CN111607571B

CN111607571B - 一种特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用

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Publication number: CN111607571B
Application number: CN201910140498.4A
Authority: CN
Inventors: 魏继武; 张永辉; 吴俊华; 张海林; 董杰
Original assignee: Nanjing Weiyade Biomedical Co ltd
Current assignee: Nanjing Weiyade Biomedical Co ltd
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: CN111607571A

Abstract

本发明涉及生物制药与肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L及其应用。本发明公开了一种新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的设计和构建方法，成功获得了一株新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L，该病毒可以在肿瘤细胞内选择性复制，并且能够高表达可溶性蛋白sCD137L，该蛋白能够分泌到细胞外肿瘤微环境局部，激活病毒所招募的浸润性淋巴细胞的共刺激信号受体CD137，发挥生物学功能。实验表明，本发明的新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L具有很强的活化抗肿瘤免疫作用，具有显著的抗肿瘤活性和安全性，有非常高的开发抗肿瘤药物的前景和价值。

Description

一种特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药和肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。

背景技术

癌症是对人类生命健康危害最大的疾病之一，我国每年新增癌症病例400 多万，近300万人死于癌症。抗癌药物的研发一直是药学研究的热点，包括传统的化疗，本世纪初涌现的小分子靶向抗癌药物治疗，发展到目前颇具突破性肿瘤免疫治疗。

抗肿瘤免疫治疗不断出现的令人振奋的临床研究结果，给肿瘤患者带来了希望。免疫系统具有识别并清除异己的能力，肿瘤在发生发展过程中不仅通过多种途径抑制免疫系统的先天性免疫反应，也通过限制自身“新抗原的展示”和启动免疫检查点等诸多方法来“麻痹”抗肿瘤的免疫效应细胞，从而逃避免疫识别和免疫清除。T细胞的活化除了TCR介导的第一信号，还需要一些特异性的共刺激分子辅助。如果缺少共刺激分子提供的信号，T细胞不能完全活化并执行抗肿瘤作用。效应T细胞膜表面的CD137是一个重要的免疫共刺激分子。利用抗体激活该通路，可以活化抗肿瘤免疫。然而，仅仅单独活化CD137通路治疗肿瘤的效果局限；更重要的是，系统性给与激活CD137的抗体，由于缺乏靶向性，使非肿瘤部位的效应T细胞，比如身体其它正常组织，也同样被活化，往往引起免疫活化过度，释放大量细胞因子导致严重全身反应(细胞因子风暴)。

病毒作为外来侵入颗粒，能够有效激活机体的天然免疫和适应性免疫。随着溶瘤病毒T-Vec在2015年底被FDA批准上市，用于复发黑色素瘤不能手术患者的治疗，在肿瘤局部注射。溶瘤病毒介导的抗肿瘤免疫治疗受到高度关注。我们设想，溶瘤病毒免疫疗法是否可以使肿瘤对活化效应T细胞CD137的治疗更加敏感，从而解决单独活化CD137抗肿瘤效果不理想的难题。

另外，利用溶瘤病毒在肿瘤局部注射(目前批准的溶瘤病毒都是肿瘤局部注射)，并能够在肿瘤细胞内选择性复制的巨大优势，构建一个新型的重组溶瘤病毒，使其在肿瘤局部高表达淋巴细胞的活化型受体CD137的配体－－CD137L 分子的胞外区(sCD137L)，该分子不同于膜结合型CD137L，能够被分泌到细胞外，与T细胞表面的活化型受体CD37特异性地结合并激活T细胞，起到有效的抗肿瘤免疫作用。溶瘤病毒所表达的sCD137L能够被局限在肿瘤的局部微环境，从而避免引起其它非肿瘤组织中的淋巴细胞被激活，有效降低“脱靶”造成的免疫过激性“误伤”，提高治疗的安全性。

本发明设计了一种构建新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的方法，获得了一株新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L，该病毒可以在肿瘤细胞内和肿瘤部位特异性复制，并且能够高表达活化型配体分子CD137L的胞外区 (sCD137L)，该蛋白能够被分泌到细胞外，在肿瘤局部特异性激活效应T细胞上的CD137，发挥活化免疫的生物学功能。药理学实验表明，本发明的新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L具有很强的活化抗肿瘤免疫作用，能产生显著的抗肿瘤作用，具有非常高的开发抗肿瘤药物的前景和价值。

目前，缺乏一种能够同时提供T细胞活化第二信号的特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够同时传递T细胞活化第二信号的特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明的一种激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，所述的病毒在肿瘤细胞内复制，并且表达和分泌可溶性蛋白，所述的可溶性蛋白为结合CD137的CD137L。

