RU2390558C2 - Гемопоэтическая клетка cd34+ и ее применение - Google Patents
Гемопоэтическая клетка cd34+ и ее применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2390558C2 RU2390558C2 RU2007107369/13A RU2007107369A RU2390558C2 RU 2390558 C2 RU2390558 C2 RU 2390558C2 RU 2007107369/13 A RU2007107369/13 A RU 2007107369/13A RU 2007107369 A RU2007107369 A RU 2007107369A RU 2390558 C2 RU2390558 C2 RU 2390558C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- trail
- cell
- tumor
- apoptosis
- Prior art date
Links
- 210000004524 haematopoietic cell Anatomy 0.000 title abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 229
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims abstract description 100
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 30
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 30
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 10
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000018594 Tumour necrosis factor Human genes 0.000 abstract 1
- 108050007852 Tumour necrosis factor Proteins 0.000 abstract 1
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 87
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 60
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 16
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 15
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 14
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 14
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 14
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 7
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 5
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 4
- 108091007178 TNFRSF10A Proteins 0.000 description 4
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 4
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 3
- 230000005735 apoptotic response Effects 0.000 description 3
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 3
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000044949 human TNFSF10 Human genes 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050005848 Annexin A10 Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700003785 Baculoviral IAP Repeat-Containing 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100021662 Baculoviral IAP repeat-containing protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710082513 C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100025752 CASP8 and FADD-like apoptosis regulator Human genes 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000914211 Homo sapiens CASP8 and FADD-like apoptosis regulator Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100032817 Integrin alpha-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010041014 Integrin alpha5 Proteins 0.000 description 1
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010040149 Junctional Adhesion Molecule B Proteins 0.000 description 1
- 108010040135 Junctional Adhesion Molecule C Proteins 0.000 description 1
- 102100023429 Junctional adhesion molecule C Human genes 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 108700000711 bcl-X Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464436—Cytokines
- A61K39/464438—Tumor necrosis factors [TNF], CD70
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/49—Breast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/48—Regulators of apoptosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению гемопоэтических клеток из крови, и может быть использовано в медицине. Гемопоэтическую клетку CD34+ выделяют из периферической крови раковых пациентов, прошедших курс лечения фактором роста. Полученную клетку трансдуцируют лигандом, индуцирующим апоптоз с участием фактора некроза опухоли, и используют для лечения опухолей. Изобретение позволяет получить гемопоэтическую клетку CD34+, обладающую противоопухолевой активностью. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к мигрирующим в опухоль клеткам, экспрессирующим лиганд (TRAIL), индуцирующий апоптоз с участием фактора некроза опухолей, и их использованию в противоопухолевой терапии.
Уровень техники
Нарушение регуляции механизмов апоптоза играет ключевую роль в патогенезе и прогрессии лимфопролиферативных нарушений, позволяющих неопластическим клеткам выживать дольше периода их обычной продолжительности жизни и, возможно, приобретать химио- и радиорезистентность [1]. Таким образом, пути апоптоза представляют собой привлекательную терапевтическую мишень в восстановлении чувствительности злокачественных клеток к апоптозу или активации агонистов апоптоза [2]. Для модуляции генов и белков апоптоза может быть рассмотрено несколько стратегий, которые нацелены либо на внутренние (Bcl-2, Bcl-XL), либо на внешние (DR4, DR5, FLIP), либо на конвергентные (cIAP2) пути апоптоза [3].
Лиганд (TRAIL), индуцирующий апоптоз с участием фактора некроза опухоли, принадлежит к семейству факторов некроза опухоли (TNF) - лигандов рецепторов гибели [клеток] [4].
Выделенные последовательности ДНК, кодирующие TRAIL, векторы экспрессии, включающие в себя упомянутые последовательности ДНК, и рекомбинантные полипептиды TRAIL описаны в патентной заявке WO 97/01633.
TRAIL связывается с рецептором гибели клеток 4 (DR4) и рецептором гибели клеток 5 (DR5), которые экспрессируются на клеточной поверхности многих раковых клеток [5]. Связывание растворимого TRAIL с DR4 или DR5 ведет к активации каспазы и апоптозу [6].
Liu Zhongyu et al., J Clin Invest. Vol 112, no.9, 9.11.2003, 1332-1341 описывают дендритные клетки, в которые с помощью рекомбинантного аденовируса трансдуцирован TRIAL, и потенциальное медицинское применение в лечении артрита. Никаких упоминаний о возможном применении упомянутых клеток в лечении опухолей сделано не было.
Исследования in vitro и in vivo предполагают, что благодаря высокой специфичности в отношении раковых клеток, так же как и высокой противоопухолевой активности, растворимый рекомбинантный TRAIL должен играть ключевую роль в противораковой терапии [7]. Действительно, TRAIL селективно индуцирует апоптоз во многих трансформированных клетках, не затрагивая нормальные клетки [4]. Кроме того, внесение TRAIL мышам демонстрирует значительную эффективность против опухолевых ксенотрансплантатов карциномы кишечника [8, 9], рака молочной железы [10], множественной миеломы (болезнь Рустицкого-Калера) [11] или глиомы [12, 13].
Изучение токсичности на мышах и нечеловекообразных приматах показало, что нормальные гепатоциты и кератиноциты резистентны к тримеризованной версии TRAIL [14, 15], тогда как они демонстрировали достоверную чувствительность к индукции апоптоза неоптимизированными препаратами TRAIL или сшитыми с антителами вариантами лиганда [16]. Может ли печеночная токсичность представлять собой большую проблему при применении тримеризованной версии TRAIL в высоких дозах, остается неясным.
Дополнительное ограничение применения растворимого TRAIL связано со слабым апоптотическим ответом, наблюдавшимся в достаточном количестве случаев изучения разнообразных линий опухолевых клеток, которые требуют либо продолжительной инкубации, либо очень высоких доз растворимого TRAIL для того, чтобы подвергнуться апоптозу [17, 18]. Полученный после внутривенной инъекции фармакокинетический профиль TRAIL (время полужизни в плазме - 32 минуты, а половина времени элиминации - 4,8 часов), условия продолжительной экспозиции и высокие концентрации неприменимы в стратегии лечения in vivo [10]. Чтобы преодолеть ограничения, связанные с растворимым рекомбинантным TRAIL и в особенности с опухолевыми клетками-мишенями, в настоящее время на различных животных моделях применяется несколько подходов, в которых используется перенос генов TRAIL, опосредованный аденовирусом [19, 20].
Однако эффективность подходов с использованием переноса генов в значительной степени зависит от эффективности инфицирования опухоли и от того, насколько можно избежать эффективного иммунного клиренса [21]. Кроме того, в отношении системных инъекций аденовирусных векторов все еще существует несколько вопросов, связанных с их безопасностью [22]. Например, аденовирусный перенос гена TRAIL преодолевает ослабленный апоптотический ответ клеток гепатомы, но вызывает агрессивный апоптоз в первичных гепатоцитах человека [19]. В настоящее время генно-терапевтические подходы с использованием аденовирусов основаны главным образом на внутриопухолевом высвобождении аденовируса, кодирующего TRAIL [23]. Несмотря на локальную противоопухолевую активность, внутриопухолевое высвобождение TRAIL не имеет системной противоопухолевой активности, утрачивая, таким образом, какое-либо клиническое значение.
Известно, что различные типы клеток мигрируют предпочтительно в опухоли [24], и их можно нагрузить конструкциями, необходимыми для продуцирования противораковых молекул. Благодаря таким миграционным характеристикам клетки CD34+ [25] и природные клетки-киллеры (NK) [26] могут быть использованы в качестве носителей для доставки противораковых молекул.
После внутривенного вливания клетки CD34+ демонстрируют специфические свойства миграции, включающие в себя способность к постоянной колонизации костного мозга и временной колонизации печени и селезенки [27-30]. Эти миграционные свойства строго связаны с экспрессией рецепторов адгезии (например, CXCR-4, VLA-4, VLA-5, CD44 и т.д.), которые взаимодействуют со специфическими лигандами (например, SDF-1, VCAM-1 и т.д.), экспрессируемыми на клетках стромы, присущих микроокружению костного мозга, а также микроокружению
опухоли [31-34].
NK-клетки представляют собой субпопуляцию лимфоцитов, которая играет существенную роль в клеточной иммунной защите против клеток опухоли через механизмы, не ограничивающиеся главным комплексом гистосовместимости [35]. После внутривенного вливания NK-клетки мигрируют в костный мозг и лимфоидные органы и проникают в участки опухоли под действием соответствующих сигнальных цитокинов. Поэтому многие группы [исследователей] пытались использовать NK-клетки для миграции в опухоли с терапевтическими целями [36-38].
