CN104694573A

CN104694573A - 利用CRISPR/Cas9抑制HIV-1感染原代淋巴细胞的方法

Info

Publication number: CN104694573A
Application number: CN201510134503.2A
Authority: CN
Inventors: 李昌; 胡勤学
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2035-03-26
Also published as: CN104694573B

Abstract

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9抑制HIV-1感染原代淋巴细胞的方法,涉及基因工程和抗病毒感染技术。本发明利用最新的CRISPR/Cas9核酸酶系统，结合高效靶向原代T淋巴细胞的Ad5F35嵌合型腺病毒载体，通过编辑人CD4⁺ T淋巴细胞的CCR5表达，有效抑制HIV-1病毒感染。本发明利用Ad5F35型腺病毒载体包装CRISPR/Cas9系统，有机地结合了二者各自的优势，提供了一种新型的对抗HIV-1病毒感染的方法，且具有应用于HIV-1基因治疗研究的潜能；同时,携带CRISPR/Cas9系统的Ad5F35型腺病毒载体，可用于靶向编辑原代淋巴细胞内的其它基因，或者用于其它造血系细胞的基因编辑研究。

Description

利用CRISPR/Cas9抑制HIV-1感染原代淋巴细胞的方法

技术领域

本发明涉及基因工程和抗病毒感染技术，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas9抑制HIV-1感染原代淋巴细胞的方法。具体地说，本发明利用表达CRISPR/Cas9核酸酶系统的Ad5F35型重组腺病毒，靶向编辑人原代CD4⁺T淋巴细胞表面的HIV-1辅助受体CCR5，破坏CCR5表达框或使CCR5丧失受体功能，从而抑制HIV-1病毒感染。

背景技术

自1984年首次报道艾滋病毒(HIV-1)为引起艾滋病(AIDS)的病原以来，全世界大批顶尖的科学家都致力于攻克这一疫病，虽取得了诸多重要进展，如通过宣传教育及联合用药疗法等途径，显著改善了HIV-1感染者的生存质量，以及使新发HIV-1感染人数大幅下降；但目前仍缺乏有效的疫苗和可治愈HIV-1感染的疗法。人们迫切需要新的更高效的替代方法，应对HIV-1疫情。近年来新兴的基因治疗技术，具有对抗HIV-1、乃至清除病毒感染的潜能。

基因治疗(gene therapy)又称为基因疗法，是指采用基因工程技术，在核酸水平纠正患者的致病基因，或者改造疾病发生所必需的编码基因，从而使患者获得抗病能力或治愈疾病的方法[Nat Biotechnol，2007，25(12)：1444-54]。通常采用复制缺陷型病毒载体，将编码正常功能的基因或靶向致病基因的干扰RNA投递至患者细胞。在HIV-1基因治疗领域，最具应用潜能的策略之一当属以趋化因子受体CCR5为靶标的基因编辑技术[N Engl J Med，2014，370(10)：901-10；Nat Biotechnol，2008，26(7)：808-16]，因为CCR5是R5嗜性的HIV-1病毒(早期感染阶段多见)入侵必需的辅助受体，阻断该受体即能阻断病毒入侵。而CCR5的缺失，不会影响人的正常生理功能，正常人中有部分群体遗传性缺失CCR5基因中一段32bp碱基(CCR5^Δ32)[Cell，1996，86(3)：367-77]，先天对HIV-1不敏感。

基因编辑技术是基因治疗的主要手段之一，利用被称为“分子剪刀”的核酸酶，对基因组特定位点进行插入、置换或剪切等改造，以实现疾病防治的功能。基因编辑的过程分为三步：首先，特异设计的导向序列(DNA结合元件)与目的DNA序列结合；然后，在导向序列引导下，核酸内切酶(DNA切割元件)对待编辑位点进行切割，在两条DNA链上各形成一个切口；最后，双切口激活胞内固有的修复机制，通常为错误倾向的非同源末端接合机制(NHEJ)，修复切口的同时，在切口附近引起缺失、插入，有外源同源片段存在时，还可引发同源重组机制，导致链置换和大片段插入。常见的核酸酶系统主要有锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和常间断短回文重复序列聚族关联蛋白核酸酶系统(CRISPR/Cas9)[Trends in Biotechnol，2013，31(7)：397-405]，它们被称为基因编辑技术领域里的三大利器。

