CN116059329A - 溶瘤病毒与car t细胞联合治疗血液肿瘤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及溶瘤病毒与CAR T细胞联合治疗血液肿瘤的方法。本发明提供了使用互补的转基因溶瘤病毒和遗传工程化的CAR T细胞来治疗肿瘤的方法。在一个实施方式中，所述溶瘤病毒包含编码CD19的核苷酸序列，或编码IL‑12和CD19的核苷酸序列，并且所述遗传工程化T细胞表达识别CD19的嵌合抗原受体(CAR)。

Description

溶瘤病毒与CAR T细胞联合治疗血液肿瘤的方法
技术领域
本发明总体涉及抗肿瘤疗法领域。更具体地，本发明提供了使用互补的转基因溶瘤病毒和遗传工程化的CAR T细胞来治疗血液肿瘤和癌症的方法。
背景技术
免疫治疗在多种肿瘤类型中取得了良好的治疗效果，比如黑色素瘤、肺癌、肾癌等。其中，嵌合抗原受体T细胞(CAR T)细胞疗法治疗急性B淋巴细胞白血病(B-ALL) 的效果尤为卓越。急性淋巴细胞白血病(ALL)是造血干细胞的恶性克隆性疾病。目前，B细胞恶性肿瘤(包括急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性非淋巴细胞白血病 (B-CLL)、非霍奇金淋巴瘤等)是目前适用嵌合抗原受体(CAR)T细胞技术的最佳疾病类型。近年来，靶向CD19或CD22的嵌合抗原受体修饰的T细胞(抗CD19或抗CD22 CAR-T细胞)在治疗急性B淋巴细胞恶性肿瘤中显示出良好的功效。已表明，接受 CD19 CAR-T细胞治疗的急性B-ALL患者的3个月完全缓解率超过80％至90％。虽然对B细胞淋巴瘤的治疗效果不如B-ALL，但完全缓解率可以达到约54％。鉴于抗 CD19 CAR-T在治疗B细胞恶性肿瘤方面的优异表现，美国迄今已批准5个靶向CD19 的CAR-T产品。针对其他抗原(例如CD33或CD123)的CAR T疗法也在密集开发中。
虽然CAR-T疗法在治疗B细胞恶性肿瘤方面取得了较高的完全缓解率，但临床数据显示，在CAR-T细胞疗法后实现完全缓解的患者中，有较大比例在9-12个月内复发。例如，对于接受抗CD19 CAR-T治疗的B-ALL患者，12个月复发率高达43％至55％，其中20％至30％的复发病例的CD19抗原丢失。由于靶抗原丢失，患者无法再选择用抗CD19 CAR-T进行治疗。目前对这些复发的患者没有有效的治疗方法，死亡率非常高。这是目前临床实践中一个重要的未解决需求。
此外，髓系白血病急性髓系白血病(AML)是成人最常见的急性白血病。AML的中位确诊时间在68岁，发病较晚，并且预后差，整体五年生存率小于30％，且对于大于65岁的患者，5年生存率小于10％。标准治疗方案在过去的40年中没有明显改变，主要是多疗程的强化化疗方案。高强度放化疗后造血干细胞移植能够明显提高高危很复发难治AML患者的预后，但它也会伴随后续的治疗相关并发症甚至死亡。
虽然CAR T治疗在B细胞肿瘤治疗中取得了很好的临床效果，但针对AML尚未有疗效明确、安全耐受的CAR T细胞产品。造成这种情况的原因主要在于AML 缺乏合适的靶点。目前针对AML的CAR T靶点主要有Lewis-Y、CLL1、CD33、 CD123、CD44-V6与FLT-3等。CD33与CD123皆因在造血干细胞中也有表达使得 CD33 CAR T细胞与CD123细胞在回输后造成严重的造血系统毒性。因此，针对髓系白血病的CAR T细胞也有巨大的临床需求。
溶瘤病毒(oncolytic virus)是能够感染肿瘤细胞、在肿瘤细胞中复制并最终杀死肿瘤细胞但不伤害健康细胞的天然存在的或遗传修饰的病毒。已经提出水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)可以用作溶瘤病毒来治疗肿瘤。这种病毒不会与正常细胞中的内源IFN-β相互作用，只能在肿瘤细胞中选择性地扩增和生长。
VSV能够表达多种细胞表面分子，包括低密度脂蛋白受体、磷脂酰丝氨酸、唾液脂(sialolipid)和硫酸类肝素，并且能够通过这些分子附着于细胞表面。与目前正在开发的其他溶瘤细胞病毒平台相比，VSV具有以下优势：(i)基因组小，复制时间短，跨突触速度快；(ii)外源基因表达极高，因此其可以具有高滴度，允许大规模生产；(iii) 有独立的细胞周期，且在宿主细胞的细胞质中没有转化的风险。这种溶瘤病毒不会整合到DNA中，经过减毒后，可以避免野生型病毒所引起的神经系统炎症。鉴于上述特点，VSV在肿瘤免疫疗法中具有很好的潜力。