进一步地，所述的可溶性蛋白为sCD137L，sCD137L的氨基酸序列和核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示。

本发明所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的复制型溶瘤腺病毒能够溶瘤。

本发明所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备活化抗肿瘤免疫药物中的应用。

本发明所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备刺激 IFN-γ表达药物中的应用。

本发明所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述的肿瘤为肝癌、腹水癌、黑色素瘤或者乳腺癌。

8.一种激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)AD5 sCD137L质粒构建：将构建好的穿梭载体AD5-pShuttle-sCD137L用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，使用含50ug/ml卡那霉素LB平板的进行筛选，挑取阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得AD5 sCD137L质粒；

(2)AD5 sCD137L病毒拯救：AD5 sCD137L质粒使用PacI线性化，纯化后6孔板中1ug/well转染293T细胞，5％CO₂、37℃培养，2天后将细胞消化后转入10cm平皿，2-3天换液，至80％细胞出现病变，使用10ml培养基将细胞吹下收集至15ml离心管，反复冻融2次，3000rpm/min离心15min，收集病毒上清-80℃保存做为毒种；

(3)病毒扩增：取病毒种液50ul加入60％293T细胞10cm平皿中，5％CO₂ 37℃培养，细胞密度至90％以上，按照1传3比例传代，直至80％细胞出现病变，大约有10个平皿细胞，按上述方法收病毒，使用氯化铯密度梯度离心纯化病毒；使用TCID50方法进行滴度测定。

进一步地，在步骤(1)中，AD5 sCD137L病毒构建

CD137L胞外区(sCD137L)的基因克隆以及携载sCD137L基因的腺病毒穿梭质粒的构建

小鼠CD137L属于膜蛋白，其结构依次是:N端信号肽-胞外区-跨膜区-胞内区C端；CD137L与CD137结合的功能单位是胞外区，使用CD33的N端信号肽序列和CD137L胞外区序列；

可溶性蛋白sCD137L的基因克隆：分别设计合成引物CD137L-F、CD137L-R、使用CD137L-F和CD137L-R引物，以小鼠脾脏cDNA为模板扩增得到片段EXO-CD137L；所述的EXO-CD137L的氨基酸序列和信号肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；所述的EXO-CD137L的核苷酸序列和信号肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

进一步地，在步骤(1)中，携载可溶性蛋白基因的腺病毒穿梭质粒AD5-pShuttle-sCD137L载体的构建：使用Infusion技术将sCD137L片段与 AD5-pShuttle(pZD55)连接；具体步骤：首先使用限制性内切酶BglII对 AD5-pShuttle(pZD55)线性化，纯化后片段按照sCD137L：AD5-pShuttle的2:1 比例使用Infusion试剂盒(clontech lab.Inc.)进行连接，后经转化扩增验证获得携载sCD137L基因的腺病毒穿梭质粒AD5-pShuttle-sCD137L。

有益效果：本发明的新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L具有很强的激活抗肿瘤免疫作用，能够刺激IFN-γ高表达。动物模型显示，新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L具有很强的抗肿瘤的作用，可以用来制备抗肿瘤药物。

与现有技术相比，本发明具有如下优点:

(1)本发明提供了一种新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的设计和构建方法，成功获得了一株新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L，该病毒可以在肿瘤细胞内和肿瘤部位选择性复制，并且能够高表达活化型配体分子CD137L 的胞外区(sCD137L)，该蛋白能够分泌到细胞外，在肿瘤局部特异性地活化效应淋巴细胞上的CD137，发挥活化免疫的生物学功能。

附图说明

下面将结合附图进一步说明，附图中：

图1为本发明的表达可溶性CD137L的重组溶瘤腺病毒的构建。(A)重组溶瘤腺病毒AD5con和AD5 sCD137L的基因结构原理图。(B)B16/F10小鼠黑色素瘤细胞分别感染AD5con和AD5 sCD137L，MOI＝10，48h后，被感染细胞的上清被收集起来，通过western blot的方法检测可溶性CD137L的表达与分泌，数据代表三次独立性重复实验。GFP,绿色荧光蛋白；E1A，病毒早期区域1 复制元件(early region 1)；sCD137L，分泌型CD137L蛋白。

图2为本发明的重组溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的复制与溶瘤。(A)B16/F10 小鼠黑色素瘤细胞株、H22小鼠肝癌腹水瘤细胞株、Hepa1-6小鼠肝癌细胞株、 LM3人肝癌细胞株分别感染AD5con和AD5 sCD137L，感染复数(MOI)为10，分别在12h，24h，36h，48h，60h，72h收取细胞，提取病毒基因组DNA，通过 Q-PCR检测AD5的拷贝数。(B)B16/F10小鼠黑色素瘤细胞、H22小鼠肝癌腹水瘤细胞、Hepa1-6小鼠肝癌细胞、LM3人肝癌细胞分别感染AD5con和AD5sCD137L后，MTT检测细胞活率。数据代表三次独立性重复实验。

