CN114908064A - 一种能抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒及其应用 - Google Patents

一种能抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉一种能抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒Ad5 GLP1及其应用。本发明公开了Ad5 GLP1的设计和构建方法，成功获得了复制型溶瘤腺病毒Ad5 GLP1，该病毒可以在肿瘤细胞内特异性复制并分泌到细胞外，能够高表达胰高血糖素样肽‑1受体激动剂‑‑胰高血糖素样肽1（GLP1），蛋白分子能够大量分泌到胞外并且能显著促进病毒复制。实验表明，本发明的新型复制型溶瘤腺病毒具有显著增强抗肿瘤免疫、抑制实体肿瘤生长、延长荷瘤个体生存的效果，有极大的开发抗肿瘤药物的前景和价值。

Description

一种能抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤 腺病毒及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种能抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒及其应用。
背景技术
癌症已经成为危害人类生命健康的疾病之首，手术是针对早期癌症最有效的治疗手段，对绝大部分晚期并转移的患者无显著改善。放/化疗及其他辅助治疗虽然在一定程度上能够抑制肿瘤的进展，癌症患者总体的生存率并无显著提高。寻找新而安全有效的治疗药物，是当今全世界药学研究的热点。
近年来肿瘤免疫治疗因其显著的疗效而备受关注。肿瘤免疫治疗是一种通过活化及/或调控免疫相关通路，激活机体免疫系统杀死并监视癌细胞的治疗手段。溶瘤病毒作为肿瘤免疫治疗领域的新星，随着溶瘤病毒T-Vec在2015年底被FDA批准上市，溶瘤病毒介导的抗肿瘤免疫治疗受到越来越多的关注。溶瘤病毒是一类具有自我复制能力，且在肿细胞内大量复制的病毒，具有多种独特的抗肿瘤作用：能够诱导肿瘤细胞免疫原性死亡；激活机体的免疫监视；表达重组蛋白调控肿瘤微环境。目前有多种溶瘤病毒相关的临床实验正在开展，腺病毒、单纯疱疹、麻疹病毒、痘苗病毒、疱疹口炎病毒等，且取得了良好的治疗效果。
然而实体肿瘤通过多种机制包括异常代谢与促炎症微环境等，逃逸机体的免疫监视并促进侵袭和转移。胰高血糖素样肽1(GLP1)是一段30个氨基酸残基组成的多肽，是胰高血糖素样肽-1受体激动剂，不仅能够降低血糖，还具有显著的抑制多个促肿瘤炎症通路的作用，包括抑制NF-κB/IL-6/STAT3通路的活化、 NLRP3/IL-1β炎性体的产生等。
研究发现，溶瘤病毒在激活免疫的同时，也会上调肿瘤微环境中的促肿瘤炎症并改变代谢微环境，从而不利于其抗肿瘤效果，如何有效克服溶瘤病毒治疗中存在的先天不足，是本发明拟解决的重要科学问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒及其应用；本发明的溶瘤腺病毒能够感染肿瘤细胞并复制分泌到细胞外，而病毒所表达的胰高血糖素样肽-1受体激动剂能够分泌到细胞外并促进病毒复制、抑制促肿瘤炎症，并能显著抑制肿瘤生长；最后，发明建立多种肿瘤模型，包括肝癌、胰腺癌等，验证溶瘤腺病毒治疗肿瘤延长生存的显著效果。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种能抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒包含编码胰高血糖素样肽-1受体激动剂的核酸。
其中，该溶瘤腺病毒能够在肿瘤中选择性复制和溶瘤，同时能够复制表达胰高血糖素样肽-1受体激动剂，该蛋白能够调控肿瘤微环境代谢并抑制促肿瘤炎症。
优选的，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂的氨基酸序列选自如下(1)或 (2)：
(1)如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列；
(2)与SEQ ID NO：2所述的序列具有80％以上同源性且与溶瘤作用相关的的氨基酸序列。
所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂为可溶性蛋白GLP1，能够促进溶瘤腺病毒复制。
所述复制型溶瘤腺病毒为Ad5 GLP1，为5型重组腺病毒。
本发明还保护上述复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述的肿瘤为肝癌、胰腺癌和结肠癌中的其中一种。
本发明还保护一种药物组合物，其包括前文所述的复制型溶瘤腺病毒，以及药学上可接受的赋形剂。
一种抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒的构建方法，通过质粒构建、病毒拯救与病毒扩增三个步骤来实现。
优选的，包括如下具体步骤：