虽然VSV具有上述优点，但是当VSV单独用于肿瘤免疫疗法时，存在一定的技术瓶颈。因此，需要开发新的策略将重组VSV溶瘤病毒的应用与其他治疗相结合，本发明利用溶瘤病毒将特异性靶点，比如CD19人为带到血液肿瘤中，与相关CAR T 细胞联合应用，解决血液肿瘤缺乏特异靶抗原的缺陷以及CAR T细胞治疗血液瘤，抗原丢失复发的问题，两者协同，以期发挥最佳的抗肿瘤效果。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物用于治疗个体肿瘤的用途，该组合物包含：(i)溶瘤病毒，其包含编码抗原或编码IL-12和抗原的核苷酸序列；和(ii)遗传工程T细胞，其表达识别所述溶瘤病毒编码的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。在一个实施方式中，抗原是CD19。在一个实施方式中，抗原是仅包含胞外结构域和跨膜结构域的截短的CD19。在一个实施方式中，CD19抗原包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6 或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。在一个实施方式中，T细胞获自所述个体。溶瘤病毒的代表性实例包括但不限于牛痘病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、腺病毒或痘病毒。在一个实施方式中，溶瘤病毒是水疱性口炎病毒。
在一个实施方式中，溶瘤病毒包含含有氨基酸突变的M蛋白，所述M蛋白与SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列相比，M蛋白的氨基酸取代包含N32S、N49D、M51R、 H54Y、V221F、V225I、S226R。即所述M蛋白的氨基酸取代包含在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)；和在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)；和在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)；和在第54位的组氨酸突变为酪氨酸 (H54Y)；在第221位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)；和在225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)；和在第226位的丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
在一个实施方式中，M蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个实施方式中，溶瘤病毒包含G蛋白，该G蛋白包含一个或多个氨基酸突变V53I、A141V、D172Y、 K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I和Y487I。在一个实施方式中，G蛋白包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列。
在一个实施方式中，溶瘤病毒以肿瘤外或肿瘤内方式施用至个体。在一个实施方式中，所述工程T细胞通过静脉内、动脉内或淋巴管内递送施用至个体。
在一个实施方式中，所述个体进一步接受其他治疗，例如但不限于手术、免疫疗法、化疗、放疗、靶向疗法、激素疗法、干细胞疗法或输血。
在一个实施方式中，个体患有肿瘤，例如急性淋巴母细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤等血液肿瘤。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种治疗患有肿瘤的个体的方法，包括以下步骤：(i)向个体施用包含编码抗原或IL-12和抗原的核苷酸序列的溶瘤病毒；和(ii) 向个体施用表达识别溶瘤病毒编码的抗原的嵌合抗原受体的遗传工程化T细胞。在一个实施方式中，抗原是CD19。在一个实施方式中，CD19抗原包含SEQ ID NO:5或 SEQ ID NO：6或SEQID NO:7的氨基酸序列。在一个实施方式中，抗CD19 CAR 包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一个实施方式中，T细胞获自所述个体。溶瘤病毒的代表性实例包括但不限于牛痘病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、腺病毒或痘病。在一个实施方式中，溶瘤病毒是水疱性口炎病毒。
在另一个实施方式中，本发明提供了溶瘤病毒和遗传工程化T细胞在制备用于治疗患有肿瘤的个体的药物中的应用，其中，所述溶瘤病毒包含编码抗原，或编码IL-12 和抗原的核苷酸序列，所述遗传工程化T细胞包含表达识别所述溶瘤病毒编码的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。
在一个实施方式中，溶瘤病毒包含含有氨基酸突变的M蛋白，所述M蛋白与SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列相比，M蛋白的氨基酸取代包含N32S、N49D、M51R、 H54Y、V221F、V225I、S226R。在一个实施方式中，M蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个实施方式中，溶瘤病毒包含G蛋白，该G蛋白包含一个或多个氨基酸突变V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、 F453L、T471I和Y487I。在一个实施方式中，G蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个实施方式中，溶瘤病毒以肿瘤外(如静脉、皮下、肌肉等)或肿瘤内方式施用至个体。在一个实施方式中，所述工程化T细胞通过静脉内、动脉内或淋巴管内递送施用至个体。
