CN113430202A - 一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、T细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA，所述sgRNA用来敲除PD1基因；所述sgRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。本发明所述针对人PD1基因的sgRNA靶点，转染到稳定表达PD1的293T细胞中，对PD1基因的敲除率为71.92‑90.97%；转染到T细胞中，对PD1基因的敲除率为58.26‑72.67%；本发明所述针对人PD1基因的sgRNA靶点，转染到T细胞中，得到Crispr‑PD1‑T细胞，对结肠癌细胞系LoVo均表现出显著的特异性细胞毒性作用并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强。

Description

一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、 T细胞
技术领域
本发明涉及一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、T细胞，属于基因工程技术领域。
背景技术
PD-1(程序性死亡受体1，programmed death 1) 蛋白属于免疫球蛋白超家族成员，可表达于活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞，以及CD4-CD8-胸腺细胞。PD-1有两个配体，即PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC），均为B7家族中的新成员。PD-1是免疫抑制性受体，与其配体PD-L1、PD-L2相互作用传递抑制性信号，在免疫应答中发挥负向调控作用。T细胞上的PD-1与肿瘤细胞中的PD-L1/ PD-L2的结合，可抑制活化的T细胞攻击肿瘤细胞，导致免疫系统不能发挥全部作用，使肿瘤细胞逃逸。
Crispr/Cas9技术是非常热门的基因编辑操作工具，目前华西医院已报道利用Crispr技术敲除T细胞中的PD1，具有安全无副作用的优势。目前用于设计sgRNA的网站有十多个，同一个基因设计出来的sgRNA序列多达数百个，其每个sgRNA导入细胞内后造成的敲除效率是不同的，需要筛选出敲除效率高的sgRNA。
CN103820454B专利虽然提供了180个PD1的sgRNA序列，但只给出了其中4个单sgRNA和4个双sgRNA的效果，对于其余sgRNA并没有验证其敲除效率。CN107586777A专利虽然也提供了131个sgRNA，但对于其效果只提供了sgRNA活性，没有涉及具体的敲除效率。
CN105671083B专利仅公开了一个sgRNA序列的效果，其余sgRNA序列具有的敲除效率是未知的。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、T细胞，实现以下发明目的：
筛选出高敲除率的sgRNA，提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案
一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA，所述sgRNA是敲除PD1基因的靶点；所述sgRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
含有所述sgRNA的质粒，将sgRNA序列构建到px458载体中，得到含有sgRNA的质粒。
含有所述sgRNA的T细胞，将含有sgRNA的质粒转染到T细胞中，得到含sgRNA的Crispr-PD1-T细胞。
所述Crispr-PD1-T细胞的制备方法如下：
步骤1、采集结肠癌患者外周血，分离出单个核细胞，将收集的单个核细胞用生理盐水清洗后，得到T细胞；收集的血浆经灭活、离心后，取上清，得到血浆上清。
步骤2、将T细胞加入KBM551培养基重悬细胞，使细胞密度保持在1×106个/mL，添加γ干扰素浓度为200 IU/mL，放入培养箱培养。
步骤3、γ干扰素作用24h后，添加CD3/CD28单抗和IL-2，浓度分别为50ng/mL和300IU/mL，培养48h后得到活化的T细胞。
步骤4、在6孔板中加入2mL/孔新鲜的含有300 IU/mL IL-2的KBM551培养基，置于37℃培养箱中预热，得到预热的培养基；收集活化的T细胞，取1.5×107个细胞，用0.3mL电转液重悬，加入6μg含有sgRNA的质粒混合均匀，选择电活化T细胞程序电转，电转完成后将细胞立即转移至预热的培养基中，放回37℃培养箱中继续培养。
步骤5、48h后，取细胞进行流式检测，检测电转的效率；取样计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和IL-2，使细胞的浓度维持在1×106个/mL，IL-2的浓度维持在300IU/mL，添加5Vol%的血浆上清。
步骤6、48h后进行细胞计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和IL-2，使细胞的浓度维持在1×106个/mL，IL-2的浓度维持在300IU/mL，补加5Vol%的血浆上清。
步骤7、48h后收集细胞，得到Crispr-PD1-T细胞。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
本发明所述针对人PD1基因的sgRNA靶点，转染到稳定表达PD1的293T细胞中，对PD1基因的敲除率为71.92-90.97%；转染到T细胞中，对PD1基因的敲除率为58.26-72.67%；