CRISPR/Cas9是一种来源于原核生物的新型核酸酶系统，它由导向序列sgRNA和核酸酶Cas9两种元件组成。sgRNA可识别基因组中核甘酸序列为5’-NGG-3’的前间区序列邻近基序(PAM motif)，依据碱基互补配对原则与靶向序列结合，Cas9在sgRNA的导向下，特异性切割靶向序列，导致序列变化。与ZFN、TALEN相比，CRISPR/Cas9系统具有操控性强、特异性高、用途广泛等优点。采用针对HIV-1LTR启动子的CRISPR/Cas9系统，可特异性切割LTR，在细胞系水平清除潜伏感染的HIV-1基因组[Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111(31)：11461-6；Sci Rep，2013，3：2510]。应用RNA导向的Cas9编辑CCR5的研究，也在细胞系水平取得了一些前期结果，编辑效率甚至比TALEN更高[Proc Natl Acad SciU S A，2014，111(26)：9591-6]。在体内HIV-1主要感染CD4⁺T淋巴细胞，由于原代T细胞通常难以被转导，且Cas9蛋白的编码基因较大，常规方法很难将其表达在淋巴细胞中，目前尚没有应用CRISPR/Cas9技术，在原代T淋巴细胞水平开展针对CCR5的基因编辑研究。

CRISPR/Cas9元件较大，全长4.2kb，加上启动子等组分后超过5kb，利用即有的慢病毒载体，病毒滴度低，难以满足慢分裂或不分裂细胞，如原代细胞转导需要。腺病毒载体是一种复制缺陷型的载体，已被证实可用于基因治疗、疫苗载体及基础生物学研究，它具有包装容量大、滴度高、可感染细胞类型多、免疫原性弱、致癌风险低等特点[Nat Protoc，2007，2(5)：1236-47]。但是，常规的Ad5型腺病毒，难以转导包括CD4⁺T细胞在内的造血系细胞。

为了克服这一挑战，本发明首次利用Ad5F35嵌合型腺病毒载体，表达CRISPR/Cas9系统，这即结合了CRISPR/Cas9系统与腺病毒载体的上述优势，又利用了Ad5F35嵌合型腺病毒对CD4⁺T细胞的强感染嗜性。本发明在T淋巴细胞基因编辑领域及HIV-1基因治疗领域均具有重要的应用潜能。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用CRISPR/Cas9抑制HIV-1感染原代淋巴细胞的方法。

本发明的目的是这样实现的：

采用最新开发出来的CRISPR/Cas9核酸酶系统，筛选得到可高效、特异性地编辑HIV-1入侵所必需的辅助受体CCR5表达的sgRNA，结合使用强淋巴细胞嗜性的Ad5F35嵌合型腺病毒载体，将CRISPR/Cas9系统投递至人原代CD4⁺T淋巴细胞中，敲除CCR5表达，从而抑制HIV-1病毒入侵和感染。

所述CRISPR/Cas9核酸酶系统是指来源于化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的一种II型CRISPR/Cas系统，因II型特异地使用Cas9核酸酶，故被称为CRISPR/Cas9系统。2013年，首次报道细菌的II型CRISPR/Cas9系统可应用于哺乳动物细胞的基因组编辑研究[Science，2013，339(6121)：819-23；Science，2013，339(6121)：823-6]。最初报道认为CRISPR/Cas9在体外发挥作用需四个组分：Cas9核酸酶、III型核糖核酸酶(RNAse III)以及两种crRNA：反式激活crRNA(tracrRNA)和一种crRNA前体(pre-crRNA)。进一步研究发现，RNAse III为非必需组分，而pre-crRNA成熟体可与部分tracrRNA嵌合，构成一个导向序列sgRNA，因而，CRISPR/Cas9系统发挥作用仅需两个必需组分：Cas9核酸酶和sgRNA序列。

所述CCR5是一种趋化因子受体，是R5嗜性(在早期感染中多见)的HIV-1病毒入侵靶细胞(主要为CD4⁺T淋巴细胞)所必需的辅助受体，敲除该受体的表达，可抑制HIV-1病毒的入侵和感染，CCR5开放阅读框(ORF)的全长核甘酸序列如SEQ ID NO：4所示。因在正常人群中存在该受体的遗传性突变体CCR5^Δ32，CCR5是HIV-1药物和基因治疗研究中极具潜能的靶点。

所述Ad5F35嵌合型腺病毒载体是在常规Ad5型腺病毒载体的基础上，改造了受体结合的纤突区的嵌合型载体。腺病毒包括7个种(A-G)，57个血清型，常用的腺病毒载体来源于2型和5型腺病毒，其中以5型(Ad5)最常见。Ad5以柯萨奇病毒-腺病毒受体(coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR)为入侵受体，通过病毒表达的纤突蛋白与CAR相互作用入侵靶细胞[J Virol，2005，79(19)：12125-31]。CAR广泛表达于多种组织和细胞，因此Ad5具有较广谱的嗜性。但是造血干细胞来源的细胞，如作为HIV-1主要靶细胞的T淋巴细胞，很少表达CAR，难以被Ad5感染。而B种腺病毒，不同于其它6种腺病毒，以CD46为受体[Nat Med，2003，9(11)：1408-12]，CD46分布在包括造血系细胞在内的诸多细胞类型表面。研究表明，含有嵌合F5/F35纤突的Ad5，对造血系细胞的嗜性显著增加。

