CN112126631A - 携带ERCC1基因siRNA的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒,其特征在于:siRNA质粒和腺病毒包装质粒，经转染，重组出目标腺病毒；其中，上述siRNA选自如下(a)‑(c)中的任一一项：(a).携带ERCC1基因的siRNA；(b).前体miRNA，上述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中上述的携带ERCC1基因的siRNA；(c).多核苷酸，上述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中上述的前体miRNA,并加工形成(a)中上述的携带ERCC1基因的siRNA，其可用于制备抗卵巢癌的药物。
Description
技术领域
本发明涉及病毒领域，具体地，涉及携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒及其应用。
背景技术
卵巢恶性肿瘤是全世界女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌。但是死亡率居三大妇科恶性肿瘤之首。其治疗主要采取肿瘤细胞减灭术联合以铂类为基础的化疗。其中，化疗耐药是卵巢癌高死亡率的重要原因之一。肿瘤细胞对一线化疗药顺铂等产生耐药性阻碍了药物的抗肿瘤效应，使术后5年生存率徘徊在30％-50％之间。因此，加强卵巢癌对顺铂耐药的机制研究，发现能够逆转顺铂耐药的关键靶标，研发理想的辅助化疗方案已经成为妇科肿瘤学重要的研究目标之一。
发明内容
本发明依据恶性实体肿瘤无限增殖和瘤内缺氧环境的存在这两个主要特征，构建了人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和缺氧诱导因子-1(HIF-1)双重调控的新型肿瘤特异性增殖溶瘤腺病毒并以此为载体转染ERCC1-siRNA，来靶向杀灭卵巢癌细胞，并进一步研究其灭瘤分子机制，并初步探讨其卵巢癌化疗辅助效果，以期灭瘤同时增强肿瘤细胞化疗敏感性，两者相辅相成，有效预防肿瘤复发，并减少化疗药物用量，加强化疗效果并提高病人生活质量，延长患者生存期。
本发明提供了一种携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒,其特征在于:siRNA质粒和腺病毒包装质粒，经转染，重组出目标腺病毒；
其中，上述siRNA选自如下(a)-(c)中的任一一项：
(a).携带ERCC1基因的siRNA；
(b).前体miRNA，上述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中上述的携带ERCC1基因的siRNA；
(c).多核苷酸，上述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中上述的前体miRNA,并加工形成(a)中上述的携带ERCC1基因的siRNA。
进一步地，本发明提供的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征还在于：
上述siRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，本发明提供的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征还在于：
上述腺病毒包装质粒为PBHGE3。
进一步地，本发明提供的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征还在于：
用于抑制和杀灭卵巢癌SKOV3细胞。
进一步地，本发明提供的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征还在于：
用于转染卵巢癌细胞。
进一步地，本发明提供的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征还在于：
用于屏蔽ERCC1耐药基因。
进一步地，本发明提供的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征还在于：
对顺铂具有增敏作用或提高顺铂耐药性。
进一步地，本发明提供的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征还在于：
用于制备抗卵巢癌的药物。
进一步地，本发明提供的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征还在于：
上述抗卵巢癌的药物为经胃肠道以外给药途径剂型。
本发明的作用和效果：
卵巢癌以盆腔种植及转移为主，因病灶位置较深，化疗药物静脉用药盆腔局部难以达到有效浓度，治疗效果不佳，盆腔灌注的方法亦对正常组织和细胞造成很大损伤。且肿瘤细胞对铂类药物产生耐药性更是阻碍了药物的抗肿瘤效应，使术后5年生存率徘徊在30％-50％之间。因此，一种肿瘤靶向性强且能逆转耐药的卵巢癌治疗新方案已经成为妇科肿瘤学重要的研究目标之一。