Хотя способность NK-клеток к миграции в опухоли известна, генетически модифицированные клетки претерпевают стресс, который зависит от типа перенесенного гена. В результате упомянутого стресса клетки могут утрачивать исходную способность к миграции в опухоль после переноса гена TRIAL. Поэтому нет особых оснований рассчитывать на успех, и в каждом случае необходима экспериментальная проверка для подтверждения того, жизнеспособен ли данный конкретный подход.
Ныне было обнаружено, что клетки CD34+ и NK-клетки, сконструированные, чтобы экспрессировать TRAIL, могут быть с успехом использованы для получения опосредованной клетками противоопухолевой активности in vivo.
Описание изобретения
В соответствии с данным изобретением, путем опосредованного аденовирусом переноса гена мигрирующие в опухоли клетки конструируются для продуцирования лиганда (TRAIL), индуцирующего апоптоз с участием фактора некроза опухоли. Клетки согласно изобретению могут вводиться систематически для выделения TRAIL в месте [нахождения] опухоли, не вызывая указанных выше затруднений.
Соответственно, данное изобретение относится к клеткам, мигрирующим в опухоли и экспрессирующим TRAIL и содержащим их клеточным препаратам. Изобретение также относится к использованию упомянутых клеток в препаратах клеточных композиций для противораковой терапии, в частности для терапии лимфомы у человека.
Клетки согласно изобретению могут быть получены путем трансдукции в мигрирующие в опухоль клетки дефектно реплицируемого аденовируса, кодирующего ген TRAIL человека (Ad-TRAIL) под контролем подходящего промотора, например промотора CMV. Трансдукция может быть выполнена в соответствии со способами, известными молекулярным биологам, предпочтительно следуя процедуре, описанной в примерах.
Термин «мигрирующие в опухоль» клетки используется в соответствии с данным изобретением для обозначения клеток, способных (1) после внутривенной инъекции мигрировать в опухолевую ткань и (2) экспрессировать адекватные количества мембранно-связанного TRAIL (mTRAIL) в течение по меньшей мере нескольких дней.
Примеры мигрирующих в опухоль клеток, способных мигрировать из крови в опухолевые метастазы, включают в себя гемопоэтические клетки, а именно гемопоэтические клетки CD34+ из периферической крови пациентов с раковыми опухолями, леченных фактором роста; NK-клетки из периферической крови; цитокин-индуцированные клетки-киллеры (CIK), полученные из культуры ex vivo одноядерных клеток периферической крови; эндотелиальные клетки и эндотелиальные клетки-предшественники; инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL); лимфокин-активируемые клетки-киллеры (LAK); макрофаги; мезенхимные стволовые клетки (MSC) (свежевыделенные из периферической крови или тканей человека или выращенные ex vivo) и даже клеточные линии человека, сохраняющие способность обнаруживать опухоль и сконструированные для экспрессии mTRAIL. Чтобы получить адекватную экспрессию mTRAIL, могут быть рассмотрены несколько способов с применением плазмид и вирусных векторов с соответствующими регуляторными генетическими элементами, такими как тканеспецифические промоторы и/или энхансеры.
Клетки CD34+ и NK особенно предпочтительны.
Оптимальная эффективность трансдукции NK-клеток может быть достигнута путем преинкубации NK-клеток в течение 18 часов с N-ацетилцистеином (10 мМ). После преинкубации NK-клетки подвергались градуальной (50-500) множественной трансфекции (MOI) Ad-TRAIL (50-500) в бессывороточных условиях при 37°С. Затем вносили среду с добавлением сыворотки (RPMI-1640/FBS (фетальная бычья сыворотка) 20%), несколько часов спустя к культуре добавляли Gene Booster (1:200), а затем дополнительно инкубировали еще в течение 18 часов.
Сходные условия могут применяться к клеткам CD34+, за исключением преинкубации с N-ацетилцистеином.
Композиции согласно изобретению могут быть получены с применением носителей, пригодных для парентерального, в частности внутривенного введения, такого как указано в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Например, наполнители, которые могут быть использованы, включают в себя любые фармацевтические агенты, которые не являются вредными для пациента, получающего композицию, например воду, физиологический раствор, глицерин и этанол, если требуется, в смеси с дополнительными веществами, такими как увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферы и пр. Соответствующие дозы зависят, среди прочих факторов, от пола, возраста и состояния пациента, подвергающегося лечению, тяжести заболевания. Соответствующее эффективное количество может быть легко определено любым специалистом, практикующим в данной области, и может быть каким-либо образом определено путем клинических исследований. Терапевтически эффективная доза обычно составляет примерно от 103 до 1015 трансдуцированных клеток. Другие дозировки, несомненно, могут быть установлены путем общепринятых экспериментов, т.е. на основании кривых «доза-ответ», определения максимально переносимой дозы (MTD) или проведения на ограниченном количестве пациентов 1-й фазы клинических исследований. Дозировка при лечении может представлять собой разовую дозу или многодозовый режим. Далее, пациенту можно вводить столько доз, сколько это необходимо. Специалист в данной области легко определит наиболее эффективный режим дозировок.
Далее данное изобретение будет более подробно проиллюстрировано с помощью следующих примеров, представляющих ясные и убедительные доказательства того, что
(i) стволовые клетки CD34+, так же как и NK-клетки, могут быть эффективно трансдуцированы in vitro аденовектором, экспрессирующим TRAIL;
(ii) после трансдукции эти клеточные подтипы временно экспрессируют TRAIL на своей клеточной поверхности;
(iii) такая краткая длительность экспрессии TRAIL связана с мощным апоптотическим эффектом, обнаруживаемым и в TRAIL-чувствительных, и в TRAIL-резистентных опухолевых клетках, культивируемых совместно с трансдуцированными клетками;
(iv) инъекция трансдуцированных клеток [мышам линии] NOD/SCID in vivo на ранней или продвинутой стадии развития опухоли связана с достоверным продлением выживания мышей, что предполагает, что трансдуцированные аденовирусом клетки CD34+ и NK-клетки могут эффективно служить в качестве носителей для системной доставки TRAIL для терапевтических целей.
Эффективность внутривенного введения представляет собой отчетливое преимущество данного изобретения по сравнению с протоколами, основанными на внутриопухолевом введении.
Тогда как механизмом противоопухолевого эффекта mTRAIL-экспрессирующих клеток человека in vitro, наиболее вероятно, является апоптоз, запускаемый непосредственной реакцией между mTRAIL и распознающим его рецептором на клетках опухолей, механизм его противоопухолевой активности in vivo нам неизвестен. Непосредственный цитолиз опухолевых клеток, возможно, связан с косвенными ингибирующими рост эффектами, возникающими вследствие апоптоза расположенных в опухоли неопухолевых клеток, экспрессирующих рецепторы TRAIL (сосудистые, периваскулярные, интерстициальные и другие типы клеток, играющие критическую роль в развитии опухоли и выживании опухолевых клеток). Нижеследующие эксперименты направлены на лучшее понимание механизма наблюдающейся in vivo противоопухолевой активности, однако никоим образом не предназначены для ограничения изобретения какой-либо из гипотез действительного механизма наблюдаемой активности.
Пример 1 - Запуск апоптоза in vitro в клеточных линиях лимфомы, культивируемых совместно с клетками CD34+ или NK-клетками, экспрессирующими TRAIL после опосредованного аденовирусом переноса гена
Оценивали эффекты совместного культивирования клеточных линий лимфомы с клетками CD34+ или NK-клетками, сконструированными с тем, чтобы они экспрессировали TRAIL после опосредованного аденовирусом переноса гена.
В первоначальных экспериментах in vitro аденовирусный вектор, экспрессирующий TRAIL (Ad-TRAIL), использовали для установления оптимальных условий аденовирусного инфицирования клеток CD34+ и NK-клеток. Период действия экспрессии TRAIL на клеточной поверхности клеток CD34+ и NK-клеток затем контролировали с применением конъюгированных с фикоэритрином (PE) анти-TRAIL-моноклональных антител (клон Rik-2). Наконец, способность мембранно-связанного TRAIL индуцировать апоптоз в клеточных линиях лимфомы оценивали при совместном культивировании клеток Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клеток и клеточных линий лимфомы.