图3为本发明的重组溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的体内抗肿瘤作用(B16/F10 黑色素瘤实体瘤模型)。(A)在B16/F10皮下瘤模型中评估AD5 sCD137L的抗肿瘤效果，实验方案图如图所示。(B)C57BL/6右侧皮下接种5×10⁶B16/F10 小鼠黑色素瘤细胞，瘤内注射5×10⁸pfu AD5con和AD5 sCD137L，肿瘤大小被实时监测，数据代表三次独立性重复试验。Pfu，空斑形成单位；Mock，未处理组；n.s.无统计学差异；**，p<0.01。

图4为本发明的重组溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的体内抗肿瘤作用(乳腺癌实体瘤模型)。(A)在乳腺癌4T1皮下瘤模型中评估AD5 sCD137L的抗肿瘤效果，实验方案图如图所示。(B)雌性Balb/c小鼠右侧皮下接种5×10⁴乳腺癌细胞，待肿瘤长至5x 5mm，瘤内注射5×10⁸pfu AD5con和AD5 sCD137L，每两天测量肿瘤大小。数据代表三次独立性重复试验。Pfu，空斑形成单位； Untreated，未处理组；n.s.无统计学差异；**p<0.01。

图5为本发明的重组溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的体内抗肿瘤作用(H22肝癌腹水瘤模型)。(A)在H22肝癌腹水瘤模型中评估AD5 sCD137L的抗肿瘤效果，实验方案图如图所示。(B)C57BL/6腹腔接种5×10⁶H22小鼠肝癌腹水瘤细胞，待小鼠出现腹水后，给予腹腔注射5×10⁸pfu AD5con和AD5 sCD137L，每天监测小鼠生存。(C)被治愈的小鼠在90天后，腹腔再次接种5×10⁶H22 小鼠肝癌腹水瘤细胞，以未经任何处理的小鼠腹腔接种同样数量的H22肝癌细胞作为阴性对照，监测小鼠生存情况。数据代表三次独立性重复实验。Pfu，空斑形成单位；Mock，未处理组；

之前未接种过肿瘤的小鼠；n.s.无统计学差异；**p<0.01。

图6为本发明的重组溶瘤腺病毒AD5 sCD137L增强免疫活化。通过H22 肝癌腹水瘤模型，评估AD5 sCD137L的免疫活化作用，实验方案图如图5(A) 所示。(A)C57BL/6小鼠腹腔接种5×10⁶H22小鼠肝癌腹水瘤细胞，小鼠出现腹水后，给予腹腔注射5×10⁸pfu AD5con和AD5 sCD137L，14天后抽取小鼠腹水，Elisa检测腹水中的可溶性CD137L表达水平。(B)ELISpot检测活化免疫细胞数和强度。数据代表三次独立性重复实验。Mock，未处理组；**p<0.01； ***p<0.001。

图7AD5 sCD137L工作模式图。溶瘤腺病毒感染肿瘤细胞后，导致肿瘤细胞裂解，肿瘤相关抗原(TAA)释放，同时能在肿瘤微环境中分泌可溶sCD137L。 TAA经抗原提呈细胞的处理加工，在MHC(主要组织相容性复合体)分子的辅助下与T细胞的T细胞受体分子(TCR)结合，产生T细胞激活的第一信号。同时sCD137L通过特异性激活CD137信号通路，产生T细胞活化的第二信号。此双信号系统，充分保证能够识别肿瘤抗原的T细胞被激活，最终形成有效的抗肿瘤免疫应答。

具体实施方式

通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

实施例1

新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的构建、制备、抗肿瘤免疫活化评估和抗肿瘤作用评价

1实验材料和方法

1.1实验材料和仪器

实验细胞系

人胚肾细胞株293T、人肝癌细胞LM3、小鼠肝癌细胞株Hepa1-6和H22；小鼠黑色素瘤细胞株B16/F10；小鼠乳腺癌细胞4T1。上述细胞均使用含10％胎牛血清，100U/I青霉素和1mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基培养于37℃、5％ CO₂的培养箱中。

