CN118139632A

CN118139632A - 褥疮的预防剂和/或治疗剂

Info

Publication number: CN118139632A
Application number: CN202280036404.9A
Authority: CN
Inventors: 善本隆之; 片平泰弘; 山下靖弘
Original assignee: Cysay Co ltd; Tokyo Medical University
Current assignee: Cysay Co ltd; Tokyo Medical University
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2024-06-04

Abstract

本发明的目的在于提供一种褥疮的预防和/或治疗剂，其以插入有特定基因的永生化间充质干细胞的培养上清作为有效成分。本发明提供一种褥疮的预防和/或治疗剂，其以插入有hTERT或pTERT基因中的任一者、以及bmi‑1基因、HPV‑E6基因、HPV‑E7基因的永生化间充质干细胞的培养上清作为有效成分。此处，上述间充质干细胞优选来源于人或猪，上述培养上清优选分别以1×10³～1×10⁶pg/mL的浓度范围包含选自由胰岛素样生长因子结合蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂、血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子受体II以及骨保护素·破骨细胞分化抑制因子组成的组中的至少3种以上的细胞因子。

Description

褥疮的预防剂和/或治疗剂

技术领域

本发明涉及以间充质干细胞的培养上清作为有效成分的褥疮的预防剂和/或治疗剂。更详细地说，涉及以在间充质干细胞中导入基因而制作的永生化干细胞的培养上清作为有效成分的褥疮的预防剂和/或治疗剂。

背景技术

当今社会中，随着老龄化的进展，罹患各种疾病的高龄者趋于增加。并且，对于高龄者来说，当卧床不起时，会产生褥疮的问题。“褥疮”是指，因卧床不起等原因，受体重压迫的身体部位的血流变差或停滞，由此使受体重压迫的部位的皮肤部分泛红、溃疡或产生伤口。通常也被称为“压疮”。

健康人的情况下，即使在睡眠中也会在无意识之中翻身，当长时间坐在椅子上时会进行抬起臀部等动作，进行“体位转换”以使得不会对相同部位施加长时间的压迫。

但是，当无法自行进行体位转换时，对于长时间受到体重压迫的皮肤细胞无法补给充分的氧和营养，由此形成“褥疮”。“褥疮”不仅形成在皮肤的表面，有时当位于皮肤中的靠近骨骼的组织受伤时也会形成。

不仅是长期卧床不起的患者，因抗癌剂、类固醇等药物的副作用而使免疫力降低的患者、罹患有充血性心衰、骨盆骨折、脊髄损伤、糖尿病、脑血管疾病、慢性阻塞性肺疾病等的患者也容易产生褥疮，因此需要注意。这正是由于褥疮的形成成为细菌等的感染途径。因此，根据形成了什么样的褥疮来进行药剂的涂布、利用敷料的被覆等保守治疗、以及切除和组织重建等外科治疗。

作为褥疮的治疗剂，将氧化锌软膏、Olcenon(注册商标)软膏、Reflap(注册商标)软膏、Actosin(注册商标)软膏等聚乙二醇软膏、托可维A酸、溶菌酶盐酸盐等化合物根据褥疮部位的状态与其他试剂合用来使用。

另一方面，近年来，开始进行使用利用了生物物质的生物药品而非化合物的治疗法，在2015年，人异体骨髓间充质干细胞(下文中有时称为“MSC”)在日本国内首次作为针对急性移植物抗宿主病的治疗的再生医疗等产品获得了许可(下文中称为“现有技术1”)。这基于如下原因：间充质干细胞(下文中有时称为“MSC”)是属于间充质系统的成体干细胞，能够从骨髓、脂肪组织、脐带、脐带血、牙髓等中采集，具有向成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞等间充质细胞分化的分化能力，此外还具有免疫抑制、容易聚集到成为炎症部位的损伤组织的性质，显示出组织修复、再生能力。由此，MSC作为再生医疗的细胞疗法而受到关注。

此处，根据日本厚生劳动省的规定，广义的“再生医疗”是指通过将整合有活细胞的设备等移植到患者体内等、或者利用细胞生长分化因子使内源性干细胞活化/分化而活化受损脏器或组织的自我再生能力，由此恢复丧失的功能的医疗。更具体地说，是指通过将在患者体外人工培养的干细胞等移植到患者体内等而使受损的脏器或组织再生、恢复丧失的人体功能的医疗；以及通过将在患者体外由干细胞等人工构建的组织移植到患者体内等而使受损的脏器或组织再生、恢复丧失的人体功能的医疗。

目前，作为褥疮治疗药，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor、以下有时称为“bFGF”)已经在市场上出售(参见非专利文献1)。另外，已有报告指出，在将来源于骨髓或脐带血的MSC用于细胞疗法的情况下，对褥疮模型有效。此外还有报告指出，MSC本身通过内质网应激的抑制效果而参与了褥疮的治愈(参见非专利文献2、以下称为“现有技术2”)。此处，内质网应激是指在内质网(下文中有时简称为“ER”)中蛋白质未被正常折叠、变性蛋白质等未被正常折叠的蛋白质(下文中有时称为“错误蛋白质”)蓄积而引起的现象，有报告指出，这样的错误蛋白质与帕金森氏病、阿尔茨海默氏病等神经变性疾病、炎症、癌等相关。另外还已知，当发生ER应激时，会引起被称为内质网应激应答(UPR：unfolded protein response；未折叠蛋白质应答)的几种信号传导途径的活化。

另外，已知有使用人乳牙来源的牙髓干细胞作为MSC来制作导入有永生化基因(hTERT、HPV16 E6/E7、hBMI1)的细胞系的技术(参见专利文献1、WO2017/078176，以下称为“现有技术3”)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2017/078176

非专利文献

非专利文献1：Robson M,et al.The safety and effect of topically appliedrecombinant basic fibroblast growth factor on the healing of chronic pressuresores Ann Surg.1992 216:401-406.

非专利文献2：Motegi S,et al.,Protective effect of mesenchymal stemcells on the pressure ulcer formation by the regulation of oxidative andendoplasmic reticulum stress.Sci Rep.2017 7(1):17186.

非专利文献3：Y.Yukie,et al.Thickness and pressure deformability ofsoft tissue over the sacrumin elderly and young subjects.日本看护研究学会杂志vol.27,No.22004

发明内容

发明所要解决的课题

现有技术1在将人异体MSC用于急性移植物抗宿主病的治疗的方面具有优点。但是，现有技术1中，用途限定于急性移植物抗宿主病的治疗、并且使用异体细胞，因此存在不能排除产生免疫应答的可能性的问题。

现有技术2在将骨髓或脐带血来源的MSC用于细胞疗法的情况下对褥疮模型有效的方面具有优点。但是，这里使用的MSC为细胞本身，与现有技术1同样地存在不能排除产生免疫应答的可能性的问题。

另外，在上述细胞疗法中使用MSC的情况下，除了迁移到炎症部位而替换损伤细胞的机理以外，认为还有由细胞分泌的细胞因子、生长因子等营养因子所产生的旁分泌效应的机理。但是，存在这样的营养因子的种类和产生量根据所使用的细胞群而不同的问题。

现有技术3在制作导入有永生化基因(hTERT、HPV16 E6/E7、hBMI1)的细胞系的方面具有优点。但是，现有技术3中完全未设想将所得到的永生化干细胞或其培养上清用于褥疮的预防和/或治疗。

因此，对于效果及安全性高的褥疮的预防和/或治疗剂有强烈的社会需求。

用于解决课题的手段

本发明是基于上述情况而完成的，其目的在于提供一种褥疮的预防和/或治疗剂，该预防和/或治疗剂以插入有特定基因的永生化间充质干细胞的培养上清作为有效成分。

即，本发明的第1方式涉及一种褥疮的预防和/或治疗剂，其以插入有bmi-1基因、HPV-E6基因、HPV-E7基因以及TERT基因的永生化间充质干细胞的培养上清作为有效成分。此处，上述TERT优选为hTERT或pTERT。另外，上述间充质干细胞优选为牙髓干细胞。此外，上述牙髓干细胞优选来源于人或猪。

另外，优选上述培养上清分别以1×10³～1×10⁶pg/mL的浓度范围包含选自由胰岛素样生长因子结合蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂、血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子受体II以及骨保护素·破骨细胞分化抑制因子组成的组中的至少3种以上的细胞因子。

此外，上述胰岛素样生长因子结合蛋白优选为选自由IGFBP-2、IGFBP-3以及IGFBP-4组成的组中的至少一者。另外，上述金属蛋白酶组织抑制剂优选为TIMP-1或TIMP-2。

上述培养上清优选为选自由冷冻品、冷冻干燥粉末以及液剂组成的组中的任一形态。另外，上述褥疮的预防和/或治疗剂优选根据需要包含赋形剂、pH调节剂、稀释剂、缓冲剂等。

上述褥疮的预防和/或治疗剂优选为选自由注射剂、软膏、硬膏、乳膏剂以及透皮吸收剂组成的组中的任一剂型。

发明的效果

根据本发明的褥疮的预防和/或治疗剂，通过以插入有bmi-1、HPV-E6、HPV-E7以及TERT基因的永生化间充质干细胞的培养上清作为有效成分，能够预防褥疮，并且即使在形成了褥疮之后也能够促进其迅速恢复。

另外，根据本发明的褥疮的预防和/或治疗剂，由于使用上述永生化干细胞，因此能够使培养上清中的含有成分的种类和量稳定，能够制造出品质稳定的褥疮的预防和/或治疗剂。

附图说明

图1是示出对于以一定浓度以上包含在本发明中使用的永生化间充质干细胞的培养上清(hSHED-CM)中的细胞因子进行分析的结果的图。

图2是示出上述hSHED-CM的制备方法的流程图。

图3是上述hSHED-CM中所包含的细胞因子的定量表达分析的流程图。

图4是上述hSHED-CM中所包含的细胞因子的定性表达分析的流程图。

图5是从上述hSHED-CM中得到的外泌体中的微RNA(microRNA)的表达分析的流程图(之一)。

图6是从上述hSHED-CM中得到的外泌体中的微RNA的表达分析的流程图(之二)。

图7是示出由图4的过程得到的细胞因子的定性表达分析结果的图(之一)。

图8是示出由图4的过程得到的细胞因子的定性表达分析结果的图(之二)。

图9是示出以实验方式使小鼠形成褥疮的方法(A)以及所形成的褥疮(B)的照片。图9(C)和图9(D)是表示这些照片的线图。

图10是示出给药方案1时的给药部位和给药结果的图。图10(A)示出给药方案1(从I/R处置的次日起连续给药4天后，空出1天，再连续给药2天)，给药部位如图10(B)所示。另外，图10(C)是示出再灌注后的损伤面积的经时变化的图。图10(C)中，DMEM表示杜氏改良伊格尔培养基，hSHED-CM表示人牙髓干细胞来源的永生化干细胞的培养上清，并且bFGF表示碱性成纤维细胞生长因子。

图11是示出给药方案2时的给药部位和给药结果的图。图11(A)示出给药方案2(从I/R处置的次日起连续给药7天)，给药部位如图11(B)所示。另外，图11(C)是示出再灌注后的损伤面积的经时变化的图。图11(C)中，DMEM表示杜氏改良伊格尔培养基，hSHED-CM表示人牙髓干细胞来源的永生化干细胞的培养上清。

图12(A)是示出利用图11(A)所示的给药方案进行了治疗的小鼠的褥疮形成部位的治愈状况的照片。上段是表示第2天～第12天期间的对象组小鼠的I/R处置部位的变化的照片，并且下段是表示相同期间内的hSHED-CM给药组的该部位的变化的照片。图12(B)是示意性地表示这些照片的线图。

图13是示出给药方案3时的给药部位和给药结果的图。图13(A)示出I/R处置部位，红色的箭头表示在一个I/R处置部位给药了100μl。图13(B)表示给药方案3(从I/R处置的次日起连续给药7天)，在第4天，从图11(C)所示的部位采取患部组织。

图14是示出采集了图13(C)所示的患部组织的小鼠的情形的照片(图14(A))、将该部位放大的照片(图14(B))、以及示出将该组织进行了福尔马林固定的状态的照片(图14(C))。在照片的下侧(图14(A)和图14(B))或横侧(图14(C))示出其线图。

图15是将图14(C)所示的采集组织进行石蜡包埋并对薄切得到的切片进行苏木精-伊红(HE)染色和作为活性氧的指标的8-OHdG的免疫组织化学染色而得到的照片(图15(A))；以及将其面积定量化的图(图15(B))。图15(A)中，在第4段示出示意性地表示放大的染色照片的线图。线图中，空白部分表示切片，并且斜线部表示切片中8-OHdG为阳性的部位。

图16是将图14所示的组织进行石蜡包埋并对薄切切片进行HE染色以及使用针对周细胞标志物CD31的抗体进行免疫组织化学染色而得到的照片(图16(A))；以及将其CD31+的面积进行定量并进行比较的结果(图16(B))。图16(A)中，在第4段示出位于第3段的放大的染色照片的示意性线图。线图中的空白部分为切片，并且位于该切片中的黑线为mCD31阳性的部位，用箭头突出显示。

图17是将图14所示的组织进行石蜡包埋并对薄切得到的切片进行HE染色以及使用针对周细胞标志物NG2的抗体进行免疫组织化学染色而得到的照片(图17(A))；以及将其NG2+的面积进行定量并进行比较的结果(图17(B))。图17(A)中，在第4段示出位于第3段的放大的染色照片的示意性线图。线图中的空白部分为切片，位于该切片中的黑色虚线表示组织的边界，并且黑线表示mCD31阳性的部位，用箭头突出显示。

图18是示出给药方案4时的给药部位和给药结果的图。图18(A)示出给药方案4(褥疮发病后连续给药7天)，给药部位如图18(B)所示。另外，图18(C)是示出损伤面积的经时变化的图。图18(C)中，箭头表示给药开始日。图中，对照培养基(Control medium)表示杜氏改良伊格尔培养基，hSHED-CM表示人牙髓干细胞来源的永生化干细胞的培养上清。

图19(A)是示出利用图18(A)所示的给药方案进行了治疗的小鼠的褥疮形成部位的治愈状况的照片。上段是示出第2天～第10天期间的对象组小鼠的褥疮形成处置(下文中有时称为“I/R处置”)部位的变化的照片，并且下段是表示相同期间内的hSHED-CM给药组的该部位的变化的照片。图19(B)是示意性表示这些照片的线图。

图20是示出在I/R处置部位给药规定的细胞因子时的实验计划的示意图。图20(A)示出除去了规定因子的培养上清的给药方案。另外，图20(B)是示出小鼠的给药部位(褥疮部位)的示意图。

图21是示出按照图20(A)的给药方案对图20(B)所示的部位进行各因子的给药时的创伤形成区域的大小的经时变化的图。图21(A)示出使用阴性对照(对照抗体(对照Ab))时的结果，图21(B)示出使用除去了IGFBP-4的上述培养上清时的结果，图21(C)示出使用除去了VFGF的上述培养上清时的结果，并且图21(D)示出使用除去了HGF的上述培养上清时的结果。

图22是为了显示上述培养上清对活性氧种(下文中有时简称为“ROS”)的抑制效果而在体外(in vitro)系统中再现褥疮模型的发病机理的实验步骤的示意图。

图23是示出在图22所示的体外实验中在利用特异性抗体通过免疫沉淀除去了HGF、VEGF的上清中对NIH3T3进行培养时的ROS抑制的变化的基于荧光显微镜的观察结果。图23(A)为该观察照片，图23(B)为表示该照片的线图。

图24是将由图23的照片的最大亮度和最小亮度计算出的对比度作为ROS的相对值进行定量比较的图。

图25示出使用小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞时上述培养上清对内质网应激的抑制效果。图25(A)是示出添加1.5μg/mL衣霉素(下文中有时简称为“TM”)实施实时PCR为止的步骤的示意图。图25(B)是示出将所回收的处理完毕的NIH3T3细胞供于实时PCR时的内质网应激标志物的mRNA表达量的图。

图26是示出本发明的培养上清的事先给药对褥疮的发病抑制有效的实验的示意图。图26(A)是示意性地示出对模型小鼠的给药方案的图。图26(B)是示出对小鼠的SHED-CM给药部位的示意图。

图27示出本发明的培养上清的事先给药对褥疮的发病抑制有效。图27(A)是培养上清给药7天后的皮肤厚度的比较结果的观察图像和其线图，图27(B)是示出将该厚度定量并进行比较的结果的图。

