CN112877293A - 胞外段为Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子及表达该分子的CAR-T细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胞外段为Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子及表达该分子的CAR‑T细胞及其用途，属于体外基因修饰的淋巴细胞过继免疫治疗技术领域。提供的CAR‑T细胞可表达胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子，能够广谱性识别并结合多种实体肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原并有效浸润到实体肿瘤微环境中的肿瘤组织，实现高效杀伤实体肿瘤细胞的目的，为实体肿瘤的CAR‑T细胞过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。

Description

胞外段为Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子及表达该分子的CAR-T细胞 及其用途
技术领域
本发明属于体外基因修饰的淋巴细胞过继免疫治疗技术领域，具体涉及一种胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9分子的CAR分子及表达该CAR分子的基因工程改造的CAR-T细胞及其用途，尤其涉及一种胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9分子的CAR分子及表达该CAR分子，并以自分泌形式表达IL-7和CCL19的基因工程改造的CAR-T细胞，以及该CAR-T细胞和该CAR分子的抑癌用途。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的重大难治性疾病，尤其是近十几年来，肿瘤的发病率和死亡率在全世界范围内都持续上升。针对肿瘤的治疗方法，除了传统的手术疗法、放射疗法和化学疗法外，免疫疗法也正在成为一种新的策略，尤其是其中之一的采用嵌合抗原受体(CAR)分子的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法。
CAR分子最初是由Zelig Eshhar教授团队的Gideon Gross博士等报道，是一种人工构建的融合基因编码的跨膜分子，主要由三部分组成—胞外段、跨膜段和胞内段，胞外段主要负责特异性的肿瘤抗原的识别，胞内段负责信号的转导，会刺激T细胞的增殖，并且通过细胞溶解和细胞因子释放来消除肿瘤细胞，跨膜段则用来连接胞外段和胞内段。其中CAR分子的胞外段主要是由识别肿瘤相关抗原的特异性单链抗体可变区组成，其在CAR-T细胞治疗中起到“精确导航”的作用，能够准确识别肿瘤细胞表面暴露的肿瘤相关抗原，然后激活CAR-T细胞，对肿瘤细胞进行靶向“定点清除”，并可以避免对正常组织和细胞的伤害，使得CAR-T细胞治疗具有高效精准杀伤肿瘤细胞的优势，另外还具有免疫记忆功能以及能够长期在体内存活等优势。
目前，CAR-T细胞疗法已经在血液恶性肿瘤中取得了很好的临床效果，例如CAR分子的胞外段以CD19为靶点在治疗急慢性白血病中的应用，然而其在实体肿瘤中的应用却遭遇挑战。实体肿瘤位于局部组织中，而且形成了复杂的免疫抑制性微环境，成为CAR-T细胞有效浸润至肿瘤细胞的屏障，并在肿瘤微环境中难以维持其功能，使其针对实体肿瘤难以发挥杀伤效力；此外实体肿瘤的肿瘤相关抗原相较于血液恶性肿瘤具有高度异质性，即其肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原差异巨大，导致在设计CAR分子时肿瘤特异性靶点难以确定，这些已经成为CAR-T细胞疗法在实体肿瘤的应用上的瓶颈。因此，设计一种能够有效靶向实体肿瘤表面的肿瘤相关抗原的CAR分子及具有良好的肿瘤组织浸润性的CAR-T细胞对于CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗的应用中具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种表达胞外段为Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子的CAR-T细胞，命名为Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞，所述CAR分子包括胞外段、跨膜段和胞内段；其中所述胞外段位于αβT细胞外，包含γδTCR的γ9链可变区(简称Vγ9)和与Vγ9连接的CDR3区被OT3多肽置换的δ2链的可变区(简称Vδ2(OT3))，所述跨膜段贯穿αβT细胞的细胞膜，用于连接胞外段中的Vγ9和胞内段，所述胞内段位于αβT细胞内。
上述跨膜段为CD8a分子，所述胞内段包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链(CD3z)。
上述的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞还以自分泌形式同时表达细胞因子IL-7和/或趋化因子CCL19。
本发明另一方面提供一种CAR分子，其包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其中所述胞外段包含与跨膜段相连的γδTCR的γ9链可变区(Vγ9)，和与Vγ9连接的CDR3区被OT3多肽置换的δ2链的可变区(Vδ2(OT3))。
上述的CAR分子中，所述跨膜段为CD8a分子，所述胞内段包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链(CD3z)。
本发明另一方面还提供了上述的CAR分子的编码基因，其包含分别编码所述CAR分子的胞外段、跨膜段和胞内段的基因片段，其中编码所述胞外段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述跨膜段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码所述胞内段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
上述的CAR分子的编码基因还在编码所述胞内段的基因片段的下游连接有细胞因子IL-7和/或趋化因子CCL19的编码基因，其中所述细胞因子IL-7的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述趋化因子CCL19的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明再一方面提供一种携带上述的CAR分子的编码基因的重组质粒。
上述的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞、或上述的CAR分子、或上述的重组质粒在制备抗肿瘤细胞制剂中的用途也属于本发明的内容；优选地，所述抗肿瘤细胞制剂还包含治疗有效量的IL-2。
上述的用途中，所述肿瘤为实体肿瘤，优选为喉癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、直肠腺癌、结肠癌、结直肠癌、肺鳞癌、B淋巴细胞瘤。
基于以上技术方案，本发明提供一种表达胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞(本文中称新型CAR-T细胞)，该新型CAR-T细胞的CAR分子的胞外段设计为由γδTCR的γ9链可变区Vγ9和CDR3区被OT3多肽置换的δ2链的可变区Vδ2(OT3)组成的肿瘤结合特异性单链，其针对多种肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原具有广谱性识别与结合，由其取代作为现有的CAR分子胞外段的只能识别单一肿瘤抗原的scFv结构，解决了由于实体肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原高度异质性而难以确定的难题。另一方面，实施例结果表明，本发明提供的新型CAR-T细胞能够在体外和体内对多种实体肿瘤细胞具有较高的杀伤活性，证明本发明提供的新型CAR-T细胞可以凭借其胞外广谱识别肿瘤相关抗原的单链Vδ2(OT3)Vγ9结构有效浸润和杀伤实体肿瘤细胞。因此本发明提供的新型CAR-T细胞是一种能够广谱性靶向肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原具有高度异质性的多种实体肿瘤细胞，且在实体肿瘤微环境中具有良好的浸润到肿瘤组织性能的CAR-T细胞，这为实体肿瘤的CAR-T细胞过继性免疫治疗提供了一种新的且实用的方法和策略。