步骤1，质粒构建：将构建好的穿梭载体pShuttle-GLP1用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，筛选阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得Ad5 GLP1全长质粒；
步骤2，病毒拯救：Ad5 GLP1全长质粒使用PacI线性化，纯化后转染293T 细胞，至80％细胞出现病变，使用培养基将细胞吹下收集至离心管，反复冻融后离心，收集病毒上清-80℃保存做为毒种；
步骤3，病毒扩增：取病毒种液加入293T细胞平皿中培养，待细胞密度至 90％以上，按照1传3比例传代，直至80％细胞出现病变，按步骤2的方法收病毒，离心纯化病毒。
更优选的，所述穿梭载体Ad5-pShuttle-GLP1的构建方6CD5如下：首先基因合成GLP1-E1A的DNA序列，如SEQ ID NO:1所示；前述序列经BamHI和 XhoI双酶切，同时pShuttle质粒也经BamHI和XhoI双酶切；将酶切后的DNA 和pShuttle质粒用T4连接酶进行连接；将连接产物转化DH5a感受态，在卡那霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆；扩增阳性单克隆DH5a菌，并进行质粒提取；此质粒为用于制备pAd5 GLP1腺病毒的shuttle-GLP1质粒。
上述构建方法构建得到的溶瘤腺病毒为Ad5 GLP1。
本发明还保护可溶性蛋白GLP1在制备促进溶瘤腺病毒复制和溶瘤药物中的应用。
本发明还保护可溶性蛋白GLP1在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还保护可溶性蛋白GLP1在制备抑制炎症通路药物中的的应用。
有益效果
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)本发明公开了复制型溶瘤腺病毒Ad5 GLP1的构建方法，Ad5 GLP1感染细胞后，能够在细胞内复制表达目的蛋白GLP1。
(2)GLP1蛋白能够显著促进溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中的复制。
(3)GLP1蛋白能够显著促进溶瘤腺病毒的溶瘤作用。
(4)GLP1蛋白能够显著抑制炎症因子和溶瘤腺病毒诱导的促肿瘤炎症通路活化。
(5)Ad5 GLP1能够显著抑制炎症因子和溶瘤腺病毒诱导的促肿瘤炎症通路活化。
(6)Ad5 GLP1能够显著促进溶瘤腺病毒诱导的抗肿瘤免疫反应。
(7)动物试验中Ad5 GLP1显著抑制肝癌皮下瘤的生长并显著延长小鼠生存时间。
(8)动物实验中Ad5 GLP1显著抑制胰腺癌的生长并显著延长小鼠生存时间。
附图说明
图1为本发明的结果显示复制型溶瘤腺病毒Ad5 GLP1的构建策略；其中， A为Ad5GLP1病毒的构建方法示意图；B为目的基因GLP1的PCR结果，其中 1为PCR产物，2为DL2000DNA Maker。
图2中(A)LM3人肝癌细胞、(B)Hepa1-6小鼠肝癌细胞分别感染本发明的表达可溶性蛋白GLP1的重组溶瘤腺病毒Ad5 GLP1和Ad5 con(MOI＝5)。 24小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，随后收取被感染细胞，通过WB的方法检测目的蛋白GLP1的表达。数据代表三次独立性重复实验。绿色荧光蛋白表达能够显示病毒复制。
图3为本发明的可溶性蛋白GLP1对溶瘤腺病毒的复制的影响，A为48小时，B为72小时。将肝癌LM3细胞接种96孔培养板，用表达荧光素酶的腺病毒(MOI＝5)加或不加GLP1(20μM)处理细胞后继续培养，于48和72小时后分别加入检测荧光素酶底物，并检测荧光强度。
图4为本发明的Ad5 GLP1在肿瘤细胞内复制能力与对照病毒Ad5 con的比较。用MOI为1的Ad5 con和Ad5 GLP1分别感染结肠癌MC38细胞，分别于 12、24、48、60及72小时收取细胞并提取总RNA，用定量RT-PCR检测病毒特异性蛋白Hexon的基因表达水平。数据分别以12小时的表达值为1，显示病毒复制增加的倍数。
图5为本发明的分泌蛋白GLP1对溶瘤腺病毒溶瘤作用的影响；其中，A为对细胞活度的影响，B为对活细胞数的影响。将HCC-LM3肝癌细胞种于96孔板或6孔板中，待其贴壁后，在含或不含GLP1(20μM)的情况下，用MOI 值为5的腺病毒感染肝癌细胞HCC-LM3，未处理组及单独GLP1处理组做对照，培养48h后，分别用MTT法检测活细胞比例或使用CountStar计数器检测台盼蓝染色后活细胞数目。结果为平均数(Mean)+标准差(SD)，与对照组相比： #P>0.05；*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图6为本发明的可溶性GLP1显著抑制炎症因子或溶瘤腺病毒所诱导的炎症通路活化。抗炎肽基因工程质粒GLP1的生物学功能验证A.