图28是示出图26(A)所示的给药方案6时的给药结果的图。图28(A)是示出损伤面积的经时变化的图。图28(B)是示出事先处置的小鼠的褥疮形成部位的治愈状况的照片以及将其示意性表示的线图。上段是示出对象组小鼠、下段是示出hSHED-CM给药组的I/R处置部位的变化的照片以及上述线图。

具体实施方式

以下参照图1～图28对本发明的一个实施方式进行说明。需要说明的是，以下的说明以及附图中，对于相同或等同的要素附以相同符号，并省略重复的说明。

本发明的第一方式的褥疮的预防和/或治疗剂按以下顺序制作。即，(S1)在间充质干细胞中插入特定的4种基因的组合而制作永生化干细胞；(S2)对所得到的上述永生化间充质干细胞进行培养，制备其培养上清；(S3)制作以上述培养上清作为有效成分的褥疮的预防和/或治疗剂。

为了得到本发明的永生化干细胞，首先从哺乳类间充质细胞中分离干细胞。作为上述哺乳类，出于与人细胞的遗传相似性高、以及感染的危险性低的原因，优选为选自由人、猪、马以及猴组成的组中的哺乳类。

本说明书中，“间充质细胞”是指具有分化成成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞等属于间充质系统的细胞的分化能力的细胞。作为具体的间充质细胞，可以举出上述动物的牙髓细胞、骨髓细胞、脐带细胞以及脂肪细胞等。此外，“牙髓细胞”是指具有再生能力的牙的神经中所包含的干细胞的一种。由于受到牙齿这样的硬质材料的保护，因此具有紫外线、放射线不会透过、基因也不容易受损的特性。

另外，上述基因的组合由bmi-1、HPV-E6、HPV-E7以及TERT构成。hTERT是端粒修复酶的基因，bmi-1是构成多梳复合物的蛋白质之一的Bmi-1的基因。此处，Bmi-1是维持造血干细胞所必需的，具有能够通过其活性增强而增加造血干细胞的作用。E6和E7是HPV-16或HPV-18的DNA的早期基因。

以下对使用来自人脱落乳牙的牙髓细胞制作永生化干细胞进行说明。

首先，将脱落乳牙利用例如氯己定、聚维酮碘(Isodine)溶液等消毒剂消毒后，分割出牙冠部，利用牙科用铰刀回收牙髓组织。

将所采取的牙髓组织混悬在基本培养基中，例如混悬在含有5～15％牛血清(下文中有时称为“CS”)以及50～150单位/mL的抗生素的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium、以下称为“DMEM”)中。接着，在37℃使用1～5mg/mL的胶原酶以及1～5mg/mL的分散酶进行0.5～2小时处理。

作为上述基本培养基，除了DMEM以外，还可以使用伊斯科夫改良杜氏培养基(IMDM)(GIBCO公司等)、Ham F12培养基(HamF12)(SIGMA公司、GIBCO公司等)、RPMI1640培养基等。也可以将两种以上的基本培养基合用。作为混合培养基的一例，可以举出将IMDM与HamF12等量混合而成的培养基(例如以商品名：IMDM/HamF12(GIBCO公司)市售)。

另外，作为添加在基本培养基中的成分，可以举出胎牛血清(下文中称为“FCS”)、人血清、羊血清等血清、血清替代物(Knockout serum replacement(KSR)等)、牛血清白蛋白(下文中有时称为“BSA”)、青霉素、链霉素等抗生素、各种维生素、各种矿物质。

上述基本培养基也可以用于后述的细胞分选用培养、以及分选后的细胞的培养。

在酶处理后进行3～10分钟的离心操作(3,000～7,000转/分钟)，回收牙髓细胞。根据需要使用细胞滤网进行细胞的分选。将分选出的细胞重悬在例如3～6mL的上述基本培养基中，接种至直径4～8cm的贴壁细胞培养用培养皿中。

接着，添加培养液、例如添加含有10％FCS的DMEM，之后在5％CO₂培养箱中在37℃培养2周左右。除去上述培养液后，利用PBS等将细胞清洗1次～数次。代替培养液的除去以及细胞的清洗，也可以回收形成了集落的贴壁性的牙髓干细胞。贴壁性的牙髓干细胞例如利用0.025～0.1％的胰蛋白酶和0.3～1mM的EDTA在37℃处理数分钟，使其从培养皿上剥离，继而回收细胞。

接着，对如上所述分选出的贴壁性细胞进行培养。例如，将如上所述得到的牙髓干细胞接种至贴壁细胞培养用培养皿中，在5％CO₂、37℃的条件下在培养箱中进行培养。

关于传代培养，例如在用肉眼观察达到近汇合或汇合时，如上所述使用胰蛋白酶和EDTA使细胞从培养容器上剥离并进行回收，再次接种到加入有培养液的培养容器中。

此处，近汇合是指培养容器中的细胞附着面的约70％有细胞附着的状态。例如，进行1～8次传代培养，使分选出的细胞增殖到必要的细胞数、例如约1×10⁷个/mL。如上所述进行培养后，回收细胞，保存在液氮中。也可以将从各种供体回收的细胞以牙髓干细胞库的形态进行保存。

接着，向对上述干细胞进行原代培养而得到的原代培养细胞中导入4种基因，制作基因导入细胞。出于能够得到个体倍增次数更多的永生化干细胞的原因，优选导入到其中的基因为上述的hTERT、bmi-1、E6和E7。此处，hTERT是人端粒酶逆转录酶的基因，bmi-1是与干细胞的自我复制、分化调控相关的多梳家族基因。E6和E7是存在于编码人乳头瘤病毒用于自我复制的早期基因的开放阅读框中的基因。

这样的基因导入可以如下进行。

制备用于插入上述目的基因的质粒，将其插入到穿梭载体、例如pSuttle2中，对上述基因进行克隆化。利用该穿梭载体转化大肠杆菌，选择卡那霉素抗性转化体。对所选择的卡那霉素抗性转化体的质粒DNA进行提纯，分析限制酶位点，鉴定重组体。

1.DNA片段的制作以及病毒载体制作步骤

1.1病毒插入用DNA片段的制作

首先获得为了在病毒中插入DNA片段而使用的载体的序列信息。在本发明的方法中，从所导入的基因并非瞬时性地表达的方面出发，作为基因导入用载体使用的病毒优选为选自由慢病毒、腺病毒、逆转录病毒组成的组中的任一种。从导入基因的稳定表达株的产生效率高的方面出发，优选使用慢病毒。

以下举出使用慢病毒质粒载体(pLVSIN)的情况为例进行说明。pLVSIN的序列信息例如从宝生物网站目录下载，确认多克隆位点。

接着，如下制作DNA片段。本发明中，在上述DNA片段中插入2～4个基因来制作永生化干细胞。所使用的细胞只要是从哺乳类得到的干细胞就没有特别限定，从容易获得、并且能够得到性状稳定的永生化干细胞的方面出发，优选使用猪牙髓组织、猪脂肪组织或者人牙髓组织。

另外，从能够制作出具有稳定性状的永生化干细胞的方面出发，优选此处所导入的基因为选自由2种乳头瘤病毒的早期基因、端粒酶逆转录酶(TERT)以及bmi组成的组中的至少2种以上的基因的组合。另外，从表达效率的方面出发，优选上述乳头瘤病毒的早期基因为人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7。

更优选制作包含下述(a)～(e)的任一种基因组合的DNA片段来使用：(a)人乳头瘤病毒E7和端粒酶逆转录酶(TERT)；(b)bmi和TERT；(c)bmi、人乳头瘤病毒E6和TERT；(d)人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7和TERT；(e)bmi、人乳头瘤病毒E6、人乳头瘤病毒E7和TERT。从基因的表达效率的方面出发，TERT优选使用hTERT。

上述基因中，TERT是编码使随着年龄增长而缩短的端粒序列延长的酶的基因。已知人乳头瘤病毒E6和E7均为人乳头瘤病毒的早期基因，E6使TERT再活化、使具有PDZ结构域的蛋白质分解。已知bmi-1是多梳家族基因，与干细胞的自我复制、分化调控相关。

通过插入上述这样的基因组合，能够确认以何种组合导入这样的基因时它们能够效率良好地表达、细胞能够永生化。

以下对制作慢病毒载体并导入2种基因的情况进行说明。为了插入作为上述(a)的组合的人乳头瘤病毒E7的基因和端粒酶逆转录酶(TERT)，按照序列信息通过标准过程合成例如EcoRI/KoZal/E7/T2A4/hTERT/BamHI的双链DNA(序列表的序列编号1)。将所得到的DNA片段通过标准过程克隆化至上述慢病毒质粒载体(pLVSIN-CMV Neo)的多克隆位点，能够得到插入有上述2种基因的慢病毒载体(E7T)。

同样地，在导入不同的2种基因的情况下、例如在导入上述(b)的组合的情况下，首先按照标准过程合成包含Bmi-1的EcoRI/KoZal/Bmi-1/T2A4/hTERT/BamHI的双链DNA(序列表的序列编号2)。将所得到的DNA片段通过标准过程克隆化至上述慢病毒质粒载体(pLVSIN-CMV Neo)的多克隆位点，能够得到插入有上述2种基因的慢病毒载体(BT)。

同样地，在导入3种基因的情况下，按照序列信息合成T2A3E6的双链DNA，插入到上述(v2)中制作的慢病毒载体的Bmi-1与T2A4之间，制作EcoRI/KoZal/Bmi-1/T2A3/E6/T2A4/hTERT/BamHI的双链DNA(序列表的序列编号3)。将所得到的DNA片段通过标准过程克隆化至上述慢病毒质粒载体(pLVSIN-CMV Neo)的多克隆位点，能够得到插入有上述3种基因的慢病毒载体(BE6T)。

同样地，在导入4种基因的情况下，合成E6T2A3的双链DNA，插入到上述(d)中制作的慢病毒载体E7T的Kozak序列与E7之间，通过标准过程合成制作EcoRI/KoZal/E6/T2A3/E7/T2A4/hTERT/BamHI(序列表的序列编号4)。将所得到的DNA片段通过标准过程克隆化至上述慢病毒质粒载体(pLVSIN-CMV Neo)的多克隆位点，能够得到插入有上述3种基因的慢病毒载体(E6E7T)。以上的DNA片段的合成可以委托受托进行DNA合成的企业来进行。

在逆转录病毒的情况下，与慢病毒载体的情况不同，制作插入有单个基因的载体，通过共感染进行导入。例如，按照常规方法制备在起始密码子的上游附加有Kozak序列(gccacc)的5种永生化基因(hTERT(序列表的序列编号5)、人乳头瘤病毒的E6(序列表的序列编号6)以及人乳头瘤病毒的E7(序列表的序列编号7)、猪TERT(序列表的序列编号8)、以及hBmi-1(序列表的序列编号9))，按照常规方法克隆化至pDON-5NEODNA(TaKaRa编号3657)的PmaC I-Hpa I位点，能够制备出逆转录病毒质粒载体(pDON-5Neo hTERT载体、pDON-5NeoHPV16E6载体、pDON-5Neo HPV16E7载体、pDON-5Neo pHTERT载体和pDON-5Neo hBmi1载体)。

之后，使用如上制作的5种质粒DNA，按照常规方法转化大肠杆菌，将所得到的转化体在CO₂培养箱中培养，能够得到转染级的质粒DNA。

接着，将G3T-hi细胞以5.5～6.5×10⁶个/皿接种到所期望的微孔板中，在5％CO₂培养箱中在约37℃培养约20～28小时，加入期望量的转染试剂(例如0.3～0.5mL的TransIT-293)，从上述5种质粒载体中选择3种，共导入pGP和pE-Ampho(均为逆转录病毒包装试剂盒(Retrovirus Packaging Kit)Ampho附带的载体))，进一步在相同条件下进行40～56小时培养，能够导入这些基因。

1.2载体产生细胞的制备

与上述作业并行地准备重组慢病毒载体产生细胞。作为这样的细胞系，可以使用例如Lenti-X 293T(Clontech公司制造、编号：632180)等市售的细胞系。Lenti-X 293T的培养可以使用含有胎牛血清和抗生素的培养基。作为这样的培养基，例如可以举出最低必需培养基(MEM)、杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)等。从细胞的增殖效率的方面出发，例如优选使用含有5％～15％的胎牛血清(FBS、HyClone公司制造)、0.5％～2％的抗生素(青霉素/链霉素、Gibco公司制造)的DMEM(SIGMA公司制造、圣路易斯、MO)等。

例如，也可以制备含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM并将该培养基用作基本培养基。以下，在本说明书中，将该培养基称为“293T基本培养基”。

例如，在作为上述细胞系使用Lenti-X 293T的情况下，制备1×10⁵～5×10⁵细胞/mL的细胞悬浮液，将该悬浮液10mL加入至10cm培养皿中，在5％CO₂培养箱中培养约24小时，之后根据细胞的状态进行传代直到使用为止。在使用时，首先除去持续传代的细胞的培养上清，用PBS清洗，加入市售的剥离剂将细胞从培养皿上剥离并回收。接着，取期望量的约3～5倍稀释的细胞悬浮液，加入台盼蓝染色液，使用血细胞计数板计数活细胞数。加入上述基本培养基，制备约5×10⁵细胞/mL的细胞悬浮液，以例如所期望的浓度接种在培养皿中，在所期望的条件下进行培养。例如将上清细胞以1×10⁶～4×10⁶细胞/4mL接种在直径6cm的胶原包被培养皿中，之后在约37℃在5％CO₂培养箱中培养约24小时，更换培养基，进一步继续培养。

另外，作为逆转录病毒制备细胞，优选使用G3T-hi细胞，其是使用潮霉素抗性基因向人肾脏来源的细胞系293T(G418抗性)中导入人N-乙酰葡糖胺基转移酶III(N-acetylglucosaminyl transferase III：GnT-III)而得到的GnT-III高表达细胞系(Takara Bio株式会社制)。

上述G3T-hi细胞是如下进行设计的：使用逆转录病毒包装试剂盒Eco或Ampho(Takara Bio株式会社制造、产品编号6160、6161)，将gag-pol、env基因的表达载体质粒和插入有目的基因的重组逆转录病毒载体质粒进行共导入，由此能够迅速且瞬时性地产生高滴度的重组病毒。其原因在于，由于上述G3T-hi细胞来源于293T，因而导入有SV40的T抗原基因，通过该基因的作用使逆转录病毒的RNA被扩增，从而得到高滴度的病毒液。通常，通过使用逆转录病毒包装试剂盒的瞬时性表达，可得到包含10⁵～10⁷cfu/mL的病毒的溶液。

上述G3T-hi细胞中，细胞膜糖链被GnT-III修饰。推测是由于出芽的逆转录病毒缠绕在宿主细胞膜上，因而由上述G3T-hi细胞得到的重组逆转录病毒的膜蛋白的糖链受到GnT-III的修饰。通过该糖链修饰，使用上述G3T-hi细胞制备的逆转录病毒对RetroNectin(重组人纤连蛋白片段)的亲和性增高，因而通过使用RetroNectin作为培养器的包被剂，可显著提高基因向靶细胞中的导入效率。RetroNectin在以血细胞系细胞作为靶的基因导入中特别有效。

在使用G3T-hi细胞的情况下，从逆转录病毒的产生效率的方面出发，优选代替上述293T基本培养基而使用在包含葡萄糖(4.5g/L)和L-谷氨酰胺(584mg/L)的DMEM中添加10％FBS和1％青霉素/链霉素而成的培养基。

1.3病毒载体的制作

以下举出慢病毒载体的情况为例进行说明。

在加入有按以上说明进行培养的细胞的多个培养皿中分别加入如上制作的慢病毒载体质粒，进行共转染。这样的共转染可以使用市售的包装系统、例如Lenti-X HTX包装系统(Clontech公司制造)等。具体的过程按照这样的系统所附带的操作手册进行即可。

共转染结束后，将培养基更换成新鲜的完全培养基，在约37℃培养24～48小时。进行病毒载体的滴度测定来确定回收的时机，在病毒滴度达到最大的时刻回收包含病毒载体的培养上清。病毒载体的滴度测定可以使用市售的简易滴度测定试剂盒，作为这样的试剂盒，例如可以举出Lenti-X GoStix(Clontech公司制造)等。

例如，在更换培养基的次日，用所期望的大小的注射器吸取上述培养皿的培养上清而进行回收，对所回收的培养上清进行过滤，得到病毒载体。例如用10mL的一次性注射器(Terumo株式会社制)吸取培养上清，之后在该注射器上安装例如0.45μm的过滤器(MILEX-HV、Millipore公司制造)，一边对注射器内的培养上清进行过滤，一边将病毒载体溶液回收到例如15mL管中。

