFV毒株Ba71V，其Genebank登录号为FJ174348)进行比对，证明ASFV GZ2018毒株为基因II型ASFV野毒株。
该ASFV GZ2018毒株通过高致病性病原微生物转运手续审批后运送至金宇保灵生物药品有限公司生物安全3级实验室保存。
实施例2：缺失CD2V和I177L基因的重组病毒的构建
对于非洲猪瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考虑到对猪的免疫应答和保护性效果，又要兼顾致病性和安全性能。单独的I177L基因特定片段的敲除(上述文献3)和MGF/CD2V/I177L基因的共同敲除(上述文献2)已经被证实均能获得减毒的非洲猪瘟病毒疫苗株，并具有良好的免疫保护效果。然而多种基因的缺失可能会造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护效果减弱，甚至也会影响基因缺失重组病毒的复制能力，而不能拯救病毒。基于此，发明人尝试从ASFV GZ2018毒株出发，构建其同时缺失CD2V和I177L基因的重组病毒，并验证是否能够获得稳定复制的基因缺失重组病毒，具体包括以下步骤。
2.1、同源重组载体的构建
2.1.1、缺失CD2V的同源重组转移载体的构建：利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即CD2V的左同源臂和CD2V的右同源臂，与mCherry基因序列(红色荧光蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)合成同源臂，命名为CD2V-mCherry，将其定向克隆至pBluescript II KS载体，获得缺失CD2V基因的同源重组转移载体，名命名为pBlue-LR-ΔCD2V-mCherry(全长2879bp)，图3中泳道1-3示出了该重组转移载体的鉴定凝胶电泳图；
2.1.2、缺失I177L的同源重组转移载体的构建：利用同源重组的方法，将待缺失部分基因左右同源臂即I177L-D的左同源臂和I177L-D的右同源臂与P72 promoter-EGFP基因序列(绿色荧光蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)合成同源臂，命名为I177L-P72-EGFP，将其定向克隆至pBluescript II KS载体，获得缺失I177L-D基因的同源重组转移载体，名命名为pBlue-LR-ΔI177L-P72-EGFP(全长3388bp)，图3中泳道4-6示出了该重组转移载体的鉴定凝胶电泳图
2.2、重组病毒的构建
2.2.1、用ASFV GZ2018野生毒株感染原代PAM细胞，将步骤2.1.1构建的同源重组转移载体pBlue-LR-ΔCD2V-mCherry用TurboFectin8.0转染试剂转染被野生毒株感染的原代PAM细胞，于37℃培养48h后，显微镜下可见存在大量的红色荧光斑点，结果如图1所示，挑取带有红色荧光的细胞至新鲜的原代PAM细胞中，完成一轮纯化，此为P1轮病毒；待P1轮病毒感染细胞扩散至荧光簇，重复上述步骤再次纯化，纯化10轮后，收集荧光细胞，冻融三次，得到表达红色荧光蛋白的CD2V基因缺失的非洲猪瘟重组病毒，命名为rASFV GZ2018ΔCD2V，其相对于ASFV GZ2018野生毒株缺失了CD2V的完整阅读框，缺失CD2V基因的重组病毒的PCR鉴定(鉴定CD2V)基因缺失使用的引物为：5’-accgcactaggaaaaacggttg-3’(SEQ IDNO:5)和5’-agttggtttgttctcgcagc-3’(SEQ ID NO:6)结果如图4-左所示，其中M表示DL2000 Marker，泳道1表示阳性对照(ASFV GZ2018野生毒株)，泳道2表示重组病毒rASFVGZ2018ΔCD2V，泳道3表示阴性对照。
2.2.2、用步骤2.2.1获得的rASFV GZ2018ΔCD2V感染原代PAM细胞，将步骤2.1.2构建的pBlue-LR-ΔI177L-P72-EGFP按照同上述步骤2.2.1同样的方法转染PAM细胞，并在显微镜下重复挑取红、绿双荧光斑点进行纯化，最终得到表达红、绿双荧光蛋白的I177L和CD2V基因都缺失的非洲猪瘟重组病毒，命名为rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L，其相对于ASFVGZ2018野生毒株缺失了I177L-D阅读框和CD2V完整阅读框，PCR鉴定(鉴定I177L-D基因缺失使用的引物为：5’-gtgggccccttaagatcaca-3’(SEQ ID NO:7)和5’-ccactctgatactccccagc-3’(SEQ ID NO:8))结果如图4-右所示，其中泳道1表示阳性对照(ASFV GZ2018野生毒株)，泳道2表示重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L，泳道3表示阴性对照。
经测序结果表明，该实施例2成功构建了同时缺失CD2V和I177L的重组病毒rASFVGZ2018ΔCD2V/I177L，并且该重组病毒能够在原代PAM细胞中稳定复制繁殖，在感染PAM细胞时能够表达红绿双色荧光，不会出现由于多种基因的缺失而导致重组病毒无法复制繁殖的问题。
实施例3：重组病毒的滴度测定
该实施例对上述实施例2构建的重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L和文献2报道的rASFV GZ2018ΔI177L及rASFV GZ2018ΔMGF360/CD2V/I177L的滴度进行测定，并与野生毒株ASFV GZ2018的滴度进行比较。非洲猪瘟病毒的滴度测定采用半数细胞感染剂量TCID50和半数血球吸附量HAD50两种方法进行操作，其中：