另一方面，本发明提供的新型CAR-T细胞还可以同时以自分泌形式表达细胞因子IL-7来提高这种基因工程改造的新型CAR-T细胞本身在肿瘤微环境中聚集的相对数量同时增强它们在体内的生存活性，还可以以自分泌形式表达趋化因子受体CCL19来招募机体免疫系统中其他部位的免疫细胞浸润到肿瘤微环境中行使相关功能，从而最终通过分泌肿瘤坏死因子和颗粒酶等途径对多种肿瘤细胞产生细胞毒作用，进而还能够将CAR分子胞外段广泛结合并识别多种实体肿瘤细胞表面抗原的特异性优势与IL-7和CCL19有助于CAR-T细胞存活、扩增及在肿瘤组织中归巢并招募其他免疫细胞浸润至肿瘤微环境中协同发挥抗肿瘤作用等优势有效结合起来，进一步增强该基因工程改造的新型CAR-T细胞对多种实体肿瘤细胞的杀伤效果。
附图说明
图1为Vδ2(OT3)Vγ9 CAR的编码序列结构示意图；
图2为某一示例性Vδ2(OT3)Vγ9 CAR分子的结构示意图；
图3为携带Vδ2(OT3)Vγ9 CAR的编码序列的质粒图谱；
图4为携带Vδ2(OT3)Vγ9 CAR的重组慢病毒载体转入293T细胞后的荧光显微照片；
图5为携带Vδ2(OT3)Vγ9 CAR的重组慢病毒载体转入293T细胞后CD3z及FLAG蛋白表达的凝胶电泳照片；
图6为经慢病毒感染7天后αβT细胞的存活率的流式细胞仪检测图像；
图7为经慢病毒感染7天后αβT细胞的感染效率的流式细胞仪检测图像；
图8为LDH法检测Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞作为效应细胞对不同组织来源的肿瘤细胞系的杀伤活性统计柱状图；
图9为与靶细胞共孵育后效应细胞中GranzymeB的表达情况，其中A幅表示GranzymeB的表达统计柱状图，B幅表示流式细胞仪检测图像；
图10为与靶细胞共孵育后效应细胞分泌活化分子CD69的情况，其中A幅表示所有αβT细胞中CD69的表达柱状图，B幅表示GFP+αβT细胞的D69的表达柱状图；
图11为与靶细胞共孵育后效应细胞分泌活化分子TNF-α的表达统计柱状图；
图12为荷瘤小鼠体内肿瘤活体成像图像；
图13为荷瘤小鼠体内肿瘤生长情况统计曲线；
图14为荷瘤小鼠生存曲线；
图15为Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19的编码序列结构示意图；
图16为PCR扩增产物Vδ2(OT3)Vγ9 CAR的凝胶电泳图像；
图17为PCR扩增产物P2A-IL7-P2A-CCL19的凝胶电泳图像；
图18为菌落PCR鉴定Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19的凝胶电泳图像；
图19为携带Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19的阳性克隆质粒双酶切鉴定的凝胶电泳图像；
图20为携带Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达载体的谱图；
图21为Western Blot检测Vδ2(OT3)Vγ9 CAR分子在293T细胞中表达的凝胶电泳图像；
图22为Western Blot检测Vδ2(OT3)Vγ9 CAR分子在293T细胞中表达的凝胶电泳图像；
图23为ELISA检测细胞培养上清中IL-7和CCL19细胞因子的表达统计柱状图；其中A幅为细胞培养上清中IL-7的水平，B幅为细胞培养上清中CCL19的水平；
图24为慢病毒颗粒感染293T细胞24和72小时的荧光照片；
图25为慢病毒颗粒感染293T细胞72小时的荧光照片，其中A幅表示293T空白，B幅表示空载体，C幅表示OT37×19；
图26为慢病毒颗粒对293T细胞的感染效率的流式细胞术检测图像；其中A幅表示空载体，B幅表示OT37×19；
图27为慢病毒感染αβT细胞72小时后荧光蛋白表达照片；
图28为慢病毒感染αβT细胞72小时后的感染效率流式细胞仪检测图像；
图29为本发明一个实施例建立的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的结构示意图及作用原理示意图；
图30为慢病毒感染αβT细胞96小时后的扩增倍数柱状图；
图31为慢病毒感染αβT细胞9天后细胞培养上清中IL-7和CCL19细胞因子的表达统计柱状图；其中A幅为细胞培养上清中IL-7的水平，B幅为细胞培养上清中CCL19的水平；
图32为LDH法检测Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞作为效应细胞对12种常见人体不同组织来源的肿瘤细胞系的杀伤活性统计柱状图；
图33为荷瘤小鼠体内肿瘤活体成像图像；
图34为荷瘤小鼠体内肿瘤生长情况统计曲线；
图35为荷瘤小鼠体内肿瘤活体成像图像；
图36为荷瘤小鼠体内肿瘤生长情况统计曲线。
具体实施方式
针对现有技术中CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗上面临的难以确定并识别肿瘤特异性靶点以及在实体肿瘤微环境中CAR-T细胞无法浸润到肿瘤组织中的缺陷，本发明旨在提供一种胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9分子的CAR分子，以及用该CAR分子修饰的新型CAR-T细胞(Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞或Vδ2(OT3)Vγ9CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞)及其在实体肿瘤治疗中的用途。本发明提供的CAR分子结构中，胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9分子，其由γδT细胞的TCR(γδTCR)的γ9链可变区(Vγ9)和δ2链可变区(Vδ2)组成，且Vδ2的CDR3区被人工合成的OT3多肽(请参见CN1504476A，氨基酸序列为CDFPSHTFHSTGGHTTDKLIFGKG，SEQ ID NO:13)置换，该OT3多肽在γδTCR结构中已经证实能够特异性地与多种肿瘤组织、肿瘤细胞系及γδT细胞识别的配体MSH2蛋白结合，具有肿瘤结合固有免疫样特异性。本发明主要通过以下技术构思实现。
本发明将γδTCR结构的γ9链可变区(Vγ9)和CDR3区被人工合成的OT3多肽置换的δ2链可变区(Vδ2(OT3))设计为CAR分子的胞外段。γδT细胞是一群特殊的T淋巴细胞亚群，其TCR(γδTCR)由γ链和δ链组成，可以第一时间识别危险信号，是γδT细胞识别抗原的主要分子，在肿瘤的免疫监视及抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。γδTCR以更类似抗体的方式直接识别完整的抗原分子，无MHC限制性，但其也与抗体有区别，γδTCR对抗原的识别不是特异性一对一的，而是一种固有免疫样的识别模式，即一种γδTCR可以特异性识别多种抗原，因此γδT细胞在肿瘤抗原识别上具有特异性和广谱性，使其在肿瘤过继免疫治疗上具备无可比拟的优势，通常用于TCR-T细胞疗法(其向T细胞引入的是一个天然存在的T细胞受体(TCR)，通过提高TCR的活性，来增强对癌细胞的杀伤力，可分为αβTCR-T和γδTCR-T)，例如直接将具有抗肿瘤活性的γδT细胞在体外扩增后回输到病人体内，或者利用γδT细胞识别的配体磷酸盐抗原或二磷酸盐联合低剂量的IL-2体内活化γδT细胞治疗恶性肿瘤，或者将完整γδTCR与αβT细胞结合的细胞疗法等，并取得了一定的效果。发明人创造性地将通常用于TCR-T技术领域的具有肿瘤识别特异性和广谱性的γδTCR结构的Vγ9和Vδ2(OT3)设计为适用于CAR-T细胞疗法的CAR结构的胞外段，惊讶发现，获得的CAR分子能够广谱性识别并结合多种实体肿瘤细胞表面的具有高度异质性的肿瘤相关抗原。更令人称奇的是，传统的CAR-T细胞更加合适用于治疗血液系统肿瘤，而本发明表达该CAR分子的αβT细胞(新型CAR-T细胞)竟然更加合适用于治疗多种实体肿瘤，并且能够有效浸润到实体肿瘤组织中，广谱性识别并结合实体肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原，进而对实体肿瘤细胞进行高效精准杀伤，本发明实现了CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗中的突破。
为了进一步增强对肿瘤细胞的杀伤效果，本发明还以自分泌的形式使构建的新型CAR-T细胞表达细胞因子IL-7和趋化因子受体CCL19，其中细胞因子IL-7可以协同提高CAR-T细胞本身在肿瘤微环境中聚集的相对数量，同时增强它们在体内的生存活性；趋化因子受体CCL19可以招募机体免疫系统中其他部位的免疫细胞浸润到肿瘤微环境中行使相关功能，从而最终通过分泌肿瘤坏死因子和颗粒酶等途径对多种肿瘤细胞产生细胞毒作用。
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
以下实施例中使用的材料和来源：
1、细胞系及培养
喉癌细胞系Hep2、非小细胞肺癌细胞系A549、肺鳞癌细胞系NCI-H520、胃癌细胞系BGC803、人肺癌细胞系NCI-H2228和NCI-H446、人B淋巴细胞瘤细胞系Raji、肝癌细胞系HepG2、结肠癌细胞系LoVo、结直肠癌细胞系HT-29、直肠腺癌细胞系HR8348、卵巢癌细胞系HO8910、SKOV3和OVCAR-8、多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和慢性髓性白血病细胞K562和SV40转化的人胚肾上皮细胞系293T以含10％FBS的DMEM培养基进行贴壁培养；上述细胞系均购自中国医学科学院细胞中心，在申请人实验室保存。PBMC细胞：通过人淋巴细胞分离液密度梯度离心法从正常人外周血中分离得到，用于活化扩增αβT细胞。
