CN101979520A

CN101979520A - 特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101979520A
Application number: CN 201010292283
Authority: CN
Inventors: 杨波; 董世武; 郭洪峰; 康菲; 应大君
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2010-09-26
Filing date: 2010-09-26
Publication date: 2011-02-23

Abstract

本发明公开了特异促成软骨分化的核心结合因子a1(Cbfa1)基因重组病毒及其制备方法和应用，该重组病毒包含一个由Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因表达盒；其制备方法包括Cbfa1基因全长cDNA的克隆及Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建，Sox9基因启动子片段的克隆及Sox9基因启动子重组表达载体的构建，Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒载体的构建，Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化等步骤；该重组病毒可用于制备定向诱导成软骨分化的种子细胞，能够高效、特异地使间充质干细胞在向成骨/软骨方向分化前提下向成软骨方向分化。

Description

特异促成软骨分化的核心结合因子al基因重组病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种基因重组病毒，特别涉及一种特异促成软骨分化的核心结合因子a1(Cbfa1)基因重组病毒，还涉及该重组病毒的制备方法和应用。

背景技术

随着软骨形成过程的组织学、细胞学和材料学研究的不断深入，对细胞因子和信号分子、细胞-材料界面相互作用的了解不断拓展，已有学者利用组织工程技术于体外形成了组织工程软骨，并显示了组织工程软骨的广阔应用前景。尽管组织工程软骨研究开展较早，技术相对较成熟，但有效合理的种子细胞来源成为限制其临床应用的瓶颈。在自体或异体软骨细胞、骨膜和软骨膜细胞、骨髓或其它组织来源的间充质干细胞(MSCs)、以及胚胎干细胞等众多备选种子细胞中，间充质干细胞因其具有来源充足、取材方便、低免疫原性、增殖能力强、可大量培养扩增等优势，成为目前组织工程软骨领域种子细胞的首选。但间充质干细胞具有多向分化潜能，为了满足组织工程软骨的构建要求，必须寻求一种能够高效、特异地促进间充质干细胞定向成软骨分化的方法。

既往研究显示，利用多种旁分泌、自分泌来源的生物活性因子如骨形成蛋白-7、转化生长因子-β1、白介素-1等以及非蛋白性化合物如地塞米松、前列腺素E2等均可明显刺激间充质干细胞的II型胶原与蛋白多糖合成，但这些活性因子和非蛋白性化合物的特异性差，往往使间充质干细胞呈多向分化。应用软骨细胞外基质进行间充质干细胞的体外3D培养，提供适宜于干细胞成软骨分化的外部环境，可促进间充质干细胞成软骨分化，但该方法更多的是从支架材料的研发考虑，而忽略了细胞自身的生物学特性。间充质干细胞与滑膜囊巨噬细胞或胚胎颅盖细胞共培养可促进其成软骨分化，但该方法除了有导致病原传递的危险之外，最主要的问题在于成软骨分化细胞难以与共培养细胞有效分离。因此，如何高效、特异地促进间充质干细胞定向成软骨分化，成为组织工程软骨领域目前需要解决的重要问题。

新近研究显示，在胚胎发育期，软骨细胞和成骨细胞都来源于未分化的间质细胞。在骨骼形成过程中，部分间质细胞集缩并分化成软骨细胞构成软骨组织，形成骨骼的原始雏形，在部分软骨细胞凋亡后，随着血管侵入，成骨细胞在残存软骨基质上合成骨基质，软骨被骨替换，此过程称为软骨内成骨；同时，部分间质细胞集缩可直接分化成成骨细胞并形成骨，此过程称为膜内成骨。因此，要促进间充质干细胞定向成软骨分化，首先需要使间充质干细胞向双潜能的间质细胞分化，继而在此基础上加强间质细胞成软骨分化能力。

Cbfa1基因是Runt结构域基因家族的重要成员之一，编码一个成骨细胞特异性转录因子，调控成骨细胞发育、分化和骨的形成。在鼠中剔除Cbfa1基因可导致成骨细胞分化完全受抑制，使骨骼的软骨内骨化成骨和膜内骨化成骨均不能发生。Chfa1-/-的头盖骨体外培养细胞已经完全丧失了向成骨细胞分化的能力，反而具有了向脂肪细胞或软骨细胞分化的潜能。尽管Cbfa1-/-鼠的软骨细胞分化和软骨形成正常，但是软骨细胞成熟即肥大化受到严重抑制。而在体外培养的软骨细胞中，过量表达Cbfa1促进软骨细胞肥大化。这些结果说明Cbfa1不仅控制成骨细胞分化和骨形成，而且还与软骨细胞肥大化有关。两项独立的转基因鼠实验进一步证实了这种观点：在II型胶原启动子和增强子的指导下，Cbfa1在软骨细胞内过表达明显地促进软骨细胞肥大化，并能够在一定程度上使Cbfa1-/-软骨细胞肥大化和凋亡，使血管侵入软骨。而在软骨细胞内过量表达Cbfa1显性负突变体，由于抑制内源Cbfa1的功能，会使软骨细胞成熟受到抑制，使软骨表现永久软骨特性。