Способы
Аденовирус, кодирующий ген TRAIL человека. В этих экспериментах применяли дефектно реплицируемый аденовирус, кодирующий ген TRAIL человека (Ad-TRAIL), экспрессирующийся под промотором CMV [39]. Ad-TRAIL содержит полную кодирующую последовательность TRAIL человека, клонированную в сайтах XhoI и NoiI pAd5CMVK-NpA. Полученную плазмиду и основные аденовирусные последовательности (Ad5) с делецией гена E1 трансфицировали в эмбриональные почечные клетки [линии] 293 человека, выделяли вирусные частицы и амплифицировали для анализа экспрессии TRAIL. Рекомбинантные аденовирусы проверяли на наличие способного к репликации вируса с помощью теста на бляшкообразование A549, а титр вируса определяли бляшкообразованием на клетках [линии] 293. Очищенные вирусы помещали в фосфатный буфер (PBS) с 3% сахарозы и хранили при -80°С до использования. Продукт гена TRAIL экспрессировался на клеточной поверхности трансдуцированных клеток и мог быть обнаружен с помощью проточной цитометрии.
Аденовирусная трансдукция клеток CD34+. Клетки CD34+ для трансдукции Ad-TRAIL были получены из периферической крови давших на это согласие раковых пациентов, получавших химиотерапию и леченных гемопоэтическими факторами роста. Клетки CD34+ из образцов лейкофереза обогащались с помощью иммуномагнитной техники и позитивного отбора (Miltenyi Biotech). Для аденовирусной трансдукции клетки CD34+ наносили [при плотности] 2 × 106/мл на 35 мм чашки Петри в 1 мл бессывороточной среды (IMDM), содержащей соответствующее разведение исходного Ad-TRAIL, позволяющего получить конечный уровень инфицирования в диапазоне от 100 до 1000. После инкубации (37°С, 5% CO2) в течение 2 часов к культурам добавляли 1 мл IMDM/FBS (фетальной телячьей сыворотки) 20%, а 4 часа спустя добавляли GeneBooster (1:200). Затем клетки инкубировали в течение 18 часов, после чего тщательно отмывали (3×) в среде, содержащей сыворотку, и, наконец, оценивали эффективность трансдукции по прямой иммунофлуоресценции с применением PE-конъюгированных анти-TRAIL-антител.
Аденовирусная трансдукция NK-клеток. NK-клетки для трансдукции получали из периферической крови давших на это согласие здоровых доноров. NK-клетки обогащали с помощью иммуномагнитной техники и позитивного отбора (Miltenyi Biotech). Перед трансдукцией NK-клетки инкубировали (18 часов, 37°С) в RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и N-ацетилцистеина (10 мМ). Для аденовирусной трансдукции NK-клетки помещали [при плотности] 2 × 106/мл на 35 мм чашки Петри в 1 мл бессывороточной среды (RPMI-1640), содержащей в подходящем разведении исходный Ad-TRAIL, с получением конечной множественности инфицирования (или заражения) (MOI) в диапазоне от 50 до 500. После инкубации (37°С, 5% CO2) в течение 2 часов к культурам добавляли 1 мл RPMI-1640/FBS20%, а 4 часа спустя добавляли GeneBooster (1:200). Клетки дополнительно инкубировали в течение 18 часов, затем тщательно отмывали (3×) в среде, содержащей сыворотку, и, наконец, эффективность трансдукции оценивали по прямой иммунофлуоресценции с помощью PE-конъюгированных анти-TRAIL-антител.
Совместные культуры. Активность клеток CD34+ или NK-клеток, экспрессирующих TRAIL на своей наружной мембране, в запуске апоптоза тестировали in vitro в экспериментах по совместному культивированию. Кратко, клетки Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клетки (эффекторные клетки) культивировали совместно с клетками лимфомы (клетки-мишени). Индукцию апоптоза оценивали через 24 и 48 часов после начала совместного культивирования. В этих экспериментах соотношение «эффекторные клетки: клетки-мишени» рассчитывали на основе эффективности трансдукции эффекторных клеток.
Результаты
Аденовирусная трансдукция клеток CD34+. Предварительные эксперименты показали, что оптимальная эффективность трансдукции клеток CD34+ последовательно достигалась воздействием на клетки CD34+ (2 × 106/мл) градуального MOI Ad-TRAIL (диапазон 100 - 1000) в бессывороточных условиях в течение 2 часов (37°С). Затем добавляли равный объем среды с добавлением сыворотки (IMDM/FBS 20%), а 4 часа спустя к культурам добавляли Gene Booster (1:200), и дополнительно инкубировали в течение 18 часов. В конце клетки тщательно отмывали (3×) в среде, содержащей сыворотку, и оценивали экспрессию трансгена по прямой иммунофлуоресценции с использованием PE-конъюгированных анти-TRAIL-антител.
Тогда как в контрольных клетках фоновый сигнал TRAIL не был обнаружен, в клетках, на которые воздействовал Ad, выявили [определенный] процент TRAIL-позитивных клеток CD34+, который повышался, в зависимости от MOI. В репрезентативном эксперименте процент TRAIL-позитивных клеток CD34+ составлял 25% и 84% при MOI 100 и 1000 соответственно.
Описанный выше протокол инфицирования соответственно приводил к максимальной эффективности переноса гена в клетки CD34+, экспрессирующие TRAIL, при MOI, равной 1000, со средним значением (± стандартное отклонение (SD)) 83 ± 8% (в диапазоне 70 - 95%, n = 5). На жизнеспособность клеток, оцениваемую по тесту на высвобождение красителя трипанового синего, MOI до 1000 не влияла (>85% жизнеспособных клеток).
Чтобы оценить временной характер экспрессии трансгена, клетки CD34+ трансдуцировали MOI 1000 и анализировали на предмет экспрессии TRAIL до 7 дней после трансдукции. В этих экспериментах, чтобы обеспечить выживание клеток CD34+, в культуру добавляли малые дозы (3 нг/мл) гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF). Как показано в таблице 1, существенный процент клеток CD34+ (25%) продолжал экспрессировать TRAIL до 120 часов после трансдукции.
Таблица 1 Дополнительное время экспрессии трансгена клетками CD34+, трансдуцированными Ad-TRAIL |
|||||
Часы после инфекции | 24 | 48 | 72 | 120 | 168 |
% клеток CD34*, экспрессирующих TRAIL | 95 | 70 | 42 | 25 | 13 |
Аденовирусная трансдукция NK-клеток. Предварительные эксперименты показали, что оптимальная эффективность трансдукции NK-клеток соответственно достигается путем преинкубации NK-клеток в течение 18 часов с N-ацетилцистеином (10 мМ). После преинкубации NK-клетки (2 × 106/мл) подвергались градуальной MOI Ad-TRAIL (диапазон 50-500) в бессывороточных условиях в течение 2 часов (37°С). Затем добавляли равный объем среды с добавлением сыворотки (RPMI-1640/FBS 20%), а 4 часа спустя добавляли Gene Booster (1:200) и далее инкубировали в течение 18 часов. Наконец, клетки тщательно отмывали (3×) в среде, содержащей сыворотку, и оценивали экспрессию трансгена по прямой иммунофлуоресценции с использованием PE-конъюгированных анти-TRAIL-антител.
Клетки, на которые воздействовал Ad, демонстрировали процент TRAIL-позитивных NK-клеток, который возрастал в зависимости от MOI. В репрезентативном эксперименте проценты TRAIL-позитивных NK-клеток составляли 30%, 45% и 46% при MOI 50, 100 и 500 соответственно.
Вышеописанный протокол инфицирования стойко давал максимальную эффективность переноса гена при MOI, равной 100, со средним значением (±SD) 61 ± 18% (диапазон 45 - 84%, n = 4) NK-клеток, экспрессирующих TRAIL. На жизнеспособность клеток, оцениваемую по тесту на высвобождение красителя трипанового синего, MOI на уровне 100 не влияла (>85% жизнеспособных клеток).
Чтобы оценить период экспрессии трансгена, NK-клетки трансдуцировали MOI 100 и анализировали на экспрессию TRAIL до 7 дней после трансдукции. Как показано в Таблице 2, трансдуцированные NK-клетки продолжали экспрессировать TRAIL до 168 часов после трансдукции.
Таблица 2 Дополнительное время экспрессии трансгена NK-клеток, трансдуцированных Ad-TRAIL |
|||||
Часы после инфицирования | 24 | 48 | 72 | 120 | 168 |
% клеток CD34*, экспрессирующих TRAIL | 41 | 55 | 60 | 63 | 55 |
Совместные культуры. В конце оценивали способность мембранно-связанного TRAIL запускать апоптоз в лимфоидных клеточных линиях путем совместного культивирования клеток Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клеток (эффекторные клетки) и опухолевых клеточных линий (клетки-мишени). Для этих экспериментов были избраны две клеточные линии в соответствии с их чувствительностью к растворимому TRAIL. В частности, использовали чувствительную к TRAIL клеточную линию KMS-11 и TRAIL-резистентную клеточную линию JVM-2.