2、实验动物
NSG小鼠，鼠龄4～6周，体重15～20g，雌性，购于生物制品检定所动物中心，于中国医学科学院基础医学研究所实验动物中心无特定病原体(specific pathogen free，SPF)条件下的层流架中饲养。
3、菌株和质粒载体
大肠杆菌DH5α，购自宝生物工程有限公司。基因型为：supE44ΔlacU169
Figure BDA0002944357980000071
hsdR17 recA1 end1 gyr96 thi-1 relA1，用于质粒的扩增与转化。
cFUGW-gamma9delta2(OT3)CAR-IRES-GFP质粒：用于扩增Vγ9/Vδ2(OT3)CAR分子基因序列(包含：Vδ2(OT3)Vγ9胞外段和CD8a跨膜段、CD28胞内段、CD137胞内段和CD3Zeta胞内段的表达序列)以构建慢病毒重组表达载体的第三代CAR骨架载体，该质粒由申请人实验室滕达博士按照常规方法构建，并保存于申请人实验室。
pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry：出发载体，中国医学科学院基础医学研究所黄波教授课题组馈赠，用于构建携带目的基因片段Vδ2(OT3)-linker-Vγ9-CD8a-CD28-CD137-CD3z-P2A-IL7-P2A-CCL19的慢病毒重组表达载体。
pUC57-P2A-IL-7-P2A-CCL19质粒：该质粒为上海生工生物技术有限公司合成的P2A-IL-7-P2A-CCL19目的基因序列所提供的质粒。
psPAX2和pMD2.G：分别为慢病毒包装系统中的包装质粒和包膜质粒，商购获得，由申请人实验室保存。
实施例中涉及到的引物均由已有技术合成。
实施例1：目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR修饰的αβT细胞的建立
如图1所示，示出了本发明提供的基因工程改造的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子的编码序列结构示意图，图2示出了该CAR分子的结构示意图。该CAR分子的胞外段Vδ2(OT3)Vγ9由γδTCR分子的γ9链的可变区(Vγ9)和CDR3区被OT3多肽置换的δ2链的可变区(Vδ2(OT3))组成，中间通过linker(连接体)连接，该胞外段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；与胞外段中的Vγ9连接的是跨膜段，为CD8(CD8a)分子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；胞内段为经典的第三代CAR分子，依次包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链序列，胞内段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
将该CAR分子的表达序列片段命名为Vδ2(OT3)Vγ9 CAR，即Vδ2(OT3)-linker-Vγ9-CD8a-CD28-CD137-CD3z，可由cFUGW-gamma9delta2(OT3)CAR-IRES-GFP质粒扩增获得。如图3所示，示出了携带有Flag标签(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，方便检测)的cFUGW-Flag-gamma9delta2(OT3)CAR-IRES-GFP质粒(可以通过常规PCR方法将Flag标签引入cFUGW-gamma9delta2(OT3)CAR-IRES-GFP质粒的N端获得)的图谱。
目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR修饰的αβT细胞(命名为Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞，即表达Vδ2(OT3)Vγ9 CAR分子的αβT细胞)的建立具体包括以下操作。
(1)按照Vigorous质粒大量提取纯化试剂盒的说明，大量提取重组质粒cFUGW-Flag-gamma9delta2(OT3)CAR-IRES-GFP，空载体cFUGW-GFP，以及病毒包装载体pMD2.G和psPAX2。
(2)按照Invitrogen Lipofectamine 2000的说明操作，分别共转染重组载体cFUGW-Flag-gamma9delta2(OT3)CAR-IRES-GFP和病毒包装载体(pMD2.G和psPAX2)，以及空载体cFUGW-GFP和病毒包装载体到293T细胞中，收集培养上清，并纯化慢病毒颗粒，分别获得试验组慢病毒颗粒和对照组慢病毒颗粒。如图4所示，为分别使用携带Vδ2(OT3)Vγ9 CAR的重组载体(图4中cFUGW-γ9δ2(OT3)CAR-GFP)和空载体(图4中cFUGW-GFP)转染293T细胞后48小时的荧光照片，可见两者均有GFP荧光蛋白的表达，且随着病毒浓度的增加，GFP阳性的细胞数目增多，荧光增强。并用Western Blotting方法检测转染48小时后细胞培养上清中CD3Zeta和FLAG蛋白的表达情况，结果如图5所示，其中M表示Protein Marker，空白表示293T阴性对照组，GFP表示空载体cFUGW-GFP对照组(从左到右泳道分别对应50μL、20μL、10μL、5μL细胞上清液)，γδCAR表示试验组(从左到右泳道分别对应50μL、20μL、10μL、5μL细胞上清液)，可见试验组的细胞培养上清中含有高表达的CD3Zeta和FLAG蛋白，表明携带目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR的质粒可以在293T细胞中正常表达。
(3)按照天津灏洋生物制品科技有限公司的人淋巴细胞分离液的说明，密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞。计数后，按照Miltenyi TCRαβ阳性分选试剂盒(德国美天旎生物技术有限公司)说明，分选得到αβT细胞。
(4)将步骤(3)分选得到的αβT细胞在固相化抗CD3抗体刺激活化的环境中培养24小时；25μl无血清RPMI-1640培养基与4μl慢病毒感染增强剂Envirus(Engreen)轻轻混匀后置于4℃孵育5分钟，在混合液中加入浓缩的慢病毒颗粒(步骤(2)获得的试验组慢病毒颗粒(γδCAR)或对照组慢病毒颗粒(空载体cFUGW-GFP))并将其置于4℃孵育15分钟；混合液与含有200IU/ml IL-2的细胞悬液(2×106个/ml)混匀，接种到事先包被抗-CD3抗体的24孔板中，32℃下，培养板1200×g离心120分钟，然后细胞置于37℃、5％CO2孵箱培养。以上感染过程重复两遍，每隔2～3天更换新鲜的含有200IU/ml IL-2的完全RPMI-1640培养基继续培养8～10天。空载体对照组与试验组γδCAR相应的慢病毒感染αβT细胞7天后，分别收集细胞，用流式细胞技术检测病毒感染的αβT细胞的存活情况以及细胞荧光蛋白GFP的表达情况。
图6示出了流式细胞术检测病毒感染的αβT细胞的存活情况，可见空载体对照组(GFP-αβT)和试验组(γδCAR-αβT)相应的慢病毒感染原代αβT细胞7天后，细胞存活率均大于60％。图7示出了流式细胞术检测病毒感染的αβT细胞的GFP表达情况，由此可知空载体对照组病毒颗粒的感染效率为80％左右(GFP-αβT)，试验组病毒颗粒的感染效率为22％左右(γδCAR-αβT)，即有22％左右的αβT细胞成功获得Vδ2(OT3)Vγ9 CAR分子，即获得了由基因工程改造的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子修饰的αβT细胞，即Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞。
综上所述，该实施例建立了胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子修饰的αβT细胞(Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞)。
实施例2：Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞的的体外和体内抗肿瘤功能
该实施例利用上述实施例1建立的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞验证其在体外和体内的抗肿瘤效果，具体包括以下操作。
2.1、Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞的体外抗肿瘤功能
2.1.1、分别制备靶细胞和效应细胞，其中靶细胞为卵巢癌细胞系OVCAR-8、多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226、人肺癌细胞系NCI-H2228和NCI-H446以及人B淋巴细胞瘤细胞系Raji；效应细胞为上述实施例1建立的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞，空载体感染的αβT细胞作为对照效应细胞；
