CN107586777A

CN107586777A - 人PDCD1基因sgRNA的用途及其相关药物

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Publication number: CN107586777A
Application number: CN201610532386.XA
Authority: CN
Inventors: 曹跃琼; 袁纪军; 朱向莹; 王庆亮; 陈思; 白雪
Original assignee: Shanghai Jibi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Jibi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-07-08
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2018-01-16

Abstract

本发明设计了针对人PDCD1基因的131个CRISPR/Cas9靶点序列，构建相应的PDCD1 CAS9‑sgRNA载体，其中的CAS9‑sgRNA载体Lenti‑CAS9‑sgRNA‑EGFP能够显著下调PDCD1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒（lentivirus，简写为Lv）作为基因操作工具携带CAS9‑sgRNA载体Lenti‑CAS9‑sgRNA‑EGFP能够靶向地将针对PDCD1基因的sgRNA序列高效导入T细胞，降低T细胞中PDCD1基因的表达水平，显著抑制细胞中PDCD1的表达，提高T细胞活性。

Description

人PDCD1基因sgRNA的用途及其相关药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人PDCD1基因sgRNA的用途及其相关药物。

背景技术

PD-1(CD297、PDCD1)是B7-CD28家族的成员之一，在激活后的T细胞、B细胞、单核细胞和自然杀伤T细胞中表达(Keir,M.E.,M.J.Butte,G.J.Freeman,andA.H.Sharpe.2008.PD-1and its ligands in tolerance andimmunity.Annu.Rev.Immunol.26:677–704.)。PD-1有两种已知配体，分别为PD-L1(B7-H1)(Dong,H.,G.Zhu,K.Tamada,and L.Chen.1999.B7-H1,a third member of the B7family,costimulates T-cell proliferation and interleukin-10secretion.Nat.Med.5:1365–1369.)和PD-L2(B7-DC)(Latchman,Y.,C.R.Wood,T.Chernova,D.Chaudhary,M.Borde,I.Chernova,et al.2001.PD-L2is a second ligand for PD-1 and inhibits T cellactivation.Nat.Immunol.2:261–268.)。这两种受体都在APCs细胞中表达。另外，PD-L1也在一些血液细胞中表达。当PD-L1或PD-L2与PD-1结合时，T细胞受体信号通路被抑制，抑凋亡因子表达下调，p15表达增加使细胞停滞在G1期，SKP2的表达下调。(Patsoukis,N.,J.Brown,V.Petkova,F.Liu,L.Li,and V.A.Boussiotis.2012.Selective effects of PD-1on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle andinhibit T cell proliferation.Sci.Signal.5:46.)PD-L1在非血液细胞的表达可以抑制免疫系统介导的组织损伤。

CRISPR/CAS9技术是近年来兴起的基因编辑操作工具。将CAS9蛋白和sgRNA在细胞内表达后，CAS9和sgRNA组成RNA-protein复合体(RNP)。其中sgRNA通过RNA-DNA碱基互补配对原则，将此RNP定位到基因组的特定位置，这时，CAS9将发挥其核酸内切酶的特性，在碱基互补配对的位置上对基因组进行切割，形成DNA双链断裂。在没有模板的情况下，细胞采用无模板介导的修复机制(nonhomologous end-joining,NHEJ)对基因组进行修复，随机引入碱基的缺失或增加，使读码框(ORF)发生移位，从而起到将原有基因进行完全敲除的效果。研究表明，长度为20nt的sgRNA序列能够起到将目的基因敲除的作用，在疾病的机制研究和治疗应用中具有重大前景(Fraietta I,Gasparri F.2016.The development of high-content screening(HCS)technology and its importance to drug discovery.ExpertOpin Drug Discov.11(5):501-14.)。

能够有效提高T细胞的活力，减少肿瘤细胞自身PD-L1对T细胞的抑制作用，增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，是亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含：单链RNA，所述单链RNA中含有能够在严紧条件下与PDCD1基因杂交的核苷酸序列。