1.1.1实验仪器

生物安全柜(

III advance，Class II Biological SafetyCabinet，The Baker Company)，二氧化碳培养箱(FORMA SERIES II WATER JACKET CO₂incubator，Thermo)，低温离心机(HERAEUS MEGAFUGE 1.0R，Thermo)，垂直电泳槽(BIO-RAD)，电泳仪(BIO-RAD)，半干转-转膜仪(BIO-RAD)，免疫印迹曝光系统(Alpha Innotech)，PCR仪(PCR Thermal Cycler Dice，TaKaRa)，实时定量PCR仪及分析软件(ABI384，SequenceDetection Software，Version 1.3.1)，酶标仪(VERSA max microplate reader)，整套移液器(eppendorf和 RAININ)，细胞计数仪(Countstar Automated cell counter，Inno-Alliance Biotech Inc.，Wilmington，USA)，流式细胞仪(FACSCalibur，Becton，Dickinsonand Company，USA)，FlowJo software(Version 7.6.5，Tree Star Inc，Ashland，Oregon)，微孔板振荡器(QiLinBeiEr)，核酸纯度浓度检测仪(Biophotometer plus， eppendorf)，数显恒温水浴锅(国华电器)。

1.1.2主要实验试剂及耗材

引物均由金斯瑞公司合成。肿瘤细胞培养所需的DMEM高糖培养基，双抗，血清均购自Invitrogen(上海)公司。定量RT-PCR试剂Faststart Universal SYBR Green Master(Roche，04913914001)。Western Blot所需试剂耗材：蛋白酶抑制剂 (Roche，11873580001)，细胞裂解液(碧云天：P0013)，PVDF膜(Roche， 03010040001)，WB ImmobilonECL发光液(Millipore，WBKLS0500),一抗稀释液(碧云天，P0023A)，HRP标记的二抗(Multisciences，GAR007and GAM007， 1:5000稀释)，其余所需试剂均为国产分析纯，购自南京大学化学化工学院。台盼蓝(碧云天，C0011)，Opti-MEM购自Invitrogen(上海)公司。Western Blot 抗体:anti-His(金斯瑞，MB001，1:5000稀释)。

1.1实验方法

1.1.1.1 AD5 sCD137L病毒构建

小鼠CD137L属于膜蛋白，其结构依次是:N端信号肽-胞外区-跨膜区-胞内区C端。CD137L与CD137结合的功能单位是胞外区，使用CD33的N端信号肽序列和CD137L胞外区序列(见图1)；

可溶性蛋白sCD137L的基因克隆：分别设计合成引物CD137L-F、 CD137L-R、使用CD137L-F和CD137L-R引物，以小鼠脾脏cDNA为模板扩增得到片段EXO-CD137L。

sCD137L、EXO-CD137L和信号肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1-3 所示；sCD137L、EXO-CD137L和信号肽的DNA序列如序列表SEQ ID NO:4-6 所示。基因模板构建相关引物如表1所示：

表1

携载可溶性蛋白基因的腺病毒穿梭质粒AD5-pShuttle-sCD137L载体的构建：使用Infusion技术将sCD137L片段与AD5-pShuttle(pZD55)连接。具体步骤：首先使用限制性内切酶BglII对AD5-pShuttle(pZD55)线性化，纯化后片段按照sCD137L：AD5-pShuttle的2:1比例使用Infusion试剂盒(clontech lab. Inc.)进行连接，后经转化扩增验证获得携载sCD137L基因的腺病毒穿梭质粒 AD5-pShuttle-sCD137L。

1.1.1.2 AD5 sCD137L病毒构建(质粒构建、病毒拯救与扩增)

A.AD5 sCD137L质粒构建：将构建好的穿梭载体AD5-pShuttle-sCD137L用 PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，使用含50ug/ml卡那霉素LB平板的进行筛选，挑取阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a 感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得AD5 sCD137L质粒。

B.AD5 sCD137L病毒拯救：AD5 sCD137L质粒使用PacI线性化，纯化后6 孔板中1ug/well转染293T细胞，5％CO₂、37℃培养，2天后将细胞消化后转入 10cm平皿，2-3天换液，至80％细胞出现病变，使用10ml培养基将细胞吹下收集至15ml离心管，反复冻融2次，3000rpm/min离心15min，收集病毒上清-80℃保存做为毒种。

C.病毒扩增：取病毒种液50ul加入60％293T细胞10cm平皿中，5％CO₂ 37℃培养，细胞密度至90％以上，按照1传3比例传代，直至80％细胞出现病变，大约有10个平皿细胞，按上述方法收病毒，使用氯化铯密度梯度离心纯化病毒；使用TCID50方法进行滴度测定。

1.1.1.2 AD5 sCD137L病毒功能评价

A.sPCD137L的表达和分泌功能：AD5 sCD137L病毒感染肿瘤细胞72小时后，收细胞和上清，使用Western Blot检测sCD137L的表达和分泌功能。