人或鼠肝癌细胞接种于6孔板中，待贴壁后，分别转染GLP1质粒或空白质粒，24h后，加入IL-6 (25ng/ml)刺激0.5h后，收取细胞蛋白，通过Western Blot的方法检测STAT3 的磷酸化水平。B.人肝癌细胞HCC-LM3接种于6孔板中，待贴壁后，分别转染 GLP1质粒或空白质粒，24h后，加入腺病毒(MOI＝5)，共培养24h后，提取细胞RNA，逆转录成cDNA，用qRT-PCR的方法检测相应炎症因子TNF-α、IL-6 及IL-1β的mRNA水平。结果为平均数(Mean)+标准差(SD)，与对照组相比： #P>0.05；*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图7为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5 GLP1显著抑制病毒诱导的促肿瘤炎症通路活化，其中A对应为HCC-LM3细胞，B对应为Hepa1-6细胞。分别将肝癌细胞HCC-LM3和Hepa1-6细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后分别感染重组溶瘤腺病毒(MOI＝5)24h后，收取细胞并分别提取蛋白和RNA，通过western blot 和qRT-PCR的方法检测相应的炎症因子的水平。结果为平均数(Mean)+标准差(SD)，与对照组相比：#P>0.05；*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图8为本发明的重组溶瘤腺病毒AD5 GLP1对炎症因子IL-6诱导的通路活化有显著抑制作用。A和B.分别将HCC-LM3和Hepa1-6细胞种板，24h后，培养基中加入IL-6(25ng/ml)刺激0.5h后，收取细胞蛋白，western blot的方法检测STAT3和IκBα的磷酸化水平。
图9为本发明的分泌蛋白GLP1增强重组溶瘤腺病毒的抗肿瘤免疫反应。将小鼠肝癌Hepa1-6细胞构建小鼠皮下移植瘤模型，待小鼠肿瘤长至0.4cm×0.4 cm时，将小鼠随机分为4组，第二天治疗组给予GLP1(300μg/kg/只)瘤内注射，腺病毒Ad5治疗组给予腺病毒5×108PFU/只，瘤内注射，每天一次，联合治疗组同时给予GLP1和腺病毒治疗，对照组小鼠给予相同体积的PBS瘤内注射，一周之后，断颈处死小鼠，分离肿瘤组织、剪碎并用胶原酶消化后，过细胞筛成单细胞悬液，用ELISpot方法检测免疫细胞释放IFN-γ的量及强度。
图10为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5 GLP1对肝癌的生长具有显著的抑制作用。治疗肝细胞性肝癌。A.体内实验方案的流程图。小鼠在治疗前4天(-4 天)接种1×107/只HCC-LM3细胞，第0天开始第一次测量小鼠肿瘤大小和体重，同时将小鼠随机分为3组，包括对照组、Ad5 GLP1组和Ad5 con组，每组6-7 只。治疗组瘤内注射Ad5 GLP1，1×109PFU/只，或相同剂量Ad5 con，对照组小鼠瘤内注射相同体积的PBS，每5天注射一次腺病毒，直至小鼠肿瘤体积大于 2.0cm3或小鼠死亡。B.第0天时开始注射腺病毒，每隔两天测一次肿瘤大小。图中所示为各组小鼠肿瘤大小。C.第0天时开始注射腺病毒，每隔两天称量小鼠体重。图中所示为各组小鼠体重大小。结果为平均数(Mean)+标准差(SD)， #P>0.05；*P<0.05；**P<0.01。
图11为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5 GLP1能显著延长人LM3肝癌荷瘤小鼠的生存。体内实验分3组，包括对照组，重组腺病毒Ad5 GLP1组和对照腺病毒Ad5 con组，每组6-7只。当小鼠肿瘤大于2.0cm3或因肿瘤负荷而死亡的情况作为死亡病例，统计小鼠生存时间。结果为平均数(Mean)+标准差(SD)，与对照组相比：#P>0.05；*P<0.05；**P<0.01。
图12为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5 GLP1能显著抑制免疫健全小鼠肝癌的生长，无明显的毒副作用。Balbc雄性小鼠接种5x106 H22肝癌细胞，待肿瘤长至约5x7mm大小后，瘤内注射3x108pfu Ad5 GLP1，隔天一次共三次，并隔天测量瘤径(左)和小鼠体重变化(右)。
图13为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5 GLP1能显著抑制免疫健全小鼠胰腺癌的生长，无明显的毒负作用。Balbc雄性小鼠接种5x106 Panc02胰腺癌细胞，待肿瘤长至约5x7mm大小后，瘤内注射3x108pfu Ad5 GLP1，隔天一次共三次，并隔天测量瘤径(左)和小鼠体重变化(右)。
图14为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5 GLP1能显著延长胰腺癌荷瘤小鼠的生存时间，33％小鼠肿瘤治愈并长期生存。Balbc雄性小鼠接种5x106 Panc02胰腺癌细胞，待肿瘤长至约5x7mm大小后，瘤内注射3x108pfu Ad5 GLP1，隔天一次共三次，监测小鼠的生存时间。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释和说明，但应理解，所给出的实施例只作为举例说明，不以任何方式对本发明构成任何限制。