Sox9基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因，参与诸如性别决定、软骨形成等多种早期胚胎发育过程，在除肥大软骨细胞外的所有前体软骨细胞和软骨细胞中均有表达。Gordon等报道Sox9基因上游序列突变可影响软骨形成而导致短指等骨骼发育异常。在软骨形成过程中，软骨细胞增殖、分化的调控过程复杂，参与的细胞因子较多，目前比较明确的是Sox9结合于软骨细胞特异增强子Co12α1，直接调控其表达；L-Sox5、Sox6与Sox9共同形成蛋白复合物协同作用于Co12α1增强子序列，增强其转录，并通过结合于PTHrP基因的启动子区上调PTHrP基因启动子活性，刺激软骨细胞早期阶段增殖和发育；Sox9与wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信号转导通路相互作用，调控软骨细胞分化。此外，最新研究显示，Sox9基因在软骨形成过程中还与其他生物因子和物理因子如低氧、电磁场等相互影响、相互作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种特异促成软骨分化的Cbfa1基因重组病毒，可以高效、特异地使间充质干细胞在向成骨/软骨方向分化前提下向成软骨方向分化；目的之二在于提供一种所述特异促成软骨分化的Cbfa1基因重组病毒的制备方法，操作简便；目的之三在于提供一种所述特异促成软骨分化的Cbfa1基因重组病毒在医药方面的应用及其应用方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、特异促成软骨分化的Cbfa1基因重组病毒，包含一个由Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因表达盒。

进一步，病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。

当然，病毒载体也可以选用逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等基因工程领域常用的其它病毒载体，只要在病毒基因组中插入一个由Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因表达盒，都可以同样达到本发明目的。

2、所述特异促成软骨分化的Cbfa1基因重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：

a、Cbfa1基因全长cDNA的克隆及Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建：根据Cbfa1基因全长cDNA的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的上、下游引物，以人成骨细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得Cbfa1基因全长cDNA，再定向克隆至复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆位点Xho I和EcoRV之间，获得Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfa1；

b、Sox9基因启动子片段的克隆及Sox9基因启动子重组表达载体的构建：根据Sox9基因启动子片段的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分别如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的上、下游引物，以小鼠软骨细胞系ATDC5的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得Sox9基因启动子片段，再定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点Bgl II和Sal I之间，获得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/Sox9pro；

c、Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒载体的构建：自步骤b所得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/Sox9pro中用Bgl II和Sal I双酶切出Sox9基因启动子片段，再定向克隆至步骤a所得Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfa1的多克隆位点Bgl II和Sal I之间，获得Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-Sox9pro/Cbfa1，将其用Pme

I酶切使线性化后，再转化AdEasier-1细胞与复制缺陷型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细胞内同源重组，获得Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/Sox9pro-Cbfa1；

d、Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化：将步骤c所得Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/Sox9pro-Cbfa1用脂质体法转染人胚胎肾293细胞，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心收集含病毒上清液，获得第一代重组腺病毒悬液；将第一代重组腺病毒悬液感染人胚胎肾293T细胞以扩增病毒，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心收集含病毒上清液，获得第二代重组腺病毒悬液；按照上述操作连续感染扩增病毒几代后，将所得含病毒上清液采用氯化铯密度梯度超离心法纯化，即得Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1。

3、所述特异促成软骨分化的Cbfa1基因重组病毒在制备定向诱导成软骨分化的种子细胞中的应用。

4、利用所述特异促成软骨分化的Cbfa1基因重组病毒制备定向诱导成软骨分化的种子细胞的方法，先用特异促成软骨分化的Cbfa1基因重组病毒转染间充质干细胞，再用成软骨诱导培养基培养已感染重组病毒的间充质干细胞，诱导间充质干细胞定向成软骨分化。