在一个实施方式中，所述个体进一步接受其他治疗，例如但不限于手术、免疫疗法、化疗、放疗、靶向疗法、激素疗法、干细胞疗法或输血。
在一个实施方式中，个体患有肿瘤，例如急性淋巴母细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤等血液肿瘤。
本发明的这些和其他方面将从随后的附图描述和本发明的详细描述中阐明。
附图说明
在此参考附图仅以示例方式描述本发明的一些实施方式。现详细地特别参考附图，强调所示的细节是示例性的并且是为了对本发明实施方式进行说明性论述。在这点上，对本领域技术人员而言，结合附图进行的描述使如何实施本发明的实施方式变得显而易见。
图1显示了携带全长CD19或截短的CD19多肽的VSV-CD19的图谱。
图2显示了携带IL-12和全长CD19或截短的CD19多肽的VSV-CD19-IL12的图谱。
图3显示了抗CD19 CAR的一个实施方式的图谱。
图4显示了K562细胞在以不同的MOI与表达CD19的重组VSV病毒温育后的细胞活力。
图5显示了在以不同的MOI与表达CD19的重组VSV病毒一起温育的K562细胞上的CD19表达。
图6显示了CD19 CAR T细胞对表达全长CD19(CD19-VSV)或截短的CD19(TrunCD19-VSV)的靶细胞的体外杀伤。细胞群为：仅CD19 CAR-T细胞，CD19 CAR-T 细胞和载有CD19全长重组VSV的靶细胞(CD19 CAR-T细胞+CD19-VSV)，CD19 CAR-T细胞和载有表达截短TrunCD19的重组VSV的靶细胞(CD19 CAR-T细胞 +TrunCD19-VSV)，仅重组VSV病毒(CD19-VSV)，仅具有截短TrunCD19的重组VSV 病毒(TrunCD19-VSV)，和未转导的T细胞(UTD)。E:T比：1.25:1、2.5:1和5:1。
图7显示CD19敲除的小鼠B细胞淋巴瘤细胞系Raji(左图)或野生型Raji细胞(右图)中的CD19表达。
图8显示采用CD19 CAR T细胞、重组VSV病毒以及CD19 CAR T细胞和重组 VSV病毒的组合治疗后的小鼠B细胞淋巴瘤模型中的肿瘤体积变化。
具体实施方式
多种实施方式涉及利用互补的溶瘤病毒和CAR T细胞来治疗肿瘤的方法。在多种实施方式中，溶瘤病毒被工程化为包含编码抗原(例如CD19)或表达编码IL-12和抗原的核苷酸序列。
在若干实施方式中，溶瘤病毒被工程化为表达编码抗原(例如CD19)或表达编码IL-12和抗原(例如CD19)并诱导肿瘤细胞和/或癌细胞表面上的异位抗原的转基因表达。在若干实施方式中，T细胞被工程化为表达能够识别异位表达的抗原的CAR。在若干实施方式中，如下治疗患有癌或肿瘤的个体：向该个体施用溶瘤病毒以诱导：(i)癌细胞或肿瘤细胞膜外表面上或肿瘤细胞膜内的(异位)抗原表达；(ii)或肿瘤细胞表达IL-2和(异位)抗原表达；(3)和向该个体进一步施用识别溶瘤病毒表达的(异位)抗原的互补性CAR T细胞，该抗原可以诱导针对所述癌细胞或肿瘤细胞的免疫反应。
在一个实施方式中，本文提供的组合物和方法可用于治疗靶抗原或肿瘤抗原丧失或表达低的复发癌症病例。例如，本文提供的组合物和方法可用于治疗CD19抗原丧失或CD19表达低的复发癌症病例，包括组合使用工程化溶瘤病毒和工程化CAR T 细胞。在一个实施方式中，溶瘤病毒被工程化在癌细胞或肿瘤细胞表达全长或截短的 CD19。在一个实施方式中，截短的CD19仅包含CD19的细胞外结构域和跨膜结构域。因此，当工程化的溶瘤病毒感染恶性肿瘤B细胞时，一方面，工程化的溶瘤病毒将恢复CD19靶抗原或肿瘤抗原丧失的肿瘤细胞上CD19的高表达，即标靶肿瘤细胞；另一方面溶瘤病毒的高复制随后又导制恶性B细胞被裂解。此外，癌症患者将通过重新输注CD19 CAR T细胞来治疗CD19标靶的肿瘤。
为了提高治疗效果，本发明还可以在溶瘤病毒载体中加入细胞因子IL-12。IL-12是一种具有抗肿瘤作用的多效细胞因子；其抗肿瘤机制包括以下方面：(a)促进IFN-γ的产生；(b)增加NK细胞和CD4-T细胞的活化；(c)增加CD8-T细胞的细胞毒作用； (d)通过诱导抗血管生成细胞因子和趋化因子的产生来促进抗血管生成作用；(e)参与肿瘤细胞外基质的重塑等等。
因此，本发明结合了三种抗肿瘤机制，并且抗肿瘤作用将是协同性的。本发明不仅使CD19抗原阴性的复发患者有再次接受治疗的机会，还将发挥更强的抗肿瘤作用，从而使患者更大程度地获益。
因此，在一个实施方式中，为了解决用CD19 CAR T治疗B细胞恶性肿瘤时靶抗原丧失或靶抗原不明确的问题，本发明提供了携带全长或截短的CD19的重组溶瘤病毒，或携带IL-12和全长或截短的CD19的重组溶瘤病毒(例如，水疱性口炎病毒 VSV)与CD19 CAR T细胞的联合应用。技术方案如下：