肿瘤特异性增殖溶瘤腺病毒(RSOAds)载体因其高度肿瘤靶向性及杀伤力引起本发明关注，它能感染肿瘤细胞，在其中复制、增殖、裂解、杀伤肿瘤细胞并释放出更多病毒，感染其他肿瘤细胞进行链式杀伤反应，且复制、增殖仅限于肿瘤细胞，对正常宿主组织几乎无破坏。
恶性实体瘤的主要特性是无限增殖性和瘤体内形成缺氧微环境，肿瘤的无限增殖能力主要靠端粒酶的激活来不断地维持端粒的长度而达到，其中人端粒酶逆转录酶(hTERT)是维持端粒酶活性所必需的催化亚单位，在大多恶性肿瘤细胞中处于活化状态而在绝大多数的正常细胞中无活性或活性很低，是目前被认为最广泛的肿瘤分子标记。目前认为，端粒酶的活化与卵巢癌的发生密切相关，其活性增加在卵巢癌的进展中具有重要意义。在肿瘤细胞的恶性增殖过程中，细胞耗氧量剧增，肿瘤内缺氧微环境诱导缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)形成，HIF-l在包括卵巢癌在内的多种肿瘤中广泛存在，它与一系列缺氧反应元件(hypoxia response element，HRE)结合，从而启动目的基因的转录表达，在肿瘤的发生、发展、凋亡、浸润及转移等方面起着十分重要的作用。有研究证明HIF-1在卵巢癌、脑癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌等一系列人体实体瘤中均高表达，而在相邻的正常组织或基质细胞中则无表达。
卵巢癌铂类耐药最为关键的因子是切除修复交叉互补基因1(ERCC1)，也是目前研究较多的DNA修复基因之一。ERCC1位于人类19号染色体上，参与了DNA链的切割和损伤识别，ERCC1 mRNA水平可以反映肿瘤组织修复铂类药物所致DNA螺旋扭转的能力，是标志肿瘤患者预后和铂类化疗效果的重要指标。很多研究发现接受以铂类为基础的化疗患者中ERCC1表达越高，化疗效果及患者的预后越差。
本发明设想依据恶性实体肿瘤无限增殖和瘤内缺氧环境的存在这两个主要特征，构建一种人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和缺氧诱导因子-1(HIF-1)双重调控的新型肿瘤特异性增殖溶瘤腺病毒并以此为载体转染ERCC1 siRNA，靶向杀灭卵巢癌细胞同时初步探讨其卵巢癌化疗辅助效果，以期灭瘤同时增强肿瘤细胞化疗敏感性，两者相辅相成，有效预防肿瘤复发，并减少化疗药物用量，加强化疗效果并提高病人生活质量，延长患者生存期。
本实验将hTERT和HIF-1分别插入已删除病毒复制所必需的E1A、E1B基因启动子删除的腺病毒质粒，成功构建仅在肿瘤细胞内特异性增殖的双调控溶瘤腺病毒(RSOAd-hTERT-HIF)，并以此为耐药基因ERCC1的siRNA基因载体，进一步包装成溶瘤腺病毒hTERT启动/HIF-ERCC1siRNA质粒(RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1 siRNA),以抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡，达到提高肿瘤基因治疗的目的。经鉴定，本研究构建的双调控腺病毒能够在卵巢癌细胞中高拷贝增殖，并能成功屏蔽卵巢癌SKOV3细胞中ERCC1耐药基因，且实现了针对恶性肿瘤端粒酶阳性和缺氧环境的双调控作用。
此外，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(serine/threonine kinase,Akt；protein kinase B,PKB)通路是一个经典的抗凋亡、促存活的信号转导途径，由PI3K家族、Akt蛋白及其一系列底物组成。PI3K是细胞膜上的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)细胞内部分的下游分子，EGFR激活后，PI3K随后活化，并进一步磷酸化激活Akt，磷酸化的Akt直接或间接参与许多生理和病理过程。目前研究表明，PI3K/Akt转导途径是卵巢癌细胞对DDP敏感性的关键调控因素。
JAK-STAT信号通路是一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。JAK-STAT信号通路功能广泛，目前与疾病及药物创新相关的研究都集中于炎症性疾病及肿瘤性疾病。
本发明选用卵巢癌SKOV3细胞进行该病毒的细胞学试验，通过对细胞进行MTT检测发现此病毒对上皮性卵巢癌细胞株SKOV3具有一定的杀灭作用，且携带ERCC1 siRNA后并不影响病毒灭瘤效果；甚至屏蔽ERCC1基因后还具有明显顺铂增敏作用。同时进行了细胞凋亡通路的检测，JAK/STAT通路的激活可能是该病毒诱导肿瘤细胞死亡的一条重要途径，PI3K/Akt通路尚未发现参与其中。
本发明将双调控腺病毒应用于妇产科肿瘤，致力构建一种靶向性极高的溶瘤腺病毒应用于卵巢癌的治疗，探讨其溶瘤机制及化疗增敏效果，为卵巢癌的基因治疗打下坚实的研究基础。以此提供一种即能靶向抗肿瘤，亦能化疗增敏的肿瘤治疗新方案，灭瘤同时减少顺铂用量，加强化疗效果并提高病人生活质量，延长患者生存期，为病患带来福音。