所述的携带CRISPR/Cas9核酸酶系统的Ad5F35嵌合型腺病毒载体，不限于用于编辑CCR5，还可以用于靶向编辑T淋巴细胞的其它基因，以及其它难以被Ad5型腺病毒转导，但易于被Ad5F35嵌合型腺病毒转导的造血系细胞，如造血干细胞所表达的基因。用于编辑其它基因时，只需使用特异性靶向该基因的sgRNA序列即可。

具体地说，本发明的技术方案是：

一、设计一种表达CRISPR/Cas9系统且可靶向CCR5的Ad5F35型腺病毒载体，该载体：

①表达Cas9核酸酶；

②表达靶向HIV-1辅助受体CCR5的开放阅读框的sgRNA，其序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示；或者表达非靶向性阴性对照sgRNA，其序列为SEQ ID NO：3所示；

③表达载体骨架为改造而来的Ad5F35嵌合型腺病毒载体；

④特征性图谱如图1所示。

二、携带CRISPR/Cas9的Ad5F35嵌合型腺病毒制备方法

本方法包括下列步骤：

①sgRNA设计与筛选

根据sgRNA的设计原则：5’-N(20)-NGG-3’，在CCR5的全长开放阅读框(ORF)内，搜索所有可能的sgRNA，根据综合评分、脱靶情况，选择sgRNA，构建sgRNA表达克隆，在细胞系水平验证sgRNA编辑CCR5的效率及脱靶效应，选取效率最高、特异性好的两条序列包装腺病毒；

②表达CRISPR/Cas9的Ad5F35腺病毒载体构建

设计与构建表达绿色荧光蛋白(EGFP)标签的CRISPR/Cas9表达载体，随后对腺病毒系统的穿梭载体进行改造，去除多余启动子序列，并将含有标签蛋白的CRISPR/Cas9元件克隆至穿梭载体中；

对Ad5载体的受体结合区进行改造，得到杂合了F5/F35受体结合域的Ad5F35嵌合型载体，采用细菌内同源重组的方法，共转化穿梭质粒与Ad5F35骨架质粒，筛选鉴定得到正确的含有CRISPR/Cas9的重组腺病毒载体；

③Ad5F35腺病毒包装与验证

将表达载体转染至HEK293细胞，直至出现明显细胞病变效应后，收集细胞，冻融释放病毒，在HEK293细胞中连续扩增，获得大量病毒液，并通过两步连续CsCl密度梯度离心，分层纯化病毒液，得到高度浓缩的重组腺病毒；

在细胞系水平检测转导了重组腺病毒后的Cas9表达情况与CCR5基因的编辑情况，验证重组腺病毒的功能。

三、携带CRISPR/Cas9的Ad5F35腺病毒在抑制HIV-1感染中的应用

①CD4⁺T淋巴细胞的分离与培养

从人新鲜外周血中，分离人外周血淋巴细胞(PBMC)，使用磁珠阴性分选法分离人原代CD4⁺T淋巴细胞，添加植物血凝素激活培养；

②Ad5F35腺病毒转导与CCR5编辑效率检测

加入制备的Ad5F35重组腺病毒，转导激活培养后的CD4⁺T淋巴细胞，转导后监测GFP表达情况及CCR5的基因编辑效率；

③HIV-1病毒感染编辑后的CD4⁺T淋巴细胞

采用流式分选技术，分离阳性转导的CD4⁺T淋巴细胞，加入HIV-1病毒感染，检测病毒复制水平变化。

本发明具有下列优点和积极效果：

①利用了CRISPR/Cas9核酸酶系统的优势,如易于操控、特异性高、用途广泛等；

②Ad5F35型腺病毒具有包装容量大、滴度高、可感染细胞类型多、免疫原性弱、致癌风险低等特点；

③Ad5F35嵌合型腺病毒载体不同于常规Ad5型载体，可较高水平地转导原代CD4⁺T淋巴细胞——HIV-1在体内感染的最主要靶细胞；

总之，本发明利用Ad5F35型腺病毒载体包装CRISPR/Cas9系统，有机地结合了二者各自的优势，提供了一种新型的对抗HIV-1病毒感染的方法，且具有应用于HIV-1基因治疗研究的潜能；同时,携带CRISPR/Cas9系统的Ad5F35型腺病毒载体，可用于靶向编辑原代淋巴细胞内的其它基因，或者用于其它造血系细胞的基因编辑研究。

