JP2024510712A - Ｉｌ－１５をコードするアデノウイルス - Google Patents

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Abstract

式 ５’ＩＴＲ－Ｂ１－ＢＡ－Ｂ２－ＢＸ－ＢＢ－ＢＹ－Ｂ３－３’ＩＴＲの配列を含むＢ群アデノウイルスであって；ここで、ＢＹは、配列 －Ｇ１－Ｇ２ｎ－Ｇ３ｍ－Ｇ４ｐ－Ｇ５ｑを含む。Ｇ１は第１の導入遺伝子である。Ｇ２は第２の導入遺伝子である。Ｇ３は第３の導入遺伝子である。Ｇ４は第４の導入遺伝子である。Ｇ５は第５の導入遺伝子であり、ＩＬ－１５は導入遺伝子として上記の位置のうちの少なくとも１か所にコードされ、ＢＹはＩＬ－１５Ｒアルファのｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドをもコードすることを特徴とする。【選択図】図２Ａ

Description

本開示は、ＩＬ－１５をコードするＢ群アデノウイルス、同上を含む医薬組成物、治療、特に癌治療における該ウイルスおよび／または組成物の用途に関するものである。本開示はさらに、宿主細胞におけるウイルス複製およびウイルスを製剤化する処理法にも関するものである。
ＩＬ－１５は、ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞；ＮＫ細胞ならびにＮＫＴ細胞をも刺激するサイトカインである。ＩＬ－１５は、Ｔ細胞の分裂およびメモリーＴ細胞の生存にとって重要であると考えられる。またさらに、ＩＬ－１５は、ＮＫＴ細胞の活性／生存にも重要であると考えられる。腫瘍微小環境におけるＩＬ－１５の発現が抗腫瘍活性／反応に相関する重要な要因であることを示唆するデータが存在する。このように、腫瘍微小環境におけるＩＬ－１５のレベルを増加させることは、癌治療において注目されている。
Ｐｅｒｅｒａら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１、Ａｐｒ ２４； ９８（９）： ５１４６－５１５１）は、ＩＬ－１５をコードする生ワクシニアウイルスを調製した。Ｂａｃｋｈａｕｓら（Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９、１１、９１４）は、ＩＬ－１２またはＩＬ－１５をコードする麻疹ウイルスを開示している。
本発明者らは、ＩＬ－１５をコードするＢ群アデノウイルス、特にＥｎＡｄを調製し、サイトカイン発現のレベルが望ましいレベルよりも低いことを明らかにしている。この問題に直面したので、本発明者らはウイルス構築物の最適化に着手した。
意外なことに、Ｂ群アデノウイルスが、ＩＬ－１５に連結または非連結のＩＬ－１５Ｒアルファの少なくともｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドをもコードしている場合（細胞外蛋白質全体をコードすることをも含む）には、発現が有意に改善するのである。
腫瘍溶解性ウイルスにコードされる導入遺伝子の遺伝子発現レベルを測定することは困難であり得る。しかし、本発明者らは、ウイルスにコードされる導入遺伝子が腫瘍微小環境において発現するのみならず、その蛋白質産物が血液にも検出され得ることを示す証拠を得ている。
腫瘍微小環境は、本開示のアデノウイルスによる浸潤に対して許容性であり、そのため所望の送達部位におけるＩＬ－１５レベルを高めることが可能になるのである。
本開示の概要を、以下の段落に示す。
段落１：
式（Ｉ）：
５′ＩＴＲ－Ｂ１－ＢＡ－Ｂ２－ＢＸ－ＢＢ－ＢＹ－Ｂ３－３′ＩＴＲ （Ｉ）
の配列を含むＢ群アデノウイルスであって；
ここで
Ｂ１は、結合であるか、
または
Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ－Ｅ１Ｂを含み；
ＢＡは、－Ｅ２Ｂ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｅ２Ａ－Ｌ４を含み；
Ｂ２は、結合であるか、
またはＥ３を含み；
ＢＸは、結合であるか、
または
制限酵素認識部位、１種類以上の導入遺伝子、またはその両方を含むＤＮＡ配列であり；
ＢＢは、Ｌ５を含み；
ＢＹは、配列－Ｇ１－Ｇ２ｎ－Ｇ３ｍ－Ｇ４ｐ－Ｇ５ｑを含み；
ここで
Ｇ１は第１の導入遺伝子であり、Ｇ２は第２の導入遺伝子であり、Ｇ３は第３の導入遺伝子であり、Ｇ４は第４の導入遺伝子であり、Ｇ５は第５の導入遺伝子であり；
Ｂ３は、結合であるか、
または
Ｅ４を含み；
ｎは０または１であり；ｍは０または１であり；ｐは０または１であり；ｑは０または１であり；
ここで
導入遺伝子中においてＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、および同上のうちの２つまたは３つの組み合わせから選択される位置に、ＩＬ－１５がコードされ；
ならびにＢＹが、ＩＬ－１５Ｒアルファのｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドをもコードする（例えば、ｓｕｓｈｉドメインが配列番号：２６に示される配列を有する）ことを特徴とする、
Ｂ群アデノウイルス。
段落２：
段落１に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ポリペプチドが、完全長ＩＬ－１５Ｒアルファ細胞外ドメイン、例えば、その膜固定型を含む完全長ＩＬ－１５Ｒアルファ（一実施態様においては、ＥＣドメインから成る、あるいは本質的にＥＣドメインから成る）を含む、Ｂ群アデノウイルス。
段落３：
段落１または２に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５Ｒアルファのｓｕｓｈｉドメインをコードする該ポリペプチドが、膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカー、例えば、配列番号：２８、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２に示される膜貫通ドメインを含む、Ｂ群アデノウイルス。
段落４：
段落１～３のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ポリペプチドはＩＬ－１５に連結される、Ｂ群アデノウイルス。
段落５：
段落１～４のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該コードされるポリペプチドが、ＩＬ－１５とは異なる位置に存在する（すなわち、ＩＬ－１５から分離している（非連結である））、Ｂ群アデノウイルス。
段落６：
段落１～５のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５がＧ５の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落７：
段落１～６のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５がＧ４の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落８：
段落１～７のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５がＧ３の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落９：
段落１～８のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５がＧ２の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落１０：