接着，使用市售的简易滴度测定试剂盒中所包含的试剂，确认重组慢病毒载体的存在。例如，可以在上述的Lenti-X GoStix的S中加入期望量的病毒载体溶液、例如加入20μL，进一步添加Chase缓冲液1，在室温使其反应期望的时间、例如反应10分钟，通过有无条带来确认重组慢病毒载体的存在。

将如上得到的包含4种质粒(E7T、BT、BE6T和E6E7T)的细胞在琼脂培养基上划线，挑取所形成的集落，接种在期望量的培养基、例如包含抗生素的约2mL的LB培养基中，在约37℃一边剧烈搅拌一边振荡培养约8小时。接着，在包含不同的抗生素、例如氨苄青霉素的例如约50mL的LB培养基中移植期望量、例如100μL的如上培养的细胞的培养液，在约37℃一边剧烈搅拌一边振荡培养约14～18小时。

使用市售的试剂盒、例如MN NucleoBond Xtra中等量提取试剂盒(Clontech公司制造)，测定用水洗脱的质粒的量。与此同时，利用所期望的凝胶、例如约1％的琼脂糖凝胶进行分析，确认所插入的DNA各自不同。作为凝胶电泳分析的标志物，可以使用例如超螺旋DNA梯状标志物、λ-Hind III消化DNA等。如上能够制作出病毒载体。

2.哺乳类的干细胞的制备

2.1猪牙髓干细胞的制备

获得出生后5～6个月的猪的颌骨(带有下颌齿的下颌骨)和肠系膜。按照以下步骤从上述猪的牙齿和下颌骨得到猪的牙髓干细胞(下文中有时称为“SHED”)。

首先，将上述猪的牙齿和下颌骨用适当的消毒剂、例如聚维酮碘消毒。之后使用例如牙科用金刚石车针将下颌齿的牙冠沿水平方向切断，接着沿垂直方向切削而除去髓腔顶。利用例如牙科手术用刮垢器从牙冠和牙根部采集牙髓。

将所得到的牙髓使用例如眼科用穿刺刀切碎，悬浮在期望的浓度、例如1～3mg/mL的胶原酶溶液中，在约37℃的恒温槽中放置期望的时间、例如1小时来分离细胞。将分离出的细胞在期望的培养基、例如包含10％FBS和1％Anti-Anti(抗生素、抗缩瞳剂(Anti-myotic)；Invitrogen公司制造、卡尔斯巴德、CA)的DMEM中在约37℃在5％CO₂培养箱中进行预培养，得到传代用的细胞。

首先，一边以每周2～3次的频率更换培养基一边进行培养，直至达到近汇合为止，使用剥离剂、例如包含0.05％胰蛋白酶的Hepes溶液将达到近汇合的细胞剥离，在期望的条件下、例如在室温以1,500rpm离心约3分钟来进行收集。将所得到的细胞转移到新鲜的培养基中，在与上述同样的条件下使用所期望的量、例如全部量进行传代培养。

2.2人乳牙牙髓干细胞的制备

获得由健康儿童得到的脱落乳牙或拔牙得到的乳牙。将这样的乳牙利用适当的消毒剂、例如聚维酮碘溶液消毒后，与得到猪的牙髓同样地回收牙髓组织。将所得到的牙髓组织在期望浓度的胶原酶和分散酶、例如约3mg/mL的I型胶原酶和约4mg/mL的分散酶的溶液中在期望的温度下消化期望的时间、例如在约37℃消化约1小时。接着，将该溶液使用例如70mm的细胞滤网(Falcon公司制造)进行过滤，滤出细胞。

将这样滤出的细胞重悬在期望量、例如4mL的上述培养基中，接种在期望直径、例如直径6cm的贴壁细胞培养用培养皿中。向其中添加期望的培养基、例如含有约10％FCS的DMEM，在调整为5％CO₂、37℃的培养箱中培养期望的时间、例如2周左右。将形成了集落的贴壁性细胞(牙髓干细胞)利用期望的剥离剂、例如包含约0.05％胰蛋白酶的约0.2mM EDTA在约37℃处理期望的时间、例如5分钟，回收从培养皿上剥离的细胞。

接着，将如上回收的贴壁性细胞接种在例如贴壁细胞培养用培养皿(胶原包被的培养皿)中，在例如调整为5％CO₂、37℃的培养箱中进行原代培养，得到原代培养细胞。在通过肉眼观察达到近汇合或汇合时，使用与上述同样的剥离剂同样地进行处理，回收包含在培养皿内的细胞。

之后，使用上述培养基以期望的浓度、例如约1×10⁴细胞/cm²的浓度对原代培养细胞进行传代培养，将传代了1～3次左右的细胞用于实验。如上能够得到人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。

根据需要，可以将如上得到的猪乳牙牙髓干细胞、猪脂肪干细胞和人乳牙牙髓干细胞分别装入小瓶中，在负80度冷冻保存。

3.基因导入细胞的制作

3.1利用慢病毒载体的基因导入

将如上得到的猪牙髓干细胞、猪脂肪干细胞以及人牙髓干细胞与上述同样地进行培养，在达到约70％～90％汇合时，使用市售的试剂盒进行支原体检测。作为这样的试剂盒，例如可以使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza公司制造、LT07-318)等。接着，使用聚凝胺试剂，使如上制作的慢病毒载体感染上述各干细胞，进行试剂选择，选择出目的基因的稳定表达株。

除去如上培养的各干细胞的培养上清，用例如PBS(pH 7.4)清洗后，使用期望的剥离剂将细胞剥离，分别进行回收。作为这样的剥离剂，例如对于猪乳牙牙髓干细胞和猪脂肪干细胞，可以使用StemPro(注册商标：GIBCO公司制造)，对于人乳牙牙髓干细胞，可以使用胰蛋白酶-EDTA等。

按照常规方法对所得到的细胞进行计数，在例如进行了组织培养处理(T.C.treatment)的6孔板(CORNING公司制造)的各孔中按照约1×10⁵细胞/孔进行接种，在约37℃的CO₂培养箱内培养约24小时，确认细胞在整体均匀地存在。

之后除去培养上清，对于猪乳牙牙髓干细胞，以期望量、例如750μL/孔分别添加包含期望浓度的聚凝胺的期望培养基、例如包含约8μg/mL的聚凝胺和约10％FBS的DMEM培养基。接着，向各孔中以例如约250μL/孔分别添加如上得到的慢病毒载体溶液。

在人乳牙牙髓干细胞的情况下，以期望量、例如约1.2mL/孔分别添加与上述同样的包含聚凝胺和FBS的DMEM，接着向各孔中以期望量、例如约400μL/孔分别添加上述慢病毒载体溶液。

将如上添加了病毒载体的各微孔板以期望的条件、例如约1,000×g在约32℃离心约30分钟，使病毒感染细胞。之后以期望的条件、例如在约37℃的CO₂培养箱内培养约4～约6小时，之后向各孔中分别添加期望量、例如约1mL/孔的培养用培养基，进一步以期望的条件、例如在37℃的CO₂培养箱内培养约24小时，进行基因导入。

3.2试剂选择

从如上培养的干细胞(猪牙髓干细胞、猪脂肪干细胞和人牙髓干细胞)的培养板的各孔中除去培养上清，将包含期望浓度的选择试剂、例如约0.4mg/mL或约0.8mg/mL的遗传霉素(G418、GIBCO公司制造)的选择培养基以期望量、例如约2mL/孔加入到各孔中，更换成选择培养基。之后一边更换培养基一边培养期望的时间、例如约3～约5天，进行基因导入细胞的选择。

将上述各培养细胞的一部分用于克隆化，余下的部分作为池细胞在选择用培养基中继续培养。克隆化可如下进行。

例如，使用不含抗生素的选择培养基、例如不含青霉素、链霉素和G418的选择培养基将细胞稀释，将期望浓度、例如约1×10³细胞/4mL或约5×10³细胞/4mL接种到各培养皿中，接着在约37℃的CO₂培养箱内培养约24小时。从培养皿的背面侧对所形成的集落进行标记，在集落数达到所期望的数目、例如约100个时，除去培养上清，用PBS清洗。将克隆环置于培养皿中，将使用剥离剂剥离的集落的细胞分别加入到各自加入有期望量、例如约1mL的培养基的48孔板的各孔中。

3.3总RNA的制备

为了确认基因表达，使用例如NucleoSpin RNA II(MACHEREY-NAGEL公司制造的试剂盒)制备总RNA。以下使用的各种缓冲液、环形过滤器等使用上述试剂盒的附带品，从得到高纯度的总mRNA的方面出发，优选按照试剂盒附带的操作手册进行操作。

将利用期望数量、例如约5×10⁵个细胞制作的细胞团块溶解来制备溶解液，将该溶解液加入到紫色的环形过滤器中，以期望的条件、例如约11,000×g离心约1分钟。离心后弃掉过滤器，向收集管中加入期望量的乙醇、例如约350μL的约70％乙醇，进行期望次数、例如约5次的吹打。

接着，取期望量、例如约700μL的所得溶液，加载到设置在收集管中的淡蓝色的环形柱中，以期望的条件、例如约11,000×g离心约30秒，使RNA结合。离心后，将该柱设置于新的收集管中，加入期望量的试剂、例如约350μL的MDB，以期望的条件、例如约11,000×g进行约1分钟离心分离，将其脱盐。

离心后，将期望量、例如约10μL的rDNA酶与约90μL的DNA酶用反应缓冲液轻轻地混合，制备DNA反应混合液，将期望量、例如约95μL加入到该柱中，以期望的条件、例如在室温温育约15分钟，对DNA进行消化。接着，将期望量、例如200μL的缓冲液RA2加入到柱中，以期望的条件、例如约11,000×g离心约30秒，进行清洗。接着，将柱设置于新的收集管中，将期望量、例如约700μL的缓冲液RA3加入到该柱中，以期望的条件、例如约11,000×g进一步离心约30秒，进行清洗。

接着，弃掉流出到收集管中的溶液，再次将期望量、例如约250μL的缓冲液RA3加入到该柱中，进一步以期望的条件、例如约11,000×g离心约2分钟，使该柱的二氧化硅膜风干。将该柱设置于期望大小、例如约1.5mL的收集管中，将期望量、例如约60μL的不含RNA酶的水加入到该柱中，以期望的条件、例如约11,000×g离心约1分钟，得到总RNA样品。

3.4逆转录反应

由如上得到的总RNA样品进行逆转录，接着进行实时PCR，得到PCR产物。逆转录使用例如PrimeScript RT试剂盒(完美实时、Takara Bio公司制造)等市售品，按照这样的试剂盒中附带的操作手册进行逆转录即可。

实时PCR可以使用例如SYBR Premix Ex Taq等市售的试剂盒来进行。另外，作为此处使用的标准基因，例如可以举出猪β-肌动蛋白、人β-肌动蛋白等，作为引物，例如可以制备序列表的序列编号10～15所示的引物来使用。

首先，将期望量、例如约350μL的SYBR Premix Ex Taq II(x2)、约28μL的引物混合物(约10μL)和约266μL的二次蒸馏水混合，制备实时PCR用预混合物。接着，将期望量、例如约23μL的上述预混合物分别分注到实时PCR用管中，向各管中各加入约2μL的模板cDNA。接着，以期望的条件、例如在约95℃约30秒、约40次循环的“在约95℃约5秒、之后在约60℃约30秒”的条件进行实时PCR。接着，以在约95℃约15秒、在约60℃约30秒、在约95℃约15秒的条件使其解离，求出熔解曲线。对人牙髓干细胞也进行同样的操作。

由如上制作的校正曲线能够求出利用各病毒载体导入了基因的细胞中的各基因的表达量。通过利用内标基因的表达量进行校正，能够得到精度良好的结果。

在导入有基因的各干细胞中，对所导入的基因的表达进行确认。通过该确认，能够求出基于如上制作的各病毒载体的基因的导入效率。接着，由如上得到的基因导入细胞(下文中有时称为“导入基因稳定表达细胞群”或“池细胞”)进行细胞的单克隆化。

首先，将上述池细胞以期望的个数接种在期望大小的培养皿中，例如以约1×10³个/培养皿的细胞浓度接种在60mm培养皿中，在CO₂培养箱中以期望的温度培养期望的时间、例如在37℃培养24小时。之后将培养基也更换成上述的含有选择试剂的生长培养基，继续进行培养，形成集落。对于所形成的集落，使用克隆环和剥离剂将每个集落剥离，分别接种在期望的微孔板、例如24孔板中。

使接种的细胞增殖后，接种在培养用培养皿等中使其增殖，进行扩大培养，由此能够以单克隆形式得到导入基因稳定细胞。接着，将所得到的克隆与上述同样地进行培养，使其增殖，得到总mRNA。以所得到的总RNA作为模板，使用期望的试剂盒、例如PrimeScript RT试剂盒进行逆转录反应，得到模板cDNA。

之后，例如以cDNA(逆转录产物)作为模板，使用上述的SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)、引物(对导入基因和内标基因分别具有特异性的引物、例如序列表的序列编号10～15所示的引物)，与上述同样地进行实时PCR。

以由上述实时PCR的二阶微分曲线计算出的Ct值为X轴、以总RNA的相对值为Y轴分别进行作图，制作各基因的表达量测定用的校正曲线。求出将池细胞的表达量设为1时的猪牙髓干细胞来源的导入基因和人牙髓干细胞来源的导入基因的表达量的相对值，由此求出所导入的基因是否全部进行了表达、并且求出它们的表达量，选择出目的克隆。

如上所述能够得到导入有期望基因的永生化干细胞群、以及由该细胞群克隆化得到的永生化干细胞的克隆。

使用例如氨苄青霉素从所得到的转化体中选择氨苄青霉素抗性异质转化体(下文中称为“Amp+”)并进行提纯，分析限制酶位点，鉴定重组体。接着，利用例如Pac I对重组腺病毒进行消化，将所得到的片段转染到HEK293细胞中使其增殖，将其收集，进行上述病毒的滴度测定。按照常规方法提纯上述病毒，使其感染靶细胞SHED-P。

按照常规方法利用FITC对病毒感染后的HEK293的细胞群进行染色，使用流式细胞仪检测STRO-1阳性细胞。此处，STRO-1被认为是骨髓中的具有多分化能力的间充质干细胞的标志物之一，成为细胞永生化的指标。通过以上的过程能够得到牙髓来源的永生化干细胞。

接着，使用上述基本培养基、例如加入有10％FBS的DMEM，在5％CO₂、37℃的条件下对所得到的永生化干细胞进行24～48小时培养，得到培养上清。培养上清的回收可以使用例如Komagome吸移管等。

另外，上述永生化干细胞向培养上清中分泌胰岛素样生长因子(IGFBPs)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、组织金属蛋白酶组(TIMPs)以及肝细胞生长因子(HGF)等生长因子。此处，“生长因子”是促进细胞分裂、带来形态变化或肥大的多肽的总称。因子根据产生生长因子的细胞的种类而不同，大致分为上皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、肿瘤生长因子(TGF)等。

此外，位于各细胞的细胞膜上的受体具有酪氨酸激酶活性，当生长因子结合时，蛋白质的酪氨酸残基被磷酸化，引起细胞的增殖或分化。已知有生长因子在个体发生中成为中胚层诱导物质的若干示例。另外，已知有调节免疫系统的淋巴因子在个体发生中成为中胚层诱导物质的若干示例。这样的生长因子可利用公知的ELISA法、微阵列法等进行定量。

上述IGFBPs是与胰岛素的序列高度相似的多肽，在细胞培养中与胰岛素同样地引起促有丝分裂等反应。已知其还会影响神经细胞的生长。另外，上述VEGF是与血管形成(在胚胎形成期在无血管的位置形成新的血管)和血管新生(从现有的血管伸出分支来形成血管)相关的一组糖蛋白。HGF不仅对肝细胞、而且对各种细胞具有担负促进细胞增殖、促进细胞运动、抗凋亡(细胞死亡)、诱导形态形成、血管新生以及组织/脏器的再生和保护的多种生理活性。

将上述各种干细胞在例如添加了15％FCS的DMEM中在37℃培养规定的期间，由此可以得到含有上述生长因子的培养上清。需要说明的是，在上述干细胞的培养上清中，除了IGFBPs、VEGF和HGF以外，还包含多种蛋白质。

将所得到的培养上清中的15mL加入到Amicon超速离心过滤单元(UltraCentrifugal Filter Units)-10K(Millipore公司制造)中，以4,000×g离心约60分钟，浓缩至约200μl。接着，向该管中投入与培养上清等量的灭菌PBS，再次以4,000×g离心约60分钟，将溶剂置换成PBS。将所得到的200μL的溶液回收到微量试管中，制成浓缩干细胞培养上清。