附图说明

图1是携带CRISPR/Cas9系统的Ad5F35腺病毒载体图谱；

图2是T7EI酶切法检测不同sgRNA编辑TZM-bl细胞的CCR5基因组位点的切割效率；

图3是流式细胞术检测含有不同sgRNA的CRISPR/Cas9系统编辑TZM-bl细胞的CCR5基因组位点后，细胞表面的CCR5表达水平；

图4是T7EI酶切法检测sgR5-5、sgR5-8的脱靶效应；

图5是携带CRISPR/Cas9的Ad5F35腺病毒转导人原代CD4⁺T淋巴细胞后，T7EI酶切法检测CCR5基因组位点的编辑效率；

图6是携带CRISPR/Cas9的Ad5F35腺病毒转导人原代CD4⁺T淋巴细胞后，流式细胞术分离阳性转导细胞，添加HIV-1病毒感染，检测病毒复制水平。

具体实施方式

下面结合附图和实例详细说明：

实例一、携带CRISPR/Cas9的Ad5F35嵌合型腺病毒制备方法

1、sgRNA设计与筛选

1)以CCR5ORF为模板，利用在线工具设计sgRNA序列，选取得分最高的前20条序列，并根据靶向位点，错配碱基数、错配位置等进行优化，得到8条sgRNA序列(sgR5-3至sgR5-10)；sgR5-1和sgR5-2是早期已经报道的两条序列，用做阳性对照；同时设计一条非靶向sgRNA(sgNeg)作为阴性对照。

sgRNA序列信息如表1所示：

表1：设计的sgRNA序列

名称	得分	序列(5’-3’)	位置	+/-链
					sgR5-1	69	GCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGG	268-287	+

sgR5-2	56	GGCAGCATAGTGAGCCCAGAAGG	254-273	-
					sgR5-3	95	TCAGTTTACACCCGATCCACTGG	1009-1028	+
sgR5-4	89	GTAAACTGAGCTTGCTCGCTCGG	998-1017	-
					sgR5-5	87	TCACTATGCTGCCGCCCAGTGGG	261-280	+
sgR5-6	86	TCTGAACTTCTCCCCGACAAAGG	896-915	-
					sgR5-7	87	TCATCCTCCTGACAATCGATAGG	356-375	+
sgR5-8	75	CAATGTGTCAACTCTTGACAGGG	296-315	+
					sgR5-9	81	CATCATCTATGCCTTTGTCGGGG	882-901	+
sgR5-10	77	ATAATTGCAGTAGCTCTAACAGG	800-819	+
					sgNeg	None	ATCGTTTCCGCTTAACGGCG	None	None

2)合成sgRNA序列，并连接构建至pLentiCRISPR.v2(Addgene)，测序验证，将pLentiCRISPR.v2与包装质粒共转染HEK293T细胞，48小时(h)后收集转染后上清，包装慢病毒，在HEK293T细胞水平检测病毒滴度。

3)铺板TZM-bl(NIH AIDS Research&Reference Reagent Program,Divisionof AIDS,NIH)，在Polybrene存在下，加入LentiCRISPR.v2慢病毒(MOI＝0.3)感染，感染后24h，加入Puromycin 2-3天，去除未转导细胞，继续培养至感染后7天。

4)收集各组细胞，提取基因组DNA(Qiagen)，扩增含CCR5ORF的片段，引物：

CCR5-F(SEQ ID NO：5)：5’-ATGCACAGGGTGGAACAAGATGG-3’

CCR5-R(SEQ ID NO：6)：5’-TGCCAAATAAATGGATGAATCTTAGACC-3’

回收PCR产物，T7EI酶切法检测编辑效率，结果如图2。

同时采用流式细胞术检测细胞表面CCR5表达，结果见图3。

图2结果显示效率最高的2条导向序列分别为：sgR5-5和sgR5-8，均可在TZM-bl细胞的CCR5基因座位置引入60％以上的插入和删除(Indels)，下游实验选择这两条序列开展。阴性对照sgNeg不产生Indels。图3与图2结果基本对应。

5)设计引物，扩增sgR5-5和sgR5-8各自在人全基因组水平得分最高的15个脱靶位点(表2)，T7EI酶切法检测脱靶情况，结果如图4所示，表明在检测的这些位点中，均未出现显著的脱靶编辑，说明sgR5-5和sgR5-8特异性良好。