1.为了更好地保证安全性，本发明中使用的重组溶瘤病毒(例如，VSV)是通过对其M蛋白进行点突变而获得的减毒株。在一个实施方式中，M蛋白的氨基酸取代包含N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R。
2.在该减毒毒株的基础上，构建了具有G蛋白突变的病毒株，该G蛋白突变位点包括以下中的一种或多种：53位的缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)(V53I)；141位的丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)(A141V)；172位的天冬氨酸(D)突变为酪氨酸(Y) (D172Y)；217位的赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)(K217E)；232位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G)(D232G)；331位(V)的缬氨酸突变为丙氨酸(A)(V331A)；371位的缬氨酸 (V)突变为谷氨酸(E)(V371E)；436位的甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)(G436D)；438 位的苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)(T438S)；453位的苯丙氨酸(F)突变为亮氨酸(L) (F453L)；471位的苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)(T471I)；487位的酪氨酸(Y)突变为异亮氨酸(I)(Y487I)。
3.基于本文所述的减毒溶瘤病毒株，构建了包含编码全长或截短的CD19的序列的重组VSV，或编码IL-12和全长或截短的CD19的序列的重组VSV。IL-12可以促进T细胞的增殖和分化，并且广泛用于癌症治疗，例如黑色素瘤或肾癌。VSV包含5种功能性蛋白。在本发明中，编码CD19或编码IL12和全长或截短的CD19的序列被插入编码G蛋白和L蛋白的序列之间。工程化的VSV的图谱如图1和图2所示。
4.CD19 CAR慢病毒载体构建和CD19 CAR T细胞制备。在一个实施方式中， CD19CAR包含CD8信号肽、CD19抗体(FMC63)单链可变区、铰链区、跨膜区、4-1BB 胞内区和CD3ζ。将这些序列串联起来并构建在具有合适的限制性位点的表达慢病毒载体中，即，CD19 CAR慢病毒载体。该CD19 CAR的图谱如图3所示。
5.在一个实施方式中，所制备的携带全长或截短的CD19的重组VSV溶瘤病毒与CD19 CAR T细胞同时应用。在另一个实施方式中，所制备的携带全长或截短的 CD19的重组VSV溶瘤病毒与CD19 CAR T细胞依次应用。例如，溶瘤病毒在施用 CD19 CAR T细胞之前或之后施用,或者同时使用。
在一个实施方式中，本文公开的方法包括：通过静脉内注射(肿瘤外如静脉、皮下、肌肉等)或肿瘤内一次或多次瘤内注射施用本文所述的重组VSV溶瘤病毒，同时静脉内输注CD19 CAR-T细胞。在另一个实施方式中，在施用重组VSV溶瘤病毒后12至72小时，通过静脉内输注施用CD19 CAR-T细胞。或者顺序相反，通过静脉内输注施用CD19 CAR-T细胞，再静脉内注射(肿瘤外如静脉、皮下、肌肉等) 或肿瘤内一次或多次注射施用本文所述的重组VSV溶瘤病毒；或者用本文所述的重组VSV溶瘤病毒和CD19 CAR-T细胞共同在体外孵化，用CD19CAR-T细胞携带溶瘤病毒到肿瘤部位进行治疗。
术语溶瘤病毒用于描述优先感染或转导肿瘤细胞或癌细胞的病毒或病毒载体。在一些情况下，用溶瘤病毒感染或转导肿瘤细胞能够导致该细胞裂解和/或死亡，但裂解和/或死亡并非必需。在本文所述的多种实施方式中，溶瘤病毒被工程化为诱导CAR T细胞靶抗原的异位表达。任何合适的溶瘤病毒都可用于将转基因表达赋予肿瘤细胞。在一些实施方式中，溶瘤病毒通过通常已知的技术来工程化以获得所需属性，这可以包括细胞向性、病毒减毒和增强的转基因表达。多种经修饰的病毒或病毒载体可用作溶瘤病毒，包括但不限于呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒 (VSV)、新城疫病毒(NDV)、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、腺病毒和痘病毒(例如痘苗病毒)。
在一个实施方式中，溶瘤病毒被工程化携带被CAR T细胞识别的靶抗原的编码序列。在一些实施方式中，靶抗原是外源性的，意味着抗原来自不同的物种。在一些实施方式中，靶抗原是内源性抗原，例如通常在肿瘤细胞上表达的抗原。在一个实施方式中，溶瘤病毒被工程化为携带靶抗原(例如CD19)的编码序列。在一些实施方式中，靶抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方式中，TAA涵盖了呈递在细胞表面上或存在于肿瘤环境中(例如在肿瘤微环境中)的分子或其一部分。在一些实施方式中，细胞是肿瘤细胞。