代替上述使用Amicon的方法，也可以利用乙醇沉淀法进行浓缩。例如，在5mL的培养上清中加入45mL的100％乙醇并进行混合，在-20℃放置60分钟。之后在4℃以15,000×g离心15分钟，除去上清。

接着，加入例如10mL的90％乙醇并充分搅拌，再次在4℃以15,000×g离心5分钟。除去上清，可以将所得到的团块溶解在例如500μL的灭菌水中。溶解后，将全部量回收到微量试管中，制成浓缩干细胞培养上清。

若按照常规方法对如上得到的培养上清进行冷冻干燥，则能够得到作为用时制备组合物的粒子粉末13。

实施例

(实施例1)永生化SHED的制作以及培养上清的制备

1.腺病毒导入用载体的制作

(1)试剂等

(1-1)质粒提取用试剂

使用卡那霉素(Kan)、氨苄青霉素(Amp)、LB液体培养基和LB琼脂培养基、糖原、琼脂糖、灭菌水、乙酸铵、乙酸钠、十二烷基硫酸钠和RNA酶A。制备50mg/mL的卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)，以储存液的形式保存在-20℃。糖原制备成20mg/mL。制备10mg/mL的RNA酶A，保存在-20℃。制备10M(饱和)乙酸铵(NH₄OAc)、3M的乙酸钠(NaOAc；pH 5.2)。

(1-2)限制酶等

大肠杆菌感受态细胞(Supercharge EZ10电转感受态细胞、产品编号636756)、SwaI(产品编号1111A、Smi I为等同品)、Xho I(产品编号1094A)、T4 DNA连接酶(产品编号2011A)、NucleoBond Xtra Midi(产品编号740410.10/.50/.100)、NucleoSpin质粒(产品编号740588 10/50/250)均由Takara Bio株式会社购入。Pac I由新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)购入。

(1-3)缓冲液等

制备1×TE缓冲液(含有1mM的EDTA的10mM Tris-HCl[pH8.0])、用100mM Tris-HCl(pH8.0)饱和的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1、以下称为“PCI混合液”)。乙醇以100％和70％使用。为了用于小规模提纯在重组中使用的pAdeno-X质粒DNA，制备下述缓冲液1～4。

缓冲液1：包含10mM EDTA和50mM葡萄糖的25mM Tris-HCl(pH8.0)(高压灭菌后在4℃保存)

缓冲液2：包含1％SDS的0.2M NaOH(在即将使用前进行用时制备，密封，室温保存)

缓冲液3：5M KOAc(高压灭菌后在4℃保存)

缓冲液4：包含1mM EDTA、20μg/mL RNA酶的10mM Tris-HCl(pH8.0)(在即将使用前添加RNA酶。在-20℃保存)

(2)腺病毒提纯和β-gal检测用试剂

使用利用人5型腺病毒进行了转化的人HEK293细胞(ATCC#CRL1573)。HEK293细胞在完全培养基中进行培养。完全培养基的组成为添加有100单位/mL的青霉素G钠和100μg/mL的链霉素、4mM的谷氨酰胺和10％FBS的DMEM(杜氏改良伊格尔培养基、基本培养基)。以10,000单位/mL制备青霉素G钠溶液、以10,000μg/mL制备硫酸链霉素溶液，以储存液的形式保存。培养中使用60mm微孔板、100mm微孔板、6孔板、T75和T175烧瓶。

胰蛋白酶-EDTA(产品编号CC-5012)由Takara Bio株式会社购入。制备磷酸缓冲生理盐水(PBS、不含Ca²⁺和Mg²⁺)和杜氏磷酸缓冲生理盐水(DPBS、含有Ca²⁺和Mg²⁺)。另外，使用0.33％的中性红染色液、0.4％台盼蓝染色液。在β-gal检测中，将X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(25mg/mL))二甲基甲酰胺(DMF)溶液在-20℃遮光保存。使用β-gal发光检测试剂盒II(产品编号631712、Takara Bio株式会社制)。

(3)预试验

(3-1)包含lacZ的重组腺病毒(pAdeno-X-lacZ)的构建

将解冻后除去了DMSO的HEK293细胞重悬于10mL的上述完全培养基中，将全部量转移至直径100mm的培养板中。在HEK293细胞贴壁后除去培养液，将细胞利用灭菌PBS进行一次清洗，加入1mL的胰蛋白酶-EDTA溶液，进行约2分钟处理。接着，加入10mL的完全培养基终止胰蛋白酶的反应，轻柔地悬浮。进行活细胞计数，将10⁵个细胞转移至加入有10mL培养液的直径100mm的培养板中，均匀地铺展。

使用pShuttle2-lacZ(包含在Adeno-X表达系统1中的阳性对照载体)和包含在试剂盒中的Adeno-X病毒DNA(利用PI-Sce I和I-Ceu I进行了消化)，按照试剂盒所附的操作规程构建包含lacZ的重组腺病毒。使其感染靶细胞SHED，检测β-半乳糖苷酶的表达，确认了载体的构建。

(3-2)重组pShuttle 2质粒的构建

在重组pShuttle 2载体(下文中称为“rpShuttle 2载体”)的构建前，利用试剂盒中包含的pShuttle 2载体和pShuttle 2-lacZ载体对DH5α大肠杆菌进行转化。在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板(下文中称为“LB/Kan”)上进行转化体的选择，将从单一菌落取得的菌体在新的LB/Kan上划线，在37℃温育过夜。

接着，将hTERT、bmi-1、HPV-E6、HPV-E7按下述过程克隆到pShuttle 2中。利用适合于这些基因的限制酶对pShuttle 2载体进行切割。接着，参照上述试剂盒中所附的pShuttle 2载体信息包(PT3416-5)，确定与所插入的DNA匹配的多克隆位点。利用碱性磷酸酶对限制酶处理后的上述质粒进行处理并提纯。

按照常规方法制备靶DNA片段并提纯。将上述利用限制酶消化后的载体与上述基因片段连接，利用连接产物对DH5α细胞(感受态细胞)进行转化。取上述感受态细胞的一部分，利用试剂盒中包含的对照载体pShuttle2-lacZ载体进行转化，作为阳性对照。

将包含转化后的大肠杆菌的混合液接种于LB/Kan琼脂板上，选择卡那霉素抗性(Kanr)转化体(菌落)。选择5～10个Kan抗性克隆，接种于少量的液体培养基中，进行扩增。在确认这些克隆具有rpShuttle 2载体后，温育过夜。之后使用市售的二氧化硅吸附柱，按照常规方法对所构建的质粒DNA进行提纯。

利用限制酶对该质粒DNA进行处理，进行1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的重组质粒。通过测序确认所插入的片段的方向和插入部位，鉴定阳性克隆。将重组pShuttle2质粒DNA(下文中称为“rpShuttle2质粒DNA”)直接转染至靶细胞中，进行蛋白免疫印迹法，对目的蛋白质的表达进行预检测。

(3-3)rpShuttle 2质粒DNA的PI-Sce I/I-Ceu I双消化

利用PI-Sce I和I-Ceu I从如上制作的rpShuttle2质粒DNA中切出所导入的基因的表达盒。按照试剂盒中所附的操作规程中记载的体外(in vitro)连接法，将切出的表达盒插入到Adeno-X病毒DNA中。制备rpShuttle 2质粒DNA的PI-Sce I/I-Ceu I双消化液30μl，将下述表1中记载的试剂装入到1.5mL的灭菌后微量离心管中，进行混合。

[表1]

接着，在充分混合后装入微量离心管中轻柔地离心，之后在37℃温育3小时。将1kb条带(DNA大小标记物)与上述双消化后的反应液(5μL)一起在1％琼脂糖/EtBr凝胶中进行电泳。

(3-4)苯酚：氯仿：异戊醇提取

在离心管中向余下的上述双消化液(25μl)中添加70μL的1×TE缓冲液(pH8.0)和100μL的PCI混合液，利用涡旋混匀器充分搅拌。接着，使用微量离心机，在4℃以14,000rpm离心5分钟，将水层转移至洁净的1.5mL微量离心管中。向其中添加400μL的95％乙醇、25μL的10M乙酸铵以及1μL的糖原(20mg/mL)，利用涡旋混匀器充分搅拌。

接着，在4℃以14,000rpm离心5分钟，抽吸除去上清，得到团块。向该团块中加入300μL的70％乙醇，在室温以14,000rpm离心2分钟。小心地抽吸除去上清，将团块在室温下风干约15分钟。

团块干燥后，将其溶解在10μL的1×TE灭菌缓冲液(pH8.0)中，使用前保存在-20℃。

(4)重组Adeno-X质粒DNA的构建

(4-1)表达盒向Adeno-X病毒基因组中的亚克隆化

将下述表2所示的试剂依序加入到1.5mL的灭菌后微量离心管中，温和地混合，轻柔离心后，在16℃温育过夜。

[表2]

试剂等	液量(μL)
		PI-Sce I/I-Ceu I消化后pShuttle 2质粒DNA	2.0
PI-Sce I/I-Ceu I消化后pShuttle 2-lac Z质粒DNA	-
		灭菌水	3.0
10×DNA连接缓冲液	1.0
		Adeno-X病毒DNA(250ng/μL)	3.0
DNA L连接酶(1单位/μL)	1.0
		合计	10.0

向各样品中加入90μL的1×TE缓冲液(pH8.0)和100μL的PCI混合液，利用涡旋混匀器温和地搅拌。在4℃以14,000rpm离心5分钟，将水层转移至洁净的1.5mL微量离心管中，向其中添加400μL的95％乙醇、25μL的10M乙酸铵以及1μL的糖原(20mg/mL)，利用涡旋混匀器温和地搅拌。

在4℃以14,000rpm离心5分钟，通过抽吸除去上清，得到团块。与上述(3-4)同样地进行之后的乙醇沉淀操作。团块干燥后，将其溶解在15μL的灭菌去离子水中。

(4-2)重组Adeno-X质粒DNA的Swa I消化

制备下述表3所示的消化液，加入到装入离心管中的各样品中，在25℃温育2小时。

[表3]

试剂等	液量(μL)
		连接产物	15
10×Swa I消化缓冲液	2.0
		10×BSA	2.0
Swa I(10单位/μL)	1.0
		合计	20.0

向各样品中加入80μL的1×TE缓冲液(pH 8.0)和100μL的PCI混合液，利用涡旋混匀器温和地搅拌。利用微量离心管在4℃以14,000rpm离心5分钟。与上述(3-4)同样地进行之后的乙醇沉淀的操作，团块的溶解液在使用前保存于-20℃。

(4-3)利用重组Adeno-X质粒DNA进行的大肠杆菌转化的确认

使用Supercharge EZ10电转感受态细胞(产品编号636756)，利用上述(4-2)中得到的Swa I消化产物对电穿孔法用感受态细胞(大肠杆菌)进行转化。将转化混合液接种到在LB培养基中加入有氨苄青霉素(最终浓度100μg/mL)的琼脂板(下文中称为“LB/Amp琼脂板”)上，在37℃温育过夜。得到作为氨苄青霉素抗性(Ampr)转化体的约10⁶个菌落。将所得到的菌落利用产品附带的Adeno-X系统PCR筛选引物组进行检测。

在5mL新鲜的LB/Amp液体培养基中接种来自单一菌落的菌体，培养过夜。次日，按照后述的小规模法提纯Adeno-X质粒DNA。

(5)重组Adeno-X质粒DNA的小规模制备

将处于对数生长期的培养液5mL以14,000rpm离心30秒，除去上清。将团块再次以10,000rpm离心1分钟，使用微量移液管除去上清。向其中加入150μL的上述缓冲液1，温和地吹打，进行重悬。向该细胞悬浮液中添加150μL的缓冲液2，温和地颠倒混合，在冰上放置5分钟。向冷却的细胞悬浮液中加入150μL的缓冲液3，再次颠倒混合，在冰上放置5分钟。

将该细胞悬浮液在4℃以14,000rpm离心5分钟，将透明的上清转移到洁净的1.5mL离心管中。向该上清中添加450μL的PCI混合液，颠倒混合，进行搅拌。之后在4℃以14,000rpm离心5分钟，将水层转移到洁净的1.5mL微量离心管中。

与上述(4-1)同样地进行之后的乙醇沉淀的操作，团块的溶解液在使用前保存于-20℃。目的rDNA通过后述的基于限制酶的分析以及PCR进行鉴定。

(6)所得到的rAdeno-X质粒DNA的限制酶位点分析

使用PI-Sce I和I-Ceu I进行分析。将下述表4所示的试剂装入1.5mL的灭菌后微量离心管中，加入30μL的PI-Sce I/I-Ceu I双消化反应液，充分搅拌，轻柔地旋转，收集内容物。

[表4]

试剂等	液量(μL)
		灭菌水	19.5
10×双消化液	3.0
		rpAdeno-X DNA(500hg/μl)(500ng/μL)	2.0
pShuttle 2-lac Z质粒(500ng/μL)	-
		PI-Sce I(1单位/μL)	2.0
I-Ceu I(5单位/μL)	0.5
		10×BSA	3.0
合计	30.0

在37℃温育3小时，进行限制酶处理。将该处理后的反应液在1％琼脂糖/EtBr凝胶中进行电泳。

(7)重组腺病毒的产生

(7-1)HEK293细胞转染用rAdeno-X质粒DNA的制备

将下述表5所示的试剂等装入到1.5mL的灭菌后离心管中进行混合，利用微量离心机轻柔地离心。之后在37℃温育2小时，进行rAdeno-X质粒DNA的Pac I限制酶处理。

[表5]

试剂等	液量(μL)
		灭菌水	20
pAdeno-X质粒DNA(500ng/μL)	10
		10×Pac I消化缓冲液	4
10×BSA	4
		Pac I(10单位/μL)	2
合计	40

添加60μL的1×TE缓冲液(pH 8.0)和100μL的PCI混合液，利用涡旋混匀器温和地搅拌，利用微量离心机在4℃以14,000rpm离心5分钟。将水层小心地转移至洁净的1.5mL灭菌后离心管中。

与上述(3-4)同样地进行之后的乙醇沉淀的操作，团块的溶解液在使用前保存于-20℃。

(7-2)Pac I消化Adeno-X质粒DNA向HEK293细胞中的转染

在上述质粒DNA转染前24小时，按照每一直径60mm的培养板的细胞数为1×10⁶～2×10⁶(大约为100细胞/mm²)的方式接种HEK293细胞，在37℃、5％CO₂存在下进行温育。

将Pac I消化后的10μL的Adeno-X质粒DNA转染至各培养板中，按照标准的转染法(CalPhos哺乳动物转染试剂盒、产品编号631312、Takara Bio株式会社制)将Adeno-X DNA导入至HEK293细胞中。自转染的次日起确认是否产生了CPE(细胞变性效果)。1周后，对附着于培养板的底面、侧面的细胞温和地搅拌，使其游离。将所得到的细胞悬浮液转移至15mL的灭菌后锥形离心管中，在室温下以1,500×g离心5分钟。

将所得到的沉淀悬浮在500μL的灭菌PBS中。重复进行3次在干冰/乙醇中冷冻、在37℃的恒温槽融解的冷冻融解操作，使细胞充分融解，得到裂解液。接着轻柔地离心，除去悬浮物，将上清转移至另一灭菌的管中，立即使用。未立即使用的部分保存于-20℃。向60mm培养板的培养细胞中加入250μL的上述裂解液，继续进行培养。需要说明的是，使用Adeno-X快速滴度检测试剂盒(产品编号631028、Takara Bio株式会社制)中所包含的抗六邻体抗体，按照该试剂盒的操作说明书(PT3651-1)测定腺病毒的滴度。

(7-3)用于高滴度病毒制备的病毒的扩增

在开始进行该滴度测定前约24小时，将HEK293细胞接种至T75烧瓶中，在37℃、5％CO₂存在下培养过夜，确认达到50％～70％汇合。

次日，更换为包含病毒的新培养基，以MOI＝10进行感染。在37℃、5％CO₂存在下培养90分钟后，取出烧瓶，加入10mL的培养基。

在37℃、5％CO₂存在下培养3～4天，确认到CPE。在50％的细胞发生剥离时，与上述同样地制成游离细胞悬浮液，转移至15mL的灭菌后锥形离心管中。进行与上述同样的冷冻融解操作，使细胞融解。使用Adeno-X快速滴度检测试剂盒(产品编号631028)，得到10⁷PFU/mL的滴度。进行蛋白免疫印迹法，对包装后的腺病毒基因组是否以可发挥功能的形态具有目的基因特异性转录单元的拷贝进行确认。