表2：sgR5-5和sgR5-8在人全基因组中得分最高的15个潜在脱靶位点

名称	序列(5’-3’)	得分	不匹配数	基因座
					On target	TCACTATGCTGCCGCCCAGTGGG	87	0MMs	chr3:+46373163
OTE-55-1	GCAAGTTGCTGCCGCCCAGTGGG	0.8	4MMs[1:4:5:6]	chr20:+37102051
					OTE-55-2	CCACTATACACCCGCCCAGTCAG	0.7	4MMs[1:8:10:11]	chr16:+17377802
OTE-55-3	TGAATATCCTGTCGCCCAGTCAG	0.7	4MMs[2:4:8:12]	chr2:+65541461
					OTE-55-4	CCAGGATGCTGCAGCCCAGTGGG	0.6	4MMs[1:4:5:13]	chr3:-53110167
OTE-55-5	CCCCAATGCTGCAGCCCAGTGAG	0.6	4MMs[1:3:5:13]	chr8:-142638674
					OTE-55-6	TCTGTATTCTGCAGCCCAGTGGG	0.6	4MMs[3:4:8:13]	chr10:-129722977
OTE-55-7	TCACCAGGCTGCCGGCCAGTTGG	0.5	3MMs[5:7:15]	chrX:-106847184
					OTE-55-8	ACACAGTGCTGACGCCCAGTAGG	0.4	4MMs[1:5:6:12]	chr8:-1379557
OTE-55-9	CCATTGTGCTGCCGCCCAGCCAG	0.4	4MMs[1:4:6:20]	chr16:+34381272
					OTE-55-10	TCACTCTTCCCCCGCCCAGTGAG	0.4	4MMs[6:8:10:11]	chr16:-30832681
OTE-55-11	CCAGTATGCTTCCGCCCAGATAG	0.4	4MMs[1:4:11:20]	chr11:-17577563
					OTE-55-12	TCTCTGTGCAGCCGCCCAGCCAG	0.4	4MMs[3:6:10:20]	chr16:+56385941
OTE-55-13	CCACCCTGCTGCTGCCCAGTGGG	0.4	4MMs[1:5:6:13]	chr17:+29798753
					OTE-55-14	TCGCTATTTTGCAGCCCAGTAGG	0.3	4MMs[3:8:9:13]	chr19:+10569898
OTE-55-15	TCACTATGGTGCAGCCCAGGGAG	0.3	3MMs[9:13:20]	chr1:-7721531
					On target	CAATGTGTCAACTCTTGACAGGG	75	0MMs	chr3:+46373198
OTE-58-1	TAAAGTGGCTACTCTTGACATAG	1.3	4MMs[1:4:8:10]	chr8:-113389299
					OTE-58-2	AAATGTGTGAACTCTTGACCTAG	0.9	3MMs[1:9:20]	chr3:+28183981
OTE-58-3	CCATGTTGCCACTCTTGACAAAG	0.9	4MMs[2:7:8:10]	chr9:+116710242
					OTE-58-4	CACAGTATCTACTCTTGACATGG	0.9	4MMs[3:4:7:10]	chr5:-149400725
OTE-58-5	CAGAGTGTCAACTCCTGACAGAG	0.8	3MMs[3:4:15]	chr4:-30918664
					OTE-58-6	AAATGTGGCCTCTCTTGACAAAG	0.7	4MMs[1:8:10:11]	chr3:+28907164
OTE-58-7	TAATTTGCCAAGTCTTGACATGG	0.7	4MMs[1:5:8:12]	chr1:-118255933
					OTE-58-8	CAATCTGCCTTCTCTTGACACAG	0.7	4MMs[5:8:10:11]	chr2:+1924183
OTE-58-9	CTACTTGTCAACTCTTGACTCAG	0.7	4MMs[2:4:5:20]	chr5:-42465271

OTE-58-10	CAAATTGCCAAGTCTTGACACAG	0.7	4MMs[4:5:8:12]	chr2:-115905509
					OTE-58-11	CCAAGTGCCAACTCTTCACATAG	0.6	4MMs[2:4:8:17]	chr3:-82206064
OTE-58-12	TAATGTCAAAACTCTTGACACGG	0.6	4MMs[1:7:8:9]	chr3:+175729801
					OTE-58-13	CTATGTTTCAACTCCTGACAAGG	0.6	3MMs[2:7:15]	chr5:-12801231
OTE-58-14	GAATGTTTATACTCTTGACAAAG	0.5	4MMs[1:7:9:10]	chr4:+87759227
					OTE-58-15	CACTATATCATCTCTTGACACAG	0.5	4MMs[3:5:7:11]	chr2:-211679347