2.1.2、调整效应细胞浓度，按效靶比10:1加入50μl效应细胞；同时设置效应细胞自发释放组作为空白对照组；每组均设4个复孔；平板于室温400×g离心3分钟，然后置于37℃，5％CO2共孵育6小时。按照Promega cytoTox
Figure BDA0002944357980000091
非放射性细胞毒性检测试剂盒(Sigma)说明，LDH方法检测计算各组的杀伤效率(即细胞毒活性)。
检测结果如图8所示，可见与空白(空白αβT细胞)以及空载体感染的αβT细胞(GFP)相比，Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞对5种肿瘤细胞中的3种(包括卵巢癌细胞系OVCAR-8；人B淋巴细胞瘤细胞系Raji；人肺癌细胞系NCI-H2228)的杀伤活性显著增强(抑瘤率为3/5＝60％)，甚至显著高于天然γδT细胞；对人肺癌细胞系NCI-H446也具有较佳的杀伤活性，但是对血液系统肿瘤细胞系RPMI8226没有杀伤活性(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001)。
还采用流式细胞术检测与靶细胞OVCAR-8细胞孵育6小时后Vδ2(OT3)Vγ9CAR-αβT细胞中Granzyme B的表达情况以及Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞活化分子CD69及TNF-α的分泌能力。图9示出了与OVCAR-8细胞孵育6小时后的空白αβT细胞(空白)、空载体感染的αβT细胞(GFP)以及Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞(γδCAR)中的Granzyme B的表达情况，其中A幅为统计柱状图，B幅为流式细胞仪检测结果，可见相较于空白和GFP，γδCAR细胞中Granzyme B的表达量显著更高。图10示出了与OVCAR-8细胞孵育6小时后的空载体感染的αβT细胞(GFP)以及Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞(CARγδT)表面CD69的表达情况，其中A幅表示所有αβT细胞的CD69的表达，B幅表示GFP+αβT细胞的CD69的表达，可见相对于空白载体感染的αβT细胞，CARγδT细胞CD69的表达量显著更高。图11示出了与OVCAR-8细胞孵育6小时后的空白αβT细胞(空白)、空载体感染的αβT细胞(GFP)以及Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞(γδCAR)分泌TNF-α的情况，可见相对于空白和GFP，γδCAR细胞分泌TNF-α的量显著更高。
2.2、Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞的体内抗肿瘤功能
(1)表达外源Luciferase的OVCAR-8细胞构建
按照实施例1中步骤(1)和(2)的方法进行Luciferase-GFP质粒慢病毒包装和纯化，获得表达Luciferase-GFP的慢病毒颗粒，利用其感染对数生长期卵巢癌OVCAR-8细胞；感染72h后，通过GFP标签流式分选阳性的OVCAR-8细胞，获得稳定表达外源Luciferase的OVCAR-8细胞系，用于体内实验的肿瘤活体成像。
(2)OVCAR-8荷瘤小鼠模型建立及细胞过继免疫治疗
共40只NSG小鼠背部位置皮下接种8×106细胞/50μl的表达Luciferase的OVCAR-8细胞，待肿瘤生长至60mm3左右进行小鼠分组和细胞过继免疫治疗；
小鼠共分为3组：空白对照组(注射PBS，磷酸盐缓冲液)、阴性对照组(空载体感染的αβT细胞(空载体细胞)，1×107细胞/只小鼠/次)和γδCAR-αβT实验组(Vδ2(OT3)Vγ9CAR-αβT细胞，1×107细胞/只小鼠/次)。每隔3天治疗一次，共治疗4次。阴性对照组和γδCAR-αβT实验组小鼠同时给予腹腔注射IL-2 5000U/只。
每隔3天进行小动物活体成像记录肿瘤生长情况。首先2％异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后腹腔注射体内发光底物Luciferin(终浓度150μg/ml，按小鼠体重1μl/mg)，20分钟后进行图像采集。并记录小鼠的生存情况。
记录的部分活体成像结果如图12所示，根据活体成像荧光强度，统计各组小鼠体内肿瘤的生长情况，统计结果如图13所示，可见与阴性对照组相比，Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞治疗组小鼠肿瘤增长显著减慢(*，P<0.05)，证明Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞具有良好的体内杀伤肿瘤功能和效果。各组小鼠的生存曲线如图14所示，可见相对于空白组小鼠(空白)和阴性对照组小鼠(GFP)，试验组小鼠(γδCAR-αβT)的生存期显著延长。
实施例3：携带有目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒的构建和目的蛋白的表达
如图15所示，示出了本发明提供的基因工程改造的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子的编码序列以及在该CAR分子的胞内段CD3z(CD3分子的zeta链)表达序列下游还连接有细胞因子IL-7和趋化因子受体CCL19的表达序列的结构示意图。其中CAR分子的结构参见实施例1。CAR分子的胞内段中CD3z与IL-7(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示)以及IL-7与CCL19(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示)之间分别通过一个P2A(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示)序列连接，使得细胞因子IL-7和趋化因子受体CCL19分别表达。
将该CAR分子的表达序列和IL-7以及CCL19的表达序列连接而成的片段命名为Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19，即Vδ2(OT3)-linker-Vγ9-CD8a-CD28-CD137-CD3z-P2A-IL7-P2A-CCL19，携带该目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒的构建及表达包括以下步骤。
(1)以cFUGW-gamma9delta2(OT3)CAR-IRES-GFP质粒为模板，利用下述引物Q5EF1a CAR-F和Q5 EF1a CAR-R，PCR扩增获得Vδ2(OT3)Vγ9 CAR基因片段(即Vδ2(OT3)-linker-Vγ9-CD8a-CD28-CD137-CD3z)，胶回收PCR产物；PCR产物的凝胶电泳照片如图16所示，其中泳道M表示DL2000 DNA ladder，OT3CAR PCR表示扩增产物Vδ2(OT3)Vγ9 CAR基因片段，其序列长度约为1700bp；
Q5 EF1a CAR-F(5'-3')：
GTCGTGAGGATCTATTTCCGGTGGCCACCATGGTTCTGCTGGTCACCAGCCTGCTGCTG(SEQ IDNO:7)；
Q5 EF1a CAR-R(5'-3')：
GAGAAGTTGGTGGCGCCGCTGCCGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTGAAG(SEQ ID NO:8)。
(2)以pUC57-P2A-IL-7-P2A-CCL19质粒为模板，利用下述引物Q5 EF1a P2A7X19-F和Q5 EF1a P2A7X19-R，PCR扩增获得P2A-IL-7-P2A-CCL19基因片段，胶回收PCR产物；PCR产物的凝胶电泳照片如图17所示，其中泳道M表示DL2000 DNA ladder，P2A7×19PCR表示PCR产物P2A-IL7-P2A-CCL19，其序列长度约为1000bp；
Q5 EF1a P2A7X19-F(5'-3')：
TCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCTCTCTGC(SEQ ID NO:9)；
Q5 EF1a P2A7X19-R(5'-3')：
GGGGGGAGGGAGAGGGGCGGGATCTCAGCTGCTTCTTCTCTTCATCTTGGCGCTGGTCCT(SEQ IDNO:10)。
(3)双酶切pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry并胶回收酶切产物。
(4)将上述步骤(3)双酶切并且胶回收的pLVX-EF1a-IRES-mCherry质粒片段，与上述步骤(1)和(2)PCR扩增并且胶回收的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR和P2A-IL-7-P2A-CCL19基因片段使用同源重组法进行连接，获得重组质粒。