B.病毒复制能力：AD5 sCD137L和AD5-CON病毒相同MOI感染肿瘤细胞，72小时后收细胞，反复冻融离心后得到等量病毒悬液，使用293T细胞进行病毒滴度测定；分析病毒复制能力变化。

C.溶瘤功能：分别使用AD5 sCD137L和AD5-CON病毒按照MOI 1到100 病毒量感染肿瘤细胞，48小时后使用MTT检测细胞活性，评价AD5 sCD137L 的杀瘤作用。

1.1.1体内研究AD5 sCD137L抗肿瘤机制

A.选用6-8周龄C57BL/6小鼠在右侧腋窝建立皮下瘤模型，每只小鼠一侧接种B16/F10细胞5×10⁵个细胞，4-6天后测量肿瘤大小至200mm³，将小鼠随机分成3组，分别是：无处理组、对照AD5病毒治疗组、AD5 sCD137L病毒治疗组；a.按照分组使用相应病毒瘤内注射，每只注射病毒量5×10⁸pfu，跟踪测量肿瘤体积，体重，至肿瘤体积大于2500mm³判定小鼠死亡，记录小鼠生存期。 b.按照分组瘤内注射病毒，每只注射病毒量5×10⁸pfu，注射两次，elispot检测免疫活化。

B.选用6-8周龄C57BL/6小鼠在腹腔建立腹水瘤模型，每只小鼠腹腔接种H22细胞1×10⁷个细胞，第7-8天左右看到小鼠有腹水，将小鼠随机分成3组，分别是：无处理组、对照AD5病毒治疗组、AD5 sCD137L病毒治疗组；a.按照分组使用相应病毒腹腔注射，每只注射病毒量5×10⁸pfu，跟踪体重，直至小鼠死亡，记录小鼠生存期。b.按照分组腹腔注射病毒，每只注射病毒量5×108pfu，注射两次，elispot检测免疫活化。

1.1.2 AD5 sCD137L病毒的滴度测定

1.293T细胞种于96孔板，每孔约1×10³个细胞，待细胞贴壁后进行滴度测定。

2.病毒梯度的稀释：准备EP管，每个EP管加入1170ul含胎牛血清的DMEM；往第一个EP管中加入130μl病毒溶液，混匀，标记为10^-1；从第一个EP管中吸取50μl于第二个EP管中，混匀，标记为10^-2；依次类推，直至稀释到所需梯度为止。

3.每孔加入100μl相应梯度的病毒稀释液，每个梯度重复10个孔，37℃培养过夜。

4.5天后，将96孔板放于显微镜下观察GFP，记下每个梯度有GFP的孔数，用于病毒滴度的计算。

5.病毒滴度TCID50的计算公式：

Log10(TCID50)＝L+d(s-0.5)+log10(1/v)

L＝Log10最高稀释度(如最高稀释度为10倍稀释，L＝1)

V＝最初每孔细胞培养液的体积(ml/well)

d＝Log10稀释度(如为10倍稀释，d＝1)

s＝各个梯度GFP比率之和

1.2.3实时定量PCR

实时定量PCR的10μl体系组成：2.6μl PCR water，上下游引物各0.2μl， 2μl的模板和5μl的SYBR Green荧光染料。样品混合后，于ABI 384PCR仪上进行扩增。

1.2.4细胞总蛋白的提取及浓度测定

1)以六孔板为例，去掉细胞培养上清，用PBS洗涤2遍，去掉PBS，每孔加入200μl的胰酶，消化吹打细胞，并将细胞收入至EP管中，1500rpm离心5min。

2)去掉上清，加入PBS重悬细胞，1500rpm离心5min。

3)去掉PBS，每孔根据细胞量加入相应的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，涡旋30s，置于冰上10min，重复操作三次。4℃，12000g离心15min。收集上清于另一干净的EP管中。

4)蛋白浓度的测定：根据BCA蛋白浓度测定盒说明书进行检测。取2μl 蛋白样品于96孔板中，加入18μl的PBS稀释样品，最后在加入200μl的测定工作液(工作液由试剂A:试剂B＝50:1)，放置于60℃的烘箱中，30min后，用酶标仪在562nm测定吸光度，根据标准曲线，计算出蛋白样品的浓度。

5)每管加入1/4蛋白裂解液体积的5×loading buffer，混匀后，100℃金属浴5min，冷却后，-20℃保存备用。

1.2.5 Western blot实验

1)配胶和电泳：按照不同要求配制不同浓度的SDS-PAGE分离胶和浓缩胶根据蛋白定量的计算结果，每个样品上样量调为30μg。电泳条件：浓缩胶80V 30min，分离胶120V，约80min，前提是将条带分开且不会跑出去。