2、表达CRISPR/Cas9的Ad5F35腺病毒载体构建

1)用引物V2_GFP_F1与V2_GFP_R1从pLentiCRISPR.v2扩增片段1，用引物V2_GFP_F2与V2_GFP_R2从pLL3.7扩增片段2，使用重叠延伸PCR连接片段1和2，回收后连回pLentiCRISPR.v2得到pLentiCRISPR.EGFP，用该载体构建sgR5-5、sgR5-8和sgNeg表达克隆。

V2_GFP_F1(SEQ ID NO：7)：5’-TGACGATAAGGGATCCGGCGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’

V2_GFP_R1(SEQ ID NO：8)：5’-TTAACGCGTCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’

V2_GFP_F2(SEQ ID NO：9)：5’-AAGTAGACGCGTTAAGTCGACAATCAACCTCTGG-3’

V2_GFP_R2(SEQ ID NO：10)：5’-CTGATCAGCGGGTTTAAACGGGCCCTGCTAG-3’

2)以pShuttle-CMV为模板，用引物Shuttle_CMV_F与Shuttle_CMV_R做PCR，回收产物连回pShuttle-CMV，构建pShuttle-MCS。

Shuttle_CMV_F(SEQ ID NO：11)：

5’-TTATTGATGATGTTAATTAACATGCATGGATCCATATG-3’

Shuttle_CMV_R(SEQ ID NO：12)：

5’-GCGGCCGCGTCGACGGTACCCAGTATTACGCGCTATGAG-3’

3)以pLentiCRISPR.v2.EGFP.sgRNA为模板，用引物CRISPR_pShu_F与CRISPR_pShu_R做PCR，产物连接至pShuttle-MCS多克隆位点，得到pShuttle.gCas9；

CRISPR_pShu_F(SEQ ID NO：13)：

5’-AGCGCGTAATACTGGGTACCGAGAGGGCCTATTTCCCATG-3’

CRISPR_pShu_R(SEQ ID NO：14)：

5’-TCCGGTGGATCGGATCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’

4)以pLentiCRISPR.v2.EGFP为模板，用引物GFP_pShu_F1与GFP_pShu_R1扩增片段3；用引物GFP_pShu_F2与GFP_pShu_R1扩增片段4；使用重叠延伸PCR连接片段3与片段4，回收后将产物连接至pShuttle-MCS多克隆位点，得到pShuttle.EGFP；

GFP_pShu_F1(SEQ ID NO：15)：

5’-AGCGCGTAATACTGGGTACCTCGAGTGGCTCCGGTGCCCGTCAG-3’

GFP_pShu_R1(SEQ ID NO：16)：

5’-CCTTGCTCACCATGGTGGCGGATCCCGCGTCAC-3’

GFP_pShu_F2(SEQ ID NO：17)：5’-CCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’

GFP_pShu_R2(SEQ ID NO：18)：

5’-TCCGGTGGATCGGATCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’

5)用引物Ad5F35_F1与Ad5F35_R1从pAdeasy-1(Addgene)扩增片段5；用引物Ad5F35_F2与Ad5F35_R2从pWE15E3GFPF35扩增片段6；用引物Ad5F35_F3与Ad5F35_R3从pAdeasy-1扩增片段7；使用重叠延伸PCR连接片段5、片段6与片段7，连回pAdeasy-1得到pAd5F35。

Ad5F35_F1(SEQ ID NO：19)：5’-ACTCTTAAGGACTAGTTTCGCGCC-3’

Ad5F35_R1(SEQ ID NO：20)：

5’-GTAAGAACTCCAGGGGGACTCTCTTGAAACCCATT-3’

Ad5F35_F2(SEQ ID NO：21)：5’-AATGGGTTTCAAGAGAGTCCCCCTGGAGTTCTTACTT

TAAAATGTTTAACCCCA-3’

Ad5F35_R2(SEQ ID NO：22)：5’-CATAACACAAACGATTCTTTATTCTTGGGCATTTTAG

TTGTCGTCTTCTGTAATGTAAG-3’

Ad5F35_F3(SEQ ID NO：23)：5’-GCCCAAGAATAAAGAATCGTTTGTGTTATG-3’

Ad5F35_R3(SEQ ID NO：24)：

5’-GATCCATGCATGTTAATTAACATCATCAATAATATACC-3’