(5)将上述步骤(4)获得的重组质粒转化大肠杆菌DH5α化学感受态细胞，并在半固体琼脂LB-agar培养板上进行阳性克隆筛选和菌落PCR鉴定；PCR鉴定产物的凝胶电泳照片如图18所示，其中M表示1kb plus DNA ladder，鉴定出泳道1、3-7的菌落为阳性克隆，序列全长约为2700bp，而泳道2的菌落为异常克隆。
(6)挑取转划后长出的阳性克隆菌落(图18中泳道7所对应的菌落)，进行质粒DNA的小量提取，并对提取的质粒进行酶切鉴定，将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并且设置相应的未酶切质粒为阴性对照；凝胶电泳照片如图19所示，其中M表示1kb plus DNAladder，编号1、2、3、4为四个阳性单克隆，可见作为阴性对照的未酶切质粒，其条带形状为典型的环形质粒电泳图谱，并且条带大小符合预期(理论值为11545bp)，四个质粒在使用NheI+NdeI双酶切系统进行鉴定时所产生的2个条带大小都正确：理论值分别为6686bp和4835bp。而使用AvrII+RsrII双酶切系统进行鉴定所产生的条带大小也正确，因为RsrII酶因效期已过，所以出现了AvrII单酶切的情况，但是单酶切所产生的条带大小也正确：理论值为11545bp。
(7)将酶切鉴定证明含有目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19插入的重组质粒进行DNA序列测定(由上海生物工程股份有限公司完成)。用DNAMAN软件分析测序结果；该重组质粒即为携带目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒，命名为pLVX-EF1a-Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-IRES-mCherry，其带有Flag(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，方便检测)标签的谱图如图20所示，其中趋化因子受体CCL19与mCherry(荧光蛋白，方便检测)之间通过IRES序列(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示)连接，使得mCherry表达。
(8)按照Vigorous质粒大量提取纯化试剂盒的说明，大量提取图19中编号为4(4#)所对应的阳性单克隆质粒，并按照Invitrogen Lipofectamine 2000的说明操作，将重组质粒转入293T细胞，荧光显微镜观察mCherry的表达，并利用Western blotting检测CAR蛋白分子的表达情况，利用ELISA检测IL-7和CCL19的表达情况；
A、在Western blotting检测中使用小鼠-抗-FLAG(1:5000)抗体检测CAR蛋白分子的表达情况，二抗为兔抗小鼠-HRP(1:5000)；结果如图21所示，其中M：pre-stainedProtein ladder 5μL，泳道1：293T阴性对照细胞裂解全蛋白30μg，泳道2：mCherry空载质粒(pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry)空白对照细胞裂解全蛋白30μg，泳道3：4#阳性单克隆质粒瞬转293T细胞全蛋白30μg；可见与泳道1和泳道2相比，泳道3在55-70KDa之间有一条深染特异条带，其分子量大小与目的蛋白CAR的分子量(CAR理论分子量为56.9KDa)大小相符；
B、在Western blotting检测中使用山羊-抗-人CD3z(1:3000)抗体检测CAR蛋白分子的表达情况，二抗为兔抗山羊-HRP(1:5000)；结果如图22所示，其中M：pre-stainedProtein ladder 5μL，泳道1：293T阴性对照细胞裂解全蛋白30μg，泳道2：mCherry空载质粒(pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry)空白对照细胞裂解全蛋白30μg，泳道3：4#阳性单克隆质粒瞬转293T细胞全蛋白30μg；可见与泳道1和泳道2相比，泳道3在55-70KDa之间有一条深染特异条带，其分子量大小与目的蛋白CAR的分子量(CAR理论分子量为56.9KDa)大小相符。
C、收集阳性单克隆4#质粒瞬转293T细胞后24小时和48小时的上清，使用IL-7和CCL19的ELISA试剂盒检测上清中IL-7和CCL19的水平；结果如图23所示，其中A幅表示293T细胞培养上清中IL-7的水平，B幅表示293T细胞培养上清中CCL19的水平，OT37×19表示瞬转阳性单克隆质粒的试验组，可见试验组细胞上清中IL-7和CCL19的OD值均显著高于对照组(空白对照和mCherry空载体对照)。
综上所述，该实施例成功构建了携带目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒，并且将该慢病毒表达质粒瞬转293T细胞后能够正常表达CAR分子，以及IL-7和CCL19。
实施例4：目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19修饰的αβT细胞的建立
该实施例利用上述实施例3中构建的携带目的基因Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19的慢病毒表达质粒经慢病毒感染的方式获得由基因工程改造的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9分子的CAR分子修饰的αβT细胞(命名为Vδ2(OT3)Vγ9CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，即表达Vδ2(OT3)Vγ9 CAR分子，并以自分泌形式表达IL-7和CCL19的αβT细胞)，具体包括以下步骤。
4.1、按照Vigorous质粒大量提取纯化试剂盒的说明，大量提取图19中编号为4(4#)所对应的阳性单克隆质粒pLVX-EF1a-Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-IRES-mCherry(简称为OT37×19)，空载体pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry(简称空载体)，以及病毒包装载体pMD2.G和psPAX2。
4.2、按照Invitrogen Lipofectamine 2000的说明操作，分别共转染重组载体pLVX-EF1a-Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-IRES-mCherry和病毒包装载体(pMD2.G和psPAX2)，以及空载体pLVX-EF1a-promotor-MCS-IRES-mCherry和病毒包装载体到293T细胞中，收集培养上清，并纯化慢病毒颗粒，分别获得试验组慢病毒颗粒和对照组慢病毒颗粒；如图24所示，为分别使用空载体和病毒包装载体，以及使用OT37×19和病毒包装载体共转染293T细胞后24和72小时的荧光照片，可见感染效率及产毒过程中293T细胞形态和状态均正常。
先后收集质粒共转染后48小时和72小时的上清，离心1500rpm×10min去除细胞碎片，使用0.45μm微孔滤膜过滤，低温冷冻离心机超速离心25000rpm(约10万g)×2h，然后使用一定体积(控制浓缩倍数大约为500倍)的1640原液于4℃过夜溶解沉淀物，然后重悬分装，于-80℃保存。使用与感染T细胞完全相同的感染方法(24孔板包被RetroNectin，然后在其上再包被慢病毒，最后铺上待感染的细胞)来感染293T细胞，72h后在荧光显微镜下观察荧光蛋白表达，并且消化收集细胞，使用流式细胞仪检测表达荧光蛋白的细胞占所有细胞的百分比，即为感染效率。其中图25示出了慢病毒感染293T细胞72h后的荧光照片，其中A幅表示未感染慢病毒的空白对照，B幅表示感染慢病毒72h后的荧光照片；图26示出了流式细胞仪检测结果，其中A幅表示空载体的感染效率，B幅表示OT37×19的感染效率。
4.3、按照天津灏洋生物制品科技有限公司的人淋巴细胞分离液的说明，密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞。计数后，按照Miltenyi TCRαβ阳性分选试剂盒(德国美天旎生物技术有限公司)说明，分选得到αβT细胞。
4.4、将步骤4.3分选得到的αβT细胞在固相化抗CD3抗体刺激活化的环境中培养24小时；25μl无血清RPMI-1640培养基与4μl慢病毒感染增强剂Envirus(Engreen)轻轻混匀后置于4℃孵育5分钟，在混合液中加入浓缩的慢病毒颗粒(试验组慢病毒颗粒(OT37×19)或对照组慢病毒颗粒(空载体))并将其置于4℃孵育15分钟；混合液与含有200IU/ml IL-2的细胞悬液(2×106个/ml)混匀，接种到事先包被抗-CD3抗体的24孔板中，32℃下，培养板1200×g离心120分钟，然后细胞置于37℃、5％CO2孵箱培养。以上感染过程重复两遍，每隔2～3天更换新鲜的含有200IU/ml IL-2的完全RPMI-1640培养基继续培养8～10天。空载体对照组与试验组OT37×19相应的慢病毒感染αβT细胞72小时后，分别收集细胞，用流式细胞技术检测其荧光蛋白的表达情况。