TCID50滴定按照下面步骤进行：将ASFV以无血清1640培养液再作10倍连续稀释，接种培养于96孔培养板、密度约5x106 cells/ml的原代BMDM细胞，每个稀释度接种8个孔，100μl/孔，于37℃、5％浓度CO2条件下培养，观察3-7天，根据细胞病变或荧光变化和Reed andMuench方法计算半数细胞感染量(TCID50)。
HAD50试验操作按照《非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程》进行操作，并作适当调整：在96孔细胞培养板中接种原代PBMC细胞，将待检样品进行10倍梯度稀释，20μl/孔，病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的玫瑰花环进行判定，观察7天，根据ReedandMuench方法计算半数血球吸附剂量(HAD50)。
具体测定操作包括以下步骤。
(1)将猪原代BMDM细胞铺入6孔板中，细胞密度约为5x106 cells/ml，分别接种0.01MOI病毒液(ASFV GZ2018、rASFV GZ2018ΔI177L-D、rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L或rASFV GZ2018ΔMGF360/CD2V/I177L-D)，分别于感染后0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h收获扩增病毒，反复冻融3次，高速离心，取上清，分别获得培养病毒液；
(2)分别将上述步骤(1)获得的培养病毒液按照10倍梯度进行稀释，野毒株感染已铺在96孔板中的猪原代PBMC细胞，基因缺失毒株感染已铺在96孔板中的猪原代BMDM细胞；野毒株感染后72h测定HAD50，按照Reed-Muench法计算病毒的滴度，基因缺失重组病毒可直接利用荧光显微镜观察，按照Reed-Muench法计算病毒的滴度，以TCID50/mL为单位。
结果显示：在所测定的144h时间内，三株基因缺失重组病毒的平均滴度均低于野生毒株ASFV GZ2018，详见图5，其中在感染后72h时，ASFV GZ2018、rASFV GZ2018ΔI177L-D、rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L及rASFV GZ2018ΔMGF360/CD2V/I177L-D的病毒滴度分别为107.33TCID50/mL、105.67TCID50/mL、106.67TCID50/mL、106.00TCID50/mL；在感染后96h时，ASFVGZ2018、rASFV GZ2018ΔI177L-D、rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L及rASFV GZ2018ΔMGF360/CD2V/I177L-D的病毒滴度分别为107.67TCID50/mL、106.00TCID50/mL、107.00TCID50/mL、106.50TCID50/mL。可见，在感染原代细胞后，基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L的滴度明显低于野生毒株ASFV GZ2018的滴度(前者比后者低10倍左右)，也明显低于文献1公开的SY18ΔMC组病毒(缺失MGF360(12L,13L,14L)和CD2V)的滴度(感染后48h的平均滴度为8.472×106TCID50/mL)，并且比文献3公开的只缺失I177L基因片段的基因缺失株ASFV-G-ΔI177L的病毒滴度高(高10倍左右)。
此外，与文献2公开的基因缺失株rASFV GZ2018ΔMGF360/CD2V/I177L-D相比较，rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L的最高病毒滴度出现在病毒培养的96h时，为107.00TCID50/mL，是rASFV GZ2018ΔMGF360/CD2V/I177L-D最高病毒滴度的3.16倍(96h培养，106.50TCID50/mL)。故而，在培养条件相同的情况下，rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L可以更节约生产成本、人工成本及原材料等，这对于开发一种高效、质优且性价比高的疫苗具有重要意义，增强了产品的市场竞争力。
因此本申请构建获得的基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L是一种相对于野生毒株明显减毒的非洲猪瘟病毒基因缺失重组病毒，并且仍保持相对较高的病毒滴度和较高的免疫原性。理论上，在不降低免疫原性的情况下，毒力基因的缺失会导致病毒毒力减弱，其安全风险降低，因此本申请提供的同时缺失CD2V和I177L基因的重组病毒相对于野生毒株、文献1和文献3公开的基因缺失株将具有更高的安全性，并且由于I177L在基因组中为单一基因，不会轻易发生自身突变和同源重组缺失或回补缺失部位的现象，也可以避免潜在的毒力返强安全风险。
实施例4：基因缺失株rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L的毒力检测
该实施例对上述实施例2获得的基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L的毒力进行检测，以对其安全性进行评价，具体包括以下步骤。
(1)选取20头健康仔猪(非洲猪瘟病毒抗原、抗体均阴性)，购自包头市草原立新猪场，随机分为4组(A、B、C和D组)；
(2)分别选用103TCID50/头低感染剂量和105TCID50/头高感染剂量的rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L对A和B组仔猪进行肌肉注射；同时采用感染剂量为103TCID50/头的野生毒株ASFV GZ2018对C组仔猪进行肌肉注射，作为对照；还采用PBS(2ml)作为阴性对照肌肉注射D组仔猪；试验方案如下表1所示；
