CN112384614B - 表达干扰素的溶瘤病毒及其应用 - Google Patents
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Abstract
提供一种表达干扰素序列的溶瘤病毒，特别提供了一种包含了表达干扰素的融合蛋白的溶瘤腺病毒，该溶瘤病毒能够在体外和体内高效抑制肿瘤。
Description
交叉引用
本申请要求发明名称为“表达干扰素的溶瘤病毒及其应用”于2018年12月26日提交到中国专利局的中国专利申请201811603052.2的优先权，其内容通过引用以整体并入本文。
技术领域
本发明属于利用溶瘤病毒进行肿瘤治疗的技术领域，具体的，本发明涉及一种表达干扰素的溶瘤腺病毒、其制备方法以及应用。
背景技术
据统计，全世界每年有超过1200万人诊断出癌症，癌症严重影响着全人类的健康和发展。受医疗和环境条件的影响，中国癌症死亡率高于全球平均水平。传统的肿瘤疗法存在疗效差、死亡率高及预后复发率高等缺点，因此对癌症的治疗提出了重大挑战。例如早在肿瘤发展的极早期，微转移就已经产生从而定位于远离肿瘤原发部位的组织中。因此在诊断发现癌症时，许多癌症患者已出现了微转移的现象。
作为一个新兴的具有广阔前景的疗法，溶瘤病毒能够在肿瘤细胞中复制并裂解细胞，从而持续杀死肿瘤细胞。而且溶瘤病毒中还能够携带抗癌基因等，在利用病毒裂解细胞的同时，发挥基因杀伤肿瘤细胞的能力，从而提高治疗效果。
目前仍然急需获得新的手段增强溶瘤病毒的效力，从而增加临床上获得成功的机会。
发明内容
本发明首先通过改进溶瘤腺病毒基因组的结构，将病毒基因组中的E1A基因的野生型启动子替换为survivin启动子，随后将E1A基因中负责编码E1A蛋白第122至129位氨基酸的24个碱基对(第364至387bp)删除，使得E1A不能结合Rb蛋白，从而不能释放E2F并促使宿主细胞进入细胞分裂周期，经过上述改造后的溶瘤腺病毒仅能在Rb异常的肿瘤细胞中选择性复制。
进一步的，本发明在病毒基因组中引入编码干扰素(例如复合干扰素)的核酸序列，特别是如SEQ ID NO：2、3或4所示的核酸序列。结果发现这样的溶瘤腺病毒具有极佳的体外和体内抑瘤效果，特别令人惊讶的是，本发明的溶瘤腺病毒能够在远离注射部位的位置高效抑制肿瘤生长并且还能够有效防止肿瘤的复发，这对于临床应用具有不可估量的价值。正是基于上述发现，完成了本发明。
本发明的第一个方面提供了一种溶瘤病毒，其包含编码干扰素的核酸序列。
在一个实施方案中，所述病毒是腺病毒。
在另一个实施方案中，所述病毒包含以survivin启动子驱动的E1A基因，优选病毒基因组中E1A的内源启动子被survivin启动子所替换；和/或
E1A基因序列被修饰从而使E1A蛋白结合Rb蛋白的活性降低或完全缺失，优选的，所述修饰为将E1A基因中编码E1A蛋白第122-129位氨基酸的碱基序列删除，例如将SEQ IDNO：1的序列中第364至387bp的序列删除；
在另一个实施方案中，干扰素为α干扰素、β干扰素或复合干扰素(例如干复津)，优选的，编码所述干扰素的核酸序列如SEQ ID NO：2、3或4所示。
在另一个实施方案中，所述核酸序列与启动子可操作连接，优选的，所述启动子为CMV启动子。
在另一个实施方案中，所述溶瘤病毒为保藏编号为CCTCC NO：V201957的溶瘤病毒，保藏信息如下：保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2019年8月27日，保藏名称：重组人5型腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，保藏编号为CCTCCNO：V201957；或者
所述溶瘤病毒为保藏编号为CCTCC NO：V201958的溶瘤病毒，保藏信息如下：保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2019年8月27日，保藏名称：重组人5型腺病毒rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，保藏编号为CCTCC NO：V201858；或者
所述溶瘤病毒为保藏编号为CCTCC NO：V201871的溶瘤病毒，保藏信息如下：保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2018年12月12日，保藏名称：重组人5型腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，保藏编号为CCTCC NO：V201871。
本发明的第二个方面提供了第一个方面中的溶瘤病毒在制备治疗增生性疾病的药物中的用途，优选的，所述增生性疾病是癌症，例如前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、宫颈癌或者肾癌。
本发明的第三个方面提供了一种药物组合物，其包含药物有效量的第一个方面中的溶瘤病毒，任选的还包含药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，所述药物组合物被配制为通过静脉内、雾化吸入、灌注或者瘤内途径施用。
在另一个实施方案中，其包含约108至1012vp(例如1.5×1010vp)的所述溶瘤病毒。
本发明的第四个方面提供了一种治疗增生性疾病的方法，其包括将第一个方面中的溶瘤病毒或第三个方面中的药物组合物施予有需要的对象，所述对象例如哺乳动物，优选为人；更优选的，所述增生性疾病是癌症，例如前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、宫颈癌或者肾癌。
本发明的第五个方面提供了一种防止或抑制癌细胞转移的方法，其包括将权利要求1至6中任一项所述的溶瘤病毒或权利要求8至10中任一项所述的药物组合物施予有需要的对象，所述对象例如哺乳动物，优选为人；所述癌例如前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、宫颈癌或者肾癌。
本发明的第六个方面提供了一种防止癌症复发的方法，其包括将权利要求1至6中任一项所述的溶瘤病毒或权利要求8至10中任一项所述的药物组合物施予有需要的对象，所述对象例如哺乳动物，优选为人，所述癌症例如前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、宫颈癌或者肾癌。
其中，在上述第四至第六方面的一些具体实施方案中，其中通过静脉内、雾化吸入、灌注或者瘤内途径向所述对象施用约108至1012vp(例如1.5×1010vp)的所述溶瘤病毒，每个疗程施用次数为1-6次(例如1次、2次、3次、4次、5次或6次)，所述施用可以是每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天进行；或者是1天内施用1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次，向所述对象施用的用药疗程数为1-12个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个)。
本发明所提供的重组溶瘤病毒，具有良好的安全性和优异的抑瘤效果，抑瘤效果显著优于现有临床用药索拉菲尼和吉西他滨。相比于单独施用干扰素蛋白和溶瘤病毒空载体，本发明提供的重组溶瘤病毒获得了预料不到的协同效果。此外，本发明的溶瘤病毒还展现出了抑制肿瘤转移和复发的能力，因而具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1显示了各种溶瘤腺病毒基因组的结构示意图。
图2显示了本发明各溶瘤腺病毒所携带目标蛋白的体外表达图。
图3显示了本发明各溶瘤腺病毒对MHC I表达的提高效果，其中图3A为SW780细胞系中的结果，图3B为MCF-7细胞系中的结果。
图4显示了本发明各溶瘤腺病毒在乳腺癌细胞系MDA-MB-231(A)和正常乳腺细胞系MCF-10A中的比复制力。
图5显示了具有不同结构的重组溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的抑制效果比较，其中图5A和5B分别显示了复制型和非复制型对肝癌细胞系Huh-7和肠癌细胞系SW620的抑制效果比较；图5C和5D分别显示了是否携带干扰素序列的溶瘤病毒对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和肺癌细胞系HCC827的抑制效果比较；图5E显示了重组溶瘤腺病毒对正常肝成纤维细胞系HLF的杀伤作用。