本发明的有益效果在于：针对目前组织工程软骨研究中种子细胞的定向成软骨分化问题，本发明建立了一种特异促成软骨分化的Cbfa1基因重组病毒，通过Sox9基因启动子驱动Cbfa1基因在间充质干细胞高表达，可以高效、特异地使间充质干细胞在向成骨/软骨方向分化前提下向成软骨分化；该重组病毒的制备方法简单，成本低；该重组病毒可用于制备定向诱导成软骨分化的种子细胞，从而为组织工程软骨的构建提供有力的支持。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1示出了重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1的构建示意图。

图2示出了重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1感染间充质干细胞的情况，其中A为荧光视野，可见感染后细胞呈现绿色荧光；B为对应的白光视野；标尺为200μm。

图3示出了重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1感染间充质干细胞后促进其成软骨分化，A组细胞呈现甲苯胺蓝染色强阳性，光学放大倍数为400倍。

图4示出了重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1感染间充质干细胞后促进其成软骨分化，A组细胞呈现II型胶原免疫组化染色强阳性，光学放大倍数为200倍。

图5示出了用感染重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1的间充质干细胞构建的细胞支架复合物在体修复关节软骨缺损12周的效果，修复组织与周围组织结构相似，细胞分泌基质量略多于正常组织。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒的制备及鉴定

1、Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒的制备

重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1的构建示意图如图1所示，其制备方法包括以下步骤：

a、Cbfa1基因全长cDNA的克隆及Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建

根据GenBank登录的Cbfa1基因全长cDNA的核苷酸序列(登录号为NM_001024630)，设计并合成如下引物：上游引物：5’-ccgctcgagatggcatcaaacagcctctt-3’(SEQ ID No.1)，下划线部分为Xho I酶切位点及其保护碱基；下游引物：5’- ccggatatctcaatatggtcgccaaacagattca-3’(SEQ ID No.2)，下划线部分为EcoRV酶切位点及其保护碱基。抽提人成骨细胞总RNA，将所得总RNA逆转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，采用上述引物PCR扩增两端分别带有Xho I和EcoRV酶切位点的Cbfa1基因全长cDNA。PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTPs5μL，上、下游引物各2μL，模板1μL，Taq DNA聚合酶1μL，用无DNA酶水稀释至总体积50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性1分钟、59℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在约1.7kb处出现特异性条带，与目标片段的分子量大小一致。采用PCR产物回收试剂盒切胶回收纯化PCR产物。

将纯化后的PCR产物和复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV分别用 Xho I和EcoRV双酶切，切胶回收纯化Cbfa1基因全长cDNA片段和穿梭质粒pAdTrack-CMV骨架，再将二者在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，抽提质粒，测序验证，获得Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfa1。

b、Sox9基因启动子片段的克隆及Sox9基因启动子重组表达载体的构建

根据GenBank登录的Sox9基因启动子片段的核苷酸序列(登录号为NC000077.5)，设计并合成如下引物：上游引物：5’-ggaagatctgtggagcgttttgtctgc-3’(SEQID No.3)，下划线部分为BglII酶切位点及其保护碱基；下游引物：5’-catccggtcgac-tgaaactggcgagtctcc-3’(SEQ ID No.4)，下划线部分为Sal I酶切位点及其保护碱基。以小鼠软骨细胞系ATDC5的基因组DNA为模板，PCR扩增两端分别带有BglII和Sal I酶切位点的Sox9基因启动子片段。PCR扩增体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTPs 5μL，上、下游引物各2μL，模板1μL，Taq DNA聚合酶1μL，用无DNA酶水稀释至总体积50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性1分钟、59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在约1kb处出现特异性条带，与目标片段的分子量大小一致。采用PCR产物回收试剂盒切胶回收纯化PCR产物。

将纯化后的PCR产物和真核表达载体pEGFP-N1分别用BglII和Sal I双酶切，切胶回收纯化Sox9基因启动子片段和表达载体pEGFP-N1骨架，将二者在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，抽提质粒，测序验证，获得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/Sox9pro。

c、Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒载体的构建

将Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/Sox9pro和Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfa1分别用Bgl II和Sal I双酶切，切胶回收纯化Sox9基因启动子片段和穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfa1骨架，再将二者在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，抽提质粒，测序验证，获得Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-Sox9pro/Cbfa1。

将Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-Sox9pro/Cbfa1用Pme I酶切使线性化后，用电穿孔法转化AdEasier-1细胞，用LB培养基于37℃孵育20分钟后，涂布于卡那霉素抗性平板上，37℃孵育过夜，挑取转化菌落，抽提质粒，用琼脂糖凝胶电泳初筛重组体，再用Pac I酶切鉴定，获得Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/Sox9pro-Cbfa1。

d、Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化

将Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/Sox9pro-Cbfa1经Pac I酶切、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后获得质粒DNA，采用脂质体DOTAP试剂(Roche公司)转染约75％融合的293细胞，按照试剂说明书操作，具体方法为：将2μg质粒DNA用HEPES缓冲液(20mmol/L HEPES+150mmol/LNaCl，PH7.4)稀释至50μL制得A液；将DOTAP 30μL与HEPES缓冲液70μL混合制得B液；将A液与B液混匀，室温下静置15分钟，再加入无血清DMEM培养基850μL，室温静置30分钟，制得转染液；将已培养至约75％融合的293细胞用无血清DMEM培养基洗涤2次后，加入上述转染液，37℃培养8小时，再换成含有体积分数为10％的胎牛血清的DMEM培养基继续培养。转染5～7天后出现细胞病变(cytopathic effect，CPE)，表现为贴壁细胞变圆；转染10～12天后可见圆形细胞呈葡萄串状丛集分布于正常的293细胞上，MTT染色显示病毒空斑。当显微镜下观察到90％以上的细胞均出现病变时，离心收集细胞，于-80℃和37℃反复冻融3次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒上清液，获得第一代重组腺病毒悬液。

取第一代重组腺病毒悬液1mL，37℃浸染293T细胞1小时，再换成含有体积分数为10％的胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，7天后离心收集细胞，于 -80℃和37℃反复冻融3次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒上清液，获得第二代重组腺病毒悬液。按照上述操作连续感染293T细胞扩增病毒几代后，葡萄串状细胞病灶逐渐增多和增大，至100％细胞出现脱落后，转入175cm²大瓶扩增，收集细胞冻融裂解液(即前述含病毒上清液)，采用氯化铯密度梯度超离心法纯化，获得Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1。

2、PCR法鉴定Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒

以所得Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1的基因组DNA为模板，采用如下引物PCR扩增Cbfa1基因cDNA片段：上游引物：5’-agtatttacaacagagggcacaag-3’(SEQ ID No.5)；下游引物：5’-aacagcggaggcatttcg-3’(SEQ ID No.6)。PCR扩增条件为：94℃变性1分钟、58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果在约600bp处出现特异性条带，与目标片段的分子量大小一致，表明Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1构建成功。

3、GFP阳性细胞计数法测定重组腺病毒滴度

因腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒，故采用GFP阳性细胞计数法测定重组腺病毒滴度：将293T细胞以细胞浓度为4×10⁴～2×10⁵/mL接种于96孔细胞培养板中，80μL/孔，培养24小时后，10孔为1组，每孔设对应复孔，向第1孔内加入重组腺病毒悬液20μL，混匀后取20μL按5∶1倍比稀释后加入第2孔，再从第2孔中取20μL按5∶1倍比稀释后加入第3孔，如此类推，从第9孔中取出20μL弃去，第10孔作为阴性对照，培养18小时后，以浓度自高到低的方向，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光细胞的数量，如前一孔阳性细胞较多(≥5个)，而此孔及以后各孔荧光消失，或此孔阳性细胞较少(＜5个)而以后各孔荧光消失，则以此孔作为计量孔(计为1U)计算病毒滴度。结果显示，所得Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1的滴度约为1×10¹⁰～3×10¹⁰U。

二、Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒特异促成软骨分化

1、经重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1处理的种子细胞体外促成软骨分化选用体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行重组腺病毒转染。实验分为A、B、C三组：A组用Sox9基因启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1进行转染，B组用CMV启动子调控的Cbfa1基因重组腺病毒进行转染，C组为空白对照。具体转染方法为：转染前用PBS冲洗细胞，经胰酶/EDTA消化后，用2mL无抗生素的完全培养基重悬细胞，按5×10⁵/孔接种于6孔细胞培养板中，置温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的培养箱中培养，待细胞生长至90％～95％融合时，按MOI＝50进行重组腺病毒转染，37℃培养1小时后换成完全培养基继续培养。A组培养48小时后在荧光显微镜下可见超过90％的细胞呈GFP阳性(图2)，表明重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1已经成功转染间充质干细胞。分别将A组、B组已感染重组腺病毒的间充质干细胞和C组处理细胞作为种子细胞，进行成软骨分化鉴定。