段落１～９のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５がＧ１の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。一実施態様においては、ＩＬ－１５はＧ１の位置にコードされない。
段落１１：
段落１～１０のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ５の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落１２：
段落１～１１のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ４の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落１３：
段落１～１２のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ３の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落１４：
段落１～１３のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ２の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落１５：
段落１～１４のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ１の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落１６：
段落１～１５のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
該ウイルスがＩＬ－１２をもコードし、例えば、該ウイルスがＩＬ－１２を１回のみコードする場合を挙げることができる、Ｂ群アデノウイルス。
段落１７：
段落１６に記載のＢ群ウイルスであって；
ここで該ＩＬ－１２が単一鎖融合蛋白質としてコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落１８：
段落１６または１７に記載のＢ群ウイルスであって；
ここで該融合蛋白質がｐ４０－リンカー－ｐ３５の形態である、Ｂ群アデノウイルス。
段落１９：
段落１８に記載のＢ群ウイルスであって；
ここで該リンカーが、１単位以上のＧｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）、例えば、１、２、３、４、５または６単位のＧ４Ｓ（３単位のＧ４Ｓなど）を含む、Ｂ群アデノウイルス。
段落２０：
段落１７～１９のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ＩＬ－１２融合蛋白質が、配列番号：１１５に示される配列を含む、Ｂ群アデノウイルス：
Figure 2024510712000002
段落２１：
段落１６～２０のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ＩＬ－１２がＧ１の位置に存在する、例えば、Ｇ１の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落２２：
段落１６～２１のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ＩＬ－１２がＧ２の位置に存在する、例えば、Ｇ２の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落２３：
段落１６～２２のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ＩＬ－１２がＧ３の位置に存在する、例えば、Ｇ３の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落２４：
段落１６～２３のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ＩＬ－１２がＧ４の位置に存在する、例えば、Ｇ４の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。一実施態様においては、ＩＬ－１２はＧ４の位置にコードされない。
段落２５：
段落１６～２４のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ＩＬ－１２がＧ５の位置に存在する、例えば、Ｇ５の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。一実施態様においては、ＩＬ－１２はＧ５の位置にコードされない。
段落２６：
段落１～２５のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでｎが１である、Ｂ群アデノウイルス。
段落２７：
段落１～２５のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでｎが０である、Ｂ群アデノウイルス。
段落２８：
段落１～２７のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでｍが１である、Ｂ群アデノウイルス。
段落２９：
段落１～２７のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでｍが０である、Ｂ群アデノウイルス。
段落３０：
段落１～２９のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでｐが１である、Ｂ群アデノウイルス。
段落３１：
段落１～２９のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでｐが０である、Ｂ群アデノウイルス。
段落３２：
請求項１～３１のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでｑが１である、Ｂ群アデノウイルス。
段落３３：
請求項１～３１のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでｑが０である、Ｂ群アデノウイルス。
段落３４：
段落１～３３のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで少なくとも１種類のさらなるサイトカインがＢＹによってコードされる（例えば、２種類または３種類のサイトカインがコードされる）、Ｂ群アデノウイルス。
段落３５：
段落３４に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該単一のサイトカインまたは複数のサイトカインが：
ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）またはＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）；ＴＧＦ－ベータスーパーファミリー（例えば、ＢＭＰ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）ファミリー（例えばＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ）；ＩＬ－１ファミリー（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１８）；サイトカイン受容体コモンγ鎖（γｃ）ファミリー（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１）；ＩＬ－１０ファミリー（例えば、ＩＬ－２４）；ＩＬ－１２ファミリー（例えば、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７）；ＩＬ－１７ファミリー（例えば、ＩＬ－１７Ｅ）；増殖因子ファミリー（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦ－アルファファミリー）；およびインターフェロンファミリー（Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロンおよびＩＩＩ型インターフェロンなど）から独立に選択される、Ｂ群アデノウイルス。
段落３６：
段落３４または３５に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該単一のサイトカインまたは複数のサイトカインが：
ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１５４、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、ＥＤＡ－Ａ、ＥＤＡ－Ａ２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－κ、およびＩＦＮ－ω、Ｆｌｔ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、およびＩＬ－２９から独立に選択される、Ｂ群アデノウイルス。
段落３７：
段落３４～３６のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでサイトカインがＩＬ－１８である、Ｂ群アデノウイルス。
段落３８：
段落１～３７のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＢＹがＩ型インターフェロン（インターフェロン－アルファなど）をコードする、Ｂ群アデノウイルス。
段落３９：
段落３４～３８のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該サイトカインがＧ１の位置でコードされる、例えば、Ｇ１の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落４０：
段落３４～３９のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該サイトカインがＧ２の位置でコードされる、例えば、Ｇ２の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落４１：
段落３４～４０のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該サイトカインがＧ３の位置でコードされる、例えば、Ｇ３の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落４２：
段落３４～４１のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該サイトカインがＧ４の位置でコードされる、例えば、Ｇ４の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落４３：
段落３４～４２のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該サイトカインがＧ５の位置でコードされる、例えば、Ｇ５の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落４４：
段落１～４３のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＢＹが少なくとも１種類のケモカイン、例えば、１種類のケモカインをコードする、Ｂ群アデノウイルス。
段落４５：
段落４４に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ケモカインが：
ＭＩＰ－１アルファ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、およびＣＣＬ２から選択される、Ｂ群アデノウイルス。
段落４６：
段落４４または４５に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ケモカインがＣＸＣＬ９である、Ｂ群アデノウイルス。
段落４７：
段落４４～４６のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ケモカインがＣＣＬ１９である、Ｂ群アデノウイルス。
段落４８：
段落４４～４７のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ケモカインがＣＣＬ２１である、Ｂ群アデノウイルス。
段落４９：
段落４４～４８のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ケモカインがＧ１の位置にコードされる、例えば、Ｇ１の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落５０：
段落４４～４９のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ケモカインがＧ２の位置にコードされる、例えば、Ｇ２の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落５１：
段落４４～５０のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ケモカインがＧ３の位置にコードされる、例えば、Ｇ３の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落５２：
段落４４～５１のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ケモカインがＧ４の位置にコードされる、例えば、Ｇ４の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落５３：
段落４４～５２のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該ケモカインがＧ５の位置にコードされる、例えば、Ｇ５の位置にのみコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
段落５４：
段落１～５３のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＢＹ中の該１種類上の導入遺伝子が、主要後期プロモーターの制御下にある、例えば、該導入遺伝子の全部が主要後期プロモーターの制御下にある、Ｂ群アデノウイルス。
段落５５：
段落５４に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＧ１が主要後期プロモーターの制御下にある、Ｂ群アデノウイルス。
段落５６：
段落５４または５５に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＧ２が主要後期プロモーターの制御下にある、Ｂ群アデノウイルス。
段落５７：
段落５４～５６のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＧ３が主要後期プロモーターの制御下にある、Ｂ群アデノウイルス。