Клетки CD34+ или NK-клетки, трансдуцированные при оптимальных условиях в соответствии с протоколами инфицирования, описанными выше, собирали через 24 часа после первичного воздействия аденовируса, тщательно отмывали и культивировали совместно с клетками KMS-11 или JVM-2.
Когда клетки Ad-TRAIL/CD34+ культивировались совместно в соотношении «эффекторные клетки: клетки-мишени» 0,8:1, существенная часть (81%) апоптотических и некротических клеток обнаруживается среди клеток KMS-11 через 24 часа совместного культивирования. Количество апоптотических клеток затем возрастает после 48 часов совместного культивирования (93% апоптотических клеток).
Когда Ad-TRAIL/NK-клетки совместно культивировались при соотношении «эффекторные клетки: клетки-мишени» 0,6:1, существенная часть (83%) апоптотических и некротических клеток обнаруживается среди клеток KMS-11 через 24 часа совместного культивирования. Количество апоптотических клеток затем возрастает после 48 часов совместного культивирования (85% апоптотических клеток).
Для TRAIL-чувствительной клеточной линии KMS-11 мощность апоптотического эффекта, вызываемого мембрано-связанным TRAIL, было сходным с таковым, вызванным 24 - 48-часовым воздействием большой дозы (100 нг/мл) растворимого TRAIL (Таблица 3). Однако данный фармакокинетический профиль TRAIL после внутривенной инъекции (время полужизни в плазме - 32 минуты и полупериод выведения - 4,8 часа) при непрерывном 48- или даже 24-часовом воздействии при уровне 100 нг/мл не может быть достигнут in vivo.
Таблица 3 Влияние растворимого TRAIL на клетки KMS-11 |
||
Количество растворимого TRAIL | % жизнеспособных клеток через 24 часа | % жизнеспособных клеток через 48 часов |
0 нг/мл | 78 | 75 |
100 нг/мл | 27 | 2 |
Были также выполнены эксперименты по совместной инкубации клеток Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клеток с резистентной к растворимому TRAIL клеточной линией JVM-2.
Когда клетки Ad-TRAIL/CD34+ культивировались совместно при соотношении «эффекторные клетки: клетки-мишени» 0,8:1, через 48 часов совместного культивирования обнаруживалась существенная часть (51%) апоптотических и некротических клеток TRAIL-резистентной [линии] JVM-2.
Когда Ad-TRAIL/NK-клетки культивировались совместно при соотношении «эффекторные клетки: клетки-мишени» 0,6:1, через 48 часов совместного культивирования обнаруживалась существенная часть (53%) апоптотических и некротических клеток TRAIL-резистентной [линии] JVM-2.
На TRAIL-резистентной клеточной линии JVM-2 мощность апоптотического эффекта, вызванного мембранно-связанным TRAIL, была достоверно выше, чем вызванного 48-часовым воздействием большой дозы (100 нг/мл) растворимого TRAIL (Таблица 4).
Таблица 4 Влияние растворимого TRAIL на клетки JVM-2 |
||
Количество растворимого TRAIL | % жизнеспособных клеток через 24 часа | % жизнеспособных клеток через 48 часов |
0 нг/мл | 87 | 84 |
100 нг/мл | 86 | 80 |
Для дальнейшего изучения мощности апоптотической активности опосредованного клетками выделения TRAIL эффекторные клетки (клетки Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клетки) культивировали совместно с клетками-мишенями (клеточная линия KMS-11) в течение 24 часов при различных соотношениях «эффектор: мишень».
Как показано в Таблице 5, клетки Ad-TRAIL/CD34+ запускают апоптоз или некроз в значительной доле (66%) клеток KMS-11 при совместном культивировании при соотношении эффектор: мишень 0,4:1.
Таблица 5 Индукция апоптоза при совместном культивировании клеток Ad-TRAIL/CD34+ и клеток KMS-11 в течение 24 часов при возрастающих соотношениях «эффектор: мишень» (E:T) |
||||
Соотношение CD34+/KMS-11 | 0:1 | 0,08:1 | 0,4:1 | 0,8:1 |
% остаточных жизнеспособных клеток | 71 | 67 | 34 | 22 |
Как показано в Таблице 6, Ad-TRAIL/NK-клетки запускают апоптоз или некроз в значительной доле (64%) клеток KMS-11 при совместном культивировании при соотношении эффектор: мишень, составляющем 0,3:1.
Таблица 6 Индукция апоптоза при совместном культивировании Ad-TRAIL/NK-клеток и клеток KMS-11 в течение 24 часов при возрастающих соотношениях E:T |
||||
Соотношение NK/KMS | 0:1 | 0,06:1 | 0,3:1 | 0,6:1 |
% жизнеспособных клеток | 66 | 68 | 36 | 19 |
Пример 2 - Оценка противораковой активности клеток CD34+ или NK-клеток, сконструированных для экспрессии TRAIL после опосредованного аденовирусом переноса гена, на мышах NOD/SCID in vivo
Чтобы исследовать терапевтический потенциал клеток Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клеток, мышам NOD/SCID вводили TRAIL-чувствительную клеточную линию множественной миеломы KMS-11. Затем мышам инъецировали клетки Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клетки, и выживание мышей служило показателем противоопухолевой эффективности выделения TRAIL клетками.
Способы
Оценка противоопухолевой активности клеток Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клеток. Самок мышей NOD/SCID в возрасте шести-восьми недель с весом тела 20-25 г приобретали на фирме Charles River (Милан, Италия). Мышей помещали в стандартные лабораторные условия в соответствии с установленными правилами. Экспериментальные процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Национального Ракового Института (Istituto Nazionale Tumori) и выполнялись в соответствии с правилами Координационного Комитета по Раковым Исследованиям Соединенного Королевства.
Мышам внутривенно (в/в) вводили клетки KMS-11 (0,5 × 106 на мышь). Лечение клетками Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клетками (1 × 106 на мышь) состояло в еженедельных в/в-инъекциях в течение 4 недель, начиная с 7-го или 17-го дня после введения опухолевых клеток. Средняя эффективность трансдукции повторно вводимых клеток Ad-TRAIL/CD34+ или Ad-TRAIL/NK-клеток составила 83 ± 8% и 61 ± 18% соответственно. Таким образом, каждая мышь получала в среднем 3,32 × 106 экспрессирующих TRAIL клеток CD34+ и 2,44 × 106 экспрессирующих TRAIL NK-клеток за четыре инъекции. Мышей дважды в неделю проверяли на появление опухоли, вес тела и токсичность. Регистрировали срок выживания в каждой группе и оценивали различия между группами с помощью статистического анализа. Соответствующие контрольные группы включали в себя (i) мышей, инъецированных только опухолевыми клетками, (iii) мышей, инъецированных опухолевыми клетками плюс нетрансдуцированными клетками CD34+ или NK-клетками.
Результаты
Клетки Ad-TRAIL/CD34+. Мышей, которым были пересажены клетки KMS-11 (0,5 × 106 на мышь), лечили четырьмя в/в-инъекциями клеток Ad-TRAIL/CD34+ на еженедельной основе в соответствии с двумя разными режимами, т.е. лечение ранней стадии опухоли, которое начиналось на 7-й день, и лечение продвинутой стадии опухоли, которое начиналось на 17-й день после инъекции клеток KMS-11. Так как средняя эффективность трансдукции повторно вводимых клеток Ad-TRAIL/CD34+ составляла 83 ± 8% (среднее ± SD, n = 9), каждая мышь получала в среднем 3,32 × 106 экспрессирующих TRAIL клеток CD34+ за четыре инъекции.
Как показано на фиг.1, средняя выживаемость мышей NOD/SCID, инъецированных только клетками KMS-11, составила 56 дней. Инъекция клеток CD34+ дикого типа не влияла на среднюю выживаемость (56 дней), тогда как мыши NOD/SCID, которых лечили клетками Ad-TRAIL/CD34+ на ранней стадии опухоли, имели среднюю выживаемость в 111 дней (P <0,0001).
Эффект лечения с помощью Ad-TRAIL/CD34+ на продвинутой стадии опухоли изображен на фиг.2. Средняя выживаемость мышей NOD/SCID, инъецированных только клетками KMS-11, составила 56 дней. Инъекция клеток CD34+ дикого типа не влияла на среднюю выживаемость (56 дней), тогда как лечение с помощью клеток Ad-TRAIL/CD34+ на продвинутой стадии опухоли было связано с достоверным возрастанием средней выживаемости (98 дней, P <0,007).