图6显示了重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在裸鼠移植瘤模型中对肿瘤生长的抑制作用。其中，图6A显示了SW620裸鼠移植瘤体内模型的结果，图6B和C显示了MDA-MB-231裸鼠移植瘤体内模型的结果；图6D和E显示了HCC827裸鼠移植瘤体内模型中的结果。
图7显示了在乳腺癌细胞系HCC1806裸鼠移植瘤模型中，本发明重组溶瘤腺病毒与空白对照、单用rIFN蛋白、单用空载病毒、以及rIFN蛋白联用和空载病毒联用的方案的比较，其中图7A显示了给药方案，图B显示了各实验组和对照组中移植瘤的体积。
图8显示了本发明各重组溶瘤腺病毒在体内的药效结果；图8A显示了注射侧的肿瘤体积变化；图8B显示了非注射侧的肿瘤体积变化。
图9显示了重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B防止肿瘤复发的效果。图9A显示了在HCC827裸鼠移植瘤体内模型中经过注射rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B后消退的小鼠体内重新移植HCC827细胞后的效果，与对照(PBS)组的比较。图9B显示了实验组不同小鼠个体的肿瘤变化数据；图5C为实验组与对照组中小鼠最终肿瘤体积的统计学比较。
图10显示了重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在人源化免疫系统小鼠移植瘤模型中对肿瘤生长的抑制作用。其中图10A和B显示了对给药侧(右侧)肿瘤的抑制效果，图10C和D显示了对非给药侧(左侧)肿瘤的抑制效果。
图11显示了重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在裸鼠PDX模型中对肿瘤生长的抑制作用。其中图11A显示了该重组溶瘤腺病毒对肺鳞癌PDX的抑制效果，图11B显示了该重组溶瘤腺病毒对肺腺癌PDX的抑制效果，图11C显示了该重组溶瘤腺病毒对三阴乳腺癌PDX的抑制效果。
具体实施方式
本申请所用术语具有与现有技术中该术语相同的含义。为了清楚地表明所用术语的含义，以下给出一些术语在本申请中的具体含义。当本文定义与该术语的常规含义有冲突时，以本文定义为准。
定义
除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。所有在此提及的出版物引入本文作为参考，以用于描述和公开在所述出版物中所报道的细胞系、载体和方法，其可用于本发明。在此没有任何事物可被认为承认了，本发明没有位于依据在前发明的此类公开内容之前的权利。
术语“溶瘤病毒”是指能够在癌症或者具有过度增殖的细胞中选择性复制，从而减缓其生长或者使其死亡的病毒，同时对正常细胞没有影响或影响很小。示例性的溶瘤病毒包括水泡性口炎病毒(VSV)，新城疫病毒(NDV)，单纯疱疹病毒(HSV)，呼肠孤病毒，麻疹病毒，逆转录病毒，流感病毒，辛比斯病毒，痘苗病毒和腺病毒等(参见，例如，Kirn等，Nat.Med.7：781)。(2001)；Coffey等，Science 282：1332(1998)；Lorence等，CancerRes.54：6017(1994)；和Peng等，Blood 98：2002(2001))。”
术语“干扰素”指由多种真核细胞在暴露于各种不同的环境刺激(包括病毒感染或者接触促细胞分裂原)后产生的分泌型蛋白质家族。除了具有抗病毒特性以外，干扰素还显示出影响多种细胞功能。三种主要的干扰素是IFN-a、IFN-β和IFN-γ。干扰素最初是根据其细胞来源(白细胞、纤维原细胞或T细胞)来分类的。白细胞干扰素目前称为IFN-α，纤维原细胞干扰素为IFN-β，T细胞干扰素为IFN-γ。
术语“复合干扰素(consensus interferon)”指一种合成干扰素，其氨基酸序列是所有已知人α干扰素亚型的大致平均的序列。已经报道了，复合干扰素具有比任何天然人IFN-α亚型更好(约5倍)的抗病毒、抗增殖和激活NK细胞的活性。一种示例性的复合干扰素例如干复津，参见美国专利US4695623和US4897471中所公开的序列。
本公开可以使用现有技术中已知的干扰素序列，在一个优选的实施方案中，本公开使用了复合干扰素。
申请人经过深入研究后发现，选择合适的核酸编码序列会影响干扰素蛋白在体内的治疗效果。针对同一个干扰素蛋白，例如复合干扰素，当溶瘤病毒载体中携带不同的干扰素核酸编码序列时，溶瘤病毒体内溶瘤效果会具有不小的差别。并且申请人发现这种效果的差异与生物体密码子的偏好性无关，即这种效果的差异并非由是否采用最适合于人体表达的密码子而导致的。在一个实施方案中，使用了适合原核表达的密码子(例如SEQ ID NO：4所示的IFN-3序列)，同样获得了优异的技术效果，获得了预料不到的技术效果。
本公开使用的复合干扰素的编码序列如下：
IFN-1：
IFN-2：
IFN-3：
本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述药学上可接受的载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于经口、鼻、瘤内、灌注、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、矫味物质和/或芳香物质等作为添加剂。
“施与”或者“施用”意指以在药理学上可用的方式向对象提供物质，例如药物组合物。
向对象提供的药物组合物的剂量，是指足以显示其对于所施用对象产生益处的剂量，在本文中也可以被称为“药物有效量”或“有效量”。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含108至1012vp的溶瘤病毒，例如1×108、1.5×108、2×108、2.5×108、3×108、3.5×108、4×108、4.5×108、5×108、5.5×108、6×108、6.5×108、7×108、7.5×108、8×108、8.5×108、9×108、9.5×108、1×109、1.5×109、2×109、2.5×109、3×109、3.5×109、4×109、4.5×109、5×109、5.5×109、6×109、6.5×109、7×109、7.5×109、8×109、8.5×109、9×109、9.5×109、1×1010、1.5×1010、2×1010、2.5×1010、3×1010、3.5×1010、4×1010、4.5×1010、5×1010、5.5×1010、6×1010、6.5×1010、7×1010、7.5×1010、8×1010、8.5×1010、9×1010、9.5×1010、1×1011、1.5×1011、2×1011、2.5×1011、3×1011、3.5×1011、4×1011、4.5×1011、5×1011、5.5×1011、6×1011、6.5×1011、7×1011、7.5×1011、8×1011、8.5×1011、9×1011、9.5×1011或1×1012vp；以及上述两点间任意的剂量。
在另一个实施方案中，单次向所述对象施用溶瘤病毒的剂量为108至1012vp，例如1×108、1.5×108、2×108、2.5×108、3×108、3.5×108、4×108、4.5×108、5×108、5.5×108、6×108、6.5×108、7×108、7.5×108、8×108、8.5×108、9×108、9.5×108、1×109、1.5×109、2×109、2.5×109、3×109、3.5×109、4×109、4.5×109、5×109、5.5×109、6×109、6.5×109、7×109、7.5×109、8×109、8.5×109、9×109、9.5×109、1×1010、1.5×1010、2×1010、2.5×1010、3×1010、3.5×1010、4×1010、4.5×1010、5×1010、5.5×1010、6×1010、6.5×1010、7×1010、7.5×1010、8×1010、8.5×1010、9×1010、9.5×1010、1×1011、1.5×1011、2×1011、2.5×1011、3×1011、3.5×1011、4×1011、4.5×1011、5×1011、5.5×1011、6×1011、6.5×1011、7×1011、7.5×1011、8×1011、8.5×1011、9×1011、9.5×1011或1×1012vp；以及上述两点间任意的剂量。每个疗程的施用次数为1-6次，例如1次、2次、3次、4次、5次或6次，两次施用的间隔为1-7天，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。