(8)腺病毒向靶细胞的感染

(8-1)向靶细胞的感染

在感染前24小时，将1×10⁶个SHED接种至6孔板中。在接种的次日去除培养基，将包含病毒的1.0mL培养基添加到各微孔板的中心。使该溶液在SHED所形成的整个单层上均匀地铺展。

在37℃、5％ CO₂存在下培养4小时，使病毒感染SHED。接着添加新鲜的培养基，进一步在37℃、5％CO₂存在下进行培养。在感染24小时后～48小时后对导入基因的表达进行经时性分析。

(8-2)感染细胞的β-半乳糖苷酶表达的分析

感染了Adeno-X-lacZ的贴壁性细胞中的β-半乳糖苷酶的表达使用β-gal发光检测试剂盒II(产品编号631712、Clontech公司制造)进行检测。

2.逆转录病毒载体的制作

(1)试剂等

使用G3T-hi细胞(Takara Bio制造、产品编号6163)、TransIT-293(转染试剂、Takara Bio制造、产品编号MIR2704)、逆转录病毒包装试剂盒Ampho(Takara Bio制造、产品编号6161)、实时PCR用逆转录病毒滴度检测套装(Takara Bio制造、产品编号6166)、一步法SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(完美实时、Takara Bio制造、产品编号RR066A)。另外，使用实时PCR装置Thermal Cycler Dice Real System(Takara Bio制造、型号TP800)。

(2)质粒制作

为了制作逆转录病毒载体制备用逆转录病毒质粒，使用pDON-5Neo(Takara Bio制造、产品编号3657)。按照常规方法在作为永生化基因的TERT(人或猪、以下有时简称为“hTERT”或“pTERT”)、人乳头瘤病毒的E6和E7、hBmi-1的起始密码子的上游附加Kozak序列(gccacc)。

将附加有Kozak序列的上述5种永生化基因克隆至上述pDON-5Neo DNA的Pmac I-Hpa I位点，制备出搭载有pDON-5Neo hTERT载体(SYN5587-1-4)、pDON-5Neo HPV16E6载体(SYN5587-2-10)、pDON-5Neo HPV16 E7载体(SYN5587-3-7)、pDON-5Neo猪TERT载体(SYN5587-4-9)、pDON-5Neo hBmi1载体(SYN5587-5-1)的重组逆转录病毒载体(双嗜性包膜)各10mL。

对于如上得到的质粒DNA，通过单链分析对插入基因序列进行确认。使用上述质粒DNA对大肠杆菌进行转化，得到转化体。对所得到的转化体进行培养，之后按照常规方法提纯转染级的质粒DNA(约50μg)，以溶解于灭菌水中的DNA溶液的形式得到质粒DNA溶液。

(3)重组逆转录病毒载体的产生

使用5个组织培养用培养皿(直径100mm)，在每1个培养皿中接种6×10⁶个G3T-hi细胞，在37℃进行约24小时培养，使用转染试剂，在每一培养皿中共导入3种逆转录病毒产生用质粒(选自由pDON-5Neo hTERT载体、pDON-5Neo HPV16E6载体、pDON-5Neo HPV16E7载体、pDON-5Neo猪TERT载体以及pDON-5Neo hBmi1载体组成的组中的任一种载体、逆转录病毒包装试剂盒Ampho所附带的pGP和pE-Ampho)，在37℃进一步进行48小时的培养。

培养结束后，回收包含上述逆转录病毒载体的培养上清，用0.45μm过滤器(Millipore)过滤灭菌，将滤液以各1mL分注到灭菌管中。

(4)重组逆转录病毒载体的滴度的计算

使用实时PCR用逆转录病毒滴度检测套装和一步法SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(完美实时)，按照试剂盒附带的说明书对重组逆转录病毒载体的滴度进行定量。下述表6和表7中示出了逆转录病毒载体的滴度测定时的模板处理以及实时PCR的反应条件。

下述表6中示出了在逆转录病毒载体的滴度测定时的模板处理(利用DNA酶I的模板处理)中所使用的反应液的组成。下述表7中示出反应条件。即，将下述下表6所示的溶液在37℃温育30分钟，之后升温至70℃保持10分钟，骤冷至4℃。

[表6]

使用下述表7所示的溶液，在下述反应条件下进行实时PCR。(s1)在42℃5分钟、(s2)在95℃10秒、之后(s3)进行40次循环的在95℃5秒和在60℃30秒，制作熔解曲线。

[表7]

试剂	用量/反应
		2x一步法SYBR RT-PCR缓冲液III	12.5μL
TaKaRa ExTaq HS(5U/μL)	0.5μL
		PrimeScript RT酶混合物II	0.5μL
正向滴度引物FRT-1(10pmol/μL)	0.5μL
		反向滴度引物FRT-1(10pmol/μL)	0.5μL
不含RNA酶的dH₂O	8.5μL
		模板	2μL
合计	25.0μL

以试剂盒附带的RNA对照模板的拷贝数为X轴、以由二阶微分曲线(二阶导数(2^ndDerivative))计算出的Ct值为Y轴进行作图，制作校正曲线。下述表8中示出实时PCR的校正曲线的Ct值。另外，下述表中，例如“1.00E+08”表示“1.00×10⁸”。以下相同。

[表8]

通过二阶导数最大值(SDM)法计算出上述Ct值，根据算出的Ct值得到斜率-3.54、截距43.88、扩增效率91.6和决定系数0.999。由该校正曲线计算出被测样品的滴度，将其结果示于表9。

[表9]

/>

上述表中，E.D.表示使用了稀释用缓冲液EAST稀释液(用于实时PCR)。另外，滴度(拷贝数/mL)以计算出的拷贝数(拷贝数/μL)×2(DNA酶I处理时的稀释倍率)×实时PCR反应时的稀释倍率(100或500)×1,000(从μL换算成mL)的形式求出。

根据基于实时PCT的测定结果，DON-5Neo hTERT显示出1.46×10¹⁰拷贝/mL的滴度，pDON-5Neo HPV16E6显示出1.15×10¹⁰拷贝/mL的滴度，pDON-5Neo HPV16E7显示出4.05×10¹⁰拷贝/mL的滴度，pDON-5Neo猪TERT显示出1.27×10¹⁰拷贝/mL的滴度，并且pDON-5NeohBmi1显示出2.83×10¹⁰拷贝/mL的滴度。

(实施例2)SHED的制作

使用由10岁健康男孩得到的脱落乳牙。将该脱落乳牙用聚维酮碘溶液消毒后，使用牙科用金刚石车针将牙冠沿水平方向切断，使用牙科用铰刀回收牙髓组织。将所得到的牙髓组织在3mg/mL的I型胶原酶和4mg/mL的分散酶的溶液中在37℃消化1小时。接着，将该溶液使用70mm的细胞滤网(Falcon公司制造)进行过滤。

将滤出的细胞重悬于4mL的上述培养基中，接种于直径60mm的贴壁细胞培养用培养皿中。向该培养皿中添加含有10％FCS的DMEM(杜氏改良伊格尔培养基)，在调整为5％CO₂、37℃的培养箱中培养2周左右。将形成了集落的贴壁性细胞(牙髓干细胞)在0.05％胰蛋白酶-0.2mM EDTA中在37℃处理5分钟，回收从培养皿上剥离的细胞。

接着，将如上所述挑选出的贴壁性细胞接种于贴壁细胞培养用培养皿(胶原包被的培养皿)中，在调整为5％CO₂、37℃的培养箱中进行原代培养，制成原代培养细胞。在通过肉眼观察达到近汇合(细胞占据培养容器表面的约70％的状态)或汇合时，利用0.05％胰蛋白酶-0.2mM EDTA在37℃处理5分钟，将细胞从培养容器上剥离，进行回收。将这样得到的细胞再次接种于加有上述培养基的培养皿中，进行数次传代培养，使之增殖到约1×10⁷个/mL。将所得到的细胞保存在液氮中。

之后，使用上述培养基，以约1×10⁴细胞/cm²的浓度对原代培养细胞进行传代培养。将1～3次传代后的细胞用于实验。人BMMSC(骨髓间充质干细胞、Bone MarrowMesenchymal stem cells)购自Lonza公司，按照制造商的操作说明书进行培养。如上得到人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。对于所得到的SHED，使用FACSTARPLUS(Becton-Dickinson公司制造)，如下所述对各试样分选出约1×10⁶个STRO-1阳性细胞。

按照溴脱氧尿苷BrdU染色试剂盒的制造商(Invitrogen公司制造)的操作说明书，进行12小时BrdU的摄入，对SHED的增殖速度进行评价(各组中n＝3)。实验重复5次。单因素方差分析后进行Tukey-Kramer检验，评价统计学显著差异。

为了利用免疫荧光对STRO-1进行检测，将SHED利用3％多聚甲醛进行固定，之后利用PBS漂洗2次，利用100mM的甘氨酸处理20分钟。接着，将这些细胞利用0.2％的Triton-X(Sigma-Aldrich公司制造)进行30分钟透过处理，之后在5％的驴血清和0.5％的牛血清白蛋白的混合物中温育20分钟。

接着，将细胞与作为一次抗体的小鼠抗人STRO-1抗体(1:100、R&D公司制造)一起温育1小时，与作为二次抗体的山羊抗小鼠免疫球蛋白M-FITC抗体(1:500、SouthernBiotech公司制造)一起温育30分钟，使用Vectashield DAPI(Vector Laboratories Inc.)进行封片。之后将添加有15％FBS的α-MEM加入到6孔板中，接种分选出的细胞用于克隆制作。将增殖的细胞中的约300个集落合并用于试验。

(2)基因的导入

(2-1)基于腺病毒载体的基因导入

如上所述将bmi-1、E6、E7和hTERT这4个基因插入到腺病毒载体中，制作表达它们的基因产物的病毒载体。作为对照，制作未插入这些基因的对照载体。

将SHED在直径100mm的胶原包被的培养皿中接种1×10⁶个，加入添加有10％FBS的DMEM，培养至近汇合。抽吸除去该培养基，加入利用上述培养基稀释的病毒溶液500μL(MOI＝10)，在37℃在5％CO₂培养箱中培养1小时，使上述病毒载体感染。感染48小时后，将感染细胞转移至加入有嘌呤霉素(1pg/mL)的上述培养基中，培养10天进行选择，将500～600个抗性克隆合并。每隔3～4天将约0.5×10⁵个SHED接种至直径100mm的培养皿中，进行传代。将导入有基因的SHED作为SHED-T、将未导入基因的SHED作为SHED-C。

(2-2)基于逆转录病毒载体的基因导入

使如上得到的逆转录病毒载体感染人牙髓来源细胞(KA_01_W14_P5D3)或人牙髓来源细胞(KA_02_W4-6_P4D3)，得到试剂抗性池细胞(以下简称为“池细胞”)。将所得到的池细胞供于实时PCR进行分析，确认插入基因的数目。实时PCR中使用下述表10中记载的引物(均由Takara Bio制造)。

[表10]

将上述KA_01_W14_P5103在Corning制造的贴壁性细胞培养用培养皿(直径6cm或10cm的细胞培养用培养皿、表面经TC处理)中在37℃、在5％CO₂培养箱中进行培养。将这些细胞复苏并接种时的传代数表示为[0](下文中表示为“+P0”)，1次传代时表示为“+1”，2次传代时表示为“+2”。

在上述培养皿中的细胞达到约80％汇合的时刻除去培养上清，用PBS清洗2～3次，之后加入作为剥离剂的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(1×)(含有酚红)(Thermo FisherScientific制造、25200-056)，在5％CO₂培养箱中在37℃温育3分钟，使贴壁细胞从培养皿底面剥离。

向其中加入适当量的培养基并进行吹打，制备单细胞的细胞悬浮液。将细胞悬浮液稀释成适当量，传代至新的培养皿中。此后利用相同的方法继续进行培养，确认了细胞的增殖以及细胞的形态无异常。另外，对于传代时采集的培养上清，使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Loza制造、产品编号LT07-318)确认了无支原体污染。

(3)试剂抗性浓度的研究

为了利用试剂来选择基因导入细胞，对靶细胞的G418抗性浓度进行了研究。使用Corning公司的6孔板(6孔的TC处理透明多孔板、产品编号3516)，在每1孔中接种2.0×10⁴个处于对数生长期的细胞。在5％CO₂培养箱中在37℃培养约24小时，之后确认到细胞附着于孔的底面。将各孔的培养基更换成添加有不同浓度的G418的培养基。拍摄从试剂选择开始起的4天后、8天后以及10天后的细胞状态，对试剂抗性浓度进行研究。

确认到从试剂选择开始起的4天后在试剂浓度为250μL/mL以上的孔中细胞失去增殖活性，在11天后在试剂浓度为500μL/mL以上的孔中大部分细胞死亡。根据以上，将靶细胞的G418选择试剂浓度确定为显示出充分选择效果的500μL/mL。

使逆转录病毒载体溶液通过聚凝胺法感染靶细胞，利用培养基B进行永生化基因稳定表达株的选择。在上述6孔板中在每1孔中接种1.40×10⁵个处于对数生长期的细胞，在5％CO₂培养箱中在37℃培养约24小时。之后在利用培养基A稀释至4倍或10倍的重组逆转录病毒载体溶液中按照最终浓度为8μg/mL的方式添加聚凝胺(溴化己二甲铵、Sigma-Aldrich制造、产品编号H9268)，在各孔中等量地加入，使病毒感染细胞。病毒感染约4小时后，在各孔中各添加1.0mL培养基A。将该培养板在5％CO₂培养箱中在37℃温育，24小时后更换成培养基B，开始进行试剂选择。

在试剂选择开始第10天以后，收集成为试剂抗性且增殖的细胞，加入1mL的CELLBANKER 1Plus(日本全药工业制造、产品编号CB021)，制成包含1×10⁶个/mL的悬浮液，作为经受该处理的细胞原液保存在-80℃。同时制备5×10⁵个/小瓶的细胞团块用于实时PCR分析，保存在-80℃。

(实施例3)培养上清中所包含的因子的分析

(1)永生化干细胞的培养上清的制备

将上述实施例1和2中制作的永生化干细胞(下文中有时称为“hSHED”)2×10⁵个/mL加入到装有10mL的添加了10％胎牛血清(下文中有时简称为“FBS”)的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium、以下有时简称为“DMEM”)的培养皿(55cm²)中，在37℃在5％CO₂培养箱中培养至达到70％汇合为止(4天～6天)。

利用显微镜确认达到70％汇合，之后使用抽吸器除去培养烧瓶中的培养上清，使用未添加血清的DMDM清洗2次。接着，在该培养烧瓶中加入10mL未添加血清的DMEM(下文中有时称为“普通DMEM”)。将添加后立即回收的培养上清作为对照。添加后，在37℃在5％CO₂培养箱中培养72小时。将培养上清收集到15mL的灭菌离心管中，以1,500rpm(约440×g)离心3分钟，使离心上清通过0.22mm PVDF过滤器(Millipore公司制造)，得到永生化hSHED的培养上清(下文中有时称为“hSHED-CM”)。

(2)定量表达分析

对于在如上得到的hSHED-CM中表达了何种细胞因子，使用Quantibody(注册商标)人细胞因子抗体阵列1000(RayBiotech Inc.、产品编号QAH-CAA-1000)按照所附的说明书通过下述过程进行定量表达分析(图3)。

首先，使上述SHED-CM支持体与固定成阵列状的抗体接触1～2小时，之后在各孔中加入生物素化抗体的混合液，温育1～2小时。接着加入标记的链霉亲和素，温育2小时，对标记的信号进行检测，使用GenePix(注册商标)4400A(Molecular Dveices、LLC)进行数据分析。将结果示于图1。对80种细胞因子进行测定，将与对照之差为1pg/mL以上的36种按浓度从高到低的顺序示出。下述表11中示出所测定的80种细胞因子的名称。

[表11]

Eotaxin：一种嗜酸性粒细胞趋化蛋白

如图1所示，显示出作为胰岛素样生长因子结合蛋白的IGFBP-4、IGFBP-6和IGFBP-2、作为金属蛋白酶组织抑制剂的TIMP-1和TIMP-2的含量比较多。胰岛素由于本次未正确测定因而将其除外。

(3)定性表达分析

对于在如上得到的hSHED-CM中表达了何种细胞因子，使用RayBio(注册商标)人细胞因子抗体阵列G系列4000(RayBiotech Inc.、产品编号AAH-CYT-G4000-4)，按照所附的说明书通过下述过程进行定性表达分析(图4)。