2)转膜：准备滤纸和PVDF膜，先用甲醇浸泡PVDF膜，再和滤纸一同浸泡在转膜缓冲液中备用。从玻璃板中小心将胶取下，浸泡在转膜缓冲液中，按照负极-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-正极的三明治顺序放置，赶走气泡，根据所需条带大小不同，恒流110mA转膜60-70min。

3)封闭：转膜结束后，立即取出PVDF膜，放入5％脱脂奶粉中室温封闭 1h。

4)一抗孵育：4℃孵育一抗过夜。

5)二抗孵育：用washing buffer洗涤条带，每次10min，共三次；再用相应的HPR标记的二抗室温孵育1h。

6)曝光：用washing buffer洗涤条带，每次10min，共三次；用化学发光液在WB曝光仪上曝光，并获取条带图像。

1.2.6台盼兰计数

以六孔板为例，去除细胞上清，用PBS洗涤2遍，去掉PBS，每孔加入200μl 胰酶消化，轻轻吹打细胞并收集进入干净的EP管中，1500rpm，离心5min。去掉上清，加入PBS重悬细胞，1500rpm，离心5min。去掉PBS，根据细胞数量加入一定量的PBS重悬细胞，从中取出10μl细胞重悬液，加入10μl 0.2％台盼蓝溶液混合，取混合液20μl于细胞计数板中，用细胞计数仪计数。

1.2.7流式细胞仪检测细胞表面分子

1)取实体瘤细胞(腹水)10⁵cells，加PBS清洗一遍。

2)去掉PBS，每管加入100μl含相应量的流式抗体的PBS，重悬细胞，置于冰上30min，避光。期间拿出样品，轻轻吹打，防止其因沉淀而影响抗体结合效果。

3)30min后，每管加入1ml PBS混合细胞，1500rpm，离心5min。去掉上清，再加入PBS重悬细胞，1500rpm，离心5min。去掉PBS，每管加入300μl PBS重悬，避光。

4.将准备好的样品，用流式细胞仪检测。用FlowJo软件分析实验结果。

1.2.8 Mouse IFN-γELISpot检测

1)ELISpot板子在使用前每孔加入200μl含10％血清的培养基孵育30min 以上，放入细胞培养箱中。

2)去掉培养基，每孔加入200μl含细胞的培养体系。细胞体系组成：100μl 的肿瘤细胞和100μl的脾脏细胞。混合均匀之后，加入孔板中，放入细胞培养箱中。且在实验结束取出之前，不要随意挪动板子。12h后，取出板子检测。

3)去掉培养基，每孔加入200μl的PBS清洗，需要清洗五遍以上。

4)去掉PBS，每孔加入100μl含一抗的稀释液。一抗稀释液：含0.5％FBS 的PBS；一抗稀释比例1:1000。室温放置2h。

5)去掉一抗稀释液，用PBS洗五遍以上；每孔加入100μl二抗稀释液。二抗稀释液：含0.5％FBS的PBS；二抗稀释比例1:1000。室温放置1h。

6)去掉二抗稀释液，用PBS洗五遍以上。每孔加入200μl显色剂显色。待有蓝色斑点出现，且又不显色过头的情况下，甩掉显色液，用自来水洗多遍。

7)将自来水甩掉，室温晾干。注意：不要在室温晾的过久，且晾干过程保持避光。最后用避光保存于封口袋中。扫描读板。

1.2.9肿瘤组织及脾细胞的mouse IFN-γ的ELISpot检测

1)肿瘤组织单细胞悬液制备及mouse IFN-γ的ELISpot检测：处死小鼠，取下一小块的肿瘤组织，用PBS清洗，再放入培养皿中，加入1ml的胶原酶溶液，用剪刀剪碎，将肿瘤组织浑浊液吸入干净的离心管中，再加入1ml胶原酶溶液，放入37℃培养箱2小时，使得肿瘤组织得以消化完全。期间，每隔15min 要取出，用枪头吹打混匀。2h后，取出装有肿瘤组织浑浊液的离心管，确认肿瘤组织消化完全。将浑浊液离心，取沉淀即肿瘤组织细胞。用含血清的DMEM 重悬，细胞计数，将细胞浓度调为2×10⁶个/ml，取100μl细胞混合液做鼠IFN-γ的ELISpot检测，方法同1.2.8。

2)脾单细胞悬液的制备及鼠IFN-γ的ELISpot检测：处死小鼠，取出脾脏，用PBS清洗，剪下一小块脾脏组织，放于70μl的细胞够滤网中，用5ml的注射器研磨，边研磨边加入适量的PBS冲洗。用Ficoll法去掉红细胞，离心重悬获得脾脏单细胞混合液，细胞计数，将细胞浓度调为2×106个/ml，取100μl与肿瘤细胞混合做鼠IFN-γ的ELISpot检测，方法同1.2.8。

