CN113046320B

CN113046320B - 胞外段为Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子及表达该分子的CAR-T细胞及其用途

Info

Publication number: CN113046320B
Application number: CN202110188788.3A
Authority: CN
Inventors: 何维; 庞永胜; 陈慧; 张建民
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2021-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2041-02-19
Also published as: CN113046320A

Abstract

本发明公开了一种胞外段为Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子及表达该分子的CAR‑T细胞及其用途，属于体外基因修饰的淋巴细胞过继免疫治疗技术领域。提供的CAR‑T细胞可表达胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子，能够广谱性识别并结合多种实体肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原并有效浸润到实体肿瘤微环境中的肿瘤组织，实现高效杀伤实体肿瘤细胞的目的，为实体肿瘤的CAR‑T细胞过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。

Description

胞外段为Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子及表达该分子的CAR-T细胞及其用途

技术领域

本发明属于体外基因修饰的淋巴细胞过继免疫治疗技术领域，具体涉及一种胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4分子的CAR分子及表达该CAR分子的基因工程改造的CAR-T细胞及其用途，尤其涉及一种胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4分子的CAR分子及表达该CAR分子，并以自分泌形式表达IL-7和CCL19的基因工程改造的CAR-T细胞，以及该CAR-T细胞和该CAR分子的抑癌用途。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的重大难治性疾病，尤其是近十几年来，肿瘤的发病率和死亡率在全世界范围内都持续上升。针对肿瘤的治疗方法，除了传统的手术疗法、放射疗法和化学疗法外，免疫疗法也正在成为一种新的策略，尤其是其中之一的采用嵌合抗原受体(CAR)分子的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法。

CAR分子最初是由Zelig Eshhar教授团队的Gideon Gross博士等报道，是一种人工构建的融合基因编码的跨膜分子，主要由三部分组成—胞外段、跨膜段和胞内段，胞外段主要负责特异性的肿瘤抗原的识别，胞内段负责信号的转导，会刺激T细胞的增殖，并且通过细胞溶解和细胞因子释放来消除肿瘤细胞，跨膜段则用来连接胞外段和胞内段。其中CAR分子的胞外段主要是由识别肿瘤相关抗原的特异性单链抗体可变区组成，其在CAR-T细胞治疗中起到“精确导航”的作用，能够准确识别肿瘤细胞表面暴露的肿瘤相关抗原，然后激活CAR-T细胞，对肿瘤细胞进行靶向“定点清除”，并可以避免对正常组织和细胞的伤害，使得CAR-T细胞治疗具有高效精准杀伤肿瘤细胞的优势，另外还具有免疫记忆功能以及能够长期在体内存活等优势。

目前，CAR-T细胞疗法已经在血液恶性肿瘤中取得了很好的临床效果，例如CAR分子的胞外段以CD19为靶点在治疗急慢性白血病中的应用，然而其在实体肿瘤中的应用却遭遇挑战。实体肿瘤位于局部组织中，而且形成了复杂的免疫抑制性微环境，成为CAR-T细胞有效浸润至肿瘤细胞的屏障，并在肿瘤微环境中难以维持其功能，使其针对实体肿瘤难以发挥杀伤效力；此外实体肿瘤的肿瘤相关抗原相较于血液恶性肿瘤具有高度异质性，即其肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原差异巨大，导致在设计CAR分子时肿瘤特异性靶点难以确定，这些已经成为CAR-T细胞疗法在实体肿瘤的应用上的瓶颈。因此，设计一种能够有效靶向实体肿瘤表面的肿瘤相关抗原的CAR分子及具有良好的肿瘤组织浸润性的CAR-T细胞对于CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗的应用中具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种表达胞外段为Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子的CAR-T细胞，命名为Vδ1(GTM)Vγ4CAR-αβT细胞，所述CAR分子包括胞外段、跨膜段和胞内段；其中所述胞外段位于αβT细胞外，包含γδTCR的γ4链可变区(简称Vγ4)和与Vγ4连接的CDR3区被GTM多肽置换的δ1链的可变区(简称Vδ1(GTM))，所述跨膜段贯穿αβT细胞的细胞膜，用于连接胞外段中的Vγ4和胞内段，所述胞内段位于αβT细胞内。

上述跨膜段为CD8a分子，所述胞内段包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链(CD3z)。

上述的Vδ1(GTM)Vγ4CAR-αβT细胞还以自分泌形式同时表达细胞因子IL-7和/或趋化因子CCL19。

本发明另一方面提供一种CAR分子，其包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其中所述胞外段包含与跨膜段相连的γδTCR的γ4链可变区(Vγ4)，和与Vγ4连接的CDR3区被GTM多肽置换的δ1链的可变区(Vδ1(GTM))。

上述的CAR分子中，所述跨膜段为CD8a分子，所述胞内段包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链(CD3z)。

本发明另一方面还提供了上述的CAR分子的编码基因，其包含分别编码所述CAR分子的胞外段、跨膜段和胞内段的基因片段，其中编码所述胞外段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述跨膜段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码所述胞内段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

上述的CAR分子的编码基因还在编码所述胞内段的基因片段的下游连接有细胞因子IL-7和/或趋化因子CCL19的编码基因，其中所述细胞因子IL-7的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述趋化因子CCL19的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明再一方面提供一种携带上述的CAR分子的编码基因的重组质粒。

