CN107904282A - 检测pd‑1敲除的或低表达的t细胞对肿瘤细胞杀伤性的方法 - Google Patents

检测pd‑1敲除的或低表达的t细胞对肿瘤细胞杀伤性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测PD‑1敲除或低表达的T细胞对肿瘤细胞杀伤能力的方法，所述方法是通过构建稳定表达荧光素酶、绿色荧光蛋白和PD‑L1的肿瘤细胞系，然后应用化学发光酶标仪检测检测肿瘤细胞化学发光强度从而测定对肿瘤细胞杀伤能力。本发明所述检测方法，简单易操作，稳定性强，准确度高，为过继性免疫细胞治疗提供了良好的技术支持。

Description

检测PD-1敲除的或低表达的T细胞对肿瘤细胞杀伤性的方法
技术领域
本发明属于过继性免疫细胞治疗技术领域，更具体地，涉及了PD-1敲除或低表达的T细胞在肿瘤细胞治疗领域的检测和应用。
背景技术
PD-1分子属于B7家族成员，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1分子诱导性表达于活化的T细胞和B细胞，PD-1与其配体PD-L1相互作用后发挥免疫抑制作用，在机体免疫耐受维持、免疫应答调节中发挥重要作用。当机体感应到外来抗原时，会产生大量特异性T细胞。而细胞程序化死亡受体PD-1与其配体(PD-L1)结合，可以传导抑制性的信号，减低T细胞的增生。肿瘤细胞逃避T细胞摧毁的一种途径是通过在它表面产生PD-L1，当免疫细胞T细胞表面的PD-1识别PD-L1后，可以传导抑制性信号，T细胞就不能发现肿瘤细胞和向肿瘤细胞发出攻击信号。PD-1是通过解除肿瘤细胞逃避免疫系统的新型免疫疗法。
PD-1/PD-L1途径在自身免疫性疾病、慢性感染、肿瘤等疾病的病理过程中具有重要作用。多种肿瘤患者体内PD-1及PD-L1分子异常表达，可作为肿瘤诊断和预后的辅助指标。阻断PD-1/PD-L1途径已成为肿瘤免疫治疗的新手段。研究表明，阻断PD-1后，肿瘤位点的T细胞数及IFN-γ分泌增加，高免疫抑制性的髓源性抑制细胞群(MDSC)百分比减少，肿瘤微环境中效应细胞与抑制细胞比例增加，从而对肿瘤微环境动态改变、肿瘤生长控制发挥重要作用。
目前，进行PD-1敲除的阻断PD-1表达的T细胞临床试验已经在中国、美国等多个国家开展。中国华西医院已经开展了首次临床试验，研究人员使用CRISPR技术敲除肿瘤病人T细胞中的PD-1基因，随后再将这些编辑过的T细胞回输到病人体内。美国研究人员则打算先给T细胞嵌入一个肿瘤嵌合抗原受体基因，使之可以攻击肿瘤细胞，然后再用CRISPR敲除PD-1及另外两个基因。PD-1可以编码T细胞表面的一种“刹车”蛋白，是导致许多病人肿瘤细胞逃过免疫系统监视的罪魁祸首之一，一旦敲除这个基因，肿瘤细胞或将无处可逃。
体外进行检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用是免疫细胞治疗技术临床前研究的一项重要检测指标，也是免疫细胞治疗技术有效性实验的重要依据。现在检测免疫细胞治疗技术，包括PD-1敲除的T细胞技术对特定肿瘤的杀伤作用的方法，主要是通过CFSE标记肿瘤细胞，然后使用流失细胞技术和凋亡检测抗体标记肿瘤细胞的凋亡比例来确定对肿瘤细胞的杀伤作用。这种方法操作繁琐，整个过程包括CFSE标记、细胞共孵育、凋亡抗体标记、流失细胞技术检测等多个环节，技术要求条件高，而且操作步骤增多加大了对细胞的损伤，导致检测结果不够准确。因此寻求一个操作简单、检测结果准确的检测方法，是PD-1敲除或阻断的细胞治疗技术在临床前实验中急需解决的问题。
发明内容
为解决现有检测PD-1敲除或低表达的T细胞治疗技术中对肿瘤细胞杀伤性检测方法的缺陷或不足，本发明提供了一种新的简单便捷准确可靠的检测方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种检测PD-1敲除的或低表达的T细胞对肿瘤细胞杀伤能力的方法，包括以下步骤：
(1)对待检测的肿瘤细胞进行处理，得到稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的、高表达PD-L1的肿瘤细胞系；
(2)取正在培养的稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的肿瘤细胞系，用胰酶消化，终止消化后，离心重悬；
(3)设置检测组和对照组，检测组中，将PD-1基因敲除的或PD-1基因低表达的T细胞，加入到步骤(2)重悬后的肿瘤细胞系中，共孵育12-20个小时；对照组中，以PD-1基因未敲除的或PD-1基因高表达的T细胞，进行上述相同操作；
(4)孵育完成后，向加入荧光素底物，振荡混匀后，立即使用化学发光酶标仪检测肿瘤细胞的化学发光强度。
优选地，对待检测的肿瘤细胞，电转PGL4.51-luciferase-GFP质粒和Plenti-puro-PD-L1质粒，电转后得到稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的、高表达PD-L1的肿瘤细胞系。
优选地，所述荧光素酶为萤火虫荧光素酶，荧光素酶底物为D-荧光素钾盐。