本发明中，病毒剂量的单位为vp(viral particle)，表示病毒溶液中所含有的病毒颗粒数，是病毒的颗粒滴度。
本文所使用的术语“对象”意指动物，包括温血哺乳动物，例如人和灵长类动物；鸟类；驯养的家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验室动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鱼；爬行动物；动物园动物和野生动物等。
应注意，如果本公开提到一个特定的数值，至少会包括该数值，除非文章清楚的表明了其另有所指。当数值表示近似值，应理解为特定的数值形成了另一个实施方案。就如所使用的，“约X”(其中X是一个数值)是指±10％(包含)所列出值。如果存在，所有范围都是包括和可以组合的。
本文使用的术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，“或”、“或者”意指“和/或”。
除非另有说明，任何关于本方法和产品一种实施方案公开的组分、元素、属性或者步骤可以应用于任何其他在此公开的方法和产品。
本公开的每项专利、专利申请、引用的出版物或者本文件中的描述以参考的方式整体并入文本中。
本发明在下面的实施例中进一步的定义。应了解这些实施例仅仅以举例的方式来说明，并不旨在限制本发明的范围。从上面的讨论以及这些例子中，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，而且在不脱离其本质和范围的情况下，能够对本发明做出各方面的改变和修改来使之适应各种各样的用法和条件。
材料与方法
一、重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B和rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B的构建
上述三个病毒的构建过程类似，其区别仅在于构建中使用的复合干扰素的编码序列不同：rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1使用了SEQ IN NO：2所示的编码序列；rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1使用了SEQ ID NO：3所示的编码序列；rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1使用了SEQ ID NO：4所示的编码序列。下面以rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1的构建过程为例，详述重组溶瘤腺病毒的构建过程，只要将rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1中的复合干扰素的编码序列替换为其他两种序列，即得到另外两种溶瘤腺病毒的构建方法。
1、重组质粒pShuttle-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B的构建
委托基因合成公司合成5’端带有NotI酶切位点和3’端带有XbaI酶切位点的核苷酸序列(如SEQ ID NO：5所示)，其中复合干扰素使用了如SEQ ID NO：4所示的编码序列：
使用N0tI、XbaI双酶切，回收酶切后核酸片段，酶切体系为：
37℃水浴2小时。
构建pShuttle-E1A-E1B质粒
用Xho I和Mfe I双酶切质粒pShuttle(上海吉然生物科技有限公司)和腺病毒载体质粒pXC2(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所刘新垣院士惠赠)，酶切体系如下：
Xho I和Mfe I双酶切质粒pShuttle体系：
Xho I和Mfe I酶切质粒pXC2体系：
将上述反应体系置于37℃水浴2h，然后经琼脂糖凝胶电泳，分别回收pShuttle质粒酶切后的大片段和pXC2质粒酶切后的小片段。然后使用连接酶将上述回收产物连接，构建成pShuttle-E1A-E1B质粒，其中连接反应体系如下：
将上述反应体系置于16℃水浴锅中反应2小时。连接产物即为质粒pShuttle-E1A-E1B。
使用NotI、XbaI双酶切pShuttle-E1A-E1B质粒，回收大片段(载体片段)。然后使用Ligation High连接酶(TOYOBO)将酶切后的核酸片段和载体片段连接起来，连接体系为：
16℃水浴2小时，连接产物即为pShuttle-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B。
2、重组质粒pAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B的构建
(1)利用PmeI酶对pShuttle-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B进行单酶切线性化，反应体系如下：
将上述反应体系置于37℃水浴锅中反应1小时，随后继续进行下一步去磷酸化实验。
(2)利用FastAp对步骤(1)中经过线性化的pShuttle-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B质粒进行去磷酸化处理，反应体系如下：
将上述反应体系置于37℃水浴锅中1小时，随后进行下一步转化实验。
(3)在BJ5183感受态细胞中重组腺病毒骨架质粒与线性化的pShuttle-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，从而获得重组质粒pAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，具体步骤如下：
①取上步实验中的线性化的pShuttle-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，转化BJ5183感受态细胞，涂板，挑菌，并摇菌过夜；
②使用质粒少量提取试剂盒对培养的菌液进行质粒提取。
其中，BJ5183感受态细胞的制备方法可参见中国专利申请CN201810651914.2，此处简要描述如下：
用HindIII酶切pBHGE3质粒(购自捷易生物)，使用SpeI酶切pAdEasy-1质粒(购自上海吉然生物科技有限公司)，然后将上述两种酶切后的质粒共转至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，获得携带E3区的重组腺病毒骨架质粒；接着，将该重组腺病毒骨架质粒转入大肠杆菌DH5β中扩增，获得扩增后的重组腺病毒骨架质粒；接着，将所述重组腺病毒骨架质粒转入大肠杆菌BJ5183感受态中，得到携带重组腺病毒骨架质粒的大肠杆菌BJ5183，再将该大肠杆菌制备成感受态，从而得到步骤①中使用的BJ5183感受态细胞。
(4)酶切鉴定。将重组质粒pAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B质粒转入大肠杆菌DH5α感受态中，涂板后挑出单克隆菌落，摇菌培养后提取质粒进行酶切鉴定。酶切反应体系如下：
将上述反应体系置于37℃水浴锅中反应30min，然后电泳鉴定。
3、重组病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B的包装
(1)细胞铺板
在6孔板中培养HEK-293细胞，第2天细胞密度达到60％-80％。
(2)利用PacI酶切重组质粒pAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B进行线性化，反应体系如下：
(3)质粒转染和病毒包装