上述的Vδ1(GTM)Vγ4CAR-αβT细胞、或上述的CAR分子、或上述的重组质粒在制备抗肿瘤细胞制剂中的用途也属于本发明的内容；优选地，所述抗肿瘤细胞制剂还包含治疗有效量的IL-2。

上述的用途中，所述肿瘤为实体肿瘤，优选为喉癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、直肠腺癌、结肠癌、结直肠癌、肺鳞癌。

基于以上技术方案，本发明提供一种表达胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子的Vδ1(GTM)Vγ4CAR-αβT细胞(本文中称新型CAR-T细胞)，该新型CAR-T细胞的CAR分子的胞外段设计为由γδTCR的γ4链可变区Vγ4和CDR3区被GTM多肽置换的δ1链的可变区Vδ1(GTM)组成的肿瘤结合特异性单链，其针对多种肿瘤细胞表面抗原具有广泛结合特异性和广谱性，由其取代作为现有的CAR分子胞外段的只能识别单一肿瘤抗原的scFv结构，解决了由于实体肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原高度异质性而难以确定的难题。另一方面，实施例结果表明，本发明提供的新型CAR-T细胞能够在体外和体内对多种实体肿瘤细胞具有较高的杀伤活性，证明本发明提供的新型CAR-T细胞可以凭借其胞外广谱识别肿瘤相关抗原的单链Vδ1(GTM)Vγ4结构有效浸润和杀伤实体肿瘤细胞。因此本发明提供的新型CAR-T细胞是一种能够广谱性靶向肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原具有高度异质性的多种实体肿瘤细胞，且在实体肿瘤微环境中具有良好的浸润到肿瘤组织性能的CAR-T细胞，这为实体肿瘤的CAR-T细胞过继性免疫治疗提供了一种新的且实用的方法和策略。

另一方面，本发明提供的新型CAR-T细胞还可以同时以自分泌形式表达细胞因子IL-7来提高这种基因工程改造的新型CAR-T细胞本身在肿瘤微环境中聚集的相对数量同时增强它们在体内的生存活性，还可以以自分泌形式表达趋化因子受体CCL19来招募机体免疫系统中其他部位的免疫细胞浸润到肿瘤微环境中行使相关功能，从而最终通过分泌肿瘤坏死因子和颗粒酶等途径对多种肿瘤细胞产生细胞毒作用，进而还能够将CAR分子胞外段广泛结合并识别多种实体肿瘤细胞表面抗原的特异性优势与IL-7和CCL19有助于CAR-T细胞存活、扩增及在肿瘤组织中归巢并招募其他免疫细胞浸润至肿瘤微环境中协同发挥抗肿瘤作用等优势有效结合起来，进一步增强该基因工程改造的新型CAR-T细胞对多种实体肿瘤细胞的杀伤效果。

附图说明

图1为Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19的编码序列结构示意图；

图2为PCR扩增产物Vδ1(GTM)Vγ4CAR的凝胶电泳图像；

图3为PCR扩增产物P2A-IL7-P2A-CCL19的凝胶电泳图像；

图4为菌落PCR鉴定Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19的凝胶电泳图像；

图5为携带Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19的阳性克隆质粒双酶切鉴定的凝胶电泳图像；

图6为携带Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达载体的谱图；

图7为Western Blot检测Vδ1(GTM)Vγ4CAR分子在293T细胞中表达的凝胶电泳图像；

图8为ELISA检测细胞培养上清中IL-7和CCL19细胞因子的表达统计柱状图；其中A幅为细胞培养上清中IL-7的水平，B幅为细胞培养上清中CCL19的水平；

图9为慢病毒颗粒感染293T细胞24和72小时的荧光照片；

图10为慢病毒颗粒感染293T细胞72小时的荧光照片，其中A幅表示293T空白，B幅表示空载体，C幅表示GTM7×19；

图11为慢病毒颗粒对293T细胞的感染效率的流式细胞术检测图像；其中A幅表示空载体，B幅表示GTM7×19；

图12为慢病毒感染αβT细胞72小时后的感染效率流式细胞仪检测图像；

图13为本发明一个实施例建立的Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的结构示意图及作用原理示意图；

图14为慢病毒感染αβT细胞96小时后的扩增倍数柱状图；

图15为慢病毒感染αβT细胞9天后细胞培养上清中IL-7和CCL19细胞因子的表达统计柱状图；其中A幅为细胞培养上清中IL-7的水平，B幅为细胞培养上清中CCL19的水平；

图16为LDH法检测Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞作为效应细胞对10种常见人体不同组织来源的肿瘤细胞系的杀伤活性统计柱状图；

图17为荷瘤小鼠体内肿瘤活体成像图像；

图18为荷瘤小鼠体内肿瘤生长情况统计曲线。

具体实施方式

针对现有技术中CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗上面临的难以确定并识别肿瘤特异性靶点以及在实体肿瘤微环境中CAR-T细胞无法浸润到肿瘤组织中的缺陷，本发明旨在提供一种胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4分子的CAR分子，以及用该CAR分子修饰的新型CAR-T细胞(Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞)及其在实体肿瘤治疗中的用途。本发明提供的CAR分子结构中，胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4分子，其由γδT细胞的TCR(γδTCR)的γ4链可变区(Vγ4)和δ1链可变区(Vδ1)组成，且Vδ1的CDR3区被人工合成的GTM多肽(请参见CN102532269A，氨基酸序列为CAFLPHADKLIFGKG，SEQ ID NO:15)置换，该GTM多肽在γδTCR结构中已经证实能够特异性地与多种肿瘤组织、肿瘤细胞系及γδT细胞识别的配体MSH2蛋白结合，具有肿瘤结合固有免疫样特异性。本发明主要通过以下技术构思实现。