在若干实施方式中，个体自身的T细胞被工程化成表达能够识别特定抗原以诱导免疫反应的CAR。本领域普通技术人员将容易地构建具有特定特异性和功能的CAR。在若干实施方式中，为了工程化来自个体自身的T细胞的CAR T细胞，从个体或者异体收获T细胞并将所需的CAR构建体诱导到T细胞中，随后可以将其作为治疗的一部分返回个体。在若干实施方式中，基于个体的特定癌症或肿瘤，可以对个体进行进一步的治疗，例如手术、免疫疗法、化疗、放疗、靶向疗法、激素疗法、干细胞疗法和输血。
在整个说明书中，术语肿瘤、瘤或癌(或肿瘤细胞和癌细胞)可互换使用。如本领域所理解的，肿瘤、瘤或癌是组织的新的异常生长，因此包括良性生长(例如良性瘤) 和癌性生长。类似地，癌是细胞的异常生长，其有可能转移并扩散到身体的其他部位。因此，本文描述的多种实施方式可应用于肿瘤和癌，除非指定为其中一种特有的。
本文所述的工程化溶瘤病毒和工程化T细胞可以根据任何合适的治疗方案施用至个体或者异体。在一些实施方式中，施用溶瘤病毒使其到达肿瘤细胞生长部位。在一些实施方式中，通过肿瘤内递送来施用溶瘤病毒。在多种实施方式中，通过肿瘤内或肿瘤外递送(例如静脉内、肌内或皮下递送)来施用溶瘤病毒。溶瘤病毒可以分散在药学上可接受的注射制剂中。在多种实施方式中，向个体施用约105、106、107、108、 109、1010、1011、1012或1013pfu量级的病毒。在多种实施方式中，向个体多次施用溶瘤病毒，包括1、2、3、4、5、6次或更多次。在一些实施方式中，工程化的CAR T细胞通过静脉内、动脉内或淋巴管内递送来施用。
如本文所用，术语“药物组合物”涉及用于施用至个体的组合物。在一些实施方式中，药物组合物包含本文所述的溶瘤病毒，用于肿瘤内或肿瘤外递送(例如静脉内、肌内或皮下递送)施用，或用于直接注射至肿瘤中。在一些实施方式中，包含本文所述的工程化溶瘤病毒或工程化CAR T细胞的药物组合物通过输注或注射施用至个体。
在一些实施方式中，溶瘤病毒和/或CAR T细胞作为疗程的一部分以治疗有效量施用。如本文所用，“治疗”意指改善待治疗的病症的至少一种症状或提供有益的生理学效果。例如，一种这样的症状改善可以是减小肿瘤尺寸。
治疗有效量可以是足以预防、减少、改善或消除癌症状的量。在一些实施方式中，治疗有效量是足以减少肿瘤生长和/或癌转移的量。
根据多种实施方式，多种类型的肿瘤或癌可以通过本文公开的组合物和方法来治疗。可以治疗的肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和血管肿瘤。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”及其同根词意指“包括但不限于”。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数的所指物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种病毒”可以包括多种病毒，包括它们的混合物。
在整个本申请中，本发明的各种实施方式可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应解读为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应当认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当认为具有具体公开的子范围，例如1至3、1至 4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、 5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
无论何时在本文中指明数字范围，其意在包括所指明的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。在第一指示数字和第二指示数字“之间的范围”和从第一指示数字“至”第二指示数字的“范围”在本文中可互换使用，并且意在包括第一和第二指示数字以及它们之间的所有小数和整数。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实践或测试，但下文描述的是示例性的方法和 /或材料。如有冲突，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意指必须是限制性的。本文提及的每篇参考文献或其他引用均通过引用整体并入本文。
在本文呈现的描述中，描述了本发明的每个步骤及其变体。该描述并非意在限制，并且组件、步骤顺序和其他变型的变化应理解为在本发明的范围内。
应当理解，在单独的多个实施方式背景下为了清楚起见而描述的本发明的某些特征也可以以组合方式提供在单个实施方式中。相反，在单个实施方式背景下为了简洁起见而描述的本发明的各种特征也可以分开或以任何合适的子组合方式适当地提供在本发明的任何其他描述的实施方式中。在多种实施方式背景下描述的某些特征不应认为是那些实施方式的必需特征，除非该实施方式在没有这些要素时无法实施。