结果如图27和图28所示，其中图27为慢病毒感染αβT细胞72小时后荧光蛋白的表达情况，可见试验组OT37×19慢病毒感染αβT细胞后，荧光蛋白能够表达。图28为流式细胞术检测的慢病毒感染αβT细胞72小时后的感染效率，可见试验组OT37×19慢病毒感染αβT细胞72小时后，感染效率为15.4％，即有15.4％的αβT细胞成功获得Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19分子，即获得了由基因工程改造的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子和细胞因子IL-7和CCL19修饰的αβT细胞，即Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，图29示出了该Vδ2(OT3)Vγ9CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的结构示意图和作用原理。
还对慢病毒感染αβT细胞96小时后Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的扩增情况进行了计数检测，结果如图30所示，可见试验组OT37×19慢病毒感染αβT细胞96小时后，Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的扩增倍数达到7倍左右。
还在慢病毒感染αβT细胞9天后，收集Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞培养上清，ELISA检测其中IL-7和CCL19细胞因子的水平。结果如图31所示，其中A幅表示细胞培养上清中IL-7细胞因子含量，B幅表示细胞培养上清中CCL19细胞因子含量，可见在试验组OT37×19慢病毒感染αβT细胞9天后，细胞培养上清中的IL-7和CCL19细胞因子含量均显著升高。
综上所述，该实施例建立了由实施例3构建的胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子修饰的αβT细胞(Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞)，且在CAR分子的胞内段的下游连接有IL-7和CCL19细胞因子表达序列，结果证明该Vδ2(OT3)Vγ9CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞能够稳定增殖，且能够稳定高效表达IL-7和CCL19细胞因子。
实施例5：Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的体外和体内抗肿瘤功能
该实施例利用上述实施例4建立的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞验证其在体外和体内的抗肿瘤效果，具体包括以下操作。
5.1、Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的体外抗肿瘤功能
5.1.1、分别制备靶细胞和效应细胞，其中靶细胞为12种常见人体不同组织来源的肿瘤细胞系，包括：喉癌细胞系Hep2、非小细胞肺癌细胞系A549、肺鳞癌细胞系NCI-H520、胃癌细胞系BGC803、肝癌细胞系HepG2、结肠癌细胞系LoVo、结直肠癌细胞系HT-29、直肠腺癌细胞系HR8348、卵巢癌细胞系HO8910、SKOV3和OVCAR-8、多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和慢性髓性白血病细胞K562；效应细胞为上述实施例4建立的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，空载体感染的αβT细胞作为对照效应细胞；
5.1.2、调整效应细胞浓度，按效靶比5:1加入50μl效应细胞；同时设置效应细胞自发释放组作为空白对照组；每组均设4-8个复孔；平板于室温400×g离心3分钟，然后置于37℃，5％CO2共孵育6-8小时。按照Promega cytoTox
Figure BDA0002944357980000151
非放射性细胞毒性检测试剂盒(Sigma)说明，LDH方法检测计算各组的杀伤效率(即细胞毒活性)。
检测结果如图32所示，可见与空载体感染的αβT细胞相比，Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞对12种肿瘤细胞中的9种(包括喉癌细胞系Hep2；卵巢癌细胞系HO8910、SKOV3和OVCAR-8；直肠腺癌细胞系HR8348；结肠癌细胞系LoVo；结直肠癌细胞系HT-29；非小细胞肺癌细胞系A549；肺鳞癌细胞系NCI-H520)的杀伤活性显著增强(抑瘤率为9/12＝75％)，但是对血液系统肿瘤细胞系RPMI8226和K562没有显著杀伤活性(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001)。
由图32结果也可知，当效靶比为5:1时，Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞对卵巢癌细胞系OVCAR-8的杀伤活性为50％左右；由图8可知，当效靶比为10:1时，Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞对卵巢癌细胞系OVCAR-8的杀伤活性为30％左右；显然可见，本发明实施例4建立的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞对肿瘤细胞的杀伤活性显著高于本发明实施例1建立的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞的杀伤活性，表明在Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞中，其以自分泌形式表达的细胞因子IL-7和CCL19可以协同增强整个体系的肿瘤细胞杀伤效果，此处仅列出对卵巢癌细胞系OVCAR-8的杀伤活性，也适用于其他对Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞或Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞敏感的肿瘤细胞系，例如喉癌细胞系Hep2；卵巢癌细胞系HO8910、SKOV3；直肠腺癌细胞系HR8348；结肠癌细胞系LoVo；结直肠癌细胞系HT-29；非小细胞肺癌细胞系A549；肺鳞癌细胞系NCI-H520；人B淋巴细胞瘤细胞系Raji；人肺癌细胞系NCI-H2228。
5.2、Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的体内抗肿瘤功能
(1)表达外源Luciferase的OVCAR-8细胞构建
按照实施例4中步骤4.2的方法进行Luciferase-GFP质粒慢病毒包装和纯化，获得表达Luciferase-GFP的慢病毒颗粒，利用其感染对数生长期卵巢癌OVCAR-8细胞；感染72h后，通过GFP标签流式分选阳性的OVCAR-8细胞，获得稳定表达外源Luciferase的OVCAR-8细胞系，用于体内实验的肿瘤活体成像。
(2)OVCAR-8荷瘤小鼠模型建立及细胞过继免疫治疗
共48只NSG小鼠背部位置皮下接种8×106细胞/50μl的表达Luciferase的OVCAR-8细胞，待肿瘤生长至100mm3左右进行小鼠分组和细胞过继免疫治疗；
小鼠共分为4组：空白对照组(注射PBS，磷酸盐缓冲液)、阴性对照组(空载体感染的αβT细胞(空载体细胞)，1×107细胞/只小鼠/次)、阳性对照组(γδT细胞，1×107细胞/只小鼠/次)和OT37×19实验组(Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，1×107细胞/只小鼠/次)。每隔4天治疗一次，共治疗4次。阴性对照组、阳性对照组和OT37×19实验组同时给予腹腔注射IL-2 5000U/只。
每隔4天进行小动物活体成像记录肿瘤生长情况。首先2％异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后腹腔注射体内发光底物Luciferin(终浓度150μg/ml，按小鼠体重1μl/mg)，20分钟后进行图像采集。并记录小鼠的生存情况。
活体成像结果如图33所示，根据活体成像荧光强度，统计各组小鼠体内肿瘤的生长情况，结果如图34所示，可见与空载体细胞和γδT细胞相比，Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞治疗组小鼠肿瘤增长显著减慢(***，P＝0.0002)，证明Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的体内杀伤肿瘤功能和效果。
3.3、Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的体内抗肿瘤剂量选择