本发明将γδTCR结构的γ4链可变区(Vγ4)和CDR3区被人工合成的GTM多肽置换的δ1链可变区(Vδ1(GTM))设计为CAR分子的胞外段。γδT细胞是一群特殊的T淋巴细胞亚群，其TCR(γδTCR)由γ链和δ链组成，可以第一时间识别危险信号，是γδT细胞识别抗原的主要分子，在肿瘤的免疫监视及抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。γδTCR以更类似抗体的方式直接识别完整的抗原分子，无MHC限制性，但其也与抗体有区别，γδTCR对抗原的识别不是特异性一对一的，而是一种固有免疫样的识别模式，即一种γδTCR可以特异性识别多种抗原，因此γδT细胞在肿瘤抗原识别上具有特异性和广谱性，使其在肿瘤过继免疫治疗上具备无可比拟的优势，通常用于TCR-T细胞疗法(其向T细胞引入的是一个天然存在的T细胞受体(TCR)，通过提高TCR的活性，来增强对癌细胞的杀伤力，可分为αβTCR-T和γδTCR-T)，例如直接将具有抗肿瘤活性的γδT细胞在体外扩增后回输到病人体内，或者利用γδT细胞识别的配体磷酸盐抗原或二磷酸盐联合低剂量的IL-2体内活化γδT细胞治疗恶性肿瘤，或者将完整γδTCR与αβT细胞结合的细胞疗法等，并取得了一定的效果。发明人创造性地将通常用于TCR-T技术领域的具有肿瘤识别特异性和广谱性的γδTCR结构的Vγ4和Vδ1(GTM)设计为适用于CAR-T细胞疗法的CAR结构的胞外段，惊讶发现，获得的CAR分子能够广谱性识别并结合多种实体肿瘤细胞表面的具有高度异质性的肿瘤相关抗原。更令人称奇的是，传统的CAR-T细胞更加合适用于治疗血液系统肿瘤，而本发明表达该CAR分子的αβT细胞(新型CAR-T细胞)竟然更加合适用于治疗多种实体肿瘤，并且能够有效浸润到实体肿瘤组织中，广谱性识别并结合实体肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原，进而对实体肿瘤细胞进行高效精准杀伤，本发明实现了CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗中的突破。

为了进一步增强对肿瘤细胞的杀伤效果，本发明还以自分泌的形式使构建的新型CAR-T细胞表达细胞因子IL-7和趋化因子受体CCL19，其中细胞因子IL-7可以协同提高CAR-T细胞本身在肿瘤微环境中聚集的相对数量，同时增强它们在体内的生存活性；趋化因子受体CCL19可以招募机体免疫系统中其他部位的免疫细胞浸润到肿瘤微环境中行使相关功能，从而最终通过分泌肿瘤坏死因子和颗粒酶等途径对多种肿瘤细胞产生细胞毒作用。

以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

以下实施例中使用的材料和来源：

1、细胞系及培养

喉癌细胞系Hep2、非小细胞肺癌细胞系A549、肺鳞癌细胞系NCI-H520、胃癌细胞系BGC803、人肺癌细胞系NCI-H2228和NCI-H446、肝癌细胞系HepG2、结肠癌细胞系LoVo、结直肠癌细胞系HT-29、直肠腺癌细胞系HR8348、卵巢癌细胞系HO8910、SKOV3和OVCAR-8、多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和慢性髓性白血病细胞K562和SV40转化的人胚肾上皮细胞系293T以含10％FBS的DMEM培养基进行贴壁培养；上述细胞系均购自中国医学科学院细胞中心，在申请人实验室保存。PBMC细胞：通过人淋巴细胞分离液密度梯度离心法从正常人外周血中分离得到，用于活化扩增αβT细胞。

2、实验动物

NSG小鼠，鼠龄4～6周，体重15～20g，雌性，购于生物制品检定所动物中心，于中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心无特定病原体(specific pathogen free，SPF)条件下的层流架中饲养。

3、菌株和质粒载体

大肠杆菌DH5α，购自宝生物工程有限公司。基因型为：supE44ΔlacU169

hsdR17 recA1 end1 gyr96 thi-1relA1，用于质粒的扩增与转化。

cFUGW-gamma4delta1(GTM)CAR-IRES-GFP质粒：用于扩增Vγ4/Vδ1(GTM)CAR分子基因序列(包含：Vδ1(GTM)Vγ4胞外段和CD8a跨膜段、CD28胞内段、CD137胞内段和CD3Zeta胞内段的表达序列)以构建慢病毒重组表达载体的第三代CAR骨架载体，该质粒由申请人实验室滕达博士按照常规方法构建，并保存于申请人实验室。

pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry：出发载体，中国医学科学院基础医学研究所黄波教授课题组馈赠，用于构建携带目的基因片段Vδ1(GTM)-linker-Vγ4-CD8a-CD28-CD137-CD3z-P2A-IL7-P2A-CCL19的慢病毒重组表达载体。

pUC57-P2A-IL-7-P2A-CCL19质粒：该质粒为上海生工生物技术有限公司合成的P2A-IL-7-P2A-CCL19目的基因序列所提供的质粒。

psPAX2和pMD2.G：分别为慢病毒包装系统中的包装质粒和包膜质粒，商购获得，由申请人实验室保存。

实施例中涉及到的引物均由已有技术合成。

实施例1：携带有目的基因Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒的构建和目的蛋白的表达

如图1所示，示出了本发明提供的基因工程改造的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子的编码序列以及在该CAR分子的胞内段CD3z(CD3分子的zeta链)表达序列下游还连接有细胞因子IL-7和趋化因子受体CCL19的表达序列的结构示意图。该CAR分子的胞外段Vδ1(GTM)Vγ4由γδTCR分子的γ4链的可变区(Vγ4)和CDR3区被GTM多肽置换的δ1链的可变区(Vδ1(GTM))组成，中间通过linker(连接体)连接，该胞外段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；与胞外段中的Vγ4连接的是跨膜段，为CD8(CD8a)分子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；胞内段为经典的第三代CAR分子，依次包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链序列，胞内段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。CAR分子的胞内段中CD3z与IL-7(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示)以及IL-7与CCL19(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示)之间分别通过一个P2A(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示)序列连接，使得细胞因子IL-7和趋化因子受体CCL19分别表达。

将该CAR分子的表达序列和IL-7以及CCL19的表达序列连接而成的片段命名为Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19，即Vδ1(GTM)-linker-Vγ4-CD8a-CD28-CD137-CD3z-P2A-IL7-P2A-CCL19，携带该目的基因Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒的构建及表达包括以下步骤。

(1)以cFUGW-gamma4delta1(GTM)CAR-IRES-GFP质粒为模板，利用下述引物Q5EF1αδ1,F和Q5 EF1αδ1,R，PCR扩增获得Vδ1(GTM)基因片段(即Vδ1(GTM)-linker)，胶回收PCR产物；同时，利用下述引物Q5 EF1αγ4，F和Q5 EF1α γ4,R，PCR扩增获得Vγ4CAR基因片段(即Vγ4-CD8a-CD28-CD137-CD3z)，胶回收PCR产物PCR产物的凝胶电泳照片如图2所示，其中泳道M表示DL2000 DNA ladder，δ1表示扩增产物Vδ1(GTM)基因片段，其序列长度约为520bp；γ4表示扩增产物Vγ4CAR基因片段，其序列长度约为1257bp；

Q5 EF1αδ1,F,5'-3'：

GTCGTGAGGATCTATTTCCGGTGGCCACCATGGTTCTGCTGGTCACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATCCCCGACTACAAGGACGACGATGACAAG(SEQ ID NO:7)；

Q5 EF1αδ1,R,5'-3'：

CCGCTGCCGCTGGTGCTGCCGGTCCGTCCTTTTCCAAAGATGAGTTTATCGGC(SEQ ID NO:8)。

Q5 EF1α γ4,F,5'-3':

CCGATAAACTCATCTTTGGAAAAGGACGGACCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGC(SEQ ID NO:9)；

Q5 EF1α γ4,R,5'-3':

AGAAGTTGGTGGCGCCGCTGCCGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTGAAG(SEQID NO:10)。

(2)以pUC57-P2A-IL-7-P2A-CCL19质粒为模板，利用下述引物Q5 EF1a P2A7X19-F和Q5 EF1a P2A7X19-R，PCR扩增获得P2A-IL-7-P2A-CCL19基因片段，胶回收PCR产物；PCR产物的凝胶电泳照片如图3所示，其中泳道M表示DL2000 DNA ladder，7×19PCR表示PCR产物P2A-IL7-P2A-CCL19，其序列长度约为1000bp；

Q5 EF1a P2A7X19-F(5'-3')：

TCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCTCTCTGC(SEQ ID NO:11)；

Q5 EF1a P2A7X19-R(5'-3')：

GGGGGGAGGGAGAGGGGCGGGATCTCAGCTGCTTCTTCTCTTCATCTTGGCGCTGGTCCT(SEQ IDNO:12)。

(3)双酶切pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry并胶回收酶切产物。

(4)将上述步骤(3)双酶切并且胶回收的pLVX-EF1a-IRES-mCherry质粒片段，与上述步骤(1)和(2)PCR扩增并且胶回收的Vδ1(GTM)、Vγ4CAR和P2A-IL-7-P2A-CCL19基因片段使用同源重组法进行连接，获得重组质粒。

(5)将上述步骤(4)获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α化学感受态细胞，并在半固体琼脂LB-agar培养板上进行阳性克隆筛选和菌落PCR鉴定；PCR鉴定产物的凝胶电泳照片如图4所示，其中M表示1kb plus DNA ladder，鉴定出泳道1、5、6和7为阳性克隆，序列全长约为2700bp，而泳道2、3和4为阴性克隆。