按照Effectene Transfection Reagent转染试剂盒的说明书进行，取1μg步骤(2)中经过线性化的重组质粒pAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，将其转染入步骤(1)得到的铺在6孔板中的HEK-293细胞。约7-10天后细胞完全病变，此时收集病毒液，于-80℃中保存备用。
4、重组病毒的滴度测定
病毒滴度测定的原理是依据免疫细胞化学法统计hexon染色阳性的细胞数来判定具有感染活性的病毒数量，根据腺病毒滴度试剂盒上的说明书对小扩和纯化后的腺病毒测定滴度。
二、重组溶瘤腺病毒的功能检测
1、目标蛋白表达水平的western检测
(1)细胞感染与样品收获
在6孔板中培养MDA-MB-231细胞，每孔5×105个细胞，于CO2培养箱中培养至第二天。取空载对照病毒rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B及重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B分别以10MOI的接种比例感染培养在六孔板中的MDA-MB-231细胞，每种病毒感染一孔，于CO2培养箱中继续培养24小时。然后弃上清，每孔使用100ul RIPA裂解液裂解细胞，收集裂解液作为测试样品。
(2)蛋白样品预处理
使用BCA蛋白定量试剂盒(购自Thermo)测量(1)步收集的各样品的蛋白浓度，具体操作方法参见试剂盒的使用说明书。然后根据测量结果使用RIPA裂解液调整各样品浓度，使蛋白浓度一致。然后向各样品中加入适量体积的5×SDS蛋白上样缓冲液(购自碧云天)，使终浓度为1×，充分混匀，于100℃金属浴煮10min。样品直接用于western分析或置于-20℃冰箱保存。
(3)Western分析
取预处理完毕的各蛋白样品，以每孔20ug总蛋白的上样量进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后通过Biorad电转槽将凝胶中的样品转移至PVDF膜上。以5％脱脂牛奶封闭30min，然后加入稀释至使用浓度的rIFN抗体(委托华安生物制备)、β-tubulin抗体(购自康为世纪)，4℃摇床孵育过夜。弃一抗，PBST缓冲液洗涤3次，加入稀释至使用浓度的相应二抗(购自碧云天)，室温摇床孵育2h。弃二抗，PBST缓冲液洗涤3次，使用ECL发光显色试剂盒(购自翌圣)显色，具体操作参见试剂盒使用说明书。
2、干扰素调节MHC I表达检测。
(1)细胞铺板与病毒接种
在24孔板中培养SW780、MCF-7细胞，每孔1.5×105个细胞，500ul/孔体系，于CO2培养箱中培养至第二天。取空载对照病毒rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B及重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B分别以1MOI的接种比例感染培养在上述24孔板中的癌细胞，接种体积为100ul/孔。另外每种细胞均设置了不加病毒的空白对照组(PBS组)，处理完细胞后轻轻摇匀，于CO2培养箱中继续培养24h。
(2)样品处理及流式细胞术分析
取上述处理了24h的细胞，弃上清，用1*PBS洗1遍后，以200ul/孔的消化液accutase加入样品孔中。待所有细胞收缩变圆，轻摇飘起后，加入800ul的1*PBS，反复吹散细胞5次，将细胞混合液转移至1.5ml EP管中。以1500r/min离心5min，弃上清，加1ml 1*PBS再洗涤离心一次。然后以60ul/样的抗体工作液(1ul抗体原液：240ul 1*PBS)对加入上述洗涤离心后的细胞中，混匀后室温避光染色30min，同时以未染色的细胞做阴性对照。染色结束后，用1*PBS洗涤离心一次，用2％PFA室温固定10min后进行流式细胞术分析(按仪器操作说明书操作)，上样体积为50ul/样。
3、比复制力测定
(1)细胞铺板与病毒接种
在6孔板中培养乳腺癌细胞系MDA-MB-231、正常乳腺细胞系MCF-10A，分别以1.2×106、8×105细胞/每孔的密度铺板，2ml/孔体系，于CO2培养箱中培养至第二天。取重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B分别以1MOI的接种比例感染培养在上述6孔板中的细胞，每种病毒感染3个复孔，接种体积为100ul/孔，处理完细胞后轻轻摇匀，于CO2培养箱中继续培养72h。
(2)样品收获、预处理及分装
取上述处理了72h的细胞，在6孔板四周封上封口膜后，存入-80℃冰箱。在室温与-80℃之间反复冻融3次处理，并在第3次融化后，用移液枪将细胞吹落，与培养基充分混匀。考虑到培养过程中的液体蒸发，最终需要使用培养基将每孔样品的总体积补至2ml，充分混匀，然后分装为3份(1份用于滴度检测，剩余2份备用)，存入80℃冰箱。
(3)样品滴度测定及复制倍数计算
使用Cell biolabs公司的QuickTiterTM Adenovirus Titer Immunoassay Kit对上述分装的样品选取1份进行滴度检测。检测原理是依据免疫细胞化学法统计hexon染色阳性的细胞数来判定具有感染活性的病毒数量，具体操作方法如下：
1)以2.5*105个细胞/孔的密度将293A细胞接种于24孔板中(1ml/孔)，待细胞贴壁(约24h)后每孔加入100ul梯度稀释后的待测定病毒。以不加病毒的孔作为空白对照，每个梯度做两个复孔，37℃，5％CO2条件下继续培养细胞；
2)培养2天后，取出24孔板，在生物安全柜内吸弃上清，以500ul/孔的量加入-20℃预冷的甲醇，于-20℃冰箱中放置20min；
3)用1*PBS轻柔洗涤细胞3遍，用1％BSA封闭1h；
4)吸弃1％BSA，以250ul/孔的量加入预先稀释好的一抗anti-Hexon于室温下孵育1h；
5)用1*PBS轻柔洗涤细胞3遍，以250ul/孔的量加入预先稀释好的二抗(HRP)于室温下孵育1h；
6)用1*PBS轻柔洗涤细胞3遍，加入1*DAB工作液，室温染色15min；
7)用1*PBS轻柔洗涤细胞2遍，最后再以200ul/孔的量加入1*PBS避免细胞干掉；
8)用显微镜进行拍照，使用10倍物镜及10倍的目镜，每个孔分别选取9个点(上、下、左、右、左上、左下、右上、右下以及正中位置)拍摄照片；
9)计数对应稀释梯度下每个视野有多少病毒单位，以每个视野50个左右病毒单位的梯度为最佳计数梯度，若假设实际计数得到的各视野平均阳性点数为Y，则病毒滴度(ifu/ml)为：135.2×Y×稀释倍数。
每个样品的滴度值乘以样品总体积2ml，即为每个样品孔的总产量。最后计算出每个样品复制倍数，复制倍数＝总产量/起始接种量。
4、结晶紫法检测溶瘤病毒的安全性
将细胞铺于24孔板，一天后用适当MOI的待测重组腺病毒感染细胞，37℃继续培养4天后弃培养基，每孔加入500μL结晶紫染色液(2％结晶紫溶于20％甲醇溶液)，染色30min，在净水中将多余的染液洗净，晾干后拍照。
5、体内药效试验
SW620细胞裸鼠移植瘤模型
实验裸鼠达到6周龄，注射1×106个SW620肿瘤细胞进行成瘤实验，经测量后发现肿瘤大小在80-100mm3左右且体质健康良好时，将小鼠随机分成3组，即PBS组、rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组和Ad-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组，均采用瘤内注射的方式，剂量为1.5×1010vp/只/次，每隔1天注射一次，共4次。每隔3天观察并测量肿瘤大小。
MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤模型
实验裸鼠达到5周龄，注射2×106个MDA-MB-231肿瘤细胞进行成瘤实验，经测量后发现肿瘤大小在80-100mm3左右且体质健康良好时，将小鼠随机分成3组，即PBS组(瘤内给药，每隔1天1次，共4次)、阳性药Sorafenib组(灌胃，单次剂量30mg/kg，每天1次，共14天)和rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组(瘤内给药，剂量为为1.5×1010vp/只/次，每隔1天1次，共4次)，每组8只，每隔3天观察并测量肿瘤大小。