优选地，所述PDCD1基因来源于人。

更进一步地，所述单链RNA的序列与PDCD1基因中的靶序列基本相同。

优选地，所述PDCD1基因中的靶序列选自如SEQ ID NO：1～131所示之任一序列或如SEQ ID NO：1～131所示之任一序列经过取代、缺失或添加一个或几个碱基序列且具有与如SEQ ID NO：1～131所示之任一序列相同活性的序列。

优选地，所述经过取代、缺失或添加一个或几个碱基序列具体是指在如SEQ IDNO：1～131所示之任一序列的5’端增加或减少5个以下碱基，或在序列中突变少于3个碱基，或既有碱基的加减也有碱基突变。

进一步地，所述单链RNA为小向导RNA(sgRNA)。更进一步地，所述小向导RNA的序列如SEQ ID NO：399～529任一序列所示。

将所述sgRNA和CAS9蛋白在细胞内表达后，CAS9和sgRNA组成RNA-protein复合体(RNP)。其中所述sgRNA通过RNA-DNA碱基互补配对原则，将此RNP定位到PDCD1基因的特定位置，这时，CAS9将发挥其核酸内切酶的特性，在碱基互补配对的位置上对PDCD1基因进行切割，形成DNA双链断裂。进而，特异性敲除细胞内源性PDCD1基因表达。

本发明的第二方面，公开了一种PDCD1基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子的基因片段，能表达所述sgRNA。

所述的人PDCD1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人PDCD1基因sgRNA的基因片段克隆入已知载体获得。

进一步地，所述PDCD1基因干扰核酸构建体选自病毒载体或质粒载体。

更进一步地，所述PDCD1基因干扰核酸构建体选自PDCD1基因干扰慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、AAV。

本发明的PDCD1基因干扰慢病毒载体是将编码前述PDCD1基因sgRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述PDCD1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而通过转录、通过酶切加工等步骤，最终获得所述sgRNA，用于特异性沉默PDCD1基因的表达。

进一步的，所述PDCD1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。

进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

本发明实施例具体列举了以Lenti-CAS9-sgRNA-EGFP为载体构建的人PDCD1基因干扰慢病毒载体。

本发明的PDCD1基因sgRNA可用于敲低T胞的PDCD1，进一步地可以用作提高T细胞活性的促进剂。PDCD1基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述PDCD1基因sgRNA。当用作提高T细胞活性的促进剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于免疫细胞。具体剂量还应考虑具体情况，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的第三方面，公开了一种PDCD1基因干扰慢病毒，由前述PDCD1基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染细胞并产生针对PDCD1基因的小向导RNA，从而抑制PDCD1的表达。该PDCD1基因干扰慢病毒可用于制备提高T细胞活性的促进剂。

本发明的第四方面，提供了前述分离的核酸分子，PDCD1基因干扰核酸构建体或PDCD1基因干扰慢病毒在制备T细胞活性促进剂中的用途。

优选地，所述T细胞活性的促进剂，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，PDCD1基因干扰核酸构建体和/或PDCD1基因干扰慢病毒中的一种或多种的组合。

优选地，所述T细胞活性的促进剂用于作用于T细胞，降低T细胞中PDCD1基因的表达，获得具有较高的杀伤力的高活性T细胞。所述高活性T细胞可通过CART，DC，CIK或DC-CIK等免疫治疗手段制备肿瘤治疗药物。

本发明的第五方面，公开了一种用于提高T细胞活性的促进剂，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，PDCD1基因干扰核酸构建体和/或PDCD1基因干扰慢病毒中的一种或多种的组合。

进一步的，所述促进剂含有1～99wt％所述分离的核酸分子、PDCD1基因干扰核酸构建体或PDCD1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在制备这些促进剂时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

本发明的第六方面，公开了一种提高T细胞活性的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子，PDCD1基因干扰核酸构建体，和/或所述的PDCD1基因干扰慢病毒。