(6)挑取转划后长出的阳性克隆菌落(图4中泳道5所对应的菌落)，进行质粒DNA的小量提取，并对提取的质粒进行酶切鉴定，将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并且设置相应的未酶切质粒为阴性对照；凝胶电泳照片如图5所示，其中M表示1kb plus DNA ladder，编号1、2、3、4、5和6为六个阳性单克隆，可见作为阴性对照的未酶切质粒，其条带形状为典型的环形质粒电泳图谱，并且条带大小符合预期(理论值为11512bp)，质粒1、2、3、5和6在使用AvrII+RsrII双酶切系统进行鉴定所产生的条带大小正确，2个条带大小分别为2326bp和9186bp，而质粒4未酶切和双酶切的条带都不正确。

(7)将酶切鉴定证明含有目的基因Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19插入的重组质粒进行DNA序列测定(由上海生物工程股份有限公司完成)。用DNAMAN软件分析测序结果；该重组质粒即为携带目的基因Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒，命名为pLVX-EF1a-Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-IRES-mCherry(简称pLVX-EF1a-GTMCAR-IL-7-CCL19)，其带有Flag(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示，方便检测)标签的谱图如图6所示，其中趋化因子受体CCL19与mCherry(荧光蛋白，方便检测)之间通过IRES序列(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:14所示)连接，使得mCherry表达。

(8)按照Vigorous质粒大量提取纯化试剂盒的说明，大量提取图5中编号为5所对应的阳性单克隆质粒，并按照Invitrogen Lipofectamine 2000的说明操作，将重组质粒转入293T细胞，荧光显微镜观察mCherry的表达，并利用Western blotting检测CAR蛋白分子的表达情况，利用ELISA检测IL-7和CCL19的表达情况；

A、在Western blotting检测中使用山羊-抗-人CD3z(1:3000)抗体检测CAR蛋白分子的表达情况，二抗为兔抗山羊-HRP(1:5000)；结果如图7所示，其中M：pre-stainedProtein ladder 5μL，泳道1(293T)：293T阴性对照细胞裂解全蛋白30μg，泳道2(EF1a)：mCherry空载质粒(pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry)空白对照细胞裂解全蛋白30μg，泳道3(GTM 7×19)：5#阳性单克隆质粒瞬转293T细胞全蛋白30μg；可见与泳道1和泳道2相比，泳道3在55-70KDa之间有一条深染特异条带(图7中箭头表示)，其分子量大小与目的蛋白CAR的分子量(CAR理论分子量为56.9KDa)大小相符。

B、收集阳性单克隆5#质粒瞬转293T细胞后24小时和48小时的上清，使用IL-7和CCL19的ELISA试剂盒检测上清中IL-7和CCL19的水平；结果如图8所示，其中A幅表示293T细胞培养上清中IL-7的水平，B幅表示293T细胞培养上清中CCL19的水平，GTM7×19表示瞬转阳性单克隆质粒的试验组，可见试验组细胞上清中IL-7和CCL19的OD值均显著高于对照组(空白对照和mCherry空载体对照)。

综上所述，该实施例成功构建了携带目的基因Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒，并且将该慢病毒表达质粒瞬转293T细胞后能够正常表达CAR分子，以及IL-7和CCL19。

实施例2：目的基因Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19修饰的αβT细胞的建立

该实施例利用上述实施例1中构建的携带目的基因Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒经慢病毒感染的方式获得由基因工程改造的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4分子的CAR分子修饰的αβT细胞(命名为Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，即表达Vδ1(GTM)Vγ4CAR分子，并以自分泌形式表达IL-7和CCL19的αβT细胞)，具体包括以下步骤。

2.1、按照Vigorous质粒大量提取纯化试剂盒的说明，大量提取图5中编号为5所对应的阳性单克隆质粒pLVX-EF1a-Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-IRES-mCherry(简称为GTM7×19)，空载体pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry(简称空载体)，以及病毒包装载体pMD2.G和psPAX2。

2.2、按照Invitrogen Lipofectamine 2000的说明操作，分别共转染重组载体pLVX-EF1a-Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-IRES-mCherry和病毒包装载体(pMD2.G和psPAX2)，以及空载体pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry和病毒包装载体到293T细胞中，收集培养上清，并纯化慢病毒颗粒，分别获得试验组慢病毒颗粒和对照组慢病毒颗粒；如图9所示，为分别使用空载体和病毒包装载体，以及使用GTM7×19和病毒包装载体共转染293T细胞后24和72小时的荧光照片，可见感染效率及产毒过程中293T细胞形态和状态均正常。

先后收集质粒共转染后48小时和72小时的上清，离心1500rpm×10min去除细胞碎片，使用0.45μm微孔滤膜过滤，低温冷冻离心机超速离心25000rpm(约10万g)×2h，然后使用一定体积(控制浓缩倍数大约为500倍)的1640原液于4℃过夜溶解沉淀物，然后重悬分装，于-80℃保存。使用与感染T细胞完全相同的感染方法(24孔板包被RetroNectin，然后在其上再包被慢病毒，最后铺上待感染的细胞)来感染293T细胞，72h后在荧光显微镜下观察荧光蛋白表达，并且消化收集细胞，使用流式细胞仪检测表达荧光蛋白的细胞占所有细胞的百分比，即为感染效率。其中图10示出了慢病毒感染293T细胞72h后的荧光照片，其中A幅表示未感染慢病毒的空白对照，B幅表示感染慢病毒72h后的荧光照片；图11示出了流式细胞仪检测结果，其中A幅表示空载体的感染效率，B幅表示GTM7×19的感染效率。