上文所描述和所附权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面得到以下实施例中的实验支持。
虽然本文已经说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员将想到许多修改、替换、改变和等同方式。因此应当理解，所附权利要求意在涵盖落入本发明真正主旨内的所有这些修改和变化。
实施例1.携带全长CD19(VSV-CD19)或截短的CD19(VSV-TrunCD19)、或携带IL-12和全长CD19(VSV-IL12-CD19)或IL-12和截短的CD19 (VSV-IL-12-TrunCD19)的重组VSV减毒株的构建
M基质蛋白基因突变质粒的构建
基于野生型VSV毒株MN164438.1，使用野生型VSV株MN164438.1作为引入突变位点的模板，采用点突变法筛选出具有M基因突变的减毒株。在一个实施方式中，具体的突变是：M蛋白的氨基酸取代包含N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、 V225I、S226R。即所述M蛋白的氨基酸取代包含在第32位的天冬酰胺突变为丝氨酸(N32S)；和在第49位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N49D)；和在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M51R)；和在第54位的组氨酸突变为酪氨酸(H54Y)；在第221 位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(V221F)；和在225位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V225I)；和在第226位的丝氨酸突变为精氨酸(S226R)。
该方法简述如下：首先，利用Thermo Mutation Generation System Kit对M基因进行点突变，得到M基因突变的pVSV质粒文库。病毒再活化后获得M突变VSV 病毒株，并进行体外和体内筛选实验以获得高溶瘤性、弱致病性的减毒株。野生型 VSV病毒株MN164438.1的M基质蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。突变的减毒株的突变M基质蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
G蛋白基因突变质粒的构建
在上述M突变质粒的基础上构建了G蛋白基因突变质粒。使用野生型VSV株MN164438.1作为引入突变位点的模板。具体突变如下：53位的缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)；141位的丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)；172位的天冬氨酸(D)突变为酪氨酸 (Y)；217位的赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)；232位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G)； 331位(V)的缬氨酸突变为丙氨酸(A)；371位的缬氨酸(V)突变为谷氨酸(E)；436位的甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)；438位的苏氨酸(T)突变为丝氨酸(S)；453位的苯丙氨酸(F)突变为亮氨酸(L)；471位的苏氨酸(T)突变为异亮氨酸(I)；487位的酪氨酸(Y)突变为异亮氨酸(I)。采用分子克隆的方法将G蛋白突变基因连接至去除了原始G蛋白基因的骨架载体(上文所述的M蛋白突变质粒载体)，从而构建G蛋白和M蛋白突变质粒载体。野生型VSV病毒株MN164438.1的G蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。突变减毒株的突变G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
病毒再活化
根据MOI＝5，用表达T7 RNA聚合酶的痘病毒vTF7-3接种BHK-21细胞。感染 1小时后，用DPBS缓冲液冲洗BHK-21细胞一次。然后制备质粒转染预混液，其具体包含：pBS-N、pBS-P、pBS-L以及上面制备的突变质粒。其中，pBS-N、pBS-P和 pBS-L是指分别克隆了VSVN、VSV P和VSV L蛋白基因的表达质粒，分别表达病毒再活化所需的N、P和L蛋白。根据lipofectamine 2000说明书中描述的方法进行质粒转染。4小时后，更换为含有10％胎牛血清的新鲜DMEM完全培养基。48小时后吸出上清液，用0.22μm过滤器过滤痘病毒。将滤液加入新鲜的BHK-21细胞中；每天观察细胞病变情况，细胞出现病变时取上清。经RT-PCR确认后，通过病毒噬斑实验纯化病毒。获得了减毒菌株。
携带全长CD19(VSV-CD19)或截短TrunCD19(VSV-TrunCD19)的重组VSV病毒的构建