附图说明
图1A为质粒构建图示；
其中，图1A(a)：携带ERCC1-siRNA基因的工具载体质粒(载体顺序为pU6-MCS-phTERT-E1A-pHREE1B55K-pIX-E2B，克隆位点：Age I、Not I)，
图1A(b)：溶瘤腺病毒包装辅助质粒(PBHGE3)。
图1B为将构建好的病毒增加荧光载体，将病毒转染后的卵巢癌细胞SKOV3放置于荧光显微镜下观察图示(病毒MOI＝30，放大倍数为100倍)；
其中，图1B(a)：正常光线下细胞图像；
图1B(b)：荧光显像。
图2为AD-ERCC1-siRNA病毒敲减后检测及作用SKOV3细胞24小时效果图。
其中，图2A为对AD-ERCC1-siRNA病毒作用后的卵巢癌细胞SKOV3进行蛋白提取，随后进行WB检测，设立对照组，p<0.01。
图2B为AD-ERCC1-siRNA实验组和NC-siRNA空白对照组，在细胞培养24小时后的对比图，实验组可见大量SKOV3细胞凋亡，显微镜放大倍数40倍。
图3为采用SKOV3细胞检测双调控腺病毒毒性的MMT实验效果图；
其中，图3A显示病毒作用卵巢癌细胞24小时效果,SKOV3细胞随病毒感染强度升高，生存率下降，且AD-ERCC1-siRNA组与AD-NC-siRNA组无明显差异；
图3B显示在感染强度(MOI)＝30时，卵巢癌SKOV3细胞存活率下降到50％以下。
图4为WB检测AD-ERCC1-siRNA病毒作用后的细胞凋亡通路；
其中，图4A显示病毒作用卵巢癌细胞SKOV3细胞24小时后JAK/STAT表达量升高，P<0.01，有统计学差异。
图4B显示同样进行相同方式检测PI3K/Akt通路结果发现无明显差异表现。
图5为MTT检测DDP组，病毒组，联合组等五个组别对卵巢癌细胞SKOV3的增值抑制率；
其中，图5A为表单形式，图5B为柱状图，其均显示五组作用卵巢癌细胞SKOV3能明显抑制肿瘤细胞增值，与对照组相比，aP<0.01，1-4组与第5组相比，以DDP联合AD-ERCC1-siRNA组(第5组)肿瘤抑制率最高，bP<0.01，#P<0.01，与AD-NC-siRNA组相比，AD-ERCC1-siRNA组对肿瘤细胞作用无明显差异,*P>0.05。
具体实施方式
一、主要试剂和设备
实验用质粒载体由上海吉凯基因公司实验构建并保存。正常的卵巢癌细胞系SKOV3购自美国ATCC公司，人胚胎肾细胞293t细胞株购自加拿大Microbix Biosystem公司，DEME培养基、胎牛血清购自GIBCO BRL公司，MTT试剂盒购自美国Genview公司，RIPA裂解液购自碧云天生物公司，磷酸酶抑制剂购自美国Sigma公司，DMSO购自上海试一化学试剂厂，D-Hanks由上海吉凯基因技术有限公司配制，酶标仪购自Tecan infinite公司，ERCC1、β-actin、JAK2、STAT、PI3K、Akt抗体皆购买于美国Abcam公司，二抗Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary antibody、二抗Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary antibody 购自Thermo Pierce公司，ERCC1干扰序列(siRNA-ERCC1)、阴性对照序列均由上海吉凯基因有限公司设计合成。
二、方法
1.双调控腺病毒构建
使用吉凯基因有限公司提供的pXC-1载体进行改造,其E1a基因上游插入了人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)，E1b基因上游插入了缺氧调控元件序列(HRE)，于E1a表达盒上游预留了酶切位点(具体结构模式图如图1A所示)。根据Genbank的ERCC1基因序列涉及特异siRNA。
ERCC1-siRNA序列为5’-ccAAGCCCTTATTCCGATCTA-3’。
阴性对照序列5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。
编码siRNA的DNA结构为：AgeI+U6启动子+Sense DNA+Loop(TTCAAGAGA)+Antisense DNA+TTTTT+NotI,将双酶切线性化的载体和退火双链DNA进行连接反应，连接后的产物进行转化、PCR鉴定及测序、质粒提取后与腺病毒包装质粒(PBHGE3)一起转染293细胞，重组出双调控腺病毒AD-ERCC1-siRNA及其对照腺病毒AD-NC-siRNA。
具体过程如下：
A、克隆构建部分
1.siRNA设计：
| Target Seq | GC％ | |
| ERCC1-siRNA | TTCTCCGAACGTGTCACGT | 52.63％ |
| 阴性对照 | ccAAGCCCTTATTCCGATCTA | 42.11％ |
2.目的腺病毒载体
载体名称：CV033
对照编号：CON159
3.合成oligo信息:
4.测序结果：
| ID | 序列 |