优选地，步骤(3)中，所述PD-1基因敲除的或PD-1基因低表达的T细胞与重悬后的肿瘤细胞共培养中，效靶比为1:1—1:20。
为了检测效果可靠，准确，更优选地，步骤(3)中，设有三个检测组，其效靶比分别为1:1，1:10，1:20。
优选地，该方法还可以，巧妙地利用在酶标板中进行检测反应，经筛选发现，酶标板的每孔中检测1万个左右(本领域的技术人员，在实际操作中，能够明白1万个左右的含义，例如9500—10500个)的肿瘤细胞时，可使检测结果更稳定，且操作方便。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种有效的检测PD-1敲除或低表达的T细胞对PD-L1高表达的肿瘤细胞的杀伤作用的方法，通过构建稳定表达荧光素酶、绿色荧光蛋白和PD-L1高表达的肿瘤细胞系，然后用化学发光酶标仪检测，巧妙地实现了快速，简单，可靠地检测PD-1敲除的T细胞对相应肿瘤细胞杀伤能力。该方法相比以前的方法，简单便捷，可操作性强，检测结果准确，耗时短，检测成本低廉，不需要流式细胞仪、特异性标记抗体等贵重设备或试剂，便于推广。
附图说明
图1为电转的PGL4.51-luciferase-GFP质粒构造示意图；
图2为电转的Plenti-puro-PD-L1质粒构造示意图；
图3为人非小细胞肺癌细胞系HCC827、H1299和黑色素瘤细胞系M14检测PD-L1表达的流式数据；
图4为电转后稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的肿瘤细胞系HCC827在荧光显微镜下形态；
图5为流式检测电转后稳定表达荧光素酶、绿色荧光蛋白和PD-L1的肿瘤细胞系HCC827中PD-L1的表达水平；
图6为使用CRISPR-Cas9技术进行PD-1敲除的T细胞里PD-1的敲除效率；
图7为PD-1敲除的T细胞对基因工程改造过的肿瘤细胞系HCC827的杀伤作用。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
实施例1：
1.构建PGL4.51-luciferase-GFP质粒和Plenti-puro-PD-L1质粒
PGL4.51-luciferase质粒购自Promega公司，Plenti-puro-GFP质粒来自中科院广州生物医药与健康研究所赠送。GFP片段是以Plenti-puro-GFP质粒为模板PCR得到，PD-L1序列来自NCBI中PD-L1基因的CDS序列，经碱基全合成得到。PGL4.51-luciferase载体是通过PGL4.51-luciferase质粒酶切获得，Plenti-puro载体是通过Plenti-puro-GFP质粒酶切去除GFP获得。PGL4.51-luciferase-GFP质粒是通过PGL4.51-luciferase载体和GFP片段连接得到。Plenti-puro-PD-L1质粒是通过Plenti-puro载体和PD-L1片段连接得到。图1和图2为PGL4.51-luciferase-GFP和Plenti-puro-PD-L1的构造示意图。
2.使用流式细胞仪检测人非小细胞肺癌细胞HCC827、H1299和黑色素瘤细胞系M14中PD-L1的表达
取正在培养的HCC827、H1299和M14肿瘤细胞系，37℃0.05％胰酶消化5min，使用血清终止消化后，500g离心5min。去上清，使用PBS重悬计数，取5*106个细胞，放入1流式管中。加入2.5微升PDL1-APC抗体，室温孵育30min。300g离心5min，去上清，使用300微升PBS洗涤2遍，最后用300微升PBS重悬，并进行流式细胞仪检测。如图3可见，HCC827细胞PD-L1的表达水平较另两种细胞系高，故选其为检测所用的细胞系。
3.向HCC827细胞系中电转PGL4.51-luciferase-GFP质粒和Plenti-puro-PD-L1质粒
取正在培养的HCC827细胞系，37℃0.05％胰酶消化5min，使用血清终止消化后，500g离心5min。去上清，计数，并用电解液重悬成1*106个/20μl。向电解液中加入浓度均为1μg/μl的PGL4.51-luciferase-GFP质粒和Plenti-puro-PD-L1质粒(如图1和图2)各1μl，混匀。使用Celetrix电转仪进行电转，电转条件为540V，20ms 1次脉冲。然后将细胞立即转移到盛有1ml RPMI1640+10％FBS的12孔板中进行培养。
4.G418和Puromycin筛选以及细胞分选
细胞电转1天后，向培养基中添加G418和Puromycin进行筛选，G418的终浓度为400μg/ml，Puromycin的终浓度为5μg/ml。持续筛选7天后，利用绿色荧光蛋白进行细胞分选，分选出稳定表达荧光素酶和GFP的HCC827细胞系。使用流式细胞仪检测分选出的HCC827细胞系的PD-L1的表达比例。
如图4，可见基本所有的HCC827细胞都稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白。所述荧光素酶为萤火虫荧光素酶。
如图5，可见筛选出的HCC827细胞基本都高表达PD-L1基因。