分别取三组种子细胞各2.5×10⁵个，进行微团培养，用成软骨诱导培养基(DMEM+10ng/mL转化生长因子β1+50μg/mL维生素C+100μg/mL丙酮酸钠+100ng/mL地塞米松+50mg/mL胰岛素+50mg/mL转铁蛋白+50mg/mL亚硒酸)在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％、饱和湿度条件下培养2周后，进行如下检测：

(1)RT-PCR检测软骨特异性标志基因的表达

分别取上述三组以微团方式成软骨诱导培养2周的种子细胞，采用Trizol试剂盒抽提细胞总RNA，使用ImProm-II逆转录系统(Promega公司)将总RNA逆转录为cDNA，再以所得cDNA为模板，采用PCR Master Mix试剂盒进行PCR扩增，检测Sox9、Co12α1、Aggrecan基因的表达，以28sRNA做内参照。引物序列如下：Sox9-F：5′-tcctcaggctttgcgattt-3′(SEQ ID No.7)，Sox9-R：5′-tgctcgggcac-ttattgg-3′(SEQ ID No.8)；Co12α1-F：5′-tggtgctgctgacgctgctcatcgccacgacggtccta-3′(SEQ ID No.9)，Co12α1-R：5′-gccttctgaaatcctccagccatctgggccgc-3′(SEQ ID No.10)； Aggrecan-F：5′-tgctgtgcctcctcaaatgtcagagagtatct-3′(SEQ ID No.11)，Aggrecan-R：5′-ctgctacacaggtgaagactttgtagacatcc-3′(SEQ ID No.12)。PCR扩增条件为：95℃变性1分钟，58℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用Quantity One凝胶图像采集系统采集图像。结果显示，A组种子细胞的Sox9、Co12α1、Aggrecan基因表达明显高于B组和C组种子细胞，提示本发明的重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1可以高效、特异地使间充质干细胞在向成骨/软骨方向分化前提下向成软骨分化。

(2)Western blot检测Sox9蛋白和II型胶原蛋白的表达

分别取上述三组以微团方式成软骨诱导培养2周的种子细胞，用PBS洗涤3次后，加入细胞裂解液，冰上裂解20分钟，离心收集上清液，与缓冲液混匀后煮沸5分钟，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完毕后转移至PVDF膜上进行免疫杂交，检测Sox9蛋白和II型胶原蛋白的表达，以β-actin蛋白做内参照。用Quantity One凝胶图像采集系统采集图像，分析各条带的光密度值，计算蛋白相对表达量(目的蛋白与内参照的比值)。结果显示，A组种子细胞的Sox9和II型胶原蛋白表达量明显高于B组和C组种子细胞。

(3)甲苯胺蓝染色检测

分别取上述三组以微团方式成软骨诱导培养2周的种子细胞，用体积分数为4％的多聚甲醛固定30分钟，PBS洗涤3次，甲苯胺蓝染色2分钟，再用体积分数为95％的乙醇分色至背景清晰，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片后进行观察。结果显示，A组种子细胞的胞浆和胞外基质呈现甲苯胺蓝染色强阳性，说明细胞合成了软骨特异性细胞外基质GAGs，而C组种子细胞的胞浆无明显蓝染，B组种子细胞的蓝染程度介于A组和C组之间，提示Cbfa1基因有促进间充质干细胞在向成骨/软骨方向分化前提下向成软骨分化的作用，但在Sox9基因启动子驱动下，此种作用明显增强。

(4)II型胶原免疫组化染色检测

分别取上述三组以微团方式成软骨诱导培养2周的种子细胞，用体积分数为95％的乙醇固定20分钟，PBS洗涤3次，进行II型胶原免疫组化染色检测。结果如图4所示，A组种子细胞的胞浆内有大量的荧光颗粒出现，呈现II型胶原免疫组化染色强阳性，表示细胞合成了软骨特异性细胞基质II型胶原，而C组种子细胞的胞浆内无明显染色，B组种子细胞的染色程度介于A组和C组之间，同样提示Cbfa1基因有促进间充质干细胞在向成骨/软骨方向分化前提下向成软骨分化的作用，但在Sox9基因启动子驱动下，此种作用明显增强。