| ERCC1-RNAi(67393-1) | ccggTTCTCCGAACGTGTCACGTttcaagagaACGTGACACGTTCGGAGAAtttttg |
| ERCC1-RNAi(67394-1) | ccggccAAGCCCTTATTCCGATCTAttcaagagaTAGATCGGAATAAGGGCTTggtttttg |
5.质粒抽提
将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。详细操作步骤如下：
5-1.收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；
5-2.弃上清,加入250μl细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；
5-3.加入250μl细胞裂解液，再加入10μl蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，致使菌体裂解澄清；
5-4.加入350μl中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；
5-5.10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干冷无菌的1.5mlEP管；
5-6.12000rpm离心5min，同时冸备标记好的回收柱，将上清转移至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；
5-7.加入600μl预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；
5-8.在超冷台中将回收柱转移至新的1.5ml EP管中，静置10-20min，自然晾干；
5-9.往回收柱中加入95μl Nuclease-Free Water，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。
B、腺病毒包装部分
| 病毒名称 | 滴度(PFU/mL) |
| AD-ERCC1-RNAi(67393-1) | 4E+10 |
| AD-ERCC1-RNAi(67394-1) | 1E+10 |
病毒滴度检测方法：终点稀释法
本实施例采用Frank L.Graham教授建立的AdMax腺病毒包装系统进行腺病毒包装，将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒不携带腺病毒大部分基因组(E1/E3缺失)的辅助包装质粒共转染HEK293细胞，利用Cre-loxP(或FLP/frt)重组酶切割系统，即可产生携带外源基因的非复制型重组腺病毒。AdMax腺病毒包装共涉及两个质粒，分别为：携带目的基因戒靶点序列的工具载体质粒，腺病毒包装辅助质粒(PBHG)。
参照经典的脂质体法进行两质粒共转染HEK293细胞。在转染完成后的10-15天进行出毒判定，根据不同的实验需求进行毒种扩增，采用相应的浓缩纯化斱式，得到高滴度的腺病毒保存液，并制定严格的质量标冸测定腺病毒的各项指标。
1、实验材料
1-1.细胞株
HEK293(ATCC，cat#CRL-1573)腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为含10％FBS的DMEM培养基。该细胞中包含幵表达Ad5型腺病毒的E1区域，E1缺失的腺病毒可以在其间生长。
2-2.菌株
大肠杆菌菌株DH5α，用于扩增腺病毒穿梭质粒和辅助包装载体质粒。
3-2.质粒
1)腺病毒穿梭质粒。
2)辅助包装质粒：pBHG lox ΔE1,3Cre(Microbix.Canada)携带了腺病毒大部分基因组和重组酶CRE基因等，质粒图谱如图1.A(b图)。
质粒的制备(病毒包装的质粒尽可能采用去内毒素质粒抽提试剂盒抽提)：
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提叏腺病毒包装系统中质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8-2.0之间。
2.质粒转染与腺病毒收获
2-1.转染前24h，用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，以含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为达30％-40％，重新接种于细胞培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱内培养。24h左右待细胞密度达到50％-60％时即可用于转染；
2-2.转染前2h更换为无血清培养基；
2-3.将DNA溶液(穿梭质粒5μg、辅助质粒5μg)不DMEM混合均匀，调整总体积为50μl，室温下温育5min；叏10μl Lipofectamine 2000试剂不50μl DMEM混合，室温下温育5min；将稀释后的DNA溶液不Lipofectamine 2000轻轻混匀，勿振荡，室温下温育20min，以便形成DNA/Lipofectamine 2000转染复合物；