(3)接种后每日对各组仔猪测定采食量、体温、体重变化情况，并记录仔猪存活情况，直至接种后28天；在观察期内，每5天对各组仔猪采集猪外周血、鼻拭子、口拭子和肛拭子(若仔猪死亡，则停止对该死亡仔猪进行采集)，以检测仔猪血液中病毒含量和口鼻肛部位是否存在排毒情况。
表1：基因缺失株rASFV GZ2018ΔCD2V/ΔI177L的毒力检测试验方案
结果显示：C组仔猪经肌肉注射接种103.0TCID50/头剂量ASFV GZ2018毒株后，所有仔猪均在接种5-7日后发生高热，高达41℃以上，精神沉郁，6-7天左右开始死亡，并在12天内全部死亡。剖检可见淋巴结、脾脏、肾脏等部位严重出血，病毒血症一直持续到猪只死亡。而使用rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L接种后，无论是低剂量(103.0TCID50/头)还是高剂量(105.0TCID50/头)接种后，所有仔猪的平均体温均未超过40.3℃，后期亦未见体温异常，精神状态正常，采食量未见异常，体重增加明显。另外，观察期内所有仔猪仅出现低水平的病毒血症(比GZ2018组低1000-10000倍)，口鼻肛部位出现轻微排毒现象，相对于文献3公开的基因缺失株ASFV-G-ΔI177L，接种本申请提供的基因缺失株rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L后，检测的仔猪血液中病毒含量与其相当或更低。
该实施例结果表明，本申请构建的减毒的基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L对仔猪确实具有良好的安全性。
实施例5：基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L作为疫苗株对仔猪的免疫保护效果评价
该实施例利用基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L作为疫苗株对仔猪进行免疫，以通过抗体检测和攻毒试验评价其免疫保护效果，具体包括以下步骤。
(1)选取3～4周龄健康仔猪20头，随机分成4组(a、b、c和d组)；a组仔猪(5头)用基因缺失株rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L于颈部肌肉注射，103.0TCID50/头，2周后同样剂量加强免疫一次；b组仔猪(5头)用基因缺失株rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L于颈部肌肉注射，105.0TCID/头，2周后同样剂量加强免疫一次；c组和d组(每组5头)为阴性对照，同样方法注射PBS 2ml；四组分别隔离饲养。试验方案如下表2所示。
(2)免疫后抗体检测：免疫后分别于3日、7日、10日、14日、21日和28日从各组仔猪的前腔静脉采血，对非洲猪瘟病毒抗体进行检测(ID.vet抗体试剂盒)，评价其免疫效果。
(3)攻毒保护试验：接种后第28日，从各组仔猪采血结束后，a组、b组和c组仔猪颈部肌肉接种ASFV GZ2018(50HAD50/头)进行攻毒保护试验，d组仔猪注射PBS 2ml。
表2：免疫保护效果评价试验方案
抗体检测结果显示：a组和b组仔猪于免疫后3日、7日和10日均未产生明显的特异性抗体；a组仔猪于免疫后14日、21日及28日后抗体阳性率分别为60％、80％和100％；b组仔猪于免疫后14日、21日和28日抗体阳性率分别为80％、100％和100％。c组和d组仔猪在观察期内均未产生特异性抗体。在观察期内，a组和b组仔猪的体温均在正常温度范围之内，无明显异常临床表现，存在低水平病毒血症，口鼻肛部位轻微排毒。剖检可见所有免疫仔猪未发现明显病理变化。
免疫攻毒保护试验结果显示：a组和b组仔猪免疫攻毒后的保护率均为100％，而c组5头仔猪全部于攻毒后12日内死亡，d组仔猪表现正常。结果如下表3所示。
表3：免疫攻毒试验结果
综上所述，可见当将本申请构建的基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L作为疫苗株按照首次免疫后14日加强免疫一次的方案接种仔猪后，不论是低剂量组(103.0TCID50/头)还是高剂量组(105.0TCID50/头)均能产生较好的免疫应答，提供100％的攻毒保护效果。其中103.0TCID50/头低剂量组在首免后14日二免前抗体转阳率为60％，二免后7日和14日抗体阳性率持续上升，攻毒前抗体阳性率达到100％；105.0TCID50/头高剂量组在首免后14日二免前可达到80％抗体阳性率，二免后7日抗体阳性率上升至100％，攻毒前抗体阳性率为100％，并且所有仔猪体温均在正常范围之内，未见明显异常临床表现，存在低水平病毒血症，口鼻肛部位轻微排毒，接种后血液病毒含量一直处于较低水平。表明野生毒株ASFV GZ2018缺失CD2v和I177L后仍然保留较高的免疫原性并且免疫健康易感猪后可提供有效的攻毒保护效果，该基因缺失株可以提供安全、有效的免疫保护作用，因此可以作为一种候选的非洲猪瘟病毒疫苗株。
实施例6：不同攻毒剂量下基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L作为疫苗株对仔猪的攻毒保护效果评价
该实施例利用基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L和rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L/MGF作为疫苗株，分别对仔猪进行免疫，用不同剂量的亲本株进行攻毒试验，评价其免疫保护效果，具体包括以下步骤。