首先，使上述SHED-CM或标准蛋白混合液与固定于载玻片上的抗体阵列接触1～2小时，之后与生物素化抗体的混合液一起温育1～2小时。接着与Cy3等量的标记链霉亲和素温育1小时，使用GenePix(注册商标)4400A(Molecular Dveices、LLC)进行扫描、数据提取和数据分析。

通过该定性分析对264种细胞因子(下述表12～16)进行测定，结果相对于对照的相对表达强度为1.5以上的细胞因子有77种。图7和8中示出了上述77种细胞因子中的相对表达强度为3以上的细胞因子。

[表12]

Eotaxin：一种嗜酸性粒细胞趋化蛋白

[表13]

[表14]

[表15]

[表16]

根据上述结果，NGF、IL家族(IL-6、IL-8、IL6R、IL-17C、IL-17R等)等的相对表达强度小于10。

(实施例4)外泌体中的微RNA表达分析

按照以下过程进行作为来源于胞内体的膜囊泡的外泌体中的MicroRNA的表达分析。

首先，将上述实施例2中建立的永生化干细胞按照上述实施例3中的记载利在无血清培养基中进行培养，取培养上清约10mL。使用ExoQuicl-TC(System Biosciences公司制造)，按照该试剂盒中所附的操作手册从该培养上清中提纯外泌体。

使用miRNeasy微量试剂盒(Quiagen公司制造)，从提纯的外泌体中提取miRNA和总RNA，如下进行标记，使用GeneChip(注册商标)miRNA阵列(Affimetrix公司)对细胞因子的表达进行分析(图5)。

使从上述提纯外泌体中提取的miRNA和总RNA的RNA分子在ATP的存在下与多聚A聚合酶反应15分钟，使其结合多聚A尾，制成带有多聚A尾的mRNA。接着，通过注入Flash标签连接混合物与连接酶反应30分钟，将生物素标记的RNA与上述带有多聚A尾的mRNA如图6所示进行连接，得到标记分子。此处，作为试样，使用对上述永生化干细胞进行72小时培养而得到的hSHED-CM。

将上述标记分子供于使用GeneChip的检测，利用荧光标记链霉亲和素进行检测。将检测的结果按照表达从高到低的顺序以1～100示于表17中。在利用上述GeneChip miRNA阵列进行了分析的全部6,599种微RNA中，845个为阳性。

[表17]

(实施例5)褥疮治愈效果的验证

(1)模型动物的制作

利用缺血再灌注(ischemia/reperfusion、I/R)法使小鼠产生作为缺血再灌注损伤之一的褥疮，给予hSHED-CM，观察直至褥疮治愈为止的经过。此处，缺血再灌注损伤是指对血流(氧)供给被阻断而导致缺血(缺氧)的组织再次进行血流灌注时所引起的各种损伤。

将8周龄的C57/BL6(雌性)的背部皮肤用1180高斯的磁铁夹持12小时，形成缺血状态的部位(缺血部位)，制作褥疮模型小鼠(参照图9)。此处，由图9可知，被磁铁夹持的部位成为强缺血状态，若该部位中产生损伤则会形成褥疮等；并且在强缺血部位的周围血流也减少，因此形成弱缺血状态，产生脱毛。对该模型小鼠的给药方案以及取下磁铁后的褥疮部位随时间经过的变化如下所示。

(2)给药方案和经过

(2-1)给药方案1(从I/R处置的次日起连续给药4天后，空出1天，再连续给药2天)

使用上述(1)中制作的褥疮模型小鼠(阴性对象组：5只、阳性对象组：5只、试验组5只)。对于任一组，均将缺血开始时作为第0天，在第1天～第4天，对于阴性对象组向背部皮下给予DMEM，对于阳性对象组向背部皮下给予1μg/100μL的bFGF。对于试验组，每天向背部皮下给予100μL(以HGF量计相当于250pg)的hSHED-CM。之后，在第5天对所有组均不进行给药，在第6天和第7天利用与上述同样的量向上述模型小鼠的背部皮下进行给药(参照图10(A)和图10(B))。

将再灌注后的天数和创伤区域(褥疮形成区域)的比例示于图10(C)。与对照相比，给予了hSHED-CM或bFGF的组均显示出创伤区域的比例迅速缩小。

(2-2)给药方案2(从I/R处置的次日起连续给药7天-1)

使用上述(1)中制作的褥疮模型小鼠(阴性对象组：5只、试验组5只)。对于这些模型小鼠的褥疮形成部位(2处)，与上述(2-1)同样地将各100μL的DMEM或hSHED-CM分别给予对象组或试验组(参照图11(A)和图11(B))。将结果示于图11(C)。显示出，与对照组相比，hSHED-CM给药组从刚进行再灌注后起创伤区域的比例的扩大倾向显著减小，缩小也很迅速，显著缩小直到第10天为止(参照图11(C))。另外，将形成了褥疮的皮肤状态进行对比时，显示出比对照组更快地恢复，并且在第12天褥疮大部分消失(参照图12)。

(2-3)给药方案3(从I/R处置的次日起连续给药7天-2)

使用上述(1)中制作的褥疮模型小鼠(阴性对象组：5只、试验组5只)。对于这些模型小鼠的褥疮形成部位(2处)，与上述(2-2)同样地将各100μL的DMEM或hSHED-CM分别给予对象组或试验组(图13(A)～(C))。并且，在第4天采集创伤区域的皮肤，用福尔马林固定，进行8-OHdG、CD31和NG2的免疫染色(图14(A)～(C))。各染色结果如图15(A)～(B)、图16(A)～(B)和图17(A)～(B)所示。

(2-4)给药方案4(自褥疮发病后起连续给药7天)

为了确认褥疮发病后的治愈，在I/R处置后的5天不进行治疗，从形成了褥疮后的I/R处置6天后起进行7天的连续给药。

使用上述(1)中制作的褥疮模型小鼠(阴性对象组：5只、试验组5只)。对于这些模型小鼠的褥疮形成部位(2处)，与上述(2-1)同样地将各50μL的DMEM或hSHED-CM分别给予对象组或试验组(参照图18(A)和(B))。将结果示于图18(C)。

与对照组相比，hSHED-CM给药组在hSHED-CM给药后创伤形成区域显著缩小。另外，将形成了褥疮的皮肤状态进行对比时，显示出比对照组更快地恢复，并且在第10天褥疮大部分消失(参照图19)。

(2-5)给药方案5(从刚进行I/R处置后起连续给药7天除去了靶因子的培养上清)

为了研究从培养上清中除去细胞因子后的治愈效果，如实施例3那样对hSHED-CM中所包含的细胞因子和原代细胞的培养上清中所包含的细胞因子进行了成分分析。作为原代细胞，使用购自株式会社Cell Technologies的人来源原代牙髓干细胞培养上清液。将其结果示于表13。其中，IGFBP-4、VEGF和HGF的含量以及组织修复/再生能力高，因此作为后述的免疫沉淀中的靶因子。

(2-6)给药方案6(从I/R处置7天前起连续给药7天)

为了研究通过事先给予培养上清是否具有抑制褥疮发病的效果，在I/R处置前将hSHED-CM连续给药7天。使用上述(1)中制作的褥疮模型小鼠(阴性对象组：4只、试验组4只)。对于这些模型小鼠的褥疮形成部位(2处)，与上述(2-1)同样地将各100μL的DMEM或hSHED-CM分别给予对象组或试验组(参照图26(A)和(B))。将结果示于图27和图28。

另外，将对本发明的永生化干细胞进行培养时的培养上清中所包含的各种因子(细胞因子等)的量和对原代培养细胞进行培养时这些因子的量汇总于下述表18中。下述表18中，将原代培养细胞表示为“原代(primary)”。

[表18]

将在上述实施例3中记载的条件下培养的永生化干细胞的上清收集在灭菌管中，使用蛋白G琼脂糖凝胶(Cytiva公司制造)和抗体(α-IGFBP-4、α-VEGF和α-HGF、R&D公司制造)进行免疫沉淀，制备除去了上述靶因子的上清。

将如上得到的上清各100μL以各组2只对上述(1)中制作的模型小鼠的褥疮形成部位(2处)进行给药。对于阴性对照组给予DMEM，对于阳性对照组给予hSHED-CM。此处，对于本发明的hSHED-CM，通过基于培养上清的成分分析结果，将IGFBP-4、VFGF(血管内皮细胞生长因子)和HGF(肝细胞生长因子)使用针对各分子的特异性抗体进行免疫沉淀将它们除去后来使用。图20(A)中，“免沉”是“免疫沉淀”的简称。给药方案是将对小鼠进行I/R处置的当天作为第0天，第1天～Day 7连续给药(参照图20(A))。另外，如图20(B)所示，给药时在进行了I/R处置的小鼠背部的2处各给予100μL。给予的因子以及所使用的动物数(N)如图20(B)所示。

将上述给药结果示于图21(A)～(D)。图21(A)示出了使用利用作为阴性对照的对照抗体(图20(B)和图21(A)中记为“对照Ab”)进行了处理的本发明的培养上清的情况，图21(B)示出了使用抗IGFBP-4抗体(图20(B)和图21(B)中记为“α-IGFBP-4”)除去了IGFBP-4的情况，图21(C)示出了使用抗VFGF抗体(图20(B)和图21(C)中记为“α-VEGF”)除去了VEGF的情况，并且图21(D)示出了使用抗HGF抗体(图20(B)和图21(D)中记为“α-HGF”)除去了HGF的情况。图中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

在给予利用α-IGFBP-4进行了处理的hSHED-CM(除去了IGFBP-4的hSHED-CM)的情况下，与给予未处理的hSHED-CM的情况相比，未观察到显著差异。与之相对，在给予利用α-HGF进行了处理的hSHED-CM(除去了HGF的hSHED-CM)的情况下，与给予未处理的hSHED-CM的情况相比，观察到创伤区域缓慢扩大、治愈也变慢的倾向。在给予利用α-VEGF进行了处理的hSHED-CM(除去了VEGF的hSHED-CM)的情况下，与给予未处理的hSHED-CM的情况相比，显著地观察到创伤区域大幅扩大、治愈也变慢的差异。根据以上，得出了在褥疮的治愈中HGF和VEGF作出了贡献的结论。

(2)使用上述细胞的培养上清的活性氧抑制效果的研究

下述文献中报道了间充质干细胞(下文中有时简称为“MSC”)本身通过活性氧种(下文中有时简称为“ROS”)的抑制效果参与了褥疮的治愈(Protective effect ofmesenchymal stem cells on the pressure ulcer formation by the regulation ofoxidative and endoplasmic reticulum stress)。因此，为了验证是否是MSC的培养上清而不是MSC本身具有这样的效果，实施了体外(in vitro)试验(参照图22)。

图22中示出了在体外系统中重现褥疮模型的发病机理的实验步骤。另外，如图23所示，添加利用特异性抗体通过免疫沉淀除去了HGF或VEGF的本发明的上清来对NIH3T3进行培养，确认有无由各细胞因子引起的ROS抑制。作为阳性对照，使用叔丁基羟基过氧化酶(下文中有时简称为“TBHP”)。

使用NIH3T3细胞，按以下过程进行该实验(参照图22)。将NIH3T3细胞以3.0×10⁴个/孔接种至底面透明的8孔腔室载玻片中，在DMEM培养基中在37℃在5％CO₂培养箱中培养过夜，利用显微镜确认各孔的细胞贴壁，用1×PBS冲洗。将事先在1.0％氧下暴露了72小时的加入有1.0％FBS的DMEM培养基添加至腔室载玻片中，在1.0％氧下在37℃在5％CO₂培养箱中培养36～48小时。之后在常规的20.0％氧下的培养槽中在37℃在5％CO₂培养箱中培养5～6小时。

接着，利用2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(下文中有时简称为“DCFDA”)细胞ROS检测分析试剂盒(abcam公司制造)附带的1×缓冲液再次进行清洗，之后在各孔中加入200μL溶解于1×缓冲液中的10～20μM DCFDA，在37℃培养45分钟，使DCFDA被细胞摄入。将细胞内产生的ROS以DCF(二氯荧光素)的荧光的形式使用荧光显微镜在Ex/Em(激发波长/荧光波长)＝480/527nm的条件下进行检测。

摄入到细胞中的DCFDA被ROS氧化，形成发出强荧光的DCF，其强度与细胞内的ROS水平成比例，利用该性质，对ROS的产生量进行测定。具体地说，对于与ROS的产生量成比例地增加的DCF照射480nm的激发光，根据所产生的荧光的强度进行定量。对照使用155nM的TBHP，根据观察结果的暗部与明部的对比度对ROS进行定量。将结果示于图23和图24。将根据图23(A)的图像的最大亮度和最小亮度计算出的对比度作为ROS的相对值进行定量比较，以图24示出。

作为阴性对照组使用常规培养的NIH3T3，作为阳性对照组使用利用TBHP添加培养基进行培养的NIH3T3。在任一对照中，培养时的氧浓度均与常规相同、设为20.0％。在阴性对照组中，表示ROS产生的信号的对比值为约50。与之相对，在阳性对照组中，显示出约3倍的强数值。另外，与上述阴性对照组相比，从在1.0％氧下培养36～48小时后在20.0％氧下培养的细胞(以下有时将这样的培养称为“再氧化”)中检测到约2倍的强ROS信号。与之相对，添加本发明的培养上清并与上述同样地进行了培养的细胞的ROS信号与阴性对照组为同等水平。但是，若从上述培养上清中除去HGF和VEGF，则ROS信号增加。以上显示出，hSHED-CM具有ROS产生抑制活性，特别是HGF和VEGF对ROS产生的抑制很重要。

(3)使用上述细胞的培养上清的内质网应激抑制效果的研究

对于使用小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞时的上述培养上清对内质网应激的抑制效果，为了验证是否是MSC的培养上清而不是MSC本身具有这样的效果，实施了体外试验。图25(A)中示意性示出了添加1.5μg/mL衣霉素(TM)直至实施实时PCR为止的实验概要。

使用小鼠NIH3T3细胞，作为培养基使用DMEM，按下述过程进行该实验。在12孔板中接种1×10⁵个细胞，培养过夜，在各孔中加入500μL的混悬有1.5μg/ml衣霉素的对照培养基或50％hSHED-CM/DMEM(v/v)。在37℃培养过夜，将上述细胞进行胰蛋白酶处理后进行回收，按照常规方法提取RNA。之后使用逆转录酶进行实时PCR(下文中有时称为“q-PCR”)，对于内质网应激标志物(评价的指标基因)的表达量以它们的mRNA量进行定量。评价的指标为内质网应激标志物XBP-1、GRP78和CHOP，内源性对照为HPRT。将结果示于图25(B)。图25(B)中，纵轴表示将对照作为1时的表达量的相对比。

此处，XBP-1已知为在内质网应激时阻断靶基因的转录的负反馈调节因子，已报道其在内质网应激时发生核转运而与GRP78等分子伴侣的UPR结合，参与伴侣诱导。GRP78(HSPA5)是也被称为“免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain-bindingprotein：BiP)”的HSP70(热休克蛋白70)家族的成员，参与内质网中的蛋白质装配和折叠。GRP78是在所有真核生物细胞的内质网中恒定表达的内质网蛋白，已报道其与癌细胞增殖的抑制和凋亡相关。CHOP是在内质网应激下诱导出的转录因子，已报道其诱导DR5(死亡受体5)等，活化caspase级联并引起凋亡。

将在无添加物的DMEM中进行培养的NIH3T3细胞的各内质网应激标志物的表达作为1.0。在DMEM中加入1.5μg/mL的衣霉素进行了培养的细胞中，各标志物的表达量显著升高，XBP-1为约7倍、GRP78为约18倍、CHOP为4倍。与之相对，在添加了hSHED-CM的细胞中，XBP-1为约4倍、GRP78为约14倍、CHOP为约3倍，与未加入hSHED-CM的细胞相比，显著抑制了内质网应激标志物的表达。将结果示于下述表19和图25(B)。

[表19]

/>

*：具有显著差异

(4)使用上述细胞的培养上清的褥疮的抑制效果的研究

如图1所示，hSHED-CM含有大量的具有抑制胶原蛋白和弹性蛋白的分解酶的作用的金属蛋白酶组织抑制剂TIMP。迄今已经报道了软组织对褥疮具有作为缓冲、分散压力的缓冲层的作用(参见非专利文献3)，因此为了验证通过给予hSHED-CM是否提高了皮肤组织对褥疮的抵抗性，实施了体外试验。

与上述实施例5的(2-6)给药方案6同样地，从I/R实施7天前起将各100μL的DMEM或hSHED-CM给药于对照组或试验组的患部形成预定部位(图26(A)和(B))。在I/R处置前回收背部皮肤组织，观察该部位的皮肤组织发生了何种变化(图27(A)和(B))。其结果，在给予了hSHED-CM的试验组的小鼠中，观察到给药部位的皮肤组织增厚的倾向。

图28(A)中示出了以上述给药方案给药时的损伤面积的经时变化。图中，*表示p<0.05，并且**表示p<0.01。另外，图28(B)中示出了以给药方案6进行了事先处置的小鼠的褥疮形成部位的治愈状况。上段表示第2天～第16天期间的对象组、下段表示相同期间内的hSHED-CM给药组的该部位的变化。将I/R处置后的褥疮形成部位(患部)的损伤面积进行比较时，在事先给药了hSHED-CM的组中，与DMEM给药组相比，损伤面积的扩大显著受到抑制(图28(A)和(B))。

(5)总结

根据以上可认为，上述hSHED-CM具有防止褥疮恶化的效果。另外确认到，在褥疮形成前后的任一时期进行给药时均发挥出一定的效果。此外可认为，上述hSHED-CM中所包含的各种细胞因子中，HGF和VEGF参与褥疮的预防和治愈。另外，与之相伴地进行了褥疮的治愈机理的研究，结果可认为，hSHED-CM通过ROS的抑制和内质网应激的缓和而促进了组织的再生。

工业实用性

本发明在医药技术领域中非常有用。

序列编号1：包含导入至细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(1)

序列编号2：包含导入至细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(2)

序列编号3：包含导入至细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(3)

序列编号4：包含导入至细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(4)

序列编号5：包含导入至细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(5)

序列编号6：包含导入至细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(6)

序列编号7：包含导入至细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(7)

序列编号8：包含导入至细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(8)

序列编号9：包含导入至细胞中的基因的DNA片段的碱基序列(9)

序列编号10：PCR用引物(1)的碱基序列

序列编号11：PCR用引物(2)的碱基序列序列编号12：PCR用引物(3)的碱基序列序列编号13：PCR用引物(4)的碱基序列序列编号14：PCR用引物(5)的碱基序列序列编号15：PCR用引物(6)的碱基序列序列编号16：PCR用引物(7)的碱基序列序列编号17：PCR用引物(8)的碱基序列序列编号18：PCR用引物(9)的碱基序列序列编号19：PCR用引物(10)的碱基序列。

序列表

<110> 株式会社Cysay(Cysay Inc.)