1实验材料和方法
1.1实验材料和仪器
1.1.1实验细胞系
人胚肾细胞株293T，人肝癌细胞株HCC-LM3、小鼠肝癌细胞株Hepa1-6及 H22，小鼠胰腺癌细胞株Panc02、小鼠结肠癌细胞株MC38，使用含10％胎牛血清，100U/I青霉素和1mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基培养于37℃、5％CO2的培养箱中。
1.1.2实验仪器
生物安全柜(
Figure BDA0002948717030000071
III advance，Class II Biological Safety Cabinet，The Baker Company)，二氧化碳培养箱(FORMA SERIES II WATER JACKET CO2 incubator，Thermo)，低温离心机(HERAEUS MEGAFUGE 1.0R，Thermo)，垂直电泳槽(BIO-RAD)，电泳仪(BIO-RAD)，半干转-转膜仪(BIO-RAD)，免疫印迹曝光系统(Alpha Innotech)，PCR仪(PCRThermal Cycler Dice，TaKaRa)，实时定量PCR仪及分析软件(ABI384，Sequence DetectionSoftware，Version 1.3.1)，酶标仪(VERSA max microplate reader)，整套移液器(eppendorf和RAININ)，细胞计数仪(Countstar Automated cell counter，Inno-AllianceBiotech Inc.， Wilmington，USA)，流式细胞仪(FACSCalibur，Becton，Dickinson andCompany， USA)，FlowJo software(Version 7.6.5，Tree Star Inc，Ashland，Oregon)，微孔板振荡器(QiLinBeiEr)，核酸纯度浓度检测仪(Biophotometer plus，eppendorf)，数显恒温水浴锅(国华电器)。
1.1.3主要实验试剂及耗材
引物均由金斯瑞公司合成。肿瘤细胞培养所需的DMEM高糖培养基，双抗，血清均购自Invitrogen(上海)公司。定量RT-PCR试剂Faststart Universal SYBR Green Master(Roche，04913914001)。Western Blot所需试剂耗材：蛋白酶抑制剂 (Roche，11873580001)，细胞裂解液(碧云天：P0013)，PVDF膜(Roche， 03010040001)，WB ImmobilonECL发光液(Millipore，WBKLS0500)，一抗稀释液(碧云天，P0023A)，HRP标记的二抗(Multisciences，GAR007 and GAM007， 1:5000稀释)，其余所需试剂均为国产分析纯，购自南京大学化学化工学院。台盼蓝(碧云天，C0011)，Opti-MEM购自Invitrogen(上海)公司。Western Blot 抗体：抗-GAPDH(Bioworld,MB001,1:5000稀释)，抗p-STAT3(CellSignaling Technology，4814S，1:1000稀释)，抗p-IκBα(Cell Signaling Technology，2859S， 1:1000稀释)，抗STAT3(Cell Signaling Technology，9139S，1:1000稀释)，抗IκBα(Cell Signaling Technology，4814S，1:1000稀释)。HRP抗鼠lgG(Abbkine，A21010-1， 1:1000稀释)，HRP抗兔lgG(Abbkine，A21020-1，1:1000稀释)。。
1.2实验方法
1.2.1 Ad5 GLP1病毒构建(质粒构建、病毒拯救与扩增)
A.Ad5 GLP1全长质粒构建：
首先基因合成GLP1-E1A的DNA序列，如SEQ ID NO:1所示；前述序列经 BamHI和XhoI双酶切，同时pShuttle质粒也经BamHI和XhoI双酶切；将酶切后的DNA和pShuttle质粒用T4连接酶进行连接；将连接产物转化DH5a感受态，在卡那霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆；扩增阳性单克隆DH5a菌，并进行质粒提取。此质粒为用于制备pAd5 GLP1腺病毒的shuttle-GLP1质粒。
将构建好的质粒pShuttle-GLP1用PmeI线性化后转入感受态 pAdEasy-BJ5183中，使用含50ug/ml卡那霉素LB平板的进行筛选，挑取阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得Ad5 GLP1全长质粒。
B.Ad5 GLP1病毒拯救：