HCC827细胞裸鼠移植瘤模型
实验裸鼠达到5周龄，注射2×106个HCC827肿瘤细胞进行成瘤实验，经测量后发现肿瘤大小在80-100mm3左右且体质健康良好时，将小鼠随机分成4组，即PBS组(n＝8，瘤内给药，每隔1天1次，共4次)、阳性药Sorafenib组(n＝5，灌胃，剂量30mg/kg，每天1次，共14天)、阳性药Gemcitabine组(n＝5，尾静脉注射，剂量120mg/kg，每4天1次，共4次)rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组(n＝5，瘤内给药，剂量1.5×1010vp/只/次，每隔1天1次，共4次)，每隔3天观察并测量肿瘤大小。
HCC1806细胞裸鼠移植瘤模型
实验裸鼠达到5周龄，注射2×106个HCC1806肿瘤细胞进行成瘤实验，经测量后发现肿瘤大小在80-100mm3左右且体质健康良好时，将小鼠随机分成5组，即病毒保存液(Vehicle)组(n＝5，瘤内给药，每隔1天1次，共5次)、重组干扰素rIFN(20ug/只/次)组(n＝5，腹腔注射，每隔1天1次，共5次)，空载溶瘤病毒rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组(n＝5，瘤内给药，剂量1.5×1010vp/只/次，每隔1天1次，共5次)，空载与重组干扰素联合用药rIFN+rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组(n＝5；空载病毒瘤内给药，剂量1.5×1010vp/只/次，每隔1天1次，共5次；rIFN腹腔注射，每隔1天1次，共5次)，重组溶瘤病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组(n＝5，瘤内给药，剂量1.5×1010vp/只/次，每隔1天1次，共5次)，溶瘤病毒第一次给药为分组当天，而重组干扰素第一次给药为分组后第二天，溶瘤病毒给药后每3天观察一次并测量肿瘤大小。
HCC827细胞人源化免疫系统小鼠移植瘤模型
本模型委托澎立生物医药技术(上海)有限公司完成。由澎立生物前期制备的CD34+人源化小鼠将被用于此实验，实验开始动物为无特定病原体(SPF)级别，周龄约22-23周，经鉴定免疫系统人源化构建成功(人CD45+细胞比例大于15％)后，每只小鼠左右两侧各注射2×106个HCC827肿瘤细胞进行成瘤实验，经测量后发现右侧肿瘤大小在80-100mm3左右且体质健康良好时，将小鼠随机分成4组，即Vehicle组(病毒冻存液，n＝6，瘤内给药，每隔1天1次，共5次)、阳性药Gemcitabine组(吉西它滨，n＝6，尾静脉注射，剂量120mg/kg，每4天一次，共4次)、阳性对照PD-1抗体组(受赠于礼进生物医药科技(上海)有限公司，n＝6，腹腔注射，剂量10mg/kg，每周2次，共6次)和rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组(n＝6，瘤内给药，剂量1.5×1010vp/只/次，每隔1天1次，共5次)，两侧成瘤，仅右侧给药。每周观察并测量肿瘤大小2次。
PDX裸鼠移植瘤模型
本模型委托上海立迪生物技术股份有限公司完成。将1例三阴乳腺癌、1例肺鳞癌和1例肺腺癌PDX体内移植瘤的瘤块切成大小约为3mm×3mm×3mm(约50～90mg)的肿瘤组织，并将其接种于5周龄裸鼠皮下。观察接种后小鼠并监测肿瘤的生长，在荷瘤小鼠平均肿瘤体积达到约150mm3时，即进行分组和给药观察。每例PDX模型均随机分成2组，每组3只小鼠。一组为Vehicle组(病毒冻存液，瘤内给药，每隔1天1次，共5次)，一组为rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组(瘤内给药，剂量1.5×1010vp/只/次，每隔1天1次，共5次)。每周观察并测量肿瘤大小2次。
三、中试规模的细胞单产测试
取传代培养的HEK-293细胞，使用DMEM培养基(含10％FBS)扩大培养至17个T175(购自康宁)培养瓶，注意保持各瓶中细胞分配均匀。病毒接种前随机取1个T175培养瓶，弃原培养基，加入5ml胰酶消化后收集细胞，适当稀释后使用细胞计数仪测量细胞浓度，并由此计算出此时1个T175培养瓶中的细胞数。随后，取待测量的重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B进行VP检测(HPLC法)，得到病毒种子浓度。两种待测溶瘤腺病毒分别以400：1、800：1的病毒/细胞比各接种4个T175培养瓶，做好分组标记，共计16个T175培养瓶。CO2培养箱中培养42h后每组收获2个T175方瓶，培养54h后每组收获剩下的2个T175方瓶。收获时，先收集瓶中原培养液作为上清样品，然后每瓶加入5ml病毒保存液，刮取所有细胞至15ml离心管中作为细胞样品。室温到-80℃反复冻融各样品3次，离心取上清2ml用于VP检测。根据上清样品和细胞样品中的VP检测结果求和得到每组总产量，然后除以接种时的细胞数，得到每组的单细胞产量。
实施例1携带复合干扰素基因的重组溶瘤腺病毒的构建
携带复合干扰素基因的重组溶瘤腺病毒结构和构建方法如下：在野生型腺病毒的基础上，将E1A蛋白编码基因中负责编码E1A蛋白122-129位氨基酸的24个碱基对(第364至387bp)删除。删除上述区段后，E1A蛋白不能结合Rb蛋白，从而不能释放E2F并促使宿主细胞进入细胞分裂周期，经过该改造的病毒仅能在Rb异常的肿瘤细胞中选择性复制。使用肿瘤特异性的Survivin启动子替换了E1A的野生型启动子，进一步增强腺病毒的安全性和靶向性。将复合干扰素(干复津)蛋白的表达框序列(分别如SEQ ID NO：2、3和4所示)插入上述腺病毒载体，从而最终得到了获得携带复合干扰素基因的重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B(含有SEQ ID NO：2所示的表达框)、rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B(含有SEQ ID NO：3所示的表达框)和rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B(含有SEQ ID NO：4所示的表达框)。
随后将以上三个病毒进行保藏，保藏单位是中国典型培养物保藏中心(地点中国武汉)，具体保藏信息如下：
1)保藏日期：2018年12月12日，保藏名称：重组人5型腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，保藏编号为CCTCC NO：V201871；
2)保藏日期：2019年08月26日，保藏名称：重组人5型腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，保藏编号为CCTCC NO：V201957；
3)保藏日期：2019年08月26日，保藏名称：重组人5型腺病毒rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，保藏编号为CCTCC NO：V201958。
此外，作为对照，还构建了不带有rIFN表达框的空载病毒rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B。上述病毒构建体的结构如图1所示。
实施例2重组溶瘤腺病毒的目标蛋白表达水平和目标蛋白功能测试
为了比较实施例1中构建的携带不同复合干扰素表达框的重组溶瘤腺病毒外源治疗基因表达能力，即表达复合干扰素rIFN蛋白的能力，分别取rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B和rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，以10MOT感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，感染24小时后裂解细胞收集蛋白样品，进行Western Blotting分析。