2-4.将转染复合液缓慢滴加至HEK293细胞培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
2-5.培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入2ml的PBS清洗一次，轻柔晃动以洗涤残余的转染混和物后倒弃；
2-6.缓慢加入含10％血清的细胞培养基5ml，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养，每天观察转染后细胞生长状冴，若培养基明显发黄，酌情补加适量的新鲜完全培养液。
2-7.转染后约10-15d，显微镜观察HEK293细胞是否开始飘落，出现细胞病发(cytopathic effect,CPE)。
2-8.待大部分细胞显示典型CPE，且有50％细胞脱壁，低速离心收集细胞幵重悬于2ml DMEM中，-70℃/37℃反复冶融、振荡3次，4℃、7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。
3.腺病毒的扩增
3-1.第1轮扩增
将生长状态良好的HEK293细胞传入T25细胞培养瓶中，待细胞汇合达60％，弃去旧培养液，加入重组成功后的复制缺陷型腺病毒粗提液2mL，置于细胞培养箱中孵育90min后补加完全培养液3mL，继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％细胞脱壁时，低速离心收集细胞幵重悬于2ml DMEM中，-70℃/37℃反复冶融、振荡3次，4℃、7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。
3-2.第2轮扩增
将生长状态良好的HEK293细胞传入T25细胞培养瓶中，待细胞汇合达90％，弃去旧培养液，加入第1轮扩增所得的病毒液2ml，置于细胞培养箱中孵育90min后补加完全培养液10mL，继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％细胞脱壁时，低速离心收集细胞幵重悬于10ml DMEM中，-70℃/37℃反复冶融、振荡3次，4℃、7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。
4.腺病毒纯化
使用Adeno-XTM Virus Purification Kit，BD Biosciences,Clontech，
4-1.取出BD Adeno-X纯化装置，0.45μm滤膜过滤10ml病毒粗提液，保存滤液于收集瓶中；
4-2.向病毒滤液中加入4μl 25U/μl的Benzonase，混匀，37℃温育30min后，加入10ml 1×dilution buffer，混合均匀；
4-3.组装过滤装置，使用灭菌PBS排尽滤器和套管中的空气后，将套管揑入收集瓶病毒滤液中，以5ml/min的速度向外拉动注射器，使病毒滤液流经滤器；注：避免空气进入系统。
4-4.使用1×Wash Buffer洗涤过滤装置；
4-5.使用5ml的BD Luer-Lok注射器洗脱腺病毒：在注射器中吸入3ml的1×Eultion Buffer；连接注射器和滤器的凹口，推入lml Elution Buffer流经滤器至5ml灭菌离心管中；室温下孵育滤器5min，推入剩下的elution buffer流经滤器来收集剩下的腺病毒；
4-6.将纯化后的腺病毒分装，-70℃保存。
2.双调控腺病毒鉴定
各腺病毒经PCR扩增鉴定E1a序列后，于293细胞中反复扩增，氯化氩密度梯度离心纯化，TCID50法检测病毒滴度：挑取病毒克隆噬斑，提取腺病毒DNA，鉴定腺病毒E1a和hTERT序列。MTT结果显示，AD-ERCC1-siRNA、AD-NC-siRNA病毒对卵巢癌细胞有杀伤作用，如图3A所示，本发明将AD-ERCC1-siRNA病毒对卵巢癌细胞作用效果进行了图像观察，如图2B所示。同时，本发明将构建好的病毒增加荧光载体，置于荧光显微镜下进行观察，病毒转染效率较高，如图1B所示。
2.1.MTT法检测细胞增殖能力
将对数期生长细胞离心后，重悬细胞，于96孔板接种(密度5×104个/孔)，继续培养，用无血清培养液稀释病毒AD-ERCC1-siRNA、AD-NC-siRNA，按照MOL＝5.00、10.00、20.00、40.00、60.00加入100ul稀释好的病毒液分别感染细胞，对应于每个MOI值设3个复孔，于24h后向各孔加入MTT液(5mg/ml)20μl，孵育4h，终止培养，小心的将孔内上清液吸弃，将100μl二甲基亚砜加入各孔，振荡15min，待结晶物完全溶解后，利用酶标仪检测各孔在492nm波长处的吸光度A值。
根据DDP作用于SKOV3预实验结果，得出DDP IC10(2.26mg/L)，并设置五个组别DDPIC10(2.26mg/L)、AD-ERCC1-siRNA(MOI30)、AD-NC-siRNA(MOI＝30)、DDP IC10+AD-NC-siRNA(MOI 30)、DDP IC10+AD-ERCC1-siRNA(MOI＝30)，MTT法比较各组的吸光度(A)值及细胞增值抑制率。