学校法人东京医科大学(Tokyo Medical University)

<120> 褥疮的预防剂和/或治疗剂(Prophylaxis and/or treatment agent forpressure ulcer)

<130> F22CY02WO

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1978

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于基因转导的DNA 片段(DNA fragment for gene transduction)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1978)

<223> SYN122-1-7

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1978)

<223> SYN4122-1-7

<400> 1

agctgacgtg gaagatgagc gtgcgggact gcgcttggct gcgcaggagc ccaggggttg 60

gctgtgttcc ggccgcagag caccgtctgc gtgaggagat cctggccaag ttcctgcact 120

ggctgatgag tgtgtacgtc gtcgagctgc tcaggtcttt cttttatgtc acggagacca 180

cgtttcaaaa gaacaggctc tttttctacc ggaagagtgt ctggagcaag ttgcaaagca 240

ttggaatcag acagcacttg aagagggtgc agctgcggga gctgtcggaa gcagaggtca 300

ggcagcatcg ggaagccagg cccgccctgc tgacgtccag actccgcttc atccccaagc 360

ctgacgggct gcggccgatt gtgaacatgg actacgtcgt gggagccaga acgttccgca 420

gagaaaagag ggccgagcgt ctcacctcga gggtgaaggc actgttcagc gtgctcaact 480

acgagcgggc gcggcgcccc ggcctcctgg gcgcctctgt gctgggcctg gacgatatcc 540

acagggcctg gcgcaccttc gtgctgcgtg tgcgggccca ggacccgccg cctgagctgt 600

actttgtcaa ggtggatgtg acgggcgcgt acgacaccat cccccaggac aggctcacgg 660

aggtcatcgc cagcatcatc aaaccccaga acacgtactg cgtgcgtcgg tatgccgtgg 720

tccagaaggc cgcccatggg cacgtccgca aggccttcaa gagccacgtc tctaccttga 780

cagacctcca gccgtacatg cgacagttcg tggctcacct gcaggagacc agcccgctga 840

gggatgccgt cgtcatcgag cagagctcct ccctgaatga ggccagcagt ggcctcttcg 900

acgtcttcct acgcttcatg tgccaccacg ccgtgcgcat caggggcaag tcctacgtcc 960

agtgccaggg gatcccgcag ggctccatcc tctccacgct gctctgcagc ctgtgctacg 1020

gcgacatgga gaacaagctg tttgcgggga ttcggcggga cgggctgctc ctgcgtttgg 1080

tggatgattt cttgttggtg acacctcacc tcacccacgc gaaaaccttc ctcaggaccc 1140

tggtccgagg tgtccctgag tatggctgcg tggtgaactt gcggaagaca gtggtgaact 1200

tccctgtaga agacgaggcc ctgggtggca cggcttttgt tcagatgccg gcccacggcc 1260

tattcccctg gtgcggcctg ctgctggata cccggaccct ggaggtgcag agcgactact 1320

ccagctatgc ccggacctcc atcagagcca gtctcacctt caaccgcggc ttcaaggctg 1380

ggaggaacat gcgtcgcaaa ctctttgggg tcttgcggct gaagtgtcac agcctgtttc 1440

tggatttgca ggtgaacagc ctccagacgg tgtgcaccaa catctacaag atcctcctgc 1500

tgcaggcgta caggtttcac gcatgtgtgc tgcagctccc atttcatcag caagtttgga 1560

agaaccccac atttttcctg cgcgtcatct ctgacacggc ctccctctgc tactccatcc 1620

tgaaagccaa gaacgcaggg atgtcgctgg gggccaaggg cgccgccggc cctctgccct 1680

ccgaggccgt gcagtggctg tgccaccaag cattcctgct caagctgact cgacaccgtg 1740

tcacctacgt gccactcctg gggtcactca ggacagccca gacgcagctg agtcggaagc 1800

tcccggggac gacgctgact gccctggagg ccgcagccaa cccggcactg ccctcagact 1860

tcaagaccat cctggactga ggatccaatt ctaccgggta ggggaggcgc ttttcccaag 1920

gcagtctgga gcatgcgctt tagcagcccc gctgggcact tggcgctaca caagtggc 1978

<210> 2

<211> 2556

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于基因转导的DNA 片段(DNA fragment for gene transduction)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2556)

<223> SYN4122-2-2

<400> 2

ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgactc tactagagga tctatttccg 60

gtgaattcgc cacccatcga acaacgagaa tcaagatcac tgagctaaat ccccacctga 120

tgtgtgtgct ttgtggaggg tacttcattg atgccacaac cataatagaa tgtctacatt 180

ccttctgtaa aacgtgtatt gttcgttacc tggagaccag caagtattgt cctatttgtg 240

atgtccaagt tcacaagacc agaccactac tgaatataag gtcagataaa actctccaag 300

atattgtata caaattagtt ccagggcttt tcaaaaatga aatgaagaga agaagggatt 360

tttatgcagc tcatccttct gctgatgctg ccaatggctc taatgaagat agaggagagg 420

ttgcagatga agataagaga attataactg atgatgagat aataagctta tccattgaat 480

tctttgacca gaacagattg gatcggaaag taaacaaaga caaagagaaa tctaaggagg 540

aggtgaatga taaaagatac ttacgatgcc cagcagcaat gactgtgatg cacttaagaa 600

agtttctcag aagtaaaatg gacataccta atactttcca gattgatgtc atgtatgagg 660

aggaaccttt aaaggattat tatacactaa tggatattgc ctacatttat acctggagaa 720

ggaatggtcc acttccattg aaatacagag ttcgacctac ttgtaaaaga atgaagatca 780

gtcaccagag agatggactg acaaatgctg gagaactgga aagtgactct gggagtgaca 840

aggccaacag cccagcagga ggtattccct ccacctcttc ttgtttgcct agccccagta 900

ctccagtgca gtctcctcat ccacagtttc ctcacatttc cagtactatg aatggaacca 960

gcaacagccc cagcggtaac caccaatctt cttttgccaa tagacctcga aaatcatcag 1020

taaatgggtc atcagcaact tcttctggtg gatctgaagg taggggaagt ttgcttactt 1080

gcggtgacgt cgaagagaat ccaggaccag atggccgcaa catgccgcgc gctccccgct 1140

gccgagccgt gcgctccctg ctgcgcagcc actaccgcga ggtgctgccg ctggccacgt 1200

tcgtgcggcg cctggggccc cagggctggc ggctggtgca gcgcggggac ccggcggctt 1260

tccgcgcgct ggtggcccag tgcctggtgt gcgtgccctg ggacgcacgg ccgccccccg 1320

ccgccccctc cttccgccag gtgtcctgcc tgaaggagct ggtggcccga gtgctgcaga 1380

ggctgtgcga gcgcggcgcg aagaacgtgc tggccttcgg cttcgcgctg ctggacgggg 1440

cccgcggggg cccccccgag gccttcacca ccagcgtgcg cagctacctg cccaacacgg 1500

tgaccgacgc actgcggggg agcggggcgt gggggctgct gctgcgccgc gtgggcgacg 1560

acgtgctggt tcacctgctg gcacgctgcg cgctctttgt gctggtggct cccagctgcg 1620

cctaccaggt gtgcgggccg ccgctgtacc agctcggcgc tgccactcag gcccggcccc 1680

cgccacacgc tagtggaccc cgaaggcgtc tgggatgcga acgggcctgg aaccatagcg 1740

tcagggaggc cggggtcccc ctgggcctgc cagccccggg tgcgaggagg cgcgggggca 1800

gtgccagccg aagtctgccg ttgcccaaga ggcccaggcg tggcgctgcc cctgagccgg 1860

agcggacgcc cgttgggcag gggtcctggg cccacccggg caggacgcgt ggaccgagtg 1920

accgtggttt ctgtgtggtg tcacctgcca gacccgccga agaagccacc tctttggagg 1980

gtgcgctctc tggcacgcgc cactcccacc catccgtggg ccgccagcac cacgcgggcc 2040

ccccatccac atcgcggcca ccacgtccct gggacacgcc ttgtcccccg gtgtacgccg 2100

agaccaagca cttcctctac tcctcaggcg acaaggagca gctgcggccc tccttcctac 2160

tcagctctct gaggcccagc ctgactggcg ctcggaggct cgtggagacc atctttctgg 2220

gttccaggcc ctggatgcca gggactcccc gcaggttgcc ccgcctgccc cagcgctact 2280

ggcaaatgcg gcccctgttt ctggagctgc ttgggaacca cgcgcagtgc ccctacgggg 2340

tgctcctcaa gacgcactgc ccgctgcgag ctgcggtcac cccagcagcc ggtgtctgtg 2400

cccgggagaa gccccagggc tctgtggcgg cccccgagga ggaggacaca gacccccgtc 2460

gcctggtgca gctgctccgc cagcacagca gcccctggca ggtgtacggc ttcgtgcggg 2520

cctgcctgcg ccggctggtg cccccaggcc tctggg 2556

<210> 3

<211> 2983

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于基因转导的DNA 片段(DNA fragment for gene transduction)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2983)

<223> SYN4122-3-3

<400> 3

ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgactctact agaggatcta tttccggtga 60

attcgccacc catcgaacaa cgagaatcaa gatcactgag ctaaatcccc acctgatgtg 120

tgtgctttgt ggagggtact tcattgatgc cacaaccata atagaatgtc tacattcctt 180

ctgtaaaacg tgtattgttc gttacctgga gaccagcaag tattgtccta tttgtgatgt 240

ccaagttcac aagaccagac cactactgaa tataaggtca gataaaactc tccaagatat 300

tgtatacaaa ttagttccag ggcttttcaa aaatgaaatg aagagaagaa gggattttta 360

tgcagctcat ccttctgctg atgctgccaa tggctctaat gaagatagag gagaggttgc 420

agatgaagat aagagaatta taactgatga tgagataata agcttatcca ttgaattctt 480

tgaccagaac agattggatc ggaaagtaaa caaagacaaa gagaaatcta aggaggaggt 540

gaatgataaa agatacttac gatgcccagc agcaatgact gtgatgcact taagaaagtt 600

tctcagaagt aaaatggaca tacctaatac tttccagatt gatgtcatgt atgaggagga 660

acctttaaag gattattata cactaatgga tattgcctac atttatacct ggagaaggaa 720

tggtccactt ccattgaaat acagagttcg acctacttgt aaaagaatga agatcagtca 780

ccagagagat ggactgacaa atgctggaga actggaaagt gactctggga gtgacaaggc 840

caacagccca gcaggaggta ttccctccac ctcttcttgt ttgcctagcc ccagtactcc 900

agtgcagtct cctcatccac agtttcctca catttccagt actatgaatg gaaccagcaa 960

cagccccagc ggtaaccacc aatcttcttt tgccaataga cctcgaaaat catcagtaaa 1020

tgggtcatca gcaacttctt ctggtggatc tgaaggcaga ggctctctgc tgacatgtgg 1080

ggatgtggag gaaaatcctg gccctacgcg tcaccaaaag agaactgcaa tgtttcagga 1140

cccacaggag cgacccagaa agttaccaca gttatgcaca gagctgcaaa caactataca 1200

tgatataata ttagaatgtg tgtactgcaa gcaacagtta ctgcgacgtg aggtatatga 1260

ctttgctttt cgggatttat gcatagtata tagagatggg aatccatatg ctgtatgtga 1320

taaatgttta aagttttatt ctaaaattag tgagtataga cattattgtt atagtttgta 1380

tggaacaaca ttagaacagc aatacaacaa accgttgtgt gatttgttaa ttaggtgtat 1440

taactgtcaa aagccactgt gtcctgaaga aaagcaaaga catctggaca aaaagcaaag 1500

attccataat ataaggggtc ggtggaccgg tcgatgtatg tcttgttgca gatcatcaag 1560

aacacgtaga gaaacccagc tgggatctga aggtagggga agtttgctta cttgcggtga 1620

cgtcgaagag aatccaggac cagatggccg caacatgccg cgcgctcccc gctgccgagc 1680

cgtgcgctcc ctgctgcgca gccactaccg cgaggtgctg ccgctggcca cgttcgtgcg 1740

gcgcctgggg ccccagggct ggcggctggt gcagcgcggg gacccggcgg ctttccgcgc 1800

gctggtggcc cagtgcctgg tgtgcgtgcc ctgggacgca cggccgcccc ccgccgcccc 1860

ctccttccgc caggtgtcct gcctgaagga gctggtggcc cgagtgctgc agaggctgtg 1920

cgagcgcggc gcgaagaacg tgctggcctt cggcttcgcg ctgctggacg gggcccgcgg 1980

gggccccccc gaggccttca ccaccagcgt gcgcagctac ctgcccaaca cggtgaccga 2040

cgcactgcgg gggagcgggg cgtgggggct gctgctgcgc cgcgtgggcg acgacgtgct 2100

ggttcacctg ctggcacgct gcgcgctctt tgtgctggtg gctcccagct gcgcctacca 2160

ggtgtgcggg ccgccgctgt accagctcgg cgctgccact caggcccggc ccccgccaca 2220

cgctagtgga ccccgaaggc gtctgggatg cgaacgggcc tggaaccata gcgtcaggga 2280

ggccggggtc cccctgggcc tgccagcccc gggtgcgagg aggcgcgggg gcagtgccag 2340

ccgaagtctg ccgttgccca agaggcccag gcgtggcgct gcccctgagc cggagcggac 2400

gcccgttggg caggggtcct gggcccaccc gggcaggacg cgtggaccga gtgaccgtgg 2460

tttctgtgtg gtgtcacctg ccagacccgc cgaagaagcc acctctttgg agggtgcgct 2520

ctctggcacg cgccactccc acccatccgt gggccgccag caccacgcgg gccccccatc 2580

cacatcgcgg ccaccacgtc cctgggacac gccttgtccc ccggtgtacg ccgagaccaa 2640

gcacttcctc tactcctcag gcgacaagga gcagctgcgg ccctccttcc tactcagctc 2700

tctgaggccc agcctgactg gcgctcggag gctcgtggag accatctttc tgggttccag 2760

gccctggatg ccagggactc cccgcaggtt gccccgcctg ccccagcgct actggcaaat 2820

gcggcccctg tttctggagc tgcttgggaa ccacgcgcag tgcccctacg gggtgctcct 2880

caagacgcac tgcccgctgc gagctgcggt caccccagca gccggtgtct gtgcccggga 2940

gaagccccag ggctctgtgg cggcccccga ggaggaggac aca 2983

<210> 4

<211> 2223

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于基因转导的DNA 片段(DNA fragment for gene transduction)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2223)