Ad-TRAIL/NK-клетки. Мышей, которым были пересажены клетки KMS-11 (0,5 × 106 на мышь), лечили четырьмя в/в-инъекциями Ad-TRAIL/NK-клеток на еженедельной основе. Повторные вливания NK-клеток начинались на 7-й день после инъекции клеток KMS-11 на ранней стадии роста опухоли. В этих экспериментах средняя эффективность трансдукции вводимых Ad-TRAIL/NK-клеток составила 61 ± 18%. Таким образом, каждая мышь получала в среднем 2,44 × 106 экспрессирующих TRAIL NK-клеток за четыре инъекции.
Как показано на фиг. 3, средняя выживаемость мышей NOD/SCID, инъецированных только клетками KMS-11, составила 56 дней. Инъекция NK-клеток дикого типа не влияла на среднюю выживаемость (50 дней), тогда как лечение Ad-TRAIL/NK-клетками на ранней стадии опухоли было связано с достоверным увеличением средней выживаемости (74 дня, P <0,03).
Пример 3 - Противоопухолевая активность клеток CD34/Ad-TRAIL in vitro против клеточных линий рака молочной железы
Значительная часть клеточных линий рака молочной железы резистентна к индуцированному TRAIL апоптозу в результате действия множества механизмов, включающих в себя секвестрирование TRAIL неспецифическими рецепторами TRAIL, утрату экспрессии рецепторов R1 и R2, сверхпродукцию FLIP и т.д. [40]. Основываясь на своих предшествующих результатах, показывающих, что резистентные к растворимому TRAIL (sTRAIL) клеточные линии лимфомы действительно становятся чувствительными к TRAIL при воздействии мембранно-связанного TRAIL (mTRAIL), авторы исследовали чувствительность двух клеточных линий рака молочной железы к sTRAIL и mTRAIL.
Чувствительность клеточных линий рака молочной железы к уничтожающему эффекту sTRAIL оценивали по сравнению с оценкой запуска апоптоза in vitro в sTRAIL-чувствительных и sTRAIL-резистентных клеточных линиях рака молочной железы, культивируемых совместно с клетками CD34/Ad-TRAIL.
Использовали две клеточные линии рака молочной железы, т.е. MCF-7 и MDA-MB-361. Чтобы оценить чувствительность индивидуальных клеточных линий к уничтожающему эффекту sTRAIL, опухолевые клетки (5-10 × 104/мл) в течение 72 часов подвергали воздействию низкой (10 нг/мл) и высокой (100 нг/мл) доз sTRAIL. Затем апоптоз оценивали по двойному окрашиванию аннексин-V/пропидиум йодидом.
Способы
Клеточные линии. Клеточные линии рака молочной железы MCF-7 и MDA-MB-361 были приобретены на фирмах DSMZ (Брауншвейг, Германия, Евросоюз) и ATCC (Манассас, Вирджиния, США) соответственно. Клетки периодически проверяли полимеразной цепной реакцией на контаминацию микоплазмой. Все эксперименты in vitro выполнялись на экспоненциально растущих клетках.
Экспрессия аннексина-V. Анализ с помощью аннексина V-FITC (флуоресциенизотиоцианат) (PharMingen) использовали для количественного определения процента клеток, претерпевающих ранний или поздний апоптоз и некроз. Кратко, анализируемые клетки отмывали дважды холодным PBS, а затем ресуспендировали в связывающем буфере (10 нМ HEPES, 140 нМ NaCl, 5 нМ CaC12, pH 7,4). После инкубации 0,1 мл клеточной суспензии переносили в 5 мл культуральную пробирку и добавляли 5 мкл аннексин V-FITC и 10 мкл пропидиум йодида. После интенсивного перемешивания образцы инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. В конце инкубации добавляли 0,4 мл связывающего буфера и клетки немедленно анализировали с помощью проточной цитометрии.
Результаты
Чтобы исследовать, связана ли инкубация с sTRAIL с запуском апоптоза, клеточные линии MCF-7 и MDA-MB-361 подвергали воздействию sTRAIL (10 - 100 нг/мл, 72 часа), а затем процент апоптотических и некротических клеток определяли с помощью анализа на клеточном сортере с возбуждением флуоресцеции (FACS). Как показано в Таблице 7, воздействие sTRAIL не могло индуцировать апоптотический ответ в клетках MCF-7, тогда как оно проявилось в достоверном ответе в виде гибели клеток MDA-MB-361 при воздействии 100 нг/мл sTRAIL в течение 72 часов. В соответствии с этими результатами MCF-7 является sTRAIL-резистентной клеточной линией, тогда как MDA-MB-361 является sTRAIL-чувствительной клеточной линией.
Таблица 7 Чувствительность клеточных линий рака молочной железы к sTRAIL |
||||
Клеточная линия | sTRAIL (нг/мл) | |||
Фенотип | 0 | 10 | 100 | |
Апоптотические + некротические клетки (%) | ||||
MCF-7 | BC | 10 | 9 | 13 |
MDA-MB-361 | BC | 6 | 9 | 46 |
После этого оценивали запуск апоптоза in vitro в клеточных линиях рака молочной железы, культивируемых совместно с клетками CD34+, экспрессирующими TRAIL после опосредованного аденовирусом переноса гена (CD34/Ad-TRAIL).
Способы
Аденовирус, кодирующий ген TRAIL человека. Для этих экспериментов использовали дефектно реплицируемый аденовирус, кодирующий ген TRAIL человека (Ad-TRAIL), экспрессирующийся под промотором CMV [39]. Ad-TRAIL содержит полную кодирующую последовательность TRAIL человека, клонированную в сайтах XhoI и NotI pAd5CMVK-NpA. Образовавшуюся плазмиду и основные аденовирусные последовательности (Ad5) с делецией гена E1 трансфицировали в эмбриональные почечные клетки человека [линии] 293, выделяли вирусные частицы и амплифицировали для анализа экспрессии TRAIL. Рекомбинантные аденовирусы проверяли на наличие способного к репликации вируса с помощью теста на бляшкообразование A549, а титр вируса определяли бляшкообразованием на клетках [линии] 293. Очищенные вирусы помещали в PBS с 3% сахарозы и хранили при -80°С до использования. Продукт гена TRAIL экспрессировался на клеточной поверхности трансдуцированных клеток и мог быть обнаружен с помощью проточной цитометрии.
Аденовирусная трансдукция клеток CD34+. Клетки CD34+, трансдуцируемые Ad-TRAIL, были получены из периферической крови давших на это согласие раковых больных, получавших химиотерапию и леченных гемопоэтическими факторами роста. Клетки CD34+ из образцов лейкофереза обогащались с помощью иммуномагнитной техники и позитивного отбора (Miltenyi Biotech). Для аденовирусной трансдукции клетки CD34+ наносили [с плотностью] 2 × 106/мл на 35 мм чашки Петри в 1 мл бессывороточной среды (IMDM), содержащей соответствующее разведение исходного Ad-TRAIL, что давало возможность для множественности инфицирования (MOI) - 500. После инкубации (37°С, 5% CO2) в течение 2 часов к культурам добавляли 1 мл IMDM/FBS 20%, а 4 часа спустя добавляли GeneBooster (1:200). Далее, клетки инкубировали в течение 18 часов, затем тщательно отмывали (3×) в среде, содержащей сыворотку, и, наконец, оценивали эффективность трансдукции по прямой иммунофлуоресценции с помощью PE-конъюгированных анти-TRAIL-антител.
Совместные культуры. Активность mTRAIL, запускающую апоптоз, тестировали in vitro с помощью экспериментов по совместному культивированию. Кратко, клетки CD34/Ad-TRAIL (эффекторные клетки) культивировали совместно с клетками рака молочной железы (клетки-мишени). Индукцию апоптоза оценивали через 48 часов после начала совместного культивирования. В этих экспериментах использовались соотношения «эффектные клетки: клетки-мишени», составляющие 1:1 и 4:1.
Результаты
Аденовирусная трансдукция клеток CD34+. Оптимальная эффективность трансдукции клеток CD34+ достигалась последовательным воздействием на клетки CD34+ (2 × 106/мл) Ad-TRAIL при MOI - 500 в бессывороточных условиях в течение 2 часов (37°С). Тогда как в контрольных клетках фонового сигнала TRAIL не обнаруживалось, клетки, экспрессирующие TRAIL, демонстрировали процент TRAIL-позитивных клеток CD34+ 93 ± 8% (среднее ± SD). На жизнеспособность клеток, оцениваемую в тесте на высвобождение красителя трипанового синего, MOI -1,000 не влияла (≥ 85% жизнеспособных клеток).