Ad5 GLP1全长质粒使用PacI线性化，纯化后6孔板中1ug/well转染293T 细胞，5％CO2、37℃培养，2天后将细胞消化后转入10cm平皿，2-3天换液，至80％细胞出现病变，使用10ml培养基将细胞吹下收集至15ml离心管，反复冻融2次，3000rpm/min离心15min，收集病毒上清-80℃保存做为毒种。
C.病毒扩增：
取病毒种液50ul加入60％293T细胞10cm平皿中，5％CO2 37℃培养，细胞密度至90％以上，按照1传3比例传代，直至80％细胞出现病变，大约有10个平皿细胞，按上述方法收病毒，使用氯化铯密度梯度离心纯化病毒；使用TCID50 方法进行滴度测定。
Ad5 GLP1病毒功能评价
A.GLP1的表达和分泌功能：
Ad5 GLP1病毒感染肿瘤细胞72小时后，收细胞和上清，使用WB检测GLP1 的表达和分泌功能。
B.病毒复制能力：
Ad5 GLP1和Ad5 con(Ad5 con为只含有病毒复制原件E1A序列，不含有 GLP1序列的5型腺病毒)病毒相同MOI感染肿瘤细胞，在不同时间收细胞，反复冻融离心后得到等量病毒悬液，使用293T细胞进行病毒滴度测定；分析病毒复制能力变化。
C.溶瘤功能：
分别使用Ad5 GLP1和Ad5 con病毒按照MOI 1到100病毒量感染肿瘤细胞， 72小时后使用MTT检测细胞活性，评价Ad5 GLP1的杀瘤作用。
1.2.2体内研究Ad5 GLP1抗肿瘤效应与机制
A.选用6-8周龄Balb/c或C57BL/6小鼠在右侧腋窝或皮下建立皮下瘤模型， 4-6天后测量肿瘤大小至200mm3，将小鼠随机分成3组，分别是：无处理组、对照Ad5 con病毒治疗组、Ad5 GLP1病毒治疗组；按照分组使用相应病毒瘤内注射，每只注射病毒量2.5×108pfu，跟踪测量肿瘤体积，体重，小鼠自然死亡后，记录小鼠生存期。
1.2.3 Ad5 GLP1病毒的滴度测定
1)293T细胞种于96孔板，每孔约1×103个细胞，待细胞贴壁后进行滴度测定。
2)病毒梯度的稀释：准备EP管，每个EP管加入1170μl含胎牛血清的DMEM；往第一个EP管中加入130μl病毒溶液，混匀，标记为10-1；从第一个EP管中吸取50μl于第二个EP管中，混匀，标记为10-2；依次类推，直至稀释到所需梯度为止。
3)每孔加入100μl相应梯度的病毒稀释液，每个梯度重复10个孔，37℃培养过夜。
4)5天后，将96孔板放于显微镜下观察GFP，记下每个梯度有GFP的孔数，用于病毒滴度的计算。
5)病毒滴度TCID50的计算公式：
Log10(TCID50)＝L+d(s-0.5)+log10(1/v)；
其中，L＝Log10最高稀释度(如最高稀释度为10倍稀释，L＝1)；
V＝最初每孔细胞培养液的体积(ml/well)；
d＝Log10稀释度(如为10倍稀释，d＝1)；
s＝各个梯度GFP比率之和。
1.2.4定量PCR
实时定量PCR的10μl体系组成：2.6μl PCR water，上下游引物各0.2μl，2μl 的模板和5μl的SYBR Green荧光染料。样品混合后，于ABI 384 PCR仪上进行扩增。
1.2.5细胞总蛋白的提取及浓度测定
1)以六孔板为例，去掉细胞培养上清，用PBS洗涤2遍，去掉PBS，每孔加入200μl的胰酶，消化吹打细胞，并将细胞收入至EP管中，1500rpm离心5min。
2)去掉上清，加入PBS重悬细胞，1500rpm离心5min。
3)去掉PBS，每孔根据细胞量加入相应的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，涡旋30s，置于冰上10min，重复操作三次。4℃，12000g离心15min。收集上清于另一干净的EP管中。
4)蛋白浓度的测定：根据BCA蛋白浓度测定盒说明书进行检测。取2μl蛋白样品于96孔板中，加入18μl的PBS稀释样品，最后在加入200μl的测定工作液(工作液由试剂A:试剂B＝50:1)，放置于60℃的烘箱中，30min后，用酶标仪在562nm测定吸光度，根据标准曲线，计算出蛋白样品的浓度。
5)每管加入1/4蛋白裂解液体积的5×loading buffer，混匀后，100℃金属浴5min，冷却后，-20℃保存备用。
1.2.6 Western blot实验
1)配胶和电泳：按照不同要求配制不同浓度的SDS-PAGE分离胶和浓缩胶根据蛋白定量的计算结果，每个样品上样量调为30μg。电泳条件：浓缩胶80V 30min，分离胶120V，约80min，前提是将条带分开且不会跑出去。
2)转膜：准备滤纸和PVDF膜，先用甲醇浸泡PVDF膜，再和滤纸一同浸泡在转膜缓冲液中备用。从玻璃板中小心将胶取下，浸泡在转膜缓冲液中，按照负极-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-正极的三明治顺序放置，赶走气泡，根据所需条带大小不同，恒流110mA转膜60-70min。
3)封闭：转膜结束后，立即取出PVDF膜，放入5％脱脂奶粉中室温封闭 1h。
4)一抗孵育：4℃孵育一抗过夜。
5)二抗孵育：用washing buffer洗涤条带，每次10min，共三次；再用相应的HPR标记的二抗室温孵育1h。