本发明的第七方面，提供了一种提高T细胞活性的方法，为将前述分离的核酸分子，和/或PDCD1基因干扰核酸构建体，和/或所述的PDCD1基因干扰慢病毒施用于T细胞，降低T细胞中PDCD1基因的表达，从而提高T细胞的活性。

所述提高T细胞活性包括但不限于：增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

优选地，所述肿瘤细胞选自高表达PD1受体PD-L1的肿瘤细胞。

优选地，所述肿瘤选自胃癌、胸腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌。

所述的提高T细胞活性的方法可以是体内或体外的。

采用本发明的方法体外处理后活性提高的T细胞可被用于治疗的或非治疗目的。

本发明的第八方面，提供了一种T细胞，所述T细胞中含有所述分离的核酸分子，和/或PDCD1基因干扰核酸构建体，和/或所述的PDCD1基因干扰慢病毒。

所述T细胞可通过CAR-T技术用于治疗肿瘤或自身免疫疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明设计了针对人PDCD1基因的131个CRISPR/Cas9靶点序列，构建相应的PDCD1CAS9-sgRNA载体，其中的CAS9-sgRNA载体Lenti-CAS9-sgRNA-EGFP能够显著下调PDCD1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带CAS9-sgRNA载体Lenti-CAS9-sgRNA-EGFP能够靶向地将针对PDCD1基因的sgRNA序列高效导入T细胞，降低T细胞中PDCD1基因的表达水平，显著抑制细胞中PDCD1的表达，提高T细胞活性。

附图说明

图1：Lenti-CAS9-sgRNA-EGFP载体图谱。

图2：PDCD1-sgRNACRISPR/CAS9切割慢病毒载体侵染表达PDCD1的细胞株5天后，经错配酶法检测，PDCD1基因发生点突变。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1 针对人PDCD1基因CRISPR/CAS9慢病毒的制备

1.筛选针对人PDCD1基因的有效的sgRNA靶点

从Genbank调取PDCD1(Gene ID：5133)基因信息；设计针对PDCD1基因的有效的sgRNA靶点。表1列出了其中131条针对PDCD1基因的有效sgRNA靶点序列。

表1靶向于人PDCD1基因的sgRNA靶点序列

2.慢病毒载体的制备

分别针对sgRNA靶点(以SEQ ID NO：1～131为例)合成两端含Bmsb I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表2)；以Bmsb I归位内切酶作用于Lenti-CAS9-sgRNA-EGFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2两端含Bmsb I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应3h或过夜)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中CRISPR/CAS9序列的上下游，设计通用PCR引物，上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO：396)；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO：397)，进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的分别针对SEQ ID NO：1～131的表达CRISPR/CAS9的载体，分别命名为：Lenti-CAS9-sgRNA(1～131)-EGFP。

构建Lenti-CAS9-Scr-sgRNA-EGFP阴性对照质粒，阴性对照sgRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO：398)。构建Lenti-CAS9-Scr-sgRNA-EGFP阴性对照质粒时，针对Scr sgRNA靶点合成两端含Bmsb I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同Lenti-CAS9-sgRNA(1～131)-EGFP。

表3两端含Bmsb I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示，37℃，反应1h)的载体。

表4 Lenti-CAS9-sgRNA-EGFP质粒酶切反应体系

表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系

表6-1 PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		10×buffer	2.0
dNTPs(2.5mM)	0.8
		上游引物	0.4
下游引物	0.4
		Taq聚合酶	0.2
模板	1.0
		ddH₂O	15.2
Total	20.0

表6-2 PCR反应体系程序设定

3.包装PDCD1-sgRNA慢病毒

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒分别提取CRISPR/CAS9质粒Lenti-CAS9-sgRNA(1～131)-EGFP的DNA，配制成100ng/μl储存液。

转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。

将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。

病毒浓缩液中能够表达得到的sgRNA的序列如表6-3所示。

表6-3

对照慢病毒的包装过程同PDCD1-sgRNA慢病毒，仅以Lenti-CAS9-Scr-sgRNA-EGFP载体代替Lenti-CAS9-sgRNA(1～131)-EGFP载体。