2.2.蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中JAK2、STAT、PI3K、Akt蛋白表达
各组细胞转染后培养24h，用预冷的RIPA裂解液和磷酸酶抑制剂分别提取总蛋白并检测纯度。取总蛋白30μl，进行10％聚丙烯胺凝胶电泳，电至PVDF膜上，用3％牛血清白蛋白室温下封闭60min，TBST冲洗3次,加入一抗JAK2、STAT、PI3K、Akt，4℃过夜孵育，TBST冲洗3次，将二抗加入，37℃孵育60min，用TBST冲洗3次，暗室下用ECL反应15min，用Image J软件分析，计算细胞中JAK2、STAT、PI3K、Akt蛋白表达量。
2.3.统计分析：
使用SPSS和GraphPad Prism软件进行统计分析和制作图表。数据表示使用平均值±标准偏差(SD)。通过使用t检验评估测试组和对照组之间的差异性。P值<0.05被认为具有统计学意义。
3.结果:
3.1.RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1双调控腺病毒成功构建并可以高效转染卵巢癌细胞。
本发明将携带ERCC1-siRNA基因的工具载体质粒(图1A-a)与腺病毒包装质粒-PBHGE3(图1A-b)一起转染293细胞，成功构建双调控溶瘤腺病AD-ERCC1-siRNA。
本发明将构建成功的AD-ERCC1-siRNA病毒增加荧光载体，置于荧光显微镜下进行观察，病毒转染效率较高(图1B)。图1B-a为常光下转染图，图1B-b为荧光显像，病毒MOI＝30，放大倍数为100倍。
3.2.RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1双调控腺病毒对卵巢癌细胞有杀伤作用。
本发明将AD-ERCC1-siRNA病毒对卵巢癌细胞作用效果进行了图像观察，与空白对照组相比，可见大量SKOV3细胞死亡(图2B)，MTT方法检测双调控腺病毒对卵巢癌细胞SKOV3细胞的杀灭作用(图3)，结果提示，当病毒接触卵巢癌细胞24小时后发挥出对卵巢癌细胞较明显的杀灭作用，且AD-ERCC1-siRNA组与AD-NC-siRNA组无明显差异(图3A)，在感染强度(MOI)＝30时，卵巢癌SKOV3细胞存活率下降到50％以下(如图3B所示)。
3.3.RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1双调控腺病毒高效屏蔽ERCC1耐药基因，并可能通过JAK/STAT通路介导杀伤上皮性卵巢癌细胞。
本发明采用传统WB方法对病毒作用后的SKOV3细胞进行细胞收集以及蛋白提取后检测。结果显示AD-ERCC1-siRNA组作用后的细胞ERCC1蛋白表达明显减少(图2A)，JAK2,STAT3表达量较对照组表达增加(图4A，p<0.01)。同时本发明也进行了PI3K/Akt通路的相关蛋白检测，没有发现表达有统计学差异(图4B)。
3.4携带ERCC1-siRNA的双调控病毒较AD-NC-siRNA更能增强顺铂的用药效果，其机制可能与ERCC1耐药基因成功屏蔽有关。
本发明采用MTT方法检测单药顺铂组、AD-ERCC1-siRNA组、AD-NC-siRNA组对卵巢癌细胞SKOV3细胞的杀灭作用(图5)，结果提示，携带ERCC1-siRNA的双调控病毒联合顺铂较顺铂单药组、AD-NC-siRNA+DDP组灭瘤作用更强，具有明显顺铂增敏作用。
序列表
<120> 携带ERCC1基因siRNA的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> human
<400> 1
Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala
1 5 10 15
Cys Gly Thr
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> human
<400> 2
Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Thr Ala Thr Thr Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ala Thr Cys Thr Ala
20
<210> 3
<211> 57
<212> PRT
<213> human
<400> 3
Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Ala Ala Cys Gly Thr
1 5 10 15
Gly Thr Cys Ala Cys Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala
20 25 30
Ala Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Ala