选取3～4周龄健康仔猪45头，随机分成10组(a-j组)；a、b、c组仔猪(5头/组)用基因缺失株rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L于颈部肌肉注射，105.0TCID50/头，2周后同样剂量加强免疫一次；d、e、f组仔猪(5头/组)用基因缺失株rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L/MGF于颈部肌肉注射，105.0TCID/头，2周后同样剂量加强免疫一次；g、h、i、j组(每组5头)为阴性对照，同样方法注射PBS 2ml；10组分别隔离饲养。接种后第28日，仔猪颈部肌肉接种不同剂量ASFVGZ2018进行攻毒保护试验,具体试验方法见表4。
表4：攻毒保护效果评价试验方案
攻毒保护试验结果显示：a组、b组和c组仔猪免疫攻毒后的保护率均为100％；d组、e组、f组仔猪免疫攻毒后的保护率分别为100％、80％、60％；g组、h组、i组仔猪全部于攻毒后12日内死亡，j组仔猪表现正常。结果如下表5所示。
表5：免疫攻毒试验结果
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综上所述，可见当将本申请构建的基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L作为疫苗株按照105.0TCID50/头进行2次免疫后，不论是低剂量攻毒(50HAD50/头)、中剂量攻毒(100HAD50/头)还是高剂量攻毒(200HAD50/头)，均能产生较好的保护效果，保护率均达到100％。而基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/ΔI177L/ΔMGF作为疫苗株按照105.0TCID50/头进行2次免疫后，仅对低剂量攻毒(50HAD50/头)有较好的保护效果，保护率为100％，当攻毒剂量提高，保护率开始下降，中剂量攻毒(100HAD50/头)保护率为80％，高剂量攻毒(200HAD50/头)的保护率仅为60％。由此可见，基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L作为疫苗株可以为免疫动物提供更好且更强的免疫效果，以抵御大量野生毒株的侵染，而基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L/MGF作为疫苗株产生的免疫效果仅对低水平野生毒株的侵染有较好的抵御效果。故而，本申请的发明人意外地发现基因缺失重组病毒rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L可以提供更有效的免疫保护作用，因此可以作为一种候选的非洲猪瘟病毒疫苗株。在作为疫苗株制备减毒活疫苗时，可以将本申请构建的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株接种原代细胞，扩大培养，收获病毒液并测定病毒滴度，可以在浓缩后选择病毒含量≥107.0TCID50/ml的病毒液直接或与配合佐剂(例如纳米佐剂、白介素或干扰素)制成疫苗，制备得到的疫苗中的病毒含量可高达107.0TCID50/ml以上。实验证明，虽然本申请相对于基因缺失重组减毒病毒株rASFV GZ2018ΔCD2V/I177L/MGF少敲除了一处基因片段，但是作为减毒活疫苗相对于其反而取得了意外的更佳的免疫效果。
另外，本申请的研究结果表明，I177L/CD2v/MGF基因同时缺失的减毒疫苗株与I177L/CD2v同时缺失的减毒疫苗株相比，前者的病毒效价低于后者，相同条件培养，I177L/CD2v基因同时缺失的减毒疫苗株的病毒滴度较I177L/CD2v/MGF基因同时缺失的减毒疫苗株高2-3倍，较高病毒效价有利于商品化疫苗的生产和成本控制。
尽管以上结合附图对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。
序列表
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Claims (11)

1.一种减毒非洲猪瘟病毒毒株，其相对于野生型II型非洲猪瘟病毒在基因组中缺失以下基因片段：CD2V和I177L基因片段；
优选缺失序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的CD2V基因片段、以及缺失序列与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的I177L基因片段；
更优选缺失序列如SEQ ID NO:1所示的CD2V基因片段、以及序列如SEQ ID NO:2所示的I177L基因片段。
2.根据权利要求1所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株，其中所述野生型II型非洲猪瘟病毒为选自下组的任一项：ASFV-SY18、Georgia2008/1、Pig/HLJ/2018、Georgia2007/1、ASFVGZ2018、ASFVAnhui2018、ASFVGD 2019、ASFVInnerMongolia2019。
3.根据权利要求1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法，其包括以下步骤：通过基因工程手段使野生型II型非洲猪瘟病毒的CD2V和I177L基因片段缺失。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其中所述基因工程手段为同源重组技术，其具体包括以下步骤：
利用同源重组将包含有CD2V基因的左右同源臂的同源重组转移载体和包含有I177L基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体转染所述野生型II型非洲猪瘟病毒；
筛选同时缺失CD2V基因和I177L基因的减毒非洲猪瘟病毒毒株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其中，所述方法包括以下步骤