2.实验结果与结论

图1的结果显示我们已经成功构建AD5 sCD137L重组溶瘤腺病毒，图中对照组对应位置没有条带、是空白的，而且AD5 sCD137L重组溶瘤腺病毒对应的条带深黑，证明AD5sCD137L重组溶瘤腺病毒能够在肿瘤细胞表达并且分泌到细胞外，而且从蛋白大小判断，是我们拟表达的目标蛋白：可溶性的CD137L。

图2的结果显示我们所构建的重组溶瘤腺病毒AD5 sCD137L在肿瘤细胞内具有很强的复制能力与溶瘤能力。

图3的肿瘤体积测量数据的结果显示重组溶瘤腺病毒AD5 sCD137L在体内具有较强的抗实体肿瘤作用(B16/F10黑色素瘤实体瘤模型)，能够显著的抑制肿瘤的生长。

图4的结果显示AD5 sCD137L在体内能够显著的抑制实体肿瘤作用(4T1 乳腺癌肿瘤模型)。

图5的生存结果数据显示重组溶瘤腺病毒AD5 sCD137L在体内具有抗肿瘤作用(H22肝癌腹水瘤模型)，能显著延长荷瘤小鼠的生存期。其中40％的小鼠完全被治愈。而且AD5 sCD137L是通过诱导针对肿瘤特异性的抗肿瘤免疫应答促进肿瘤的清除。当机体对该肿瘤清除后，存在长期的抗肿瘤免疫记忆。当再次受到该肿瘤的攻击时，能够产生有效保护性免疫应答清除肿瘤细胞。

图6通过酶链免疫斑点印记法ELISpot对分泌IFN-γ的免疫细胞进行检测，数据结果显示重组溶瘤腺病毒AD5 sCD137L显著促进免疫活化而提高抗肿瘤作用(H22肝癌腹水瘤模型)，刺激IFN-γ的高表达。

图7重组溶瘤腺病毒Ad5 sCD137L通过裂解肿瘤细胞，使肿瘤相关抗原释放。同时CD137L可以提供第二刺激信号，从而诱导免疫细胞活化，产生有效抗肿瘤免疫应答。

由以上结果可知，本发明提供了一种新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L 的设计和构建方法，成功获得了一株新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L，该病毒可以在肿瘤细胞内和肿瘤部位选择性复制、具有肿瘤靶向性，而且能够溶瘤，诱导免疫原性细胞死亡。与此同时，该病毒能够高表达可溶性蛋白 sCD137L，该蛋白能够分泌到细胞外，对浸润到肿瘤微环境中效应淋巴细胞的共刺激信号通路CD137产生特异性的活化，在肿瘤微环境局部发挥活化免疫的生物学功能。本发明的新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L具有很强的活化肿瘤局部的抗肿瘤免疫作用，能够显著刺激肿瘤局部IFN-γ的高表达且不产生全身毒性；能够显著抑制肿瘤生长、延长生存期，具有很强的抗肿瘤作用，且能够产生长时程免疫监视。新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L，具有多种独特抗肿瘤免疫功能：活化、招募并特异性地激活效应淋巴细胞，具有预料不到的抗肿瘤效果，可以用来制备抗肿瘤药物。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用

<130> 2019

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> mouse (Mus musculus)

<400> 1

Met Leu Trp Pro Leu Pro Leu Phe Leu Leu Cys Ala Gly Ser Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn

20 25 30

Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr

35 40 45

Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala

50 55 60

Ser Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly

65 70 75 80

Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu

85 90 95

Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val

115 120 125

Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu

130 135 140

Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val

145 150 155 160

Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu

165 170 175

Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg

180 185 190

Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu

195 200 205

Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu

210 215

<210> 2

<211> 200

<212> PRT

<213> mouse (Mus musculus)

<400> 2

Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn

1 5 10 15

Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr

20 25 30

Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala

35 40 45

Ser Leu Cys Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly

50 55 60

Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu

65 70 75 80

Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val

100 105 110

Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu

115 120 125

Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val

130 135 140

Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu

145 150 155 160

Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg

165 170 175

Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu

180 185 190

Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu

195 200

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> mouse (Mus musculus)

<400> 3

Met Leu Trp Pro Leu Pro Leu Phe Leu Leu Cys Ala Gly Ser Leu Ala

1 5 10 15

<210> 4

<211> 648

<212> DNA

<213> mouse (Mus musculus)