<223> SYN4122-4-4

<400> 4

acgctgtttt gacctccata gaagacaccg actctactag aggatctatt tccggtgaat 60

tcgccaccca ccaaaagaga actgcaatgt ttcaggaccc acaggagcga cccagaaagt 120

taccacagtt atgcacagag ctgcaaacaa ctatacatga tataatatta gaatgtgtgt 180

actgcaagca acagttactg cgacgtgagg tatatgactt tgcttttcgg gatttatgca 240

tagtatatag agatgggaat ccatatgctg tatgtgataa atgtttaaag ttttattcta 300

aaattagtga gtatagacat tattgttata gtttgtatgg aacaacatta gaacagcaat 360

acaacaaacc gttgtgtgat ttgttaatta ggtgtattaa ctgtcaaaag ccactgtgtc 420

ctgaagaaaa gcaaagacat ctggacaaaa agcaaagatt ccataatata aggggtcggt 480

ggaccggtcg atgtatgtct tgttgcagat catcaagaac acgtagagaa acccagctgg 540

gatctgaagg cagaggctct ctgctgacat gtggggatgt ggaggaaaat cctggcccta 600

cgcgtcatgg agatacacct acattgcatg aatatatgtt agatttgcaa ccagagacaa 660

ctgatctcta ctgttatgag caattaaatg acagctcaga ggaggaggat gaaatagatg 720

gtccagctgg acaagcagaa ccggacagag cccattacaa tattgtaacc ttttgttgca 780

agtgtgactc tacgcttcgg ttgtgcgtac aaagcacaca cgtagacatt cgtactttgg 840

aagacctgtt aatgggcaca ctaggaattg tgtgccccat ctgttctcag aaaccaggat 900

ctgaaggtag gggaagtttg cttacttgcg gtgacgtcga agagaatcca ggaccagatg 960

gccgcaacat gccgcgcgct ccccgctgcc gagccgtgcg ctccctgctg cgcagccact 1020

accgcgaggt gctgccgctg gccacgttcg tgcggcgcct ggggccccag ggctggcggc 1080

tggtgcagcg cggggacccg gcggctttcc gcgcgctggt ggcccagtgc ctggtgtgcg 1140

tgccctggga cgcacggccg ccccccgccg ccccctcctt ccgccaggtg tcctgcctga 1200

aggagctggt ggcccgagtg ctgcagaggc tgtgcgagcg cggcgcgaag aacgtgctgg 1260

ccttcggctt cgcgctgctg gacggggccc gcgggggccc ccccgaggcc ttcaccacca 1320

gcgtgcgcag ctacctgccc aacacggtga ccgacgcact gcgggggagc ggggcgtggg 1380

ggctgctgct gcgccgcgtg ggcgacgacg tgctggttca cctgctggca cgctgcgcgc 1440

tctttgtgct ggtggctccc agctgcgcct accaggtgtg cgggccgccg ctgtaccagc 1500

tcggcgctgc cactcaggcc cggcccccgc cacacgctag tggaccccga aggcgtctgg 1560

gatgcgaacg ggcctggaac catagcgtca gggaggccgg ggtccccctg ggcctgccag 1620

ccccgggtgc gaggaggcgc gggggcagtg ccagccgaag tctgccgttg cccaagaggc 1680

ccaggcgtgg cgctgcccct gagccggagc ggacgcccgt tgggcagggg tcctgggccc 1740

acccgggcag gacgcgtgga ccgagtgacc gtggtttctg tgtggtgtca cctgccagac 1800

ccgccgaaga agccacctct ttggagggtg cgctctctgg cacgcgccac tcccacccat 1860

ccgtgggccg ccagcaccac gcgggccccc catccacatc gcggccacca cgtccctggg 1920

acacgccttg tcccccggtg tacgccgaga ccaagcactt cctctactcc tcaggcgaca 1980

aggagcagct gcggccctcc ttcctactca gctctctgag gcccagcctg actggcgctc 2040

ggaggctcgt ggagaccatc tttctgggtt ccaggccctg gatgccaggg actccccgca 2100

ggttgccccg cctgccccag cgctactggc aaatgcggcc cctgtttctg gagctgcttg 2160

ggaaccacgc gcagtgcccc tacggggtgc tcctcaagac gcactgcccg ctgcgagctg 2220

cgg 2223

<210> 5

<211> 3399

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> misc_feature

<223> hTERT

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(3399)

<223> hTERT

<400> 5

atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60

gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120

cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240

gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300

ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360

agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480

ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540

gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600

cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660

gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720

ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780

aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840

gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900

cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960

tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020

ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080

gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140

cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200

gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260

ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320

gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380

gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440

aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500

gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560

cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620

ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680

ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740

tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800

ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860

ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920

ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980

ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040

ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100

gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160

ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220

gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280

agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340

caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400

gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460

aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520

ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580

gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640

aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700

cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760

cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820

gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880

aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940

aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000

atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060

tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120

tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180

gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240

aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300

acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360

ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactga 3399

<210> 6

<211> 477

<212> DNA

<213> 人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16)

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(477)

<223> HPV16 E6

<400> 6

atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60

cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120

aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180

tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240

agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300

aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360

gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420

ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 477

<210> 7

<211> 297

<212> DNA

<213> 人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16)

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(297)

<223> HPV 16 E7

<400> 7

atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60

gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120

ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180

tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240

gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297

<210> 8

<211> 3396

<212> DNA

<213> 猪(swine)

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(3396)

<223> 猪TERT(pigTERT)

<400> 8

atgccgcgcg cgccccggtg ccgggccgtg cgctccctgc tccgggaccg ctacaggcag 60

gtgctgccgc tggccacctt cgtgcggcgc ctgggccctg agggccggcg gcttgttcgg 120

cgcggggacc cggcggccta ccgcgcgctg gtggcgcagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgcgcagc cgcctcctgc ctccccgtcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240

gtggccaggg tcgtgcagag gctctgcgag cgcggcgcga ggaacgtgct ggcctttggc 300

ttcgcgctgc tggacggggc tcgcggcggg ccgcccgtgg ccttcacgac cagcgtgcgc 360

agctacctgc ccaacaccgt gaccgacaca ctgcgcggga gcggcgcgtg ggggctgctg 420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctcacc cacctgttgg cgcgctgcgc gctgtacctg 480

ctggtgcccc cgagttgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cactctatga cctctacacc 540

gcagcggagg ctcggcccat gcgacacaag ggccagaccc cgactggcct cggactcacg 600

cgccccgttt gcaatgggga agccgggcga ccccaggagc agagggcgca aggtgtgagg 660

cgacgtcggg gcagagcggg gggacatcca cttccagcca agaggcccag gcacgtcccg 720

gagcctgaac agggtcccga agggcaggcg tcccgggccc accagggcag ggcgcctggg 780

ccgagcgaca gcgacccccc cgtgatgaca cctaccagag ccgctgcgaa agccaagtct 840

cgggagggtg aggcgcccgg aacccggcac ctttcccctc aagcaggcgg tgcgcggggt 900

acctgccccc catcctggtg gcagccacac ctccagggca agcccagtcc tcatgtgtgc 960

gctgccgaga ccaagcgctt cctctactgc tcggggagca aggaagggct gcgccgctcg 1020

ttcctgctct gctccctgcc gcccagcctg gcgggggccg ggaggctcgt ggaggtcatc 1080

tttctggcct caaagcccgg gcagccaggg gcgcgccgcg tgcccgcacg ctactggcgg 1140

atgaggcccc tgttccggga gctgcttaag aaccacgcgc ggtgccccta caaggcgctt 1200

ctcagggcgc actgcccgtt gcgggctgcg gcgaccctct cggggtccgg cggtcaggtg 1260

tgcgaccaca aagtgggccc cctcgctcca gagcggctgg cagcggccgc cgagggggac 1320

tcggcctcga ggcgcctagt ccagctgctc cgccagcaca gcagcccctg gcaggtgtac 1380

cgcctcctgc gggcctgtct tcaccggctg gtgcccccgg gcctctgggg ctccccgcac 1440

aacaagcggc gctttctgaa gaatgtgaag aagctcgtct ccctggggaa gcacgccagg 1500

ctctcgctgc aggagctgat gtggaagatg aaagtgcaag actgcatctg gctgcgccgg 1560

agcccggacg ctcgccatgt ccaggccgcc gagcaccgtc tgagagaggc cattctggcc 1620

aagttcctgc gctggttgat gggcacgtac gtggtcgagc tgctcaggtc gtttttttat 1680

gtcacggaga ccacgtttca gaagaaccgg ctcttcttct tccggaagcg catctggagc 1740

cggctgcaga gcgcaggcat caggcaacac ttagatcgtg tgcggcttcg agaactgtcg 1800

gaagcagaga tcaggcgacg ccgggaggcc aggcccgctg tactgacctc caagctccgc 1860

ttcgtcccca aacccgacgg gctgcggccc atcgtgaaca tggcgaacgt cgtgcgagcc 1920

aggacaggcc ccggagacaa gaaggtccgg cgtctcacgg ggcaggtcaa gacgctgttt 1980

gctgtgctga actacgagcg ggcgcggcgc ccgcgcctcc tgggggcctc cgtgctgggc 2040

gtgggtgaca tccacagggc gtggcgggcc tttgtgctgc ccctgcgggc ccaggacccg 2100

gcccccccgc tgtactttgt caaggtggac gtgacggggg cctacgacgc cctccctcag 2160

gacaggcttg ctgaggtggt cgccaacgtg atccggccct acgagagcac gtactgcgtg 2220

cgccagtgcg ccgtgctccg gaggaccgcc cgcgggcacg tgcgcaagtc cttccaaacc 2280

cacgtgtcca ccttcgcaga cctccagcct tacatgagac agtttgtggc acacctgcag 2340

gcaaccggcc cgctgaggga cgccgtggtc atcgagcaga gctgctctct gaacgaggcc 2400

ggcagccgtc ccctggagct tttcctgagc ctgctgcgaa accacgtcat ccggatcggg 2460

ggcaggtcct acgtccagtg tcaggggatc ccacagggct ccattctgtc cacgctgctc 2520

tgcagcctgt gctacgggga catggaaaac agactgtccc cggggatcca gcgtgacggg 2580

gtgctcctgc gcttggtgga cgacttcctg ctggtgaccc ctcacctgac acgagccaaa 2640

gcctttctca ggaccctggt ccgcggcgtg cccgagtacg gctgcctggc caacttgcgg 2700

aagacggccg tgaacttccc tgtggaggac ggcgcccggg gcggcccggc cccactgcag 2760

ctgccggcac actgcctgtt cccctggtgc gggctgctgc tggacacccg cacgctggag 2820

gtgcactgcg actatgccag ttacgcccgg acctcgatca gagcgagtct caccttcaac 2880

cagggcttca agcccgggag gaacatgcgc cgcaagctct tggcggtctt gcggctaaag 2940

tgccacggga tccttctgga cctgcaggtg aacagtcttc cgacggtgct cgccaacgtt 3000

tacaagatct tcctgctgca ggcctacagg ttccacgcgt gtgtgctgca gctgcccttc 3060

cgtcagccgc ttgcgaggaa cccctcattt ttcctccggc ttgtctccga caccgcgtcc 3120

tgctgctact cgctcctgaa agccagaaac gcagggatgt ccctgggagc caggggcgcc 3180

tccggcccgt ttccctctga agccgcagag tggctctgcc tccacgcctt cctgctcaag 3240

ctggttcgtc accgcgttac ctacagctgt cttctggggc cgctccgggc agccagagag 3300

cgattgtgcc agcggctccc tggggccaca ctggccgccc tcgaggccgc cgccgaccca 3360

gccctgacta cagacttccg gaccatcctg gactga 3396

<210> 9

<211> 981

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> 基因(gene)

<222> (1)..(981)

<223> hbmi1

<400> 9

atgcatcgaa caacgagaat caagatcact gagctaaatc cccacctgat gtgtgtgctt 60

tgtggagggt acttcattga tgccacaacc ataatagaat gtctacattc cttctgtaaa 120

acgtgtattg ttcgttacct ggagaccagc aagtattgtc ctatttgtga tgtccaagtt 180

cacaagacca gaccactact gaatataagg tcagataaaa ctctccaaga tattgtatac 240

aaattagttc cagggctttt caaaaatgaa atgaagagaa gaagggattt ttatgcagct 300

catccttctg ctgatgctgc caatggctct aatgaagata gaggagaggt tgcagatgaa 360

gataagagaa ttataactga tgatgagata ataagcttat ccattgaatt ctttgaccag 420

aacagattgg atcggaaagt aaacaaagac aaagagaaat ctaaggagga ggtgaatgat 480

aaaagatact tacgatgccc agcagcaatg actgtgatgc acttaagaaa gtttctcaga 540

agtaaaatgg acatacctaa tactttccag attgatgtca tgtatgagga ggaaccttta 600

aaggattatt atacactaat ggatattgcc tacatttata cctggagaag gaatggtcca 660

cttccattga aatacagagt tcgacctact tgtaaaagaa tgaagatcag tcaccagaga 720

gatggactga caaatgctgg agaactggaa agtgactctg ggagtgacaa ggccaacagc 780

ccagcaggag gtattccctc cacctcttct tgtttgccta gccccagtac tccagtgcag 840

tctcctcatc cacagtttcc tcacatttcc agtactatga atggaaccag caacagcccc 900

agcggtaacc accaatcttc ttttgccaat agacctcgaa aatcatcagt aaatgggtca 960

tcagcaactt cttctggttg a 981

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 10

ggcactgccc tcagacttca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 11

ctgctaaagc gcatgctcca 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 12

ctgcggcatc cacgaacta 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 13

acagcaccgt gttggcgta 19

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 14

ttggtcaagc agcataatcc aaag 24

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 15

gtcaagggca tagcctacca caa 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 16

gcactgccct cagacttcaa ga 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 17

gcgggactat ggttgctgac 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 18

tggcacccag cacaatgaa 19

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 用于实时PCR的引物(a primer for real-time PCR)

<400> 19

ctaagtcata gtccgcctag aagcca 26

Claims

1.一种褥疮的预防和/或治疗剂，其以插入有bmi-1基因、HPV-E6基因、HPV-E7基因以及TERT基因的永生化间充质干细胞的培养上清作为有效成分。

2.如权利要求1所述的褥疮的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述TERT为hTERT或pTERT。

3.如权利要求1所述的褥疮的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述间充质干细胞为牙髓干细胞。

4.如权利要求1或3所述的褥疮的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述牙髓干细胞来源于人或猪。

5.如权利要求1～4中任一项所述的褥疮的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述培养上清分别以1×10³pg/mL～1×10⁶pg/mL的浓度范围包含选自由胰岛素样生长因子结合蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂、血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子受体II以及骨保护素·破骨细胞分化抑制因子组成的组中的至少3种以上的细胞因子。

6.如权利要求5所述的褥疮的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述胰岛素样生长因子结合蛋白为选自由IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4以及IGFBP-6组成的组中的至少一者。

7.如权利要求5所述的褥疮的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述金属蛋白酶组织抑制剂为TIMP-1或TIMP-2。

8.如权利要求1～7中任一项所述的褥疮的预防和/或治疗剂，其特征在于，所述培养上清为选自由冷冻品、冷冻干燥粉末以及液剂组成的组中的任一种形态。

9.如权利要求8所述的褥疮的预防和/或治疗剂，其特征在于，进一步包含选自由赋形剂、pH调节剂、稀释剂以及缓冲剂组成的组中的至少一者以上。

10.如权利要求9所述的褥疮的预防和/或治疗剂，其特征在于，其为选自由注射剂、注射剂、软膏、硬膏、乳膏剂以及透皮吸收剂组成的组中的任一种剂型。

11.一种褥疮组织的修复方法，其使用培养组合物，

所述培养组合物是对插入有选自由Bmi-1基因、HPV16-E6基因以及HPV16-E7基因组成的组中的2个基因以及端粒酶逆转录酶(TERT)基因的组合的永生化间充质干细胞进行培养而得到的，

所述培养组合物分别以1×10³pg/mL～1×10⁶pg/mL的浓度范围包含选自由胰岛素样生长因子结合蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂、血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子受体II以及骨保护素·破骨细胞分化抑制因子组成的组中的至少3种以上的细胞因子。

12.一种褥疮中的细胞的再生方法，其使用培养组合物，