35 40 45
Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly
50 55
<210> 4
<211> 61
<212> PRT
<213> human
<400> 4
Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Thr Ala Thr
1 5 10 15
Thr Cys Cys Gly Ala Thr Cys Thr Ala Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala
20 25 30
Gly Ala Thr Ala Gly Ala Thr Cys Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Thr Gly
50 55 60
Claims (9)
1.携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒,其特征在于:siRNA质粒和腺病毒包装质粒，经转染，重组出目标腺病毒；
其中，所述siRNA选自如下(a)-(c)中的任一一项：
(a).携带ERCC1基因的siRNA；
(b).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的携带ERCC1基因的siRNA；
(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA,并加工形成(a)中所述的携带ERCC1基因的siRNA。
2.如权利要求1所述的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征在于：
所述siRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征在于：
所述腺病毒包装质粒为PBHGE3。
4.如权利要求1所述的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征在于：
用于抑制和杀灭卵巢癌SKOV3细胞。
5.如权利要求1所述的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征在于：
用于转染卵巢癌细胞。
6.如权利要求1所述的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征在于：
用于屏蔽ERCC1耐药基因。
7.如权利要求1所述的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征在于：
对顺铂具有增敏作用或提高顺铂耐药性。
8.如权利要求1所述的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征在于：
用于制备抗卵巢癌的药物。
9.如权利要求1所述的携带ERCC1基因siRNA的hTERT/HIF的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒，其特征在于：
所述抗卵巢癌的药物为经胃肠道以外给药途径剂型。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080292592A1 (en) * | 2004-04-30 | 2008-11-27 | Sunil Chada | Oncolytic Adenovirus Armed with Therapeutic Genes |
| US20100136658A1 (en) * | 2006-12-22 | 2010-06-03 | Bayer Schering Pharma Ag | Generation of oncolytic adenoviruses and uses thereof |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080292592A1 (en) * | 2004-04-30 | 2008-11-27 | Sunil Chada | Oncolytic Adenovirus Armed with Therapeutic Genes |
| US20100136658A1 (en) * | 2006-12-22 | 2010-06-03 | Bayer Schering Pharma Ag | Generation of oncolytic adenoviruses and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘国艳等: "核苷酸切除修复交叉互补基因1与卵巢癌顺铂耐药的关系", 中华肿瘤杂志, vol. 30, no. 3, pages 184 - 187 * |
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