6)使用穿梭质粒和骨架质粒电转染BJ5183，挑单克隆，Pac I酶切鉴定，得到重组腺病毒载体pAd5F35.EGFP及pAd5F35.g^5/8/NCas9。

7)大提质粒，进一步做酶切图谱分析，-20℃保存待用。

3、Ad5F35腺病毒包装与验证

1)转染前16-24h，铺HEK293细胞于6孔板中，使转染时细胞密度为50-70％。每孔转染3μg Pac I线性化处理后的重组腺病毒载体，使用6μL Lipofectamine2000。转染后6h换成新鲜完全培养基。

2)37℃培养10-18天，直到形成明显空斑(CPE)，收集空斑，冻融4次，离心去除细胞沉淀，得第1代病毒，-80℃保存。

3)感染前24h，铺HEK293细胞，使感染时细胞密度为50-70％。加入第1代病毒，直至出现明显CPE，收集细胞，PBS重悬，冻融4次，离心去除细胞沉淀，得第二代病毒。重复扩增3-5轮，逐渐增加扩增规模，直至得到大量高浓度病毒。7000×g、10℃离心10min，进一步去除细胞碎片。

4)往14mL UltraClear无菌离心管中依次加入2.5mL 1.4g/cm³的CsCl溶液、2.5mL 1.25g/cm³的CsCl溶液、8.5mL病毒液、0.5mL矿物油，26,000rpm、10℃离心2h，穿刺离心管收集位于两种密度的CsCl溶液之间的条带。

5)在1.33g/cm3的单一CsCl溶液中，46,000rpm、4℃离心18h，采用相同方法，收集病毒条带，加入等体积2×腺病毒保存液，-80℃保存，或者通过PD-10脱盐柱，去除CsCl，分装后-80℃保存。

6)感染前24h，铺HEK293细胞，使感染时细胞密度为50-70％。梯度稀释浓缩的腺病毒，取适当稀释度感染细胞。48h后，根据GFP阳性细胞的数量，计算病毒滴度，Ad5F35.g^5/8/NCas9滴度平均约10¹⁰MOI/mL。

7)感染前24小时，铺HEK293细胞于6孔板，使感染时细胞密度为30-50％。感染时，分别加入各组Ad5F35重组腺病毒(MOI＝30)，感染2-3h，换新鲜培养基，继续培养2-3天，收集细胞，Western Blotting检测Cas9蛋白表达，转导Ad5F35.gCas9的细胞，可检测到显著Cas9蛋白表达；而未转导细胞或转导Ad5F35.EGFP的细胞，未检测到Cas9蛋白表达，验证包装的Ad5F35.gCas9携带Cas9蛋白。

8)感染前24小时，铺TZM-bl细胞于6孔板，使感染时细胞密度为30-50％。感染时，分别加入各组Ad5F35重组腺病毒(MOI＝30)，感染2-3h，换新鲜培养基，继续培养7天，收集细胞，提取基因组DNA，如实施例一中1、4)所述检测CCR5编辑情况，结果显示，Ad5F35.g⁵Cas9和Ad5F35.g⁸Cas9在CCR5的基因组所在位点均产生了超过40％的Indels，而Ad5F35.EGFP和Ad5F35.g^NCas9不产生显著Indels，证实重组腺病毒具有目的功能。

实例二、携带CRISPR/Cas9的Ad5F35腺病毒在抑制HIV-1感染中的应用

1、CD4⁺T淋巴细胞的分离与培养

1)静脉穿刺法采集健康志愿者外周血，添加抗凝剂，暂存于4℃，保存时间不超过8h。

2)往抗凝血中加入等体积PBS，混匀。往离心管中先后加入淋巴细胞分离液(平衡至室温)，约2倍体积的稀释后的抗凝血，800×g，22℃无刹车离心30min。

3)吸取第二层灰白色的淋巴细胞层，加入至少3倍体积的D-Hanks缓冲液(配方如下)，300×g、10℃离心10min。D-Hanks重复洗3～5次，得到PBMC。

D-Hanks缓冲液配方：

加入1L双蒸水溶解，高温灭菌，加入2mL 0.5g/mL D-葡萄糖溶液(0.2μm滤器过滤除菌)4℃保存待用。

4)使用磁珠阴性分选试剂盒(Miltenyi)，按操作说明书分离CD4⁺T淋巴细胞，用RMPI 1640完全培养基(含10％FBS、100mg/mL penicillin和100mg/mLstreptomycin)重悬细胞，浓度调整为5×10⁶个/mL，添加5μg/mL植物血凝素(Sigma)，100U/mL白介素2(IL-2,Peprotech)激活培养1天。

2、Ad5F35腺病毒转导与CCR5编辑效率检测

1)计数刺激培养后的CD4⁺T细胞，调整细胞浓度为5×10⁶个/mL，在24孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，30或100MOI重组腺病毒，补足培养基至200μL，于37℃培养箱中感染2h后，补加300μL培养基，继续感染4h。