本发明所述针对人PD1基因的sgRNA靶点，转染到T细胞中，得到Crispr-PD1-T细胞，对结肠癌细胞系LoVo均表现出显著的特异性细胞毒性作用，效靶比为3:1时，Crispr-PD1-T细胞对结肠癌LoVo细胞系的杀伤效率为68-83%；效靶比为10:1时，Crispr-PD1-T细胞，对结肠癌LoVo细胞系的杀伤效率为77-95%；并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强；
本发明所述针对人PD1基因的sgRNA靶点，转染到T细胞中，得到Crispr-PD1-T细胞对BLAB/C小鼠肿瘤生长具有抑制作用，从第一次免疫起10天内，65.3-80%小鼠几乎触摸不到肿瘤；第一次免疫后10d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为59-330 mm3，第一次免疫后12d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为29-290 mm3，第一次免疫后15d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为7-225mm3。
附图说明
图1为293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光和流式图；
其中1a为293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图，1b为293T-PD1稳转细胞系的流式图；
图2为不同sgRNA转染293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图；
其中2a为sg1转染293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图；
2b为sg2转染293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图；
2c为sg3转染293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图；
2d为sg4转染293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图；
2e为sg5转染293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图；
2f为sg6转染293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图；
2g为sg7转染293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图；
2h为sg8转染293T-PD1稳转细胞系的免疫荧光图；
图3 为不同sgRNA转染293T-PD1稳转细胞系的T7EN1酶切图；
图4为本发明中Crispr-PD1-T细胞对结肠癌细胞系LoVo杀伤率图；
图5为本发明中实施例7免疫后不同天数小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值的折线图。
具体实施方式
实施例1:针对人PD1基因Crispr/Cas9载体的构建
1、筛选针对人PD1基因的有效sgRNA靶点
根据PD1的基因序列，设计针对PD1基因的有效的sgRNA靶点。
表1列出了其中8条针对PD1基因的有效sgRNA靶点序列。
表1 靶点PD1基因的sgRNA靶点序列
Figure 282589DEST_PATH_IMAGE001
2、重组px458载体的构建
本发明中选择的载体为px458载体（购自addgene），利用常规方法将表1中每个sgRNA序列分别构建到px458载体中，其重组载体名称按顺序从上到下为px458-PD1-sg1、px458-PD1-sg2、px458-PD1-sg3、px458-PD1-sg4、px458-PD1-sg5、px458-PD1-sg6、px458-PD1-sg7、px458-PD1-sg8。
本发明中，8个重组质粒采用氯化铯法进行质粒提纯与浓缩，使其浓度达到1µg/µL。
实施例2：构建稳定表达PD1基因的293T细胞
1、构建表达PD1蛋白的慢病毒
本发明中选择的慢病毒载体为CD513B（购自addgene，pCDH-CMV-Nluc-EF1α-
copRFP-T2A-Puro），将PD1基因编码区（GenBank：AY238517.1）全长序列委托北京博迈德基因技术有限公司合成全长序列，利用XbaI和EcoRI分别双酶切PD1基因和CD513B载体，回收酶切产物，利用T4 DNA将两者连接起来，形成含有PD1基因的CD513B载体，命名为CD513B-PD1，进行测序验证，正确后提取质粒，去除内毒素，本发明中提取的CD513B-PD1质粒浓度为600ng/µL。
2、利用293T细胞包装慢病毒
复苏293T细胞，传代3次后用于转染；六孔板中按6×105个细胞/孔进行接种，加入2mL 含有10Vol% FBS的DMEM培养基（均购自Gibco公司），为第二天的转染做准备。
转染前将六孔板中的培养基换成新的DMEM培养基，37℃温箱中培养1h；重组慢病毒质粒CD513B-PD1、与包装质粒psPAX2与pMD2.G按4:2:3质量比例混合后，加入60µLFuGENE HD（购自PROMEGA公司）转染试剂转染293T细胞，48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化和GFP的表达；72h后将含有病毒的细胞培养上清收集到离心管中，3500rpm/min离心10min，去除细胞碎片，4.5μm滤器过滤后以70000g，4℃离心2h，然后用100µL的PBS重悬，得到病毒悬液，分装后放入-80℃保存；病毒悬液中重组慢病毒CD513B-PD1的病毒滴度为3.2×108 TU/mL。