小鼠共分为3组：空白对照组(注射PBS)、5×107剂量组(Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，瘤内注射5×107细胞/50μl)、1×107剂量组(Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞，瘤内注射1×107细胞/50μl)。只治疗一次，每隔7天对小鼠进行活体成像一次。
每隔7天进行小动物活体成像记录肿瘤生长情况。首先2％异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后腹腔注射体内发光底物Luciferin(终浓度150μg/ml，按小鼠体重1μl/mg)，20分钟后进行图像采集。并记录小鼠的生存情况。
活体成像结果如图35所示，根据活体成像荧光强度，统计各组小鼠体内肿瘤的生长情况，结果如图36所示，可见与空白对照组相比，1×107剂量组在瘤内注射Vδ2(OT3)Vγ9CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞14天后，肿瘤增长显著减慢，但是随后与空白对照组相比无显著性差异。而5×107剂量组在瘤内注射Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞14天后，肿瘤增长显著减慢，并且至实验终止时持续有效(*，P<0.05；**，P<0.01)。
综上所述，本发明建立的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞和Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞(新型CAR-T细胞)在体内和体外均具有广泛的抗肿瘤作用，对多种实体肿瘤具有良好的体内外治疗效果，并且相对于Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞，Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-IL-7-CCL19-αβT细胞的抗肿瘤细胞效果更佳，其还以自分泌形式表达的细胞因子IL-7和CCL19可以协同增强整个体系的肿瘤细胞杀伤活性，显著增强其灭杀肿瘤效果。因此，该新型CAR-T细胞可以用于制备抗肿瘤(尤其是实体肿瘤，例如喉癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、直肠腺癌、结肠癌、结直肠癌等)的细胞制剂，为CAR-T细胞疗法在实体肿瘤的过继性免疫治疗提供新的且实用的方法和策略。
另一方面，虽然已有文献公开的体内和体外实验证实γδT细胞由于其γδTCR的固有免疫样的识别模式在肿瘤抗原识别上具有特异性和广谱性特点，使其在肿瘤过继免疫治疗上具备无可比拟的优势，但是直接使用天然γδT细胞进行肿瘤免疫治疗也存在着一些问题。例如，对于很多癌症晚期患者，其自体γδT细胞的获得非常困难，且体外扩增后回输到病人体内的单次注输细胞数量需求较高，达到10亿-100亿；并且在临床试验中发现，使用磷酸盐重复刺激γδT细胞会致其出现失能、耗竭和死亡等现象，从而导致γδT细胞所产生的杀瘤效应非常短暂，不能在体内长期存活；另外，因为对γδTCR细胞进行体外扩增所用的单抗来源于小鼠，所以过继回输人体时这种鼠源抗体可能会引起免疫排斥反应。因此，直接使用γδT细胞进行肿瘤免疫治疗就受到限制。而本发明创造性地将通常用于TCR-T技术领域的具有肿瘤结合特异性和广谱性的γδTCR结构的Vγ9和Vδ2(OT3)应用到适用于CAR-T细胞疗法的CAR分子中，结果表明，不仅可以获得一种新型CAR-T细胞，其相对于在血液系统肿瘤治疗中有效的传统CAR-T细胞更加适用于多种实体肿瘤治疗，并且该新型CAR-T细胞可以巧妙地将γδT细胞在肿瘤抗原识别上的广谱性优势和αβT细胞易获得的优势以及CAR-T细胞在肿瘤治疗中高效精准杀伤肿瘤细胞、具有免疫记忆功能、能够长期在体内存活以及在体外扩增后回输到病人体内的单次注输细胞数量较少(仅需1000万-1亿)等优势有效结合起来，有效避免了临床上直接使用癌症患者本人的γδT细胞进行过继治疗所面临细胞因为免疫抑制不能有效扩增而导致数量不足的难题，又解决了传统CAR-T细胞在治疗实体肿瘤时无法有效识别和结合高度异质性的肿瘤相关抗原以及无法浸润到肿瘤组织的问题。因此，本发明提供的新型CAR-T细胞实现了CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗领域的突破。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京佳德和细胞治疗技术有限公司
<120> 胞外段为Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子及表达该分子的CAR-T细胞及其用途
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccattgagt tggtgcctga acaccaaaca gtgcctgtgt caataggggt ccctgccacc 60
ctcaggtgct ccatgaaagg agaagcgatc ggtaactact atatcaactg gtacaggaag 120
acccaaggta acacaatcac tttcatatac cgagaaaagg acatctatgg ccctggtttc 180
aaagacaatt tccaaggtga cattgatatt gcaaagaacc tggctgtact taagatactt 240
gcaccatcag agagagatga agggtcttac tactgttgtg attttccttc tcatactttc 300
cactccaccg gtggccatac aacggacaaa ttaatttttg gtaagggccg gaccggcagc 360
accagcggca gcggcaagcc tggcagcggc gagggaagcg caggtcacct agagcaacct 420
caaatttcca gtactaaaac gctgtcaaaa acagcccgcc tggaatgtgt ggtgtctgga 480
ataacaattt ctgcaacatc tgtatattgg tatcgagaga gacctggtga agtcatacag 540
ttcctggtgt ccatttcata tgacggcact gtcagaaagg aatccggcat tccgtcaggc 600
aaatttgagg tggataggat acctgaaacg tctacatcca ctctcaccat tcacaatgta 660
gagaaacagg acatagctac ctactactgt gccttgtggg agtgggagtt gggcaaaaaa 720
atcaaggtat ttggtcccgg aacaaagctt atcattacag cggccgcatt cgtgccggtc 780
ttcctgccag cgaagcccac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaacca caggaacagg 1020
agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1080
cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1140
cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aagctcctgt atatattcaa acaaccattt 1200
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 1260
gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1320
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1380
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 1440
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1500
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1560
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1617
<210> 2
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 180
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 240
cacaggaac 249
<210> 3
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcccgtttct ctgttgttaa acggggcaga aagaagctcc tgtatatatt caaacaacca 180