2.3、按照天津灏洋生物制品科技有限公司的人淋巴细胞分离液的说明，密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞。计数后，按照Miltenyi TCRαβ阳性分选试剂盒(德国美天旎生物技术有限公司)说明，分选得到αβT细胞。

2.4、将步骤2.3分选得到的αβT细胞在固相化抗CD3抗体刺激活化的环境中培养24小时；25μl无血清RPMI-1640培养基与4μl慢病毒感染增强剂Envirus(Engreen)轻轻混匀后置于4℃孵育5分钟，在混合液中加入浓缩的慢病毒颗粒(试验组慢病毒颗粒(GTM7×19)或对照组慢病毒颗粒(空载体))并将其置于4℃孵育15分钟；混合液与含有200IU/ml IL-2的细胞悬液(2×10⁶个/ml)混匀，接种到事先包被抗-CD3抗体的24孔板中，32℃下，培养板1200×g离心120分钟，然后细胞置于37℃、5％CO₂孵箱培养。以上感染过程重复两遍，每隔2～3天更换新鲜的含有200IU/ml IL-2的完全RPMI-1640培养基继续培养8～10天。空载体对照组与试验组GTM7×19相应的慢病毒感染αβT细胞72小时后，分别收集细胞，用流式细胞技术检测其荧光蛋白的表达情况。

结果如图12所示，图12为流式细胞术检测的慢病毒感染αβT细胞72小时后的感染效率，可见试验组GTM7×19慢病毒感染αβT细胞72小时后，感染效率为14.5％，即有14.5％的αβT细胞成功获得Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19分子，即获得了由基因工程改造的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子和细胞因子IL-7和CCL19修饰的αβT细胞，即Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，图13示出了该Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的结构示意图和作用原理。

还对慢病毒感染αβT细胞96小时后Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的扩增情况进行了计数检测，结果如图14所示，可见试验组GTM7×19慢病毒感染αβT细胞96小时后，Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的扩增倍数达到7倍左右。

还在慢病毒感染αβT细胞9天后，收集Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞培养上清，ELISA检测其中IL-7和CCL19细胞因子的水平。结果如图15所示，其中A幅表示细胞培养上清中IL-7细胞因子含量，B幅表示细胞培养上清中CCL19细胞因子含量，可见在试验组GTM7×19慢病毒感染αβT细胞9天后，细胞培养上清中的IL-7和CCL19细胞因子含量均显著升高。

综上所述，该实施例建立了由实施例1构建的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子修饰的αβT细胞(Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞)，且在CAR分子的胞内段的下游连接有IL-7和CCL19细胞因子表达序列，结果证明该Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞能够稳定增殖，且能够稳定高效表达IL-7和CCL19细胞因子。

实施例3：Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的体外和体内抗肿瘤功能

该实施例利用上述实施例2建立的Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞验证其在体外和体内的抗肿瘤效果，具体包括以下操作。

3.1、Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的体外抗肿瘤功能

3.1.1、分别制备靶细胞和效应细胞，其中靶细胞为10种常见人体不同组织来源的肿瘤细胞系，包括：喉癌细胞系Hep2、非小细胞肺癌细胞系A549、胃癌细胞系BGC803、结肠癌细胞系LoVo、结直肠癌细胞系HT-29、直肠腺癌细胞系HR8348、卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR-8、多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和慢性髓性白血病细胞K562；效应细胞为上述实施例2建立的Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，空载体感染的αβT细胞作为对照效应细胞；

3.1.2、调整效应细胞浓度，按效靶比5:1加入50μl效应细胞；同时设置效应细胞自发释放组作为空白对照组；每组均设4-8个复孔；平板于室温400×g离心3分钟，然后置于37℃，5％CO₂共孵育6-8小时。按照Promega cytoTox

非放射性细胞毒性检测试剂盒(Sigma)说明，LDH方法检测计算各组的杀伤效率(即细胞毒活性)。

检测结果如图16所示，可见与空载体感染的αβT细胞相比，Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞对10种肿瘤细胞中的8种(包括喉癌细胞系Hep2；卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR-8；直肠腺癌细胞系HR8348；结肠癌细胞系LoVo；结直肠癌细胞系HT-29；非小细胞肺癌细胞系A549；胃癌细胞系BGC803)的杀伤活性显著增强(抑瘤率为8/10＝80％)，但是对血液系统肿瘤细胞系RPMI8226和K562没有显著杀伤活性(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001；ns，没有显著性差异)。

3.2、Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的体内抗肿瘤功能

(1)表达外源Luciferase的OVCAR-8细胞构建

按照实施例2中步骤2.2的方法进行Luciferase-GFP质粒慢病毒包装和纯化，获得表达Luciferase-GFP的慢病毒颗粒，利用其感染对数生长期卵巢癌OVCAR-8细胞；感染72h后，通过GFP标签流式分选阳性的OVCAR-8细胞，获得稳定表达外源Luciferase的OVCAR-8细胞系，用于体内实验的肿瘤活体成像。

(2)OVCAR-8荷瘤小鼠模型建立及细胞过继免疫治疗

共48只NSG小鼠背部位置皮下接种8×10⁶细胞/50μl的表达Luciferase的OVCAR-8细胞，待肿瘤生长至100mm³左右进行小鼠分组和细胞过继免疫治疗；