Совместные культивирования. Авторами оценивалась способность mTRAIL запускать апоптоз в клеточных линиях рака молочной железы путем совместного культивирования клеток CD34/Ad-TRAIL (эффекторные клетки) и опухолевых клеток (клетки-мишени). Клетки CD34/Ad-TRAIL собирали через 24 часа после первоначального воздействия на аденовирус, тщательно отмывали и культивировали совместно с клетками MCF-7 или MDA-MB-361. В этих экспериментах использовали два соотношения «эффекторные клетки: клетки-мишени», т.е. 1:1 и 4:1. Результаты суммированы в Таблице 8.
Таблица 8 Уничтожающая опухолевые клетки активность mTRAIL в отношении клеточных линий рака молочной железы |
||
Клеточная линия | Условия культуры | Апоптоз + некроз |
MDA-MB-361 | ||
Контроль | 6 | |
CD34/Ad-TRAIL (соотношение E:T =1:1) | 28 | |
CD34/Ad-TRAIL (соотношение E:T = 4:1) | 50 | |
CD34/Ad-Mock (соотношение E:T = 1:1) | 12 | |
CD34/Ad-Mock (соотношение E:T = 5:1) | 19 | |
Ad-TRAIL 106 бляшкообразующих единиц (pfu) | 6 | |
MCF-7 | ||
Контроль | 5 | |
CD34/Ad-TRAIL (соотношение E:T =1:1) | 17 | |
CD34/Ad-TRAIL (соотношение E:T = 4:1) | 64 | |
CD34/Ad-Mock (соотношение E:T = 1:1) | 21 | |
CD34/Ad-Mock (соотношение E:T = 4:1) | 22 | |
Ad-TRAIL 106 pfu | 9 |
Достоверная доля гибели клеток обнаружилась при совместном культивировании в течение 48 часов клеток CD34/Ad-TRAIL с sTRAIL-чувствительными клетками MDA-MB-361 при соотношении E:T 1:1 (гибель клеток = 28%) и при соотношении E:T 4:1 (гибель клеток = 50%).
В отношении sTRAIL-чувствительной клеточной линии MDA-MB-361 мощность апоптотического эффекта, вызываемого воздействием mTRAIL была сходна с таковой, вызываемой 72-часовым воздействием высокой дозы (100 нг/мл) sTRAIL (Таблица 7).
Чтобы проверить то обстоятельство, что цитотоксический эффект CD34/Ad-TRAIL действительно возникает благодаря mTRAIL, клетки MDA-MB-361 культивировали совместно с ложно трансдуцированными клетками CD34+. Как показано в Таблице 2, совместное культивирование клеток MDA-MB-361 с ложно трансдуцированными клетками CD34+ было связано с умеренным эффектом гибели клеток, обнаруживаемым только при высшем соотношении E:T. Такая умеренная индукция гибели клеток, вероятно, связана с избыточной плотностью культуры.
Чтобы исключить возможность того, что активность CD34/Ad-TRAIL, [приводящая] к гибели клеток, связана со свободными аденовирусными частицами, которые не отмылись в конце инфицирования CD34 Ad-TRAIL, клетки MDA-MB-361 подвергали воздействию в 106 бляшкообразующих единиц (pfu). Никаких доказательств клеточной токсичности не удалось обнаружить при воздействии 106 вирусных частиц на клетки MDA-MB-361 (Таблица 8).
Величину pfu рассчитывали следующим образом.
Чтобы инфицировать 5 × 105 клеток CD34+ при величине MOI, составляющей 500, использовали 250 × 106 pfu, которые добавляли к 1 мл суспензии клеток CD34+.
В конце инфицирования клетки CD34+ 3 раза отмывали в культуральной среде. Для каждой процедуры отмывки использовали разведение 1:20, т.е. культуральную суспензию разбавляли по меньшей мере в 8000 раз.
Исходя из предположения, что в конце процедуры отмывки в суспензионной культуре остается еще 250 × 106 pfu, ее разбавляли в 8000 раз, т.е. ожидали, что к совместной культуре добавлялось <50,000 оставшихся pfu.
Таким образом, чтобы исключить, что активность, вызывающая гибель клеток, обнаруживаемая в совместной культуре, связана со свободными аденовирусными частицами, которые не были отмыты, на клеточные линии рака молочной железы воздействовали количеством pfu, равным теоретическому значению остаточных pfu (см. #3), умноженному на 20 (т.е. 50000 × 20 = 106 pfu).
Затем эксперименты по совместному культивированию выполняли путем инкубации клеток CD34/Ad-TRAIL с sTRAIL-резистентной клеточной линией MCF-7. В этих экспериментах обнаруживалась достоверная доля гибели клеток при совместном культивировании в течение 48 часов клеток CD34/Ad-TRAIL с sTRAIL-резистентными клетками MCF-7 при соотношении E:T, равном 4:1 (клеточная гибель = 64%), тогда как при соотношении E:T, равном 1:1, клеточной гибели обнаружить не удавалось.
В отношении sTRAIL-резистентной клеточной линии MCF-7 мощность апоптотического эффекта, вызываемого 48-часовым воздействием mTRAIL, была достоверно выше, чем таковая, вызываемая 72-часовым воздействием большой дозы (100 нг/мл) sTRAIL (Таблицы 7 и 8).
Чтобы убедиться, что цитотоксический эффект CD34/Ad-TRAIL действительно связан с mTRAIL, клетки MCF-7 культивировали совместно с ложно трансдуцированными клетками CD34+. Как показано в Таблице 8, совместное культивирование клеток MCF-7 с ложно трансдуцированными клетками CD34+ было сопряжено с умеренным эффектом клеточной гибели, который, вероятно, обусловлен избыточной плотностью культуры.
Чтобы исключить возможность того, что активность CD34/Ad-TRAIL, вызывающая клеточную гибель, связана со свободными аденовирусными частицами, которые остались не отмытыми в конце инфицирования CD34 Ad-TRAIL, клетки MCF-7 подвергали воздействию 106 pfu. Доказательств того, что клеточная токсичность наблюдается при воздействии 106 pfu на клетки MCF-7, не обнаружено (Таблица 8).
Список литературы
1. Danial, N.N. and S.J. Korsmeyer, Cell death: critical control points. Cell, 2004. 116(2): p. 205-19.
2. Blagosklonny, M.V., Prospective strategies to enforce selectively cell death in cancer cells. Oncogene, 2004. 23(16): p. 2967-75.
3. Waxman, D.J. and P.S. Schwartz, Harnessing apoptosis for improved anticancer gene therapy. Cancer Res, 2003. 63(24): p. 8563-72.
4. Ashkenazi, A. and V.M. Dixit, Death receptors: signaling and modulation. Science, 1998. 281(5381): p. 1305-8.
5. Ashkenazi, A. and V.M. Dixit, Apoptosis control by death and decoy receptors. Curr Opin Cell Biol, 1999. 11(2): p. 255-60.
6. Wang, S. and W.S. El-Deiry, TRAIL and apoptosis induction by TNF-family death receptors. Oncogene, 2003. 22(53): p. 8628-33.
7. Almasan, A. and A. Ashkenazi, Apo2L/TRAIL: apoptosis signaling, biology, and potential for cancer therapy. Cytokine Growth Factor Rev, 2003. 14(3-4): p. 337-48.
8. LeBlanc, H., et al., Tumor-cell resistance to death receptor-induced apoptosis through mutational inactivation of the proapoptotic Bcl-2 homolog Bax. Nat Med, 2002. 8(3): p. 274-81.
9. Ashkenazi, A., et al., Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand. J. Clin. Invest., 1999. 104(2): p. 155-162.
10. Walczak, H., et al., Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo. Nat Med, 1999. 5(2): p. 157-63.
11. Mitsiades, C.S., et al., TRAIL/Apo2L ligand selectively induces apoptosis and overcomes drug resistance in multiple myeloma: therapeutic applications. Blood, 2001. 98(3): p. 795-804.
12. Fulda, S., et al., Smac agonists sensitize for Apo2L/TRAIL- or anticancer drug-induced apoptosis and induce regression of malignant glioma in vivo. Nature Medicine, 2002. 8(8): p. 808-815.