结果如图2所示，所有携带rIFN编码序列的重组溶瘤病毒均能够表达出目标蛋白rIFN，而空载病毒则并没有可检测的蛋白条带，这表明实施例1构建的重组溶瘤病毒能够在细胞内正常的发挥功能。此外，从图2中还可以看出重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B表达外源治疗基因rIFN的水平最高，其次为rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，而rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B最低。这表明了目标蛋白编码序列的不同会影响目标蛋白的表达量。
接下来检测了上述表达的rIFN蛋白是否具有正常的功能。由于干扰素能够上调I型主要组织相容性复合物(MHC I，又称HLA-ABC)的表达。因此接下来以MHC I的表达量变化为标准，比较了各重组溶瘤腺病毒所表达的外源重组干扰素rIFN的功能。
取重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B和rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，分别以1MOT感染人膀胱癌细胞系SW780，感染24小时后收集细胞，经染色后利用流式细胞仪分析。结果如图3A所示，PBS组和空载病毒rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组几乎检测不到MHC I的表达；而所有能够表达rIFN的重组溶瘤腺病毒均能够明显上调MHC I的表达。这表明重组溶瘤腺病毒表达得到的rIFN具有正常的活性。其中，rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B与rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B相比于rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B能够更显著的上调MHC I的表达。在人乳腺癌细胞系MCF-7中得到了同样的结果(图3B)。
实施例3重组溶瘤腺病毒的肿瘤靶向性测试
如实施例1所述，三个重组溶瘤腺病毒均经过了复制靶向性改造，从而仅在肿瘤细胞中复制。而是否能够有效的靶向肿瘤细胞进行复制，则与溶瘤病毒的实际临床治疗效果密切相关。本实施例则测试了各重组溶瘤腺病毒在乳腺癌细胞系MDA-MB-231以及正常乳腺细胞MCF-10A中的复制能力。
本实施例中，病毒的复制能力以“比复制力”和“复制靶向系数”进行测量。“比复制力”为溶瘤腺病毒感染宿主细胞一定时间后，产生的子代病毒数与原始感染的病毒数之比，用于定量描述溶瘤腺病毒在宿主细胞中的复制能力；“复制靶向系数”为溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中的比复制力除以其在正常细胞中的比复制力，用于定量描述溶瘤腺病毒的肿瘤靶向性复制。
具体地，各重组溶瘤腺病毒均以1MOI感染宿主细胞，感染72小时后收集子代病毒，然后测量子代病毒的滴度，与原始感染滴度相比得到比复制力。再根据复制靶向系数的定义，由各病毒在肿瘤细胞和正常细胞中的比复制力计算复制靶向系数。
结果如表1和图4所示，这三个重组溶瘤腺病毒均能够更多的在癌细胞系MDA-MB-231中进行复制，比复制力均较高，其中rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B和rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B略高于rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B；而在正常细胞系MCF-10A中的比复制力均较低，其中rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B的比复制力最低。以上结果表明这三个重组溶瘤腺病毒在正常细胞中的复制能力较弱。而rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B虽然在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的比复制力稍微低于rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B和rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，但由于在乳腺正常细胞MCF-10A中具有显著更低的比复制力，从而使得rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B具有最高的复制靶向系数23.36，远高于另外两个重组溶瘤腺病毒。也就是说rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B的肿瘤细胞靶向性最好，具有最高的安全性。
表1各重组溶瘤腺病毒的复制靶向系数
| 病毒名称 | 复制靶向系数 |
| rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B | 23.36 |
| rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B | 8.15 |
| rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B | 9.64 |
实施例4重组溶瘤腺病毒能够特异性的杀伤癌细胞
本实施例以实施例2中验证的具有中等复制靶向系数的重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B为例，研究了本发明重组溶瘤腺病毒对于癌细胞和普通细胞的作用。作为对照，本实施例进一步构建了删除E1区的非复制型腺病毒，同时在该载体上插入IFN-3表达框所得到的携带IFN-3基因的非复制型重组腺病毒Ad-IFN-3(见图1)。
首先研究了rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B和Ad-IFN-3分别对肝癌细胞系Huh-7的杀伤作用。如图5A所示，rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B对肝癌细胞的杀伤能力显著强于非复制型病毒Ad-IFN-3，当MOI为1时rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B即可杀伤一半以上的Huh-7细胞，优于MOI为10时的Ad-IFN-3。
接下来，在结肠癌细胞系SW620中，比较了复制型和非复制型溶瘤腺病毒的杀伤作用。如图5B所示，rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B杀伤结肠癌细胞系SW620的能力显著强于非复制型病毒Ad-IFN-3。当MOI为0.1时rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B即可杀伤一半左右的SW620细胞，优于MOI为10时的Ad-IFN-3。
接下来，本实施例进一步比较了溶瘤腺病毒是否携带干扰素序列时，对癌细胞的杀伤作用，如图5C所示，rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B杀伤乳腺癌细胞系MDA-MB-231的能力显著强于空载对照病毒rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B。当MOI为0.5时，rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B即可杀伤一半左右的MDA-MB-231细胞，与MOI为5时的rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B基本一致。