实施例2 错配酶法检测PDCD1基因的敲除效率

首先，构建稳定表达PDCD1的293T，具体方法如下：

处于对数生长期的293T进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI:1)值，加入适宜量的稳定表达PDCD1同时表达嘌呤霉素抗性基因(嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC))的慢病毒，40小时后，在培养基中加入1ug/ml的嘌呤霉素，继续培养3天，通过免疫荧光印迹的方法确定此293T细胞能够稳定表达PDCD1基因。

处于对数生长期的稳定表达PDCD1的293T进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI:1)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据天根公司的基因组抽提操作说明书，抽提总基因组。

采用PCR仪进行修饰位点附近PCR，保证总条带大小为500bp±200bp，且靶位点处于PCR片段中段位置，保证错配酶法切割后条带经过琼脂糖可区分。采用吉凯基因的基因组活性检测试剂盒进行PCR反应和活性检测。

各靶序列对应的引物序列及若CAS9发挥作用，错配酶法得到的切割大小见下表所示：

按表7中的比例配置反应体系。

表7 PCR反应体系

PCR反应程序设置：

结束后，取5μl进行电泳检测，要求目的片段明亮且单一。之后直接对PCR产物进行纯化，最后使用纯水进行洗脱，并且使用Nanodrop进行浓度的测定。

在灭菌PCR管中配制如下反应体系，酶切筛选活性sgRNA

45℃反应20min后立即向上述10μl体系内加入2μl Stop Buffer，随后将全部样品进行2％琼脂糖凝胶电泳检测或置于-20℃保存。

实验结果展示针对SEQ NO为1到21的sgRNA(图2)，PDCD1的基因组受到了明显修饰。所有的sgRNA活性统计如下表：

实施例3 慢病毒感染T淋巴细胞制备PDCD1敲除的T细胞

感染实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行。简述感染步骤如下：

1.外周血单核淋巴细胞(PBMC)的获得，通过血液单采系统获得>1x107的细胞。

2.抗人CD3/CD28抗体包被细胞培养皿。

用PBS稀释抗人CD3及抗人CD28抗体，终浓度为1ug/ml，向细胞培养皿中加入稀释后的抗体混合液，使其铺满培养皿，室温孵育2小时。2小时后用PBS洗一次，备用。

3.对T淋巴细胞进行激活处理

将分离的PBMC用T淋巴细胞培养液(TexMACS培养基+10％FBS+30IU/重组人IL-2)进行重悬，使终浓度为1*10⁶个细胞/ml，并放入2步骤中处理过的培养皿中培养，培养条件为37℃+5％CO₂，培养时间为24小时。

4.对激活的T淋巴细胞进行感染

1)培养板处理。

取1mg/ml CD3及0.5mg/ml的CD28抗体按1:1000体积比稀释至适量的PBS缓冲液中，并取retronectin试剂，按1:40体积比稀释至该PBS缓冲液中，混匀后均匀铺至细胞皿，室温孵育2小时。2小时后用PBS进行洗涤并待用。

2)慢病毒感染T淋巴细胞及T淋巴细胞维持

用完全培养基稀释已激活的T淋巴细胞，并按MOI＝3加入实施例1中包被的慢病毒或对照慢病毒，并混匀。均匀铺在1)中所处理的培养皿中。

感染后监测细胞密度，使细胞维持在1*10⁶个细胞/ml，5天后，使用实施例2中同样的错配酶法检测PDCD1基因在T细胞中的敲除活性。

实施例4 LDH细胞裂解实验证明PDCD1敲除后的T细胞对PDL1高表达的肿瘤细胞杀伤力增强

为验证PDCD1敲除的T细胞对PDL1高表达的肿瘤的细胞杀伤作用，本研究采用PDCD1高表达的细胞作为靶细胞。试剂盒采用Cytotox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega)，该方法原理为，用细胞内稳定表达且不分泌的乳酸脱氢酶(LDH)，代替传统的放射性元素，当细胞发生凋亡时，LDH会释放到胞外，通过检测被LDH氧化的formazan含量来判断上清中酶含量，从而说明细胞凋亡水平。效应细胞分别采用PDCD1被敲除或未被敲除的T细胞，效靶比分别采用1:2、1:5、1:10、1:20、1:30。靶细胞数量为10000个/孔，各组设置3个附孔，检测时间为作用后4小时。