3、慢病毒感染293T细胞，并用嘌呤霉素筛选稳定表达PD1的293T细胞
六孔板内将复苏后293T细胞以6×105个/孔的密度铺板，加入2mL 含有10Vol%FBS的DMEM培养基孵育过夜，去除旧的培养基，加入MOI=5的含重组慢病毒CD513B-PD1的病毒悬液（步骤2制备的病毒悬液），并加入1.5mL的无血清DMEM培养基；病毒转导后6h，再添加1mL含10Vol% FBS的DMEM培养基到细胞培养板内，然后孵育过夜；病毒转导后48h，更换2mL新鲜的筛选培养基，继续培养；每2天替换新鲜配制的筛选培养基，每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及GFP表达的水平及所占比例；当GFP表达比率达到95%以上时（见图1），筛选成功，命名为293T-PD1，用PD1流式抗体来检测筛选后的293T细胞中PD1的表达率；本发明中，PD1的表达率为95.5%（见图1）。
上述筛选培养基为含有2µg/mL的嘌呤霉素、10Vol% FBS的DMEM培养基。
实施例3：PD1 sgRNA敲除效率的测定
将293T-PD1细胞以1×106个/孔的密度接种在六孔板内，孵育过夜。
将构建的8个不同的含PD1 sgRNA的重组px458载体分别取4μg，与10µl FuGENE HD转染试剂混合，加入DMEM培养基至100µl，静置15min形成复合物，将六孔板内的培养基吸掉，加入静置好的复合物，添加DMEM培养基至2mL，放在37℃、5%CO2的培养箱内培养6h，更换含有10Vol%FBS的DMEM培养基继续培养48h，荧光显微镜下观察转染情况（见图2），收集每组1孔细胞，利用FLAG流式抗体进行转染效率的测定；同时其余两孔细胞进行传代，传代后3天收集各组细胞，利用PD1流式抗体进行检测。
实验中设置两组对照组，对照组1是相同条件下培养的293T-PD1，对照组2是以空载px458转染293T-PD1；每组实验组设3个复孔，取其平均值。
本发明中，每组的转染率和PD1的表达效率如表2；根据敲除率公式，计算每组的敲除率；结果显示293T-PD1-px458-sg4的敲除率最高，达到90.97%；293T-PD1-px458-sg6的敲除率为71.92%；293T-PD1-px458-sg8的敲除率为84.78%。
Figure 793205DEST_PATH_IMAGE002
表2 实验组和对照组转染率、PD1表达率和敲除率
Figure 166417DEST_PATH_IMAGE003
实施例4：利用T7EN1酶切验证
(1)将实施例3收集的各组细胞利用博迈德的磁珠法基因组提取试剂盒提取DNA，用乙醇沉淀法纯化获得的PCR回收产物，利用表3中的引物扩增目的片段，其中sg5和sg7利用PD1-F2/R2引物扩增，其余的用PD1-F1/R1引物扩增。
(2)对于纯化的基因组DNA 的PCR产物，配制以下反应体系：
DNA（100ng/µL） 500ng；
10×T7EN buffer 2µL；
无核酸酶ddH2O 加至19µL；
总体积 19µL；
将反应体系混合，高速离心数秒，在95℃加热5分钟；退火，将解链后的PCR产物冷却至室温。
（3）每反应体系加入1µL浓度为2U/µL的T7核酸内切酶I，在37℃反应40分钟。
（4）在每个酶切反应体系中加入 2 μL 的10× loading buffer并混匀； 将一半的反应体系混合物加到含有2%琼脂糖胶的孔中，在TAE或TBE缓冲液中进行电泳。
结果见图3，sg1到sg8均有两条目的条带，其中sg4目的条带最亮（跑胶图中下面两条带是目的条带），与其敲除率相对应。表4为PCR扩增长度和相对应的酶切片段长度。
表3 扩增目的片段的引物
Figure 623944DEST_PATH_IMAGE004
表4 T7EN1酶切检测目的片段
Figure 237983DEST_PATH_IMAGE005
实施例5 Crispr-PD1-T细胞的制备
本实施例中对293T-PD1初筛得到的敲除率高的sg4、sg6、sg8进行验证，利用同一份外周血分离培养的免疫细胞进行电转，本次实验分为对照组和实验组，对照组有两组，一组为利用px458空载电转，一组为不进行电转的正常培养，实验组有三组，分别为px458-PD1-sg4、px458-PD1-sg6、px458-PD1-sg8。
1、采集结肠癌患者外周血，利用淋巴细胞分离液（购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司）分离出单个核细胞，将收集的单个核细胞用生理盐水清洗2遍，得到T细胞；收集的血浆56℃灭活30min后，3000rpm离心20min，取上清放置于4℃冰箱备用。
2、根据T细胞的计数结果加入KBM551培养基（购自Corning）重悬细胞，使细胞密度保持在1×106个/mL，添加γ干扰素浓度为200 IU/mL，放入培养箱培养。
3、γ干扰素作用24h后，添加CD3/CD28单抗（购自北京同立海源生物科技有限公司）和IL-2（购自江苏金丝利药业股份有限公司），浓度分别为50ng/mL和300 IU/mL，培养48h后，得到活化的T细胞培养液。
4、电转前准备工作，在6孔板中加入2mL/孔新鲜的含有300 IU/mL IL-2的KBM551培养基，置于37℃培养箱中预热；将电转液（购自LONZA的 P3 Primary Cell 4D X Kit L核转试剂盒，V4XP-3024）从4℃冰箱中拿出，取1.5mL电转液置于离心管中恢复至室温，剩余的电转液放回4℃冰箱；收集活化的T细胞，取7.5×107个细胞，用1.5mL电转液重悬，平均分为五份，其中一份直接添加到预热的6孔板中，剩余4份分别加入6μg的px458、px458-PD1-sg4、px458-PD1-sg6、px458-PD1-sg8混合均匀，每个电转杯中加入的T细胞数量为5×106个，每份需要3个电转杯。