将人工合成的具有限制性酶切位点Xho I和Mlu I的CD19全长序列(氨基酸序列SEQ ID NO:5)或截短的TrunCD19序列(氨基酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7) 克隆到实施例1中制备的M基质蛋白减毒突变株的G蛋白和L蛋白之间的非编码区中，得到携带全长CD19或截短TrunCD19多肽的重组VSV质粒。VSV-CD19载体的图谱如图1所示。如上文所述对VSV-CD19载体进行再活化。
携带IL-12和全长CD19(VSV-IL12-CD19)，或IL-12和截短TrunCD19的重组 VSV病毒(VSV-IL-12-TrunCD19)的构建
将人工合成的具有限制性酶切位点Xho I和Mlu I的IL12序列(氨基酸序列SEQ IDNO:8)以及CD19全长序列(氨基酸序列SEQ ID NO:5)或截短的TrunCD19序列(氨基酸序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7)克隆到实施例1中制备的M基质蛋白减毒突变株的G蛋白和L蛋白之间的非编码区中，得到携带IL-12和全长CD19或截短 TrunCD19多肽的重组VSV质粒。IL-12序列与CD19(全长序列或截短的TrunCD19) 序列之间有T2A接头，业内专业技术人员都能熟练使用。
VSV-CD19-IL12载体的图谱如图2所示。如上文所述对VSV-IL12-CD19载体进行再活化。
实施例2.CD19 CAR慢病毒载体的构建与制备
由苏州金维智生物科技有限公司人工合成了由CD8信号肽、CD19抗体(FMC63) 单链可变区、铰链区、跨膜区、4-1BB胞内区和CD3ζ链组成的CD19 CAR序列(核苷酸序列SEQ IDNO:9，氨基酸序列SEQ ID NO:10)，并通过克隆位点Nhe I和Sal I 将其克隆至慢病毒PCDH-EF1α-MCS-T2A-copGFP。
使用天根无内毒素质粒大提试剂盒对CD19 CAR慢病毒载体及其辅助载体 psPAX2和PMD2.G质粒进行提取和定量。
实施例3.CD19 CAR慢病毒制剂
293T细胞的转染：第0天，铺板：对293FT细胞进行0.25％胰蛋白酶消化，铺板在含有10ml DMEM(含10％FBS)的10cm培养皿中，在37℃、5％CO2恒温培养培中养箱，24小时后细胞融合度达到90％-95％。
转染前两小时，更换293FT细胞培养基。将CD19 CAR慢病毒载体和辅助载体与PEI混合，抽吸均匀，室温静置15分钟，得到DNA/PEI混合物。将制备好的DNA/PEI 混合物逐滴加入293FT细胞中，继续温育4-6小时，然后更换培养基。
转染后24小时和48小时收集细胞上清液，通过0.45μM过滤器过滤，并以25,000rpm在4℃下超速离心2小时。最后，用PBS溶解病毒沉淀块。
实施例4.CD19 CAR-T细胞制备
使用Ficoll淋巴细胞分离器分离外周血单个核细胞(PBMC)。用CD3和CD28抗体激活T细胞24小时。T细胞活化后，以MOI＝5的比例用所制备的慢病毒感染T 细胞。感染72小时后，使用上海近岸CAR19检测试剂盒进行流式免疫荧光染色，分析CD19 CAR的感染效率，并确认CD19 CAR在T细胞上的表达。确认表达后，在含有IL-2(500U/ml)的X-VIVO15无血清培养基中继续培养10至14天，以完成靶向嵌合抗原受体T细胞的制备。
实施例5.表达CD19或截短的TrunCD19以提供CD19 CAR-T靶抗原
(1)收集K562细胞(CD19表达阴性)，用PBS洗涤后调整细胞浓度至2x107/ml；
(2)加入5mM eFlouor670，终浓度为5μM，37℃水浴避光10分钟；
(3)加入6倍体积的1640完全培养基，冰上温育5分钟，停止标记；
(4)用PBS洗涤，10ml，3次；
(5)用X-VIVO15(5％人AB血清)重悬经标记的K562细胞，并将细胞浓度调整为1x106/ml。
(6)取1ml经标记的K562细胞，即1x106个细胞，在不同的MOI(例如MOI为0、 1、2、4)下与表达CD19的重组VSV病毒在24孔板中的X-VIVO15(5％人AB血清) 中温育8小时，然后用PBS清洗以更换培养基。一半的细胞用7-AAD染色以评估细胞活力；同时，将另一半细胞样品用抗CD19染色以通过流式细胞术评估CD19的表达。如图4所示，随着病毒量增加，K562细胞中的7-AAD阳性率增加，表明细胞活力下降。如图5所示，随着重组VSV病毒量增加，表达CD19的K562细胞的比率增加。当MOI为1时，阳性率高达94.3％。
实施例6.CD19 CAR-T细胞对感染了表达全长或截短的CD19的重组VSV病毒的K562细胞的体外杀伤
(1)将K562-CD19稳定株和CAR T细胞以1.25:1、2.5:1和5:1的不同靶比率温育。细胞组为：仅CD19 CAR-T细胞；CD19 CAR-T细胞和载有CD19全长重组VSV的靶细胞(CD19 CAR-T细胞+CD19-VSV)；CD19 CAR-T细胞和载有表达截短TrunCD19 的重组VSV的靶细胞(CD19CAR-T细胞+TrunCD19-VSV)；仅重组VSV病毒 (CD19-VSV)；仅具有截短TrunCD19的重组VSV病毒(TrunCD19-VSV)；和未转导的 T细胞。简单地每孔添加100μl效应细胞至靶细胞。细胞一式三份温育16至24小时 (具体时间通过显微镜观察肿瘤杀伤效果来确定，并且溶瘤病毒组的具体时间与实验组一致)。包括仅具有靶细胞的孔和仅具有效应细胞的孔作为自发死亡的对照。