6)曝光：用washing buffer洗涤条带，每次10min，共三次；用化学发光液在WB曝光仪上曝光，并获取条带图像。
1.2.7台盼兰计数
以六孔板为例，去除细胞上清，用PBS洗涤2遍，去掉PBS，每孔加入200μl 胰酶消化，轻轻吹打细胞并收集进入干净的EP管中，1500rpm，离心5min。去掉上清，加入PBS重悬细胞，1500rpm，离心5min。去掉PBS，根据细胞数量加入一定量的PBS重悬细胞，从中取出10μl细胞重悬液，加入10μl 0.2％台盼蓝溶液混合，取混合液20μl于细胞计数板中，用细胞计数仪计数。
2.结果和结论
参见图2，结果显示我们所构建的复制型溶瘤腺病毒Ad5 GLP1与对照病毒相比，具有同样的感染肿瘤细胞并表达目的基因的能力。在人和小鼠肝癌细胞株HCC-LM3、Hepa1-6细胞株中，Ad5 GLP1能够高效感染细胞并表达GLP1蛋白。
参见图3，结果显示可溶性GLP1能够显著促进溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中的复制。在含有GLP1蛋白的培养基中，溶瘤腺病毒(Ad5)在肝癌细胞(LM3) 中的复制显著增加，说明GLP1具有促进溶瘤腺病毒复制的作用。
参见图4，结果显示重组溶瘤腺病毒Ad5 GLP1在肿瘤细胞中的复制显著高于对照溶瘤腺病毒。在小鼠结肠癌细胞中，用MOI为1的Ad5 GLP1感染小鼠结肠癌细胞株(MC38)，Ad5 GLP1的Hexon的基因表达数，在感染细胞48、60 和72小时后，均显著高于对照病毒的拷贝数，说明Ad5 GLP1的在肿瘤中的复制能力显著增强。
参见图5，结果显示可溶性GLP1能够促进溶瘤腺病毒溶瘤作用。在含有 GLP1蛋白的培养基中，腺病毒对肝癌细胞(LM3)的溶瘤作用显著高于病毒或 GLP1单独处理组，说明GLP1促进腺病毒溶瘤。
参见图6，结果显示GLP1能够显著抑制炎症因子或溶瘤病毒所引起的炎症通路活化。在人或小鼠的肝癌细胞株中，GLP1能够抑制炎症因子IL-6对STAT3 通路的活化，并显著降低病毒诱导的炎症因子的表达，包括肿瘤坏死因子 (TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及白细胞介素1(IL-1β)。
参见图7，结果显示重组Ad5 GLP1腺病毒能够显著抑制病毒诱导的促肿瘤炎症通路活化。在人和小鼠的肝癌细胞株中，Ad5 GLP1处理组，其TNF-α/NFkB、 IL-6/STAT3通路显著被抑制。
参见图8，结果显示重组Ad5 GLP1腺病毒显著抑制炎症因子介导的促肿瘤炎症。在人和小鼠的肝癌细胞中，Ad5 GLP1感染的肿瘤细胞对IL-6诱导 TNF-α/NFkB和IL-6/STAT3等炎症通路活化具有显著的抑制作用。
参见图9，结果显示GLP1蛋白显著促进溶瘤腺病毒诱导的抗肿瘤免疫。在小鼠肝癌(Hepa1-6)模型中，GLP1联合溶瘤腺病毒处理组，其分泌IFN-γ的淋巴细胞数显著增加。
参见图10，结果显示重组Ad5 GLP1腺病毒显著抑制肝癌生长并没有明显的毒副作用。人肝癌细胞(LM3)荷瘤小鼠经AD5 GLP1治疗后，肿瘤生长显著受到抑制，与对照病毒治疗组小鼠比较，具有显著性差异。
参见图11，结果显示重组Ad5 GLP1腺病毒显著延长肝癌荷瘤小鼠生存时间。人肝癌细胞荷瘤小鼠经Ad5 GLP1治疗后，小鼠存活时间较非治疗组和对照病毒处理组小鼠生存时间显著延长。
参见图12，结果显示重组Ad5 GLP1腺病毒显著抑制肝癌生长并没有明显的毒副作用。小鼠肝癌细胞(H22)荷瘤小鼠经Ad5 GLP1治疗后，与对照组小鼠相比，肿瘤生长显著受到抑制。
参见图13，结果显示重组Ad5 GLP1腺病毒显著抑制胰腺癌生长并没有明显的毒副作用。小鼠胰腺癌细胞(Panc02)荷瘤小鼠经Ad5 GLP1治疗后，与对照组小鼠相比，肿瘤生长显著受到抑制，约33％小鼠肿瘤被治愈。
参见图14，结果显示重组Ad5 GLP1腺病毒显著延长胰腺癌荷瘤小鼠生存时间。小鼠胰腺癌荷瘤小鼠经Ad5 GLP1治疗后，小鼠存活时间较对照组小鼠生存时间显著延长，约40％小鼠长期存活。
由以上结果可知，本发明提供了一种可以抑制肿瘤进展并显著延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒AD5 GLP1。该病毒比野生型病毒在肿瘤细胞内有更强的复制能力。与此同时，该病毒能够高表达GLP1，该蛋白能够分泌到细胞外，进而发挥其生物学功能。
本发明的复制型溶瘤腺病毒Ad5 GLP1具有显著的抑制肿瘤生长能力、且延长生存期，具有显著的抗肿瘤作用。一个病毒，同时整合多种独特的抗肿瘤机制于一身，包括调控代谢、促进抗肿瘤免疫、抑制促肿瘤炎症等，具有预料不到的抗肿瘤效果。可以用来制备抗肿瘤药物。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
GLP1-E1A的DNA序列(SEQ ID NO:1)