5.T细胞中进行PD-1基因敲除
T细胞是通过外周血分离PBMC，并由Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28forT Cell Expansion and Activation(货号11132D)分选并激活获得。PD-1基因敲除是通过CRISPR-Cas9技术，设计靶向PD-1的sgRNA，序列为ATGTGGAAGTCACGCCCGTT，通过体外合成sgRNA，将sgRNA与Cas9蛋白进行混匀后，经Celetrix电转仪进行电转得到。电转后的T细胞通过GeneArt GenomicCleavage Selection Kit(货号A27663)检测基因敲除效率。如图6，PD-1基因敲除的比例为18.6％。图中的M、1、2和3通道分别代表DNA marker、PD-1敲除的T细胞、试剂盒的阳性对照以及未敲除的T细胞阴性对照。
6.化学发光法检测对肿瘤细胞的杀伤效率
取正在培养的稳定表达荧光素酶的HCC827细胞系，37℃℃0.05％胰酶消化5min，使用血清终止消化后，500g离心5min。去上清，计数，并用AIMV+5％AB血清培养基重悬成1*106个/ml。取1个96孔板，将实验分成七组，每组各3个复孔，每孔总体积为200微升。第一组(对照组)：每孔添加1万个肿瘤细胞。第二组：每孔1万个肿瘤细胞+1万个未处理的T细胞，效靶比为1:1。第三组：每孔1万个肿瘤细胞+10万个未处理的T细胞，效靶比为10:1。第四组：每孔1万个肿瘤细胞+20万个未处理的T细胞，效靶比为20:1。第五组：每孔1万个肿瘤细胞+1万个PD-1基因敲除的T细胞，效靶比为1:1。第六组：每孔1万个肿瘤细胞+10万个PD-1基因敲除的T细胞，效靶比为10:1。第七组：每孔1万个肿瘤细胞+20万个PD-1基因敲除的T细胞，效靶比为20:1。各组细胞混匀后放在37℃培养箱里共孵育16个小时。
孵育完成后，向每个孔内加入200x的储存液浓度为30mg/ml的荧光素底物1微升，振荡混匀后，立即使用化学发光酶标仪进行读数测量。所述荧光素酶底物为D-荧光素钾盐。
杀伤效率＝(对照组读数-实验组读数)/对照组读数
如图7所示，PD-1敲除的T细胞相对正常的T细胞来说，对特定肿瘤细胞的杀伤作用大大增强。从得到的结果来看，本发明所述的检测方法，简单，实用，结果可靠。
此外，实验发现，1万个肿瘤细胞检测时所得的化学发光仪读数范围较好，小于1万个则读数偏低。而且1万个肿瘤细胞的饱和度约为80％，小于1万则饱和度偏低，不利于肿瘤细胞和T细胞充分接触，大于1万个则细胞太拥挤，也不利于充分接触。特别适合于在96孔板(酶标板)中反应。
所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种检测PD-1敲除的或低表达的T细胞对肿瘤细胞杀伤能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对待检测的肿瘤细胞进行处理，得到稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的肿瘤细胞系；
(2)取正在培养的稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的肿瘤细胞系，用胰酶消化，终止消化后，离心重悬；
(3)设置检测组和对照组，检测组中，将PD-1基因敲除的或PD-1基因低表达的T细胞，加入到步骤(2)重悬后的肿瘤细胞系中，共孵育12-20个小时；对照组中，以PD-1基因未敲除的或PD-1基因高表达的T细胞，进行上述相同操作；
(4)孵育完成后，加入荧光素底物，振荡混匀后，立即使用化学发光酶标仪检测肿瘤细胞的化学发光强度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，对待检测的肿瘤细胞，电转PGL4.51-luciferase-GFP质粒和Plenti-puro-PD-L1质粒，电转后得到稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的肿瘤细胞系。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光素酶为萤火虫荧光素酶，荧光素酶底物为D-荧光素钾盐。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PD-1基因敲除的或PD-1基因低表达的T细胞与重悬后的肿瘤细胞共培养中，效靶比为1:1—1:20。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，设有三个检测组，其效靶比分别为1:1，1:10，1:20。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)在酶标板中进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶标板的每孔中检测1万个左右的肿瘤细胞。
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