<400> 4

atgctgtggc cactgccgct gttcttgctg tgtgcaggct ccctggctgc gctcacaatc 60

accacctcgc ccaacctggg tacccgagag aataatgcag accaggtcac ccctgtttcc 120

cacattggct gccccaacac tacacaacag ggctctcctg tgttcgccaa gctactggct 180

aaaaaccaag catcgttgtg caatacaact ctgaactggc acagccaaga tggagctggg 240

agctcatacc tatctcaagg tctgaggtac gaagaagaca aaaaggagtt ggtggtagac 300

agtcccgggc tctactacgt atttttggaa ctgaagctca gtccaacatt cacaaacaca 360

ggccacaagg tgcagggctg ggtctctctt gttttgcaag caaagcctca ggtagatgac 420

tttgacaact tggccctgac agtggaactg ttcccttgct ccatggagaa caagttagtg 480

gaccgttcct ggagtcaact gttgctcctg aaggctggcc accgcctcag tgtgggtctg 540

agggcttatc tgcatggagc ccaggatgca tacagagact gggagctgtc ttatcccaac 600

accaccagct ttggactctt tcttgtgaaa cccgacaacc catgggaa 648

<210> 5

<211> 420

<212> DNA

<213> mouse (Mus musculus)

<400> 5

gcgctcacaa tcaccacctc gcccaacctg ggtacccgag agaataatgc agaccaggtc 60

acccctgttt cccacattgg ctgccccaac actacacaac agggctctcc tgtgttcgcc 120

aagctactgg ctaaaaacca agcatcgttg tgcaatacaa ctctgaactg gcacagccaa 180

gatggagctg ggagctcata cctatctcaa ggtctgaggt acgaagaaga caaaaaggag 240

ttggtggtag acagtcccgg gctctactac gtatttttgg aactgaagct cagtccaaca 300

ttcacaaaca caggccacaa ggtgcagggc tgggtctctc ttgttttgca agcaaagcct 360

caggtagatg actttgacaa cttggccctg acagtggaac tgttcccttg ctccatggag 420

Claims

1.一种激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的病毒在肿瘤细胞内复制，并且表达和分泌可溶性蛋白，所述的可溶性蛋白为sCD137L，sCD137L的氨基酸序列和核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示。

2.权利要求1所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的复制型溶瘤腺病毒能够溶瘤。

3.如权利要求1所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肝癌、腹水癌、黑色素瘤或者乳腺癌。

4.一种激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的构建方法，其特征在于：sCD137L的氨基酸序列和核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示，复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的构建方法包括如下步骤：(1) AD5 sCD137L质粒构建：将构建好的穿梭载体AD5-pShuttlesCD137L用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，使用含50ug/ml卡那霉素LB平板的进行筛选，挑取阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5α感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得AD5 sCD137L质粒；携载可溶性蛋白基因的腺病毒穿梭质粒AD5-pShuttle-sCD137L载体的构建：使用Infusion技术将sCD137L与AD5-pShuttle连接，所述的AD5-pShuttle即pZD55；具体步骤：首先使用限制性内切酶将BglII AD5-pShuttle线性化，纯化后片段按照sCD137L：AD5-pShuttle的2:1比例使用Infusion试剂盒进行连接，Infusion试剂盒购自clontech lab.Inc.，后经转化扩增验证获得携载sCD137L基因的腺病毒穿梭质粒AD5-pShuttle-sCD137L；

(2) AD5 sCD137L病毒拯救：AD5 sCD137L质粒使用PacI线性化，纯化后6孔板中1ug/well转染293T细胞，5％CO2、37℃培养，2天后将细胞消化后转入10cm平皿，2-3天换液，至80％细胞出现病变，使用1 0 m l培养基将细胞吹下收集至1 5 m l离心管，反复冻融2次，3000rpm/min离心15min，收集病毒上清-80℃保存做为毒种；

(3) 病毒扩增：取病毒种液50ul加入60％293T细胞10cm平皿中，5％CO₂37℃培养，细胞密度至90％以上，按照1传3比例传代，直至80％细胞出现病变，共有10个平皿细胞，按步骤（2）的方法收病毒，使用氯化铯密度梯度离心纯化病毒；使用TCID50方法进行滴度测定。

5.根据权利要求4所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的构建方法，其特征在于：

在步骤(1)中， sCD137L的基因克隆步骤为：分别设计合成引物CD137L-F、CD137L-R，所述的CD137L-F的核酸序列为CAGGGGCCCTGGCTATGGCGCTCACAATCACCAC，CD137L-R的核酸序列为GTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCCCATGGGTTGTCG，使用CD137L-F和CD137L-R引物，以小鼠脾脏cDNA为模板扩增得到EXO-CD137L；EXO-CD137L的氨基酸序列和EXO-CD137L信号肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；EXOCD137L的核苷酸序列和EXOCD137L信号肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；sCD137L由EXO-CD137L信号肽和EXO-CD137L组成。