2)离心去除未感染病毒，加入1mL PBS重悬细胞，离心，进一步去除残留的未感染病毒。随后加入500μL RMPI 1640完全培养基重悬细胞，补加20U/mLIL-2，在37℃、含5％CO₂的培养箱中继续培养8-10天。

3)采用流式细胞术检测转导效率，MOI＝30时，24.6％(n＝9)的细胞被阳性转导；当MOI＝100时，30.3％(n＝3)的细胞被阳性转导。以GFP表达设门，阳性转导的细胞，流式分选表达GFP的细胞(GFP⁺)，提取基因组，如实施例一中1、4)所述检测CCR5编辑情况，结果如图5所示，Ad5F35.g⁵Cas9和Ad5F35.g⁸Cas9在CCR5的基因组位点均产生了超过30％的Indels，而Ad5F35.EGFP和Ad5F35.g^NCas9不产生显著Indels。进一步的流式细胞术结果显示，Ad5F35.g⁵Cas9和Ad5F35.g⁸Cas9有效敲除了细胞表面的CCR5表达。

3、HIV-1病毒感染编辑后的CD4⁺T淋巴细胞

1)HIV-1包装与滴度测定：转染前16-20h，铺HEK293T于6孔板中，使转染时细胞密度为80-90％。每孔转染2μg pNL4-3BaL⁺(NIH AIDS Research&Reference Reagent Program,Division of AIDS,NIH)，使用4μL Lipofectamine2000。转染后4-6h换成新鲜完全培养基，转染后48h收集培养基上清，额外添加10％FBS(终浓度20％)，分装，-80℃保存。按p24ELISA(Beckman Coulter)操作说明书测定病毒滴度。

2)采用流式细胞术，分离GFP⁺阳性转导的CD4⁺T淋巴细胞，在96孔板中，每孔加入2×10⁵个细胞及对应量的HIV-1_BaL病毒(2ng或10ng p24)，培养基终体积为50μL，37℃孵育。感染2-3h后，用PBS洗4-5遍，去除未结合病毒，随后用200μL RPMI 1640完全培养基重悬(含有20U/mL IL-2)。

3)感染后1、4、7、11天，分别收集1/2体积的培养基上清，并补充等体积的新鲜培养基。收集的上清样品，添加1/10体积的10％Triton X-100，裂解后-80℃保存。收完所样品后，p24ELISA检测p24蛋白含量。使用2ng p24的病毒量的实验结果如图6所示，Ad5F35.g⁵Cas9和Ad5F35.g⁸Cas9编辑CCR5表达后，HIV-1_BaL复制水平大幅下降。

Claims

1.一种表达CRISPR/Cas9系统且可靶向CCR5的Ad5F35型腺病毒载体，其特征在于：

①表达Cas9核酸酶；

③表达载体骨架为改造而来的Ad5F35嵌合型腺病毒载体；

④表达载体特征性图谱如图1所示。

2.权利要求1所述的Ad5F35型腺病毒载体的制备方法,其特征在于：

①sgRNA设计与筛选

根据sgRNA的设计原则：5’-N(20)-NGG-3’，在CCR5的全长开放阅读框内，搜索所有可能的sgRNA，根据综合评分、脱靶情况，选择sgRNA，构建sgRNA表达克隆，在细胞系水平验证sgRNA编辑CCR5的效率及脱靶效应，选取效率最高、特异性好的两条序列包装腺病毒；

②表达CRISPR/Cas9的Ad5F35腺病毒载体构建

设计与构建表达绿色荧光蛋白标签的CRISPR/Cas9表达载体，随后对腺病毒系统的穿梭载体进行改造，去除多余启动子序列，并将含有标签蛋白的CRISPR/Cas9元件克隆至穿梭载体中；

③Ad5F35腺病毒包装与验证

3.权利要求2所述方法的应用,其特征在于：

①CD4⁺ T淋巴细胞的分离与培养

从人新鲜外周血中，分离人外周血淋巴细胞，使用磁珠阴性分选法分离人原代CD4⁺ T淋巴细胞，添加植物血凝素激活培养；

②Ad5F35腺病毒转导与CCR5编辑效率检测

加入制备的Ad5F35重组腺病毒，转导激活培养后的CD4⁺ T淋巴细胞，转导后监测GFP表达情况及CCR5的基因编辑效率；

③HIV-1病毒感染编辑后的CD4⁺ T淋巴细胞

采用流式分选技术，分离阳性转导的CD4⁺ T淋巴细胞，加入HIV-1病毒感染，检测病毒复制水平变化。