在肺癌细胞系HCC827中，比较了rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B和空载对照病毒rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B的杀伤作用。如图5D所示，结果表明rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B杀伤肺癌细胞系HCC827的能力显著强于空载对照病毒rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B。当MOI为5时rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B即可几乎杀伤全部的HCC827细胞，强于MOI为20时的rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B的效果。
相反，对于正常细胞人肝成纤维细胞系HLF，如图5E所示，重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B与相应空载对照病毒均不杀伤HLF细胞。
以上结果表明了本发明的重组溶瘤腺病毒能够特异性的杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有影响，具有良好的安全性。
实施例5重组溶瘤腺病毒显著抑制裸鼠移植瘤的生长
本实施例测试了rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B对SW620裸鼠移植瘤模型的肿瘤抑制情况，结果如图6A所示，重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在SW620裸鼠移植瘤体内模型中也显示出显著好于携带IFN-3基因的非复制型腺病毒Ad-IFN-3的药效。
进一步测试了重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在MDA-MB-231裸鼠移植瘤体内模型的效果，如图6B和C所示，该重组溶瘤腺病毒显示出极好的药效，几乎全部消灭了移植瘤，抑瘤率高达96.4％。
随后测试了重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在HCC827裸鼠移植瘤体内模型中的效果，如图6D和E所示，该溶瘤腺病毒表现出了极好的药效，显著好于阳性对照药索拉菲尼和吉西他滨，完全消灭了移植瘤，抑瘤率达到了100％。
实施例6重组溶瘤腺病毒对肿瘤的抑制作用表现出协同效应
本实施例验证了本发明的重组溶瘤腺病毒(rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B)，能够获得比单独使用rIFN蛋白、空载溶瘤病毒、以及rIFN蛋白与空载溶瘤病毒联用更好的效果，表明本发明结构的重组溶瘤病毒能够获得预料不到的协同效果。
具体地，选择免疫细胞浸润较少的三阴乳腺癌细胞系HCC1806裸鼠移植瘤进行体内药效测试。每只裸鼠皮下注射2×106个HCC1806细胞进行皮下成瘤，待肿瘤体积长到约90mm3时随机分组，开始给药处理。给药方案如图7A所示，Vehicle对照及各重组溶瘤腺病毒于分组当天开始给药，瘤内注射给药，给药剂量为1.5×1010VP/次/只(50μL/次/只)，每隔一天给药一次，共给药五次。重组干扰素蛋白于分组后一天开始给药，腹腔注射给药，给药剂量为20μg/次/只，每隔一天给药一次，共给药五次。每隔三天测量一次肿瘤大小。
结果如图7B所示，与阴性对照Vehicle相比，单独施用重组干扰素蛋白无明显抑瘤效果，与之相比，单用空载溶瘤腺病毒能够产生一定的抑瘤效果，而如果进一步将重组干扰素蛋白与空载溶瘤腺病毒联合使用，能够获得比单独使用其中任何一种更强的抑瘤效果。不过，本发明的重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B获得了最佳的抑瘤效果，与二者联用的方案相比具有统计学上的极显著差异(**)。以上结果表明，本发明所构建的携带rIFN治疗基因的重组溶瘤腺病毒产生了协同效果。
实施例7重组溶瘤腺病毒在体内能够实现对肿瘤细胞的全局抑制作用
本实施例验证了重组溶瘤腺病毒在体内对肿瘤细胞的抑制并不局限于施药注射部位，而是能够在非给药部位同样产生令人惊讶的肿瘤抑制效果。
具体地，选择三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型，同时进一步构建了携带天然IFN-β的重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-β-SP-E1A(Δ24bp)-E1B作为药效的对照。每只裸鼠左右双侧皮下成瘤，各侧注射2×106个MDA-MB-231细胞，待左侧肿瘤体积长到约90mm3时随机分组，开始给药处理。Vehicle对照及各重组溶瘤腺病毒均于分组当天开始给药，左侧瘤内注射给药，给药剂量为1.5×1010VP/次/只(50μL/次/只)，每隔一天给药一次，共给药五次。右侧不给药，左右侧肿瘤每隔三天测量一次。
对于给药侧(左侧)，如图8A所示，至实验结束时，各携带干扰素基因的重组溶瘤腺病毒几乎都可以完全消除移植瘤，空载溶瘤腺病毒同样也表现出对移植瘤生长的显著抑制作用。进一步如表2所示，在给药后的第11天(即图8A和表2中的Day 19)，阴性对照Vehicle组、空载溶瘤腺病毒rAd-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组以及重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组均无移植瘤被消除，重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组和携带天然IFN-β的重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-β-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组均有40％的移植瘤被消除，只有重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组所有的移植瘤均被消除。在实验结束时，仅有重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组和rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B组所有的移植瘤均被消除。由上可知，在这几种重组溶瘤腺病毒中，rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B起效最快并且能够达到最佳的肿瘤抑制效果(与rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B并列，均完全消除肿瘤细胞)。
表2各处理组在19天和28天时的肿瘤消退个体数量
对于非给药侧(右侧)，如图8B所示，空载溶瘤腺病毒完全没有抑瘤效果，携带天然IFN-β的重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-β-SP-E1A(Δ24bp)-E1B有一定的抑瘤效果。相比rAd-IFN-β-SP-E1A(Δ24bp)-E1B，本发明所构建的三个重组溶瘤病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-2-SP-E1A(Δ24bp)-E1B、rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B产生了明显更好的抑瘤效果，获得了统计学上的显著差异(*)。上述三种重组溶瘤腺病毒之间无明显的药效差异。
由此可见，本发明的重组溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤具有全局性，并不仅限于局部注射位置，对于癌症的临床治疗具有不可估量的价值，例如用于肿瘤转移的治疗。
实施例8重组溶瘤腺病毒能够有效防止肿瘤复发
为了了解本发明溶瘤腺病毒的治疗效果持续时间，选取实施例5中经瘤内注射rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B使移植瘤全部消退的HCC827裸鼠移植瘤模型小鼠再次单侧注射2×106个HCC827肿瘤细胞进行成瘤实验。对照组为相同周龄的未经处理的裸鼠单侧注射2×106个HCC827肿瘤细胞进行成瘤实验，成瘤后两组均不作任何处理，每周测量肿瘤体积两次。如图9所示，结果显示，与对照组相比，实验组中移植瘤生长被显著抑制，最大仅能长至平均体积不到100mm3，然后开始消退直至再次完全消除。以上结果表明rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B治疗后的小鼠中存在明显的免疫记忆，可以快速清除后期出现的同样的肿瘤细胞，具有很好的防止肿瘤复发的作用。