将电转杯放入LONZA 4D电转仪中，选择电活化T细胞程序电转，电转完成后将细胞立即转移至预热的培养基中，放回37℃培养箱中继续培养。
5、48h后，取细胞进行流式检测，检测电转的效率；取样计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和IL-2，使细胞的浓度维持在1×106个/mL，IL-2的浓度维持在300IU/mL，添加5Vol%的血浆上清。
6、48h后进行细胞计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和IL-2，使细胞的浓度维持在1×106个/mL，IL-2的浓度维持在300IU/mL，补加5Vol%的血浆上清。
7、48h后收集细胞，对细胞进行计数、活率检测、支原体检测，利用流式细胞仪对各组细胞进行PD1蛋白表达检测，计算实验组的敲除率。
本发明中，PD1蛋白的表达率如表5所示，其中px458-PD1-sg4-T的敲除率最高，为72.67%，px458-PD1-sg6-T和px458-PD1-sg8-T的敲除率相近，分别为58.26%、60%。
Figure 716238DEST_PATH_IMAGE006
表5 各组实验中PD1蛋白的表达率
Figure 842326DEST_PATH_IMAGE007
实施例6 Crispr-PD1-T细胞对结肠癌LoVo细胞系的杀伤活性研究
体外毒性实验使用的材料如下：
以结肠癌细胞系LoVo作为靶细胞，效应细胞为如实施例5所制备的体外培养的Crispr-PD1-T细胞，分别为px458-PD1-sg4-T、px458-PD1-sg6-T、px458-PD1-sg8-T、px458-T、T细胞。
效靶比视情况分别为10:1、3:1、1:1和1:3，靶细胞数量为1×104个/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。检测时间为细胞混合后4 h。
其中各实验组和各对照组如下：
各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的T细胞，
对照组1：靶细胞最大释放LDH，需加入一定体积的细胞裂解液 ；
对照组2：靶细胞自发释放LDH；
对照组3：效应细胞自发释放LDH；
对照组4：空白培养基的背景；
对照组5：体积校准的背景 ，空白培养基加入一定体积的细胞裂解液。
检测方法：采用CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒（Promega公司）检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶（LDH）。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐（INT）转化为红色的甲臜（formazan），生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比（具体参照CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书）。
细胞毒性计算公式为：
Figure 306805DEST_PATH_IMAGE008
实验结果表明：
具体如图4和表6所示，本发明筛选制备的三种Crispr-PD1-T细胞对结肠癌细胞系LoVo均表现出显著的特异性细胞毒性作用，其中px458-PD1-sg4-T的细胞毒性作用要高于px458-PD1-sg6-T和px458-PD1-sg8-T的细胞毒性作用，效靶比为3:1时，对结肠癌LoVo细胞系的杀伤效率为68-83%；效靶比为10:1时，对结肠癌LoVo细胞系的杀伤效率为77-95%；并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强；其中px458-PD1-sg4-T在效靶比10:1时对结肠癌细胞LoVo的细胞毒性高达95％。
效靶比依赖性的数据进一步显示本发明的Crispr-PD1-T细胞对结肠癌细胞LoVo的特异性细胞毒性作用。
表6 Crispr-PD1-T细胞对结肠癌LoVo细胞系的杀伤效率
Figure 834738DEST_PATH_IMAGE009
实施例7：Crispr-PD1-T细胞对BLAB/C小鼠肿瘤生长抑制作用
18-22g雄性BLAB/C小鼠(购自沈阳蓝谱达斯实验用品科技有限公司)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50%±10%)，收集对数期的结肠癌LoVo细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至2×105个/mL。无菌条件下，小鼠左腋下接种0.2mL结肠癌LoVo细胞悬浮液，观察3-5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。
BLAB/C结肠癌模型小鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm3)随机分成6组，每组20只，开始注射治疗实验。
实验组分别为：
a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；
b.治疗一组，尾部静脉注射2×106个细胞/只正常T细胞；
c.治疗二组，尾部静脉注射2×106个细胞/只px458空载电转的T细胞；
d.治疗三组，尾部静脉注射2×106个细胞/只px458-PD1-sg4-T细胞；
e.治疗四组，尾部静脉注射2×106个细胞/只px458-PD1-sg6-T细胞；