(2)杀灭肿瘤的温育完成后，进行Promega的CytoTox-GloTM细胞毒性试剂盒的实验步骤，每孔加入50μl细胞毒性测定试剂，室温下温育15分钟，并在酶标仪上读数。
读数完成后，每孔加入50μl裂解试剂，室温下温育15分钟，在酶标仪上读数。
(3)根据下式计算杀灭效率：
细胞毒性％＝(RLU实验-RLU效应细胞自发-RLU靶细胞自发)/(RLU靶细胞最大-RLU靶细胞自发)
图6显示了CD19 CAR T细胞对表达全长或截短TrunCD19的靶细胞的体外杀伤。与单独使用CD19 CAR-T细胞时相比，CD19 CAR T和表达CD19的VSV的联用显著提高了杀伤效率。
实施例7.小鼠B细胞淋巴瘤模型中的治疗效果
(1)利用CRISPR基因敲除技术在人B细胞淋巴瘤中敲除CD19的表达。
CD19 sgRNA的正向引物：5'CACCGATGAAAAGCCAGATGGCCAG 3'(SEQ ID NO:11)，CD19 sgRNA的反向引物：5'AAACCTGGCCATCTGGCTTTTCATC 3'(SEQ ID NO:12)。构建到Px330载体中，并转移到小鼠B细胞淋巴瘤细胞系Raji中。72 小时后，使用有限稀释法将电穿孔的细胞转移到96孔板中。当细胞克隆生长时，使用流式免疫荧光染色检测细胞表面的CD19表达，并选择CD19表达阴性的克隆(见图 7)。扩增培养物供以下实验使用。
(2)小鼠实验
选择6-8周龄的B-NSG雌性小鼠，用CD19表达呈阴性的Raji对小鼠进行皮下接种，2x106/小鼠。当上述淋巴瘤的移植瘤长到10mm3时开始治疗。瘤内注射重组 VSV病毒，108pfu/小鼠，24小时后尾静脉注射CD19 CAR T细胞，1x107/小鼠，具体设计见表1。
表1治疗组
Figure BDA0003746708350000151
每两天用游标卡尺测量肿瘤体积。如图8所示，与单独使用CD19 CAR T细胞或单独使用重组VSV病毒治疗的组相比，CD19 CAR T细胞和重组VSV病毒联合治疗组的肿瘤体积显著减少。

Claims (15)

1.溶瘤病毒和遗传工程化T细胞在制备用于治疗患有肿瘤的个体的药物中的应用，其中，所述溶瘤病毒包含编码抗原或IL-12和抗原的核苷酸序列，所述遗传工程化T细胞包含表达识别所述溶瘤病毒编码的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述抗原是CD19。
3.如权利要求2所述的应用，其中，所述CD19抗原包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQID NO:7的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的应用，其中，所述CAR包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的应用，其中，所述T细胞获自所述个体/或异体。
6.如权利要求1所述的应用，其中，所述溶瘤病毒包含含有M蛋白氨基酸突变的M蛋白，并且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，所述M蛋白的氨基酸突变包括N32S、N49D、M51R、H54Y、V221F、V225I、S226R。
7.如权利要求6所述的应用，其中，所述M蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的应用，其中，所述溶瘤病毒包含G蛋白，所述G蛋白包含多个氨基酸突变V53I、A141V、D172Y、K217E、D232G、V331A、V371E、G436D、T438S、F453L、T471I和Y487I。
9.如权利要求8所述的应用，其中，所述G蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的应用，其中，所述溶瘤病毒是水疱性口炎病毒(VSV)。
11.如权利要求1所述的应用，其中，所述溶瘤病毒通过肿瘤外或肿瘤内方式施用。
12.如权利要求11所述的应用，其中，所述溶瘤病毒通过静脉内、皮下或肌内方式施用。
13.如权利要求1所述的应用，其中，所述工程化T细胞通过静脉内、动脉内或淋巴管内递送来施用。
14.如权利要求1所述的应用，其中，所述个体进一步接受手术、免疫疗法、化疗、放疗、靶向疗法、激素疗法、干细胞疗法或输血。
15.如权利要求1所述的应用，其中，所述肿瘤是血液瘤，包括但不限于急性淋巴母细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病、慢性非淋巴细胞白血病或非霍奇金淋巴瘤。
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