13. Pollack, I.F., M. Erff, and A. Ashkenazi, Direct stimulation of apoptotic signaling by soluble Apo2L/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand leads to selective killing of glioma cells. Clinical Cancer Research, 2001. 7(5): p. 1362-1369.
14. Lawrence, D., et al., Differential hepatocyte toxicity of recombinant Apo2L/TRAIL versions. Nat Med, 2001. 7(4): p. 383-5.
15. Qin, J., et al., Avoiding premature apoptosis of normal epidermal cells. Nature Medicine, 2001. 7(4): p. 385-386.
16. Jo, M., et al., Apoptosis induced in normal human hepatocytes by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. Nat Med, 2000. 6(5): p. 564-7.
17. Johnston, J.B., et al., Role of the TRAIL/APO2-L death receptors in chlorambucil- and fludarabine-induced apoptosis in chronic lymphocytic leukemia. Oncogene, 2003. 22(51): p. 8356-69.
18. Yamanaka, Т., et al., Chemotherapeutic agents augment TRAIL-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell lines. Hepatology, 2000. 32(3): p. 482-90.
19. Armeanu, S., et al., Adenoviral gene transfer of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand overcomes an impaired response of hepatoma cells but causes severe apoptosis in primary human hepatocytes. Cancer Res, 2003. 63(10): p. 2369-72.
20. Voelkel-Johnson, С., D.L. King, and J.S. Norris, Resistance of prostate cancer cells to soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL/Apo2L) can be overcome by doxorubicin or adenoviral delivery of full-length TRAIL. Cancer Gene Ther, 2002. 9(2): p. 164-72.
21. McCormick, F., Cancer gene therapy: fringe or cutting edge? Nat Rev Cancer, 2001. 1(2): p. 130-41.
22. Somia, N. and I.M. Verma, Gene therapy: trials and tribulations. Nat Rev Genet, 2000. g(2): p. 91-9.
23. Griffith, T.S. and E.L. Broghammer, Suppression of tumor growth following intralesional therapy with TRAIL recombinant adenovirus. Mol Ther, 2001. 4(3): p. 257-66.
24. Harrington, К., et al., Cells as vehicles for cancer gene therapy: the missing link between targeted vectors and systemic delivery? Hum Gene Ther, 2002. 13(11): p. 1263-80.
25. Rafii, S. and D. Lyden, Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med, 2003. 9(6): p. 702-12.
26. Rosenberg, S.A., Karnofsky Memorial Lecture. The immunotherapy and gene therapy of cancer. J Clin Oncol, 1992. 10(2): p. 180-99.
27. Hardy, C.L., The homing of hematopoietic stem cells to the bone marrow. Am J Med Sci, 1995. 309(5): p. 260-6.
28. Lapidot, Т., Mechanism of human stem cell migration and repopulation of NOD/SCID and B2mnull NOD/SCID mice. The role of SDF-1/CXCR4 interactions. Ann N Y Acad Sci, 2001. 938: p. 83-95.
29. Lapidot, T. and I. Petit, Current understanding of stem cell mobilization: the roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp Hematol, 2002. 30(9): p. 973-81.
30. Srour, E.F., et al., Homing, cell cycle kinetics and fate of transplanted hematopoietic stem cells. Leukemia, 2001. 15(11): p. 1681-4.
31. Clark, B.R., J.T. Gallagher, and T.M. Dexter, Cell adhesion in the stromal regulation of haemopoiesis. Baillieres Clin Haematol, 1992. 5(3): p. 619-52.
32. Deguchi, T. and Y. Komada, Homing-associated cell adhesion molecule (H-CAM/CD44) on human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Leuk Lymphoma, 2000. 40(1-2): p. 25-37.
33. Tavassoli, M. and J.J. Minguell, Homing of hemopoietic progenitor cells to the marrow. Proc Soc Exp Biol Med, 1991. 196(4): p. 367-73.
34. Verfaillie, C.M., Adhesion Receptors as Regulators of the Hematopoietic Process. Blood, 1998. 92(8): p. 2609-2612.
35. Cooper, M.A., T.A. Fehniger, and M.A. Caligiuri, The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol, 2001. 22(11): p. 633-40.
36. Basse, P.H., T.L. Whiteside, and R.B. Herberman, Use of activated natural killer cells for tumor immunotherapy in mouse and human. Methods Mol Biol, 2000. 121: p. 81-94.
37. deMagalhaes-Silverman, M., et al., Posttransplant adoptive immunotherapy with activated natural killer cells in patients with metastatic breast cancer. J Immunother, 2000. 23(1): p. 154-60.
38. Rosenberg, S.A., et al., Prospective randomized trial of high-dose interleukin-2 alone or in conjunction with lymphokine-activated killer cells for the treatment of patients with advanced cancer. J. Natl. Cancer Inst, 1993. 85(8): p. 622-32.
39. Griffith, T.S., et al., Adenoviral-mediated transfer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand gene induces tumor cell apoptosis. J Immunol, 2000. 165(5): p. 2886-94.
40. Kazhdan I. and R.A. Marciniak, Death receptor 4 (DR4) efficiently kills breast cancer cells irrespective of ther sensitivity to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Cancer Gene Ther, 2004. 11: p.691-698.
Claims (6)
1. Гемопоэтическая клетка CD34+ из периферической крови раковых пациентов, прошедших курс лечения фактором роста, трансдуцированная лигандом, индуцирующим апоптоз с участием фактора некроза опухоли, и обладающая противоопухолевой активностью.
2. Клетка по п.1, которую можно получить путем трансдукции клеток CD34+ аденовирусными векторами, кодирующими лиганд, индуцирующий апоптоз с участием фактора некроза опухоли.
3. Применение клетки по п.1 или 2 для приготовления лекарственного средства для лечения опухолей.
4. Применение по п.3, где опухоль представляет собой лимфому.
5. Применение по п.3, где опухоль представляет собой карциному молочной железы.
6. Применение по пп.3, 4 или 5, где лекарственное средство предназначено для внутривенного введения.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP04017907.9 | 2004-07-29 | ||
EP04017907A EP1621550A1 (en) | 2004-07-29 | 2004-07-29 | Tumor-homing cells engineered to produce tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007107369A RU2007107369A (ru) | 2008-09-10 |
RU2390558C2 true RU2390558C2 (ru) | 2010-05-27 |
Family
ID=34925971
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007107369/13A RU2390558C2 (ru) | 2004-07-29 | 2005-07-21 | Гемопоэтическая клетка cd34+ и ее применение |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070264231A1 (ru) |
EP (2) | EP1621550A1 (ru) |
JP (1) | JP5042826B2 (ru) |
KR (1) | KR20070047757A (ru) |
CN (1) | CN101076540B (ru) |
AT (1) | ATE455847T1 (ru) |
AU (1) | AU2005266543B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0513855A (ru) |
CA (1) | CA2571426A1 (ru) |
DE (1) | DE602005019050D1 (ru) |
DK (1) | DK1771468T3 (ru) |
ES (1) | ES2340400T3 (ru) |
HK (1) | HK1110874A1 (ru) |
HR (1) | HRP20100227T1 (ru) |
IL (1) | IL180233A (ru) |
MX (1) | MX2007001152A (ru) |
NO (1) | NO20070956L (ru) |
NZ (1) | NZ552223A (ru) |
PL (1) | PL1771468T3 (ru) |
PT (1) | PT1771468E (ru) |
RS (1) | RS51381B (ru) |
RU (1) | RU2390558C2 (ru) |
SI (1) | SI1771468T1 (ru) |
WO (1) | WO2006010558A1 (ru) |
ZA (1) | ZA200701231B (ru) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2005264993A1 (en) * | 2004-06-18 | 2006-01-26 | Genentech, Inc. | Use of Apo2L receptor agonists and NK cells or NK cell activators |
DE102006020307A1 (de) * | 2006-05-03 | 2007-11-08 | Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg | TNF-related apoptosis-including (TRAIL)stabil transgen exprimierende mesenchymale Stammzellen, Verfahren zu ihrer Herstellung und zu ihrer Verwendung |
EP2163250B1 (en) * | 2007-05-18 | 2013-01-09 | National University Corporation Asahikawa Medical University | Anticancer therapy by transplanting vascular endothelial progenitor cells |