f.治疗五组，尾部静脉注射2×106个细胞/只px458-PD1-sg8-T细胞。
每周免疫上述各组小鼠一次，连续免疫两周，每天通过游标卡尺量取各个实验组小鼠皮下肿瘤组织块大小，并记录，用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图，结果如图5和表7所示。
表7免疫后不同天数小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值
Figure 359261DEST_PATH_IMAGE010
图5和表7结果显示，治疗三、四、五组可以明显减少肿瘤组织的大小，第一次免疫后10d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为59-330 mm3，第一次免疫后12d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为29-290 mm3，第一次免疫后15d，小鼠皮下肿瘤组织的肿瘤均值为7-225mm3。
序列表
<110> 山东兴瑞生物科技有限公司
<120> 一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、T细胞
<130> 2021
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggccggctgg cctgggtgag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
cccaccccag cccctcaccc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ggctcctatt gtccctcgtg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
cgtgtcacac aactgcccaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cattccgcta ggaaagacaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
atgtggaagt cacgcccgtt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
atggggagct ggatttccag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
acatgagcgt ggtcagggcc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
ccaggatggt tcttagactc c 21
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
aatggtggca tactccgt 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
agcaaccaga cggacaag 18
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
cgacatcact ttcccagttt ac 22

Claims (4)

1.一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA，其特征在于：所述sgRNA是敲除PD1基因的靶点；所述sgRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。
2.含有权利要求1所述sgRNA的质粒，其特征在于：将sgRNA序列构建到px458载体中，得到含有sgRNA的质粒。
3.含有权利要求1所述sgRNA的T细胞，其特征在于：将含有sgRNA的质粒转染到T细胞中，得到含sgRNA的Crispr-PD1-T细胞。
4.根据权利要求3所述的T细胞，其特征在于：所述Crispr-PD1-T细胞的制备方法如下：
步骤1、采集结肠癌患者外周血，分离出单个核细胞，将收集的单个核细胞用生理盐水清洗后，得到T细胞；收集的血浆经灭活、离心后，取上清，得到血浆上清；
步骤2、将T细胞加入KBM551培养基重悬细胞，使细胞密度保持在1×106个/mL，添加γ干扰素浓度为200 IU/mL，放入培养箱培养；
步骤3、γ干扰素作用24h后，添加CD3/CD28单抗和IL-2，浓度分别为50ng/mL和300 IU/mL，培养48h后得到活化的T细胞；
步骤4、在6孔板中加入2mL/孔新鲜的含有300 IU/mL IL-2的KBM551培养基，置于37℃培养箱中预热，得到预热的培养基；收集活化的T细胞，取1.5×107个细胞，用0.3mL电转液重悬，加入6μg含有sgRNA的质粒混合均匀，选择电活化T细胞程序电转，电转完成后将细胞立即转移至预热的培养基中，放回37℃培养箱中继续培养；
步骤5、48h后，取细胞进行流式检测，检测电转的效率；取样计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和IL-2，使细胞的浓度维持在1×106个/mL，IL-2的浓度维持在300IU/mL，添加5Vol%的血浆上清；
步骤6、48h后进行细胞计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和IL-2，使细胞的浓度维持在1×106个/mL，IL-2的浓度维持在300IU/mL，补加5Vol%的血浆上清；
步骤7、48h后收集细胞，得到Crispr-PD1-T细胞。
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