S1)将CD2V基因的左右同源臂和第一筛选表达盒克隆至pBluescriptII KS载体，获得第一同源重组转移载体；
S2)将I177L基因片段的左右同源臂和第二筛选表达盒克隆至pBluescriptIIKS载体，获得第二同源重组转移载体；
S3)将步骤S1)的第一同源重组转移载体用转染试剂转染至使用所述野生型II型非洲猪瘟病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒筛选获得缺失CD2V基因的第一重组病毒；
S4)将步骤S2)的第二同源重组转移载体用转染试剂转染至使用步骤S3)获得的第一重组病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒和第二筛选表达盒筛选获得同时缺失CD2V基因和I177L基因的第二重组病毒，作为减毒非洲猪瘟病毒毒株。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其中所述第一筛选表达盒和所述第二筛选表达盒为不同的筛选表达盒，且分别选自mCherry和EGFP表达盒的任一项。
7.根据权利要求1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的用于制备非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的用途。
8.一种非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其由权利要求1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株制备获得。
9.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其中的减毒非洲猪瘟病毒的病毒含量≥107.0TCID50/ml。
10.根据权利要求8或9所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
T1)将权利要求1或2所述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株接种原代细胞，扩大培养，收获病毒液；
T2)以病毒含量≥107.0TCID50/ml的病毒液直接或配合佐剂制成疫苗。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其中所述佐剂选自下组的一项或多项：铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂和聚集体结构佐剂，优选选自下组的一项或多项：白介素或干扰素。
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Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110551695A (zh) * 2019-08-14 2019-12-10 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用
CN113897395B (zh) * 2020-07-06 2023-10-03 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
CN112063592A (zh) * 2020-07-10 2020-12-11 中国农业科学院兰州兽医研究所 非洲猪瘟多基因联合缺失减毒株的构建及作为疫苗的应用
CN112626101A (zh) * 2021-01-06 2021-04-09 佛山科学技术学院 非洲猪瘟病毒i177l基因重组质粒、表达载体及制备方法
CN112646934B (zh) * 2021-01-21 2021-08-31 华南农业大学 一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量pcr检测引物及试剂盒
CN112852761B (zh) * 2021-03-08 2022-08-23 中国农业科学院兰州兽医研究所 基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及作为疫苗的应用
CN113073086A (zh) * 2021-03-19 2021-07-06 华南农业大学 一种非洲猪瘟病毒基因缺失株及其构建方法和用途
CN113122511B (zh) * 2021-04-13 2021-11-19 金宇保灵生物药品有限公司 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用
CN113061588B (zh) * 2021-05-20 2023-08-01 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 缺失i226r基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗
CN114272365B (zh) * 2021-09-15 2024-02-23 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒构建及其作为疫苗的应用
CN114015660B (zh) * 2021-11-11 2023-05-05 中国农业科学院兰州兽医研究所 缺失十个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用
CN117417905A (zh) * 2022-07-13 2024-01-19 金宇保灵生物药品有限公司 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用

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