GACGGATCCGCCACCATGAAAAGCATTTACTTTGTGGCTGGATTATTTG TAATGCTGGTACAAGGCAGCTGGCAACATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG ATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCCAAGCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCT GGTGAAAGGCCGAGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGG CTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGACATATTATCTGCCACG GAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCG AAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTAC CCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGA GGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGA AGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCC TCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGG TTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGC TGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGT TAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCG GAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACC TGTGGCATGTTTGTCTACAGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAG CCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCT ATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACG GATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTG GTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGC CAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTG GACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCATAAAGATCTCACCTATCGATAAGC TTGGGAGTTCCGGTCGACCTCGAGGGGCCCctcgagCCc
SEQ ID NO:2
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR。
序列表
<110> 南京惟亚德生物医药有限公司
<120> 一种能抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacggatccg ccaccatgaa aagcatttac tttgtggctg gattatttgt aatgctggta 60
caaggcagct ggcaacatgc tgaagggacc tttaccagtg atgtaagttc ttatttggaa 120
ggccaagctg ccaaggaatt cattgcttgg ctggtgaaag gccgaggaag cggagctact 180
aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc tatgagacat 240
attatctgcc acggaggtgt tattaccgaa gaaatggccg ccagtctttt ggaccagctg 300
atcgaagagg tactggctga taatcttcca cctcctagcc attttgaacc acctaccctt 360
cacgaactgt atgatttaga cgtgacggcc cccgaagatc ccaacgagga ggcggtttcg 420
cagatttttc ccgactctgt aatgttggcg gtgcaggaag ggattgactt actcactttt 480
ccgccggcgc ccggttctcc ggagccgcct cacctttccc ggcagcccga gcagccggag 540