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 240
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 300
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 360
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 420
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 480
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 540
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 600
<210> 4
<211> 531
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgttccacg tgagctttag atacatcttt ggcctgccac ctctgatcct ggtgctgctg 60
cctgtggcct cttctgattg tgatatcgag ggaaaagatg gcaagcagta tgagtctgtg 120
ctgatggtgt ctattgatca gctgctggac agcatgaagg aaattgggtc caattgtctg 180
aataacgagt tcaacttctt caagagacac atctgcgacg ccaacaagga gggcatgttc 240
cttttcagag ccgccagaaa gctgaggcag ttcctgaaga tgaatagcac cggcgacttc 300
gacctgcacc tgctgaaggt gagcgagggc accaccatcc tgctgaactg caccggccag 360
gtgaagggca ggaagcccgc cgccctgggc gaggcccagc ccaccaagag cctggaggag 420
aacaagagcc tgaaggagca gaagaaactg aacgacctgt gcttcctgaa gcggctgctg 480
caggagatca agacctgctg gaacaagatc ctgatgggca ccaaggagca c 531
<210> 5
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggccctgc tgctggccct gagcctgctg gtgctgtgga ccagccccgc ccccaccctg 60
agcggcacca atgacgccga ggactgctgc ctgagcgtga cccagaagcc catccctggc 120
tacatcgtga gaaatttcca ctacctgctg atcaaggacg gctgcagagt gcccgccgtg 180
gtgttcacca ccctgagggg cagacagctg tgcgcccccc ccgaccagcc ctgggtggag 240
aggatcatcc agcggctgca gaggaccagc gccaagatga agagaagaag cagc 294
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccaccaact tctctctgct gaagcaggcc ggcgacgtgg aggagaatcc aggacct 57
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgtgagga tctatttccg gtggccacca tggttctgct ggtcaccagc ctgctgctg 59
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagaagttgg tggcgccgct gccgcgaggg ggcagggcct gcatgtgaag 50
<210> 9
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcacatgcag gccctgcccc ctcgcggcag cggcgccacc aacttctctc tgc 53
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggggggaggg agaggggcgg gatctcagct gcttcttctc ttcatcttgg cgctggtcct 60
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gactacaagg acgacgatga caag 24
<210> 12
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc acctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 540
gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taa 573
<210> 13
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Cys Asp Phe Pro Ser His Thr Phe His Ser Thr Gly Gly His Thr Thr
1 5 10 15
Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly
20

Claims (10)

1.一种表达胞外段为Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子的CAR-T细胞，命名为Vδ2(OT3)Vγ9CAR-αβT细胞，所述CAR分子包括胞外段、跨膜段和胞内段；其中所述胞外段位于αβT细胞外，包含γδTCR的γ9链可变区(简称Vγ9)和与Vγ9连接的CDR3区被OT3多肽置换的δ2链的可变区(简称Vδ2(OT3))，所述跨膜段贯穿αβT细胞的细胞膜，用于连接胞外段中的Vγ9和胞内段，所述胞内段位于αβT细胞内。
2.根据权利要求1所述的Vδ2(OT3)Vγ9CAR-αβT细胞，所述跨膜段为CD8a分子，所述胞内段包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链(CD3z)。
3.根据权利要求1或2所述的Vδ2(OT3)Vγ9CAR-αβT细胞，其还以自分泌形式同时表达细胞因子IL-7和/或趋化因子CCL19。
4.一种CAR分子，其包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其中所述胞外段包含与跨膜段相连的γδTCR的γ9链可变区(Vγ9)，和与Vγ9连接的CDR3区被OT3多肽置换的δ2链的可变区(Vδ2(OT3))。
5.根据权利要求4所述的CAR分子，其中所述跨膜段为CD8a分子，所述胞内段包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链(CD3z)。
6.权利要求4或5所述的CAR分子的编码基因，其包含分别编码所述CAR分子的胞外段、跨膜段和胞内段的基因片段，其中编码所述胞外段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述跨膜段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码所述胞内段的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求6所述的CAR分子的编码基因，其还在编码所述胞内段的基因片段的下游连接有细胞因子IL-7和/或趋化因子CCL19的编码基因，其中所述细胞因子IL-7的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述趋化因子CCL19的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。
8.一种携带权利要求6或7所述的CAR分子的编码基因的重组质粒。
9.权利要求1-3中任一项所述的Vδ2(OT3)Vγ9CAR-αβT细胞、或权利要求4或5所述的CAR分子、或权利要求8所述的重组质粒在制备抗肿瘤细胞制剂中的用途；
优选地，所述抗肿瘤细胞制剂还包含治疗有效量的IL-2。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述肿瘤为实体肿瘤，优选为喉癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、直肠腺癌、结肠癌、结直肠癌、肺鳞癌、B淋巴细胞瘤。
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