2、经重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1处理的种子细胞在体修复关节软骨缺损

选用体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞进行重组腺病毒转染，选用壳聚糖/磷酸甘油钠(C/GP)作为细胞支架材料。转染前用PBS冲洗细胞，经胰酶/EDTA消化后，用2mL无抗生素的完全培养基重悬细胞，按5×105/孔接种于6孔细胞培养板中，置温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的培养箱中培养，待细胞生长至90％～95％融合时，按MOI＝50转染重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1，37℃培养1小时后换成完全培养基继续培养。转染1天后，用PBS冲洗细胞2次，经胰酶消化后，用PBS重悬细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入C/GP溶液小心吹打制成细胞浓度为1×10⁷/mL的单细胞悬液，获得经重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1处理的MSCs-C/GP复合物。

选用新西兰大白兔进行关节软骨缺损的修复。将兔麻醉后，取双膝关节内侧纵切口，依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜和关节囊，暴露膝关节关节面，用钻头在股骨内髁负重区关节面上钻孔，造成直径为4mm、深度为3mm、穿透软骨下骨板的全层关节软骨损伤。实验分为I、II、III三组：I组在软骨缺损处植入上述经重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1处理的MSCs-C/GP复合物，II组在软骨缺损处植入不含细胞的C/GP溶液，III组为空白对照。分别于术后6周、12周各处死12只动物，取出膝关节进行观察。

结果显示，术后6周时，I组标本软骨缺损区域由修复组织填充，色泽灰白，与周围软骨组织结合良好，缺损边界较为明显，触之有一定硬度；II组标本软骨缺损区域修复组织色泽乳白，表面光滑，质软；III组标本软骨缺损区域修复组织形成较少，修复组织表面明显凹陷。术后12周，I组修复的关节面较光滑，修复组织与周围软骨基本整合，色泽相近，质地较6周时明显变硬，细胞形态排列、基质及II型胶原与正常软骨组织相近(图5)；II组修复处表面略不平整，色泽变灰黄，组织学可见明显纤维组织修复缺损，甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色均呈弱阳性；III组软骨缺损区域凹陷，边界清晰，颜色不均一，缺损边缘有少量修复，甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫组化染色均呈阴性。上述结果说明用感染重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1的间充质干细胞构建的细胞支架复合物在体修复关节软骨缺损可以取得良好的修复效果。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒，其特征在于：包含一个由Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因表达盒。

2.根据权利要求1所述特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒，其特征在于：病毒载体为复制缺陷型腺病毒载体。

3.权利要求1或2所述特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、核心结合因子a1基因全长cDNA的克隆及核心结合因子a1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建：根据核心结合因子a1基因全长cDNA的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的上、下游引物，以人成骨细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得核心结合因子a1基因全长cDNA，再定向克隆至复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆位点Xho I和EcoRV之间，获得核心结合因子a1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfa1；

b、Sox9基因启动子片段的克隆及Sox9基因启动子重组表达载体的构建：根据Sox9基因启动子片段的核苷酸序列设计并合成核苷酸序列分别如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示的上、下游引物，以小鼠软骨细胞系ATDC5的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得Sox9基因启动子片段，再定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点BglII和Sal I之间，获得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/Sox9pro；

c、Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒载体的构建：自步骤b所得Sox9基因启动子重组表达载体pEGFP/Sox9pro中用BglII和Sal I双酶切出Sox9基因启动子片段，再定向克隆至步骤a所得核心结合因子a1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV/Cbfa1的多克隆位点BglII和Sal I之间，获得Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-Sox9pro/Cbfa1，将其用Pme I酶切使线性化后，再转化AdEasier-1细胞与复制缺陷型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细胞内同源重组，获得Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/Sox9pro-Cbfa1；

d、Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化：将步骤c所得Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒载体pAdEasy-1/Sox9pro-Cbfa1用脂质体法转染人胚胎肾293细胞，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心收集含病毒上清液，获得第一代重组腺病毒悬液；将第一代重组腺病毒悬液感染人胚胎肾293T细胞以扩增病毒，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心收集含病毒上清液，获得第二代重组腺病毒悬液；按照上述操作连续感染扩增病毒几代后，将所得含病毒上清液采用氯化铯密度梯度超离心法纯化，即得Sox9基因启动子调控的核心结合因子a1基因重组腺病毒Sox9pro-Cbfa1。

4.权利要求1或2所述特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒在制备定向诱导成软骨分化的种子细胞中的应用。

5.利用权利要求1或2所述特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒制备定向诱导成软骨分化的种子细胞的方法，其特征在于：先用特异促成软骨分化的核心结合因子a1基因重组病毒转染间充质干细胞，再用成软骨诱导培养基培养已感染重组病毒的间充质干细胞，诱导间充质干细胞定向成软骨分化。