cagagagcct tgggtccggt ttctatgcca aaccttgtac cggaggtgat cgatcttacc 600
tgccacgagg ctggctttcc acccagtgac gacgaggatg aagagggtga ggagtttgtg 660
ttagattatg tggagcaccc cgggcacggt tgcaggtctt gtcattatca ccggaggaat 720
acgggggacc cagatattat gtgttcgctt tgctatatga ggacctgtgg catgtttgtc 780
tacagtcctg tgtctgaacc tgagcctgag cccgagccag aaccggagcc tgcaagacct 840
acccgccgtc ctaaaatggc gcctgctatc ctgagacgcc cgacatcacc tgtgtctaga 900
gaatgcaata gtagtacgga tagctgtgac tccggtcctt ctaacacacc tcctgagata 960
cacccggtgg tcccgctgtg ccccattaaa ccagttgccg tgagagttgg tgggcgtcgc 1020
caggctgtgg aatgtatcga ggacttgctt aacgagcctg ggcaaccttt ggacttgagc 1080
tgtaaacgcc ccaggccata aagatctcac ctatcgataa gcttgggagt tccggtcgac 1140
ctcgaggggc ccctcgagcc c 1161
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30

Claims (10)

1.一种能抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述溶瘤腺病毒包含编码胰高血糖素样肽-1受体激动剂的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于，该溶瘤腺病毒能够在肿瘤中选择性复制和溶瘤，同时能够复制表达胰高血糖素样肽-1受体激动剂蛋白，该蛋白能够调控肿瘤微环境代谢并抑制促肿瘤炎症。
3.根据权利要求1或2所述的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂的氨基酸序列选自如下（1）或（2）：
（1）如SEQ ID NO：2 所述的氨基酸序列；
（2）与SEQ ID NO：2所述的序列具有80%以上同源性且与溶瘤作用相关的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂为分泌型蛋白胰高血糖素样肽1，该蛋白能够促进溶瘤腺病毒复制。
5.权利要求1-4任一所述的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌、胰腺癌和结肠癌中的其中一种。
7.药物组合物，其包括权利要求1-4任一所述的复制型溶瘤腺病毒，以及药学上可接受的赋形剂。
8.权利要求1-4任一所述的抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，通过质粒构建、病毒拯救与病毒扩增三个步骤来实现。
9.根据权利要求8所述的抑制肿瘤进展并延长荷瘤个体生存时间的复制型溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
步骤1，质粒构建：将构建好的质粒pShuttle-GLP1用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，筛选阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得Ad5 GLP1全长质粒；
步骤2，病毒拯救：Ad5 GLP1全长质粒使用PacI线性化，纯化后转染293T细胞，至80%细胞出现病变，使用培养基将细胞吹下收集至离心管，反复冻融后离心，收集病毒上清-80℃保存做为毒种；
步骤3，病毒扩增：取病毒种液加入293T细胞平皿中培养，待细胞密度至90%以上，按照1传3比例传代，直至80%细胞出现病变，按步骤2的方法收病毒，离心纯化病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述穿梭载体Ad5-pShuttle-GLP1的构建方法如下：首先基因合成GLP1-E1A的DNA序列，如SEQ ID NO:1所示；前述系列经BamHI和XhoI双酶切，同时pShuttle质粒也经BamHI和XhoI双酶切；将酶切后的DNA和pShuttle质粒用T4连接酶进行连接；将连接产物转化DH5a感受态，在卡那霉素抗性LB平板上筛选阳性克隆；扩增阳性单克隆DH5a菌，并进行质粒提取；此质粒为用于制备pAd5 GLP1腺病毒的shuttle- GLP1质粒 。
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