CN102154213B (zh) * | 2011-01-19 | 2012-07-25 | 郑骏年 | 一种运载荷载细胞因子的双调控溶瘤腺病毒的新型cik细胞 |
CN105950630A (zh) * | 2012-02-01 | 2016-09-21 | 浦项工科大学校产学协力团 | 同时表达十二聚体trail及hsv-tk自杀基因的载体及利用其的抗癌干细胞治疗剂 |
CN103288966B (zh) * | 2013-05-17 | 2015-01-21 | 华侨大学 | 一种融合受体及其用于治疗大肠癌的基因药物 |
RU2552609C1 (ru) * | 2013-10-28 | 2015-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биотехнологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) | Способ получения системы направленной доставки белковых молекул (онколитических белков) в опухолевые ткани на основе активированных лимфоцитов |
EP3209382B1 (en) | 2014-10-24 | 2020-11-25 | Calidi Biotherapeutics, Inc. | Combination immunotherapy approach for treatment of cancer |
EP3434762B1 (en) * | 2015-07-29 | 2021-03-17 | ONK Therapeutics Limited | Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity |
US10906951B2 (en) | 2015-07-29 | 2021-02-02 | Onk Therapeutics Limited | Modified natural killer cells and natural killer cell lines having increased cytotoxicity |
US20210230542A1 (en) * | 2018-06-06 | 2021-07-29 | Stemcell Technologies Canada Inc. | Kits, compositions and methods for cell enrichment |
EP3712257A1 (en) | 2019-03-21 | 2020-09-23 | ONK Therapeutics Limited | Modified natural killer cells with increased resistance to cell death |
KR20210142665A (ko) | 2019-03-21 | 2021-11-25 | 오엔케이 테라퓨틱스 리미티드 | 세포 사멸에 대한 증가된 내성을 갖는 변형된 면역 효과기 세포 |
WO2021209625A1 (en) | 2020-04-17 | 2021-10-21 | Onk Therapeutics Limited | High potency natural killer cells |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1224712C (zh) * | 1997-06-04 | 2005-10-26 | 牛津生物医学(英国)有限公司 | 载体 |
WO2002022175A2 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-21 | Musc Foundation For Research Development | Method and composition for treating tumors by selective induction of apoptosis |
WO2002066044A2 (en) * | 2000-10-24 | 2002-08-29 | Immunex Corporation | Method for dendritic cells based immunotherapy of tumors using combination therapy |
US7235358B2 (en) * | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
JP4493882B2 (ja) * | 2001-06-19 | 2010-06-30 | 株式会社カネカ | 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体 |
-
2004
- 2004-07-29 EP EP04017907A patent/EP1621550A1/en not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-07-21 AU AU2005266543A patent/AU2005266543B2/en not_active Ceased
- 2005-07-21 RS RSP-2010/0179A patent/RS51381B/en unknown
- 2005-07-21 KR KR1020077000005A patent/KR20070047757A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-07-21 US US11/631,262 patent/US20070264231A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-21 BR BRPI0513855-8A patent/BRPI0513855A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-07-21 PT PT05764208T patent/PT1771468E/pt unknown
- 2005-07-21 CN CN2005800324298A patent/CN101076540B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-21 CA CA002571426A patent/CA2571426A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-21 SI SI200530969T patent/SI1771468T1/sl unknown
- 2005-07-21 WO PCT/EP2005/007957 patent/WO2006010558A1/en active Application Filing
- 2005-07-21 ZA ZA200701231A patent/ZA200701231B/xx unknown
- 2005-07-21 JP JP2007522989A patent/JP5042826B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-21 ES ES05764208T patent/ES2340400T3/es active Active
- 2005-07-21 RU RU2007107369/13A patent/RU2390558C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-07-21 AT AT05764208T patent/ATE455847T1/de active
- 2005-07-21 PL PL05764208T patent/PL1771468T3/pl unknown
- 2005-07-21 NZ NZ552223A patent/NZ552223A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-07-21 MX MX2007001152A patent/MX2007001152A/es active IP Right Grant
- 2005-07-21 DE DE602005019050T patent/DE602005019050D1/de active Active
- 2005-07-21 DK DK05764208.4T patent/DK1771468T3/da active
- 2005-07-21 EP EP05764208A patent/EP1771468B1/en active Active
-
2006
- 2006-12-21 IL IL180233A patent/IL180233A/en not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-02-20 NO NO20070956A patent/NO20070956L/no not_active Application Discontinuation
-
2008
- 2008-05-13 HK HK08105289.1A patent/HK1110874A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-04-19 HR HR20100227T patent/HRP20100227T1/hr unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LEE J. et al., Cellular and genetic characterization of human adult bone marrow-derived neural stem-like cells: a potential antiglioma cellular vector. Cancer Res., 2003, v.63, n.24, p.8877-8889. UCUR E. et al., Induction of apoptosis in experimental human В cell lymphomas by conditional TRAIL-expressing Т cells, J. Br. J. Cancer, 2003, Dec 1; v.89, n.11, p.2155-2162. GARSIA-CASTRO J. et al., Antitumoral cell-based therapies, CANCER THERAPY, 2003, v.1, p.163-171. SMYTH M.J. et al., Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) contributes to interferon gamma-dependent natural killer cell protection from tumor metastasis, J. Exp. Med., 2001, v.193, n.6, p.661-670. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BRPI0513855A (pt) | 2008-05-20 |
ES2340400T3 (es) | 2010-06-02 |
DK1771468T3 (da) | 2010-05-25 |
WO2006010558A1 (en) | 2006-02-02 |
NO20070956L (no) | 2007-02-20 |
EP1771468B1 (en) | 2010-01-20 |
RU2007107369A (ru) | 2008-09-10 |
RS51381B (en) | 2011-02-28 |
CN101076540A (zh) | 2007-11-21 |
PL1771468T3 (pl) | 2010-07-30 |
CA2571426A1 (en) | 2006-02-02 |
NZ552223A (en) | 2009-01-31 |
HK1110874A1 (en) | 2008-07-25 |
CN101076540B (zh) | 2012-10-24 |
AU2005266543A1 (en) | 2006-02-02 |
HRP20100227T1 (hr) | 2010-07-31 |
SI1771468T1 (sl) | 2010-07-30 |
KR20070047757A (ko) | 2007-05-07 |
AU2005266543B2 (en) | 2012-02-02 |
US20070264231A1 (en) | 2007-11-15 |
MX2007001152A (es) | 2007-04-18 |
EP1621550A1 (en) | 2006-02-01 |
PT1771468E (pt) | 2010-04-20 |
JP2008507961A (ja) | 2008-03-21 |
ZA200701231B (en) | 2008-08-27 |
IL180233A0 (en) | 2007-07-04 |
DE602005019050D1 (de) | 2010-03-11 |
IL180233A (en) | 2010-12-30 |
WO2006010558A8 (en) | 2006-08-24 |
EP1771468A1 (en) | 2007-04-11 |
JP5042826B2 (ja) | 2012-10-03 |
ATE455847T1 (de) | 2010-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2390558C2 (ru) | Гемопоэтическая клетка cd34+ и ее применение | |
US11464806B2 (en) | Genetically modified mesenchymal stem cells expressing an immune response-stimulating cytokine to attract and/or activate immune cells | |
JP6971986B2 (ja) | 免疫療法の抗腫瘍活性を高めるための間葉系幹細胞 | |
CN113416260B (zh) | 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 | |
JP2021526842A (ja) | I型インターフェロン及びcd40−配位子を用いる腫瘍溶解性ウイルス又は抗原提示細胞媒介性癌治療 | |
Grisendi et al. | Tumor stroma manipulation by MSC | |
Wang et al. | Viral vectors expressing interleukin 2 for cancer immunotherapy | |
JP2024510712A (ja) | Il-15をコードするアデノウイルス | |
WO2023176938A1 (ja) | 腫瘍溶解性遺伝子改変麻疹ウイルスの新規用途 | |
CN117511977A (zh) | 用于治疗肿瘤的新型免疫细胞及其制备方法 | |
JP6358831B2 (ja) | 新規細胞、それを用いた抗腫瘍効果の誘導剤、癌の遺伝子治療用医薬および抗腫瘍効果の誘導方法 | |
KR20240000477A (ko) | 암 치료용 아데노바이러스 | |
KR20230046298A (ko) | 세포 조성물 및 치료 방법 | |
Detu | Development of New Neural Stem Cell-Based Tumor-Targeted Gene Therapy Approaches | |
Goding | Induction of anti-tumor responses via adoptively transferred, cytokine-gene transduced A-NK cells | |
CN116059329A (zh) | 溶瘤病毒与car t细胞联合治疗血液肿瘤的方法 | |
Xia | Cancer Immunogene Therapy Using Viral Vectors Encoding Cytokines and Chimeric Antigen Receptors | |
Whiteside | The Role of Immune Effector Cells in Immunotherapy of Head and Neck Cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130722 |