实施例9重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B显著抑制人源化小鼠移植瘤的生长
为了进一步测试重组溶瘤腺病毒在更接近人体免疫环境下的抑瘤效果，本实施例在人源化免疫系统的小鼠移植瘤模型中测试了本发明重组溶瘤腺病毒的抑瘤能力(本实施例选择了rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B作为测试对象)。在人源化免疫系统的小鼠背部双侧皮下注射人HCC827细胞，形成移植瘤，但只对右侧肿瘤进行重组溶瘤腺病毒给药，左侧不做任何处理。
结果如图10所示，测试组右侧(给药侧)移植瘤在瘤内注射重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B后体积开始逐步缩小，实验结束时抑瘤率达到了96.4％，显著强于阳性对照药吉西他滨和PD-1抗体蛋白(图10A和B)。与实施例7的结果类似，测试组左侧(非给药侧)移植瘤在右侧瘤内给药后体积也开始逐步缩小，实验结束时抑瘤率也达到了92.5％的水平，同样显著强于阳性对照药吉西他滨和PD-1抗体蛋白(图10C和D)，表明重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B即使在更接近人体的复杂状态下，仍然表现出极佳的肿瘤杀伤效果且不仅限于局部注射位置，展现了不可估量的临床应用价值。
实施例10重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B显著抑制PDX裸鼠移植瘤的生长
为了进一步测试重组溶瘤腺病毒在更接近临床真实情况(肿瘤存在很强的异质性)下的抑瘤效果，本实施例在临床病人来源的移植瘤(PDX)裸鼠移植瘤模型中测试了本发明重组溶瘤腺病毒的抑瘤能力(本实施例选择了rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B作为测试对象)，共选取肺腺癌PDX、肺鳞癌PDX和三阴乳腺癌PDX各1例进行测试。
结果如图11所示，重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在肺腺癌PDX(图11A)、肺鳞癌PDX(图11B)和三阴乳腺癌PDX(图11C)模型中均显示了优异的肿瘤杀伤效果，实验结束时的抑瘤率分别为98.7％、97.0％和97.5％。表明重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B即使用于治疗具有高度异质性的临床来源的肿瘤，仍然表现出优异的肿瘤杀伤效果。
实施例11重组溶瘤腺病毒的中试规模单产检测
重组溶瘤腺病毒作为一种药物，需要通过发酵才能够大规模生产。中试规模的细胞单产不仅是判断是否能通过发酵生产的依据，也是药物经济性的重要指标。因此本实施例在中试规模水平测试了重组溶瘤腺病毒的细胞单产。
细胞单产测试使用的工程细胞株为业内常用的ATCC来源的HEK-293细胞，待测试病毒以不同的接种比(VP/cell)接种到一定数量的工程细胞株中，然后在接种后的42、54小时裂解细胞收集子代病毒，测量子代病毒的VP数，除以当时接种的细胞数即得到细胞单产。
结果如表3所示，测试的重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B和rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B均能够实现工业规模的细胞单产。其中，重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在接种42小时后的细胞单产即达到最高值，接种54小时后的细胞单产反而下降，这表明该重组溶瘤腺病毒的发酵速度更快，这就意味着工业化生产中，可以以更短的时间可完成发酵，能够节省成本；相比较而言，rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在接种54小时后的细胞单产才达到峰值，发酵速度低于rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B。而且rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在第42小时时达到的单产峰值高于rAd-IFN-3-SP-E1A(Δ24bp)-E1B在第56小时达到的单产峰值，这意味着病毒的生产效率也更高。由此可见，就细胞单产而言，重组溶瘤腺病毒rAd-IFN-1-SP-E1A(Δ24bp)-E1B更有优势。
表3重组溶瘤腺病毒的细胞单产量
Claims (17)
1.一种溶瘤病毒，其包含编码干扰素的核酸序列，所述干扰素由SEQ ID NO：2、3或4所示的核酸序列编码。
2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述病毒是腺病毒。
3.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述病毒包含以survivin启动子驱动的E1A基因；和/或E1A基因序列被修饰从而使E1A蛋白结合Rb蛋白的活性降低或完全缺失。
4.根据权利要求3所述的溶瘤病毒，其中所述病毒基因组中E1A的内源启动子被survivin启动子所替换。
5.根据权利要求3所述的溶瘤病毒，其中所述E1A基因中编码E1A蛋白第122-129位氨基酸的碱基序列删除。
6.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述核酸序列与启动子可操作连接。
7.根据权利要求6所述的溶瘤病毒，其中所述启动子为CMV启动子。
8.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCC NO：V201871、CCTCC NO：V201957或CCTCC NO：V201958。
9.权利要求1至8中任一项所述的溶瘤病毒在制备治疗增生性疾病的药物中的用途，其中所述增生性疾病是癌症。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症选自前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、宫颈癌和肾癌。
11.一种治疗癌症的药物组合物，其包含药物有效量的权利要求1至8中任一项所述的溶瘤病毒，任选的还包含药学上可接受的载体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为通过静脉内、雾化吸入、灌注或者瘤内途径施用。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其包含约108至1012vp的所述溶瘤病毒。
14.权利要求1至8中任一项所述的溶瘤病毒或权利要求11至13中任一项所述的药物组合物在制备防止或抑制癌细胞转移的药物中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述癌选自前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、宫颈癌和肾癌。
16.权利要求1至8中任一项所述的溶瘤病毒或权利要求11至13中任一项所述的药物组合物在制备防止癌症复发的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述癌症选自前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、淋巴癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、宫颈癌和肾癌。
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