其中，各实验组及对照组设置如下：

实验组：不同效靶比的CAR-T细胞及不同种靶细胞；

对照组一：各靶细胞LDH最大释放组；

对照组二：各靶细胞LDH自发释放组；

对照组三：效应细胞自发释放组；

具体实验方法参加试剂盒说明书。细胞毒性计算公式为：

特异性裂解＝(实验组-对照组2-对照组3)/(对照组1-对照组2)。

结果显示，PDCD1被敲除后的T细胞有更强的杀伤效果，而PDCD1未敲除的T细胞杀伤作用被抑制。

实施例5 细胞因子实验证明敲除后的T细胞对PDL1高表达的肿瘤细胞杀伤力增强

靶细胞为PDL1高表达的细胞，效应细胞为实施例4中提及的PDCD1敲除或未敲除的细胞，在CAR病毒感染后10天进行细胞因子分泌检测。

方法为：分别取1*10⁵个靶细胞与效应细胞进行1:1混合，混合于100ul RPMI 1640+2％FBS培养基中，在37℃5％CO₂培养箱中共孵育约16小时。16小时后200g离心5分钟，取上清液，检测上清液中细胞因子分泌水平。检测细胞因子含量用BD公司生产的HU TH1-TH2CBAKIT，其原理为，反应液中细胞因子可以与其对应Beads上的抗体结合，每种细胞因子所对应的Beads均带有不同强度的APC荧光标签，细胞因子与beads结合后，再用另一种PE荧光标记的抗体对结合于beads上的细胞因子进行标记，通过检测PE荧光强度来判断细胞因子含量，而通过区分APC荧光强度来区分不同细胞因子种类。本研究中检测IL-2、IFN-γ、TNF-α三种细胞因子分泌水平。具体检测方法参加该试剂盒说明书。检测结果通过FCAP Array v3软件进行分析。

结果表明，T细胞中PDCD1敲除后，IL-2、TNF-alpha、IFN-gamma等细胞因子均有很明显上升。表面PDCD1的敲除促进了T细胞对靶细胞的杀伤。

实施例6 小鼠动物体内实验证明敲除后的T细胞对PDL1高表达的肿瘤细胞杀伤力增强

对NCG小鼠(购于南京大学模式生物所)进行皮下注射PDCD1高表达的人源性肿瘤细胞，待平均瘤体积达到160-180mm3时，对模式动物进行瘤内注射效应细胞。

本研究所用效应细胞为PDCD1被敲低的T细胞，对照组为PDCD1未敲除的T细胞。注射前，将效应细胞用PBS洗两次，用PBS重悬至3E7/ml及1E8/ml两种浓度，分别记为低剂量组及高剂量组。每只小鼠瘤内注射30ul效应细胞/PBS。

本研究检测内容包括：

小鼠体重及瘤体积/3天/次；

小鼠外周血细胞因子检测/7天/次；

瘤体积结果如图所示，从注射PDCD1被敲除的T细胞第四天起，高剂量组瘤体积开始有下降趋势，而正常T细胞组及PBS组无瘤体积无下降趋势。这说明PDCD1敲除后的T细胞具有增强的抑癌作用。

外周血中细胞因子分泌趋势表明，注射PDCD1被敲除的T细胞可以在外周血中明显检测到多种人源细胞因子分泌(IL-2、TNF-alpha、IFN-gamma)，随着肿瘤体积减少，细胞因子分泌量也逐渐降低，而注射正常T细胞的小鼠外周血中细胞因子分泌并未明显上升，证明PDCD1的敲除对肿瘤细胞产生明显的激活效应。