小鼠共分为4组：空白对照组(注射PBS，磷酸盐缓冲液)、阴性对照组(空载体感染的αβT细胞(空载体细胞)，1×10⁷细胞/只小鼠/次)、阳性对照组(γδT细胞，1×10⁷细胞/只小鼠/次)和GTM7×19实验组(Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，1×10⁷细胞/只小鼠/次)。每隔4天治疗一次，共治疗4次。阴性对照组、阳性对照组和GTM7×19实验组同时给予腹腔注射IL-2 5000U/只。

每隔4天进行小动物活体成像记录肿瘤生长情况。首先2％异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后腹腔注射体内发光底物Luciferin(终浓度150μg/ml，按小鼠体重1μl/mg)，20分钟后进行图像采集。并记录小鼠的生存情况。

活体成像结果如图17所示，根据活体成像荧光强度，统计各组小鼠体内肿瘤的生长情况，结果如图18所示，可见与空载体细胞和γδT细胞相比，Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞治疗组小鼠肿瘤增长显著减慢(**，P＝0.0039)，证明Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的体内杀伤肿瘤功能和效果。

综上所述，本发明建立的Vδ1(GTM)Vγ4CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞(新型CAR-T细胞)在体内和体外均具有广泛的抗肿瘤作用，对多种实体肿瘤具有良好的体内外治疗效果，因此，该新型CAR-T细胞可以用于制备抗肿瘤(尤其是实体肿瘤，例如喉癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、直肠腺癌、结肠癌、结直肠癌等)的细胞制剂，为CAR-T细胞疗法在实体肿瘤的过继性免疫治疗提供新的且实用的方法和策略。

另一方面，虽然已有文献公开的体内和体外实验证实γδT细胞由于其γδTCR的固有免疫样的识别模式在肿瘤抗原识别上具有特异性和广谱性特点，使其在肿瘤过继免疫治疗上具备无可比拟的优势，但是直接使用天然γδT细胞进行肿瘤免疫治疗也存在着一些问题。例如，对于很多癌症晚期患者，其自体γδT细胞的获得非常困难，且体外扩增后回输到病人体内的单次注输细胞数量需求较高，达到10亿-100亿；并且在临床试验中发现，使用磷酸盐重复刺激γδT细胞会致其出现失能、耗竭和死亡等现象，从而导致γδT细胞所产生的杀瘤效应非常短暂，不能在体内长期存活；另外，因为对γδTCR细胞进行体外扩增所用的单抗来源于小鼠，所以过继回输人体时这种鼠源抗体可能会引起免疫排斥反应。因此，直接使用γδT细胞进行肿瘤免疫治疗就受到限制。而本发明创造性地将通常用于TCR-T技术领域的具有肿瘤结合特异性和广谱性的γδTCR结构的Vγ4和Vδ1(GTM)应用到适用于CAR-T细胞疗法的CAR分子中，结果表明，不仅可以获得一种新型CAR-T细胞，其相对于在血液系统肿瘤治疗中有效的传统CAR-T细胞更加适用于多种实体肿瘤治疗，并且该新型CAR-T细胞可以巧妙地将γδT细胞在肿瘤抗原识别上的广谱性优势和αβT细胞易获得的优势以及CAR-T细胞在肿瘤治疗中高效精准杀伤肿瘤细胞、具有免疫记忆功能、能够长期在体内存活以及在体外扩增后回输到病人体内的单次注输细胞数量较少(仅需1000万-1亿)等优势有效结合起来，有效避免了临床上直接使用癌症患者本人的γδT细胞进行过继治疗所面临细胞因为免疫抑制不能有效扩增而导致数量不足的难题，又解决了传统CAR-T细胞在治疗实体肿瘤时无法有效识别和结合高度异质性的肿瘤相关抗原以及无法浸润到肿瘤组织的问题。因此，本发明提供的新型CAR-T细胞实现了CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗领域的突破。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

<120> 胞外段为Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子及表达该分子的CAR-T细胞及其用途

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctgttct ccagcctgct gtgtgtattt gtggccttca gctactctgg atcaagtgtg 60

gcccagaagg ttactcaagc ccagtcatca gtatccatgc cagtgaggaa agcagtcacc 120

ctgaactgcc tgtatgaaac aagttggtgg tcatattata ttttttggta caagcaactt 180

cccagcaaag agatgatttt ccttattcgc cagggttctg atgaacagaa tgcaaaaagt 240

ggtcgctatt ctgtcaactt caagaaagca gcgaaatccg tcgccttaac catttcagcc 300

ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctttcc ttcctcatgc cgataaactc 360

atctttggaa aaggacggac cggcagcacc agcggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 420

ggaagctctt ccaacttgga agggagaacg aagtcagtca tcaggcagac tgggtcatct 480

gctgaaatca cttgtgatct tgctgaagga agtaccggct acatccactg gtacctacac 540

caggagggga aggccccaca gcgtcttctg tactatgact cctacacctc cagcgttgtg 600

ttggaatcag gaatcagccc agggaagtat gatacttacg gaagcacaag gaagaacttg 660

agaatgatac tgcgaaatct tattgaaaat gactctggag tctattactg tgccacctgg 720

gatggg 726

<210> 2

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 180

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 240

cacaggaac 249

<210> 3

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcccgtttct ctgttgttaa acggggcaga aagaagctcc tgtatatatt caaacaacca 180

tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 240

gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 300

taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 360

gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 420

aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 480

gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 540

ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 600

<210> 4

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgttccacg tgagctttag atacatcttt ggcctgccac ctctgatcct ggtgctgctg 60

cctgtggcct cttctgattg tgatatcgag ggaaaagatg gcaagcagta tgagtctgtg 120

ctgatggtgt ctattgatca gctgctggac agcatgaagg aaattgggtc caattgtctg 180

aataacgagt tcaacttctt caagagacac atctgcgacg ccaacaagga gggcatgttc 240

cttttcagag ccgccagaaa gctgaggcag ttcctgaaga tgaatagcac cggcgacttc 300

gacctgcacc tgctgaaggt gagcgagggc accaccatcc tgctgaactg caccggccag 360

gtgaagggca ggaagcccgc cgccctgggc gaggcccagc ccaccaagag cctggaggag 420

aacaagagcc tgaaggagca gaagaaactg aacgacctgt gcttcctgaa gcggctgctg 480

caggagatca agacctgctg gaacaagatc ctgatgggca ccaaggagca c 531

<210> 5

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggccctgc tgctggccct gagcctgctg gtgctgtgga ccagccccgc ccccaccctg 60

agcggcacca atgacgccga ggactgctgc ctgagcgtga cccagaagcc catccctggc 120

tacatcgtga gaaatttcca ctacctgctg atcaaggacg gctgcagagt gcccgccgtg 180

gtgttcacca ccctgagggg cagacagctg tgcgcccccc ccgaccagcc ctgggtggag 240

aggatcatcc agcggctgca gaggaccagc gccaagatga agagaagaag cagc 294

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccaccaact tctctctgct gaagcaggcc ggcgacgtgg aggagaatcc aggacct 57

<210> 7

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcgtgagga tctatttccg gtggccacca tggttctgct ggtcaccagc ctgctgctgt 60

gcgaactgcc ccaccccgcc tttctgctga tccccgacta caaggacgac gatgacaag 119

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgctgccgc tggtgctgcc ggtccgtcct tttccaaaga tgagtttatc ggc 53

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgataaact catctttgga aaaggacgga ccggcagcac cagcggcagc ggc 53

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agaagttggt ggcgccgctg ccgcgagggg gcagggcctg catgtgaag 49

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcacatgcag gccctgcccc ctcgcggcag cggcgccacc aacttctctc tgc 53

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggggggaggg agaggggcgg gatctcagct gcttcttctc ttcatcttgg cgctggtcct 60

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gactacaagg acgacgatga caag 24

<210> 14

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc acctcaagcg tattcaacaa 420

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 540

gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taa 573

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Cys Ala Phe Leu Pro His Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly

1 5 10 15

Claims

1.一种表达胞外段为Vδ1(GTM)Vγ4的CAR分子的CAR-T细胞，命名为Vδ1(GTM)Vγ4CAR-αβT细胞，所述CAR分子包括胞外段、跨膜段和胞内段；其中所述胞外段为单链，位于αβT细胞外，包含γδTCR的简称为Vγ4的γ4链可变区和与Vγ4连接的简称为Vδ1(GTM)的CDR3区被GTM多肽置换的δ1链的可变区，所述跨膜段贯穿αβT细胞的细胞膜，用于连接胞外段中的Vγ4和胞内段，所述胞内段位于αβT细胞内；

所述跨膜段为CD8a分子，所述胞内段包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链（CD3z）；

所述Vδ1(GTM)Vγ4 CAR-αβT细胞还以自分泌形式同时表达细胞因子IL-7和趋化因子CCL19；

其中编码所述胞外段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述跨膜段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码所述胞内段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

其中所述细胞因子IL-7的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述趋化因子CCL19的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.一种CAR分子，其包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其中所述胞外段为单链，其包含与跨膜段相连的γδTCR的简称为Vγ4的γ4链可变区，和与Vγ4连接的简称为Vδ1(GTM)的CDR3区被GTM多肽置换的δ1链的可变区；

在编码所述胞内段的基因片段的下游连接有细胞因子IL-7和趋化因子CCL19的编码基因，其中所述细胞因子IL-7的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述趋化因子CCL19的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.权利要求2所述的CAR分子的编码基因，其包含分别编码所述CAR分子的胞外段、跨膜段和胞内段的基因片段，其中编码所述胞外段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述跨膜段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码所述胞内段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述CAR分子的编码基因还在编码所述胞内段的基因片段的下游连接有细胞因子IL-7和趋化因子CCL19的编码基因，其中所述细胞因子IL-7的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，所述趋化因子CCL19的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.一种携带权利要求3所述的CAR分子的编码基因的重组质粒。

5.权利要求1所述的Vδ1(GTM)Vγ4 CAR-αβT细胞、或权利要求2所述的CAR分子、或权利要求4所述的重组质粒在制备抗肿瘤细胞制剂中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，所述抗肿瘤细胞制剂还包含治疗有效量的IL-2。

7.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述肿瘤为实体肿瘤。

8.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述肿瘤为喉癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、直肠腺癌、结肠癌、结直肠癌、肺鳞癌。