实施例7 sgRNA靶点的变体也可对PDCD1进行有效敲除

根据表1中列出的PDCD1基因的有效的sgRNA靶点，在其5’端增加或减少5个以下碱基，或在序列中突变少于3个碱基(以sgRNA1为例，序列如下表)，或既有碱基的加减也有碱基突变，之后按照实施例1的方法包装慢病毒，按照实施例2的方法对这些序列的敲除效果进行验证，结果表明这些序列仍旧可以起到对PDCD1的敲除效果。

SEQ ID NO:1	ATGTGGAAGTCACGCCCGTT
			5'端增加碱基	CACATATGTGGAAGTCACGCCCGTT	SEQ ID NO:550
5'端减少碱基	GTGGAAGTCACGCCCGTT	SEQ ID NO:551
			碱基突变	ATGTGCAAGACACGCCCGTT	SEQ ID NO:552
碱基突变	CACATATGTGGAACTCTCGCCCGTT	SEQ ID NO:553
			碱基突变	CAT ATGTGGAAGTCACGCCCGTT	SEQ ID NO:554

Claims

1.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含：单链RNA，所述单链RNA中含有能够在严紧条件下与PDCD1基因杂交的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述PDCD1基因来源于人。

3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述单链RNA的序列与PDCD1基因中的靶序列基本相同。

4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述PDCD1基因中的靶序列选自如SEQ ID NO：1～131所示之任一序列或如SEQ ID NO：1～131所示之任一序列经过取代、缺失或添加一个或几个碱基序列且具有与如SEQ ID NO：1～131所示之任一序列相同活性的序列。

5.根据权利要求1～3任一权利要求所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述单链RNA为小向导RNA。

6.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述小向导RNA的序列如SEQID NO：399～529任一序列所示。

7.一种PDCD1基因干扰核酸构建体，含有编码如权利要求1～6任一权利要求所述分离的核酸分子中的基因片段，能表达所述核苷酸分子。

8.如权利要求7所述PDCD1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述PDCD1基因干扰核酸构建体选自病毒载体或质粒载体。

9.如权利要求8所述PDCD1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述PDCD1基因干扰核酸构建体选自慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、AAV。

10.如权利要求9所述PDCD1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述慢病毒载体选自：

pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、

pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、

pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、

pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、

pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、

pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、

pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

11.一种PDCD1基因干扰慢病毒，由权利要求7～10任一权利要求所述干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

12.如权利要求1～6任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求7～10任一权利要求所述PDCD1基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的PDCD1基因干扰慢病毒在制备T细胞活性促进剂中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述T细胞活性的促进剂用于作用于T细胞，降低T细胞中PDCD1基因的表达，获得具有较高的杀伤力的高活性T细胞，所述高活性T细胞可通过CART，DC，CIK或DC-CIK免疫治疗手段制备肿瘤或自身免疫疾病治疗药物。

14.一种T细胞活性促进剂，其有效物质含有如权利要求1-6任一权利要求所述的分离的核酸分子，和/或权利要求7-10任一权利要求所述PDCD1基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的PDCD1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

15.一种提高T细胞活性的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的权利要求1-6任一权利要求所述的分离的核酸分子，和/或权利要求7-10任一权利要求所述PDCD1基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的PDCD1基因干扰慢病毒。

16.一种提高T细胞活性的方法，为将如权利要求1-6任一权利要求所述的分离的核酸分子，和/或权利要求7-10任一权利要求所述PDCD1基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的PDCD1基因干扰慢病毒施用于T细胞，降低T细胞中PDCD1基因的表达，从而提高T细胞的活性。

17.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞中含有如权利要求1-6任一权利要求所述的分离的核酸分子，和/或权利要求7-10任一权利要求所述PDCD1基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的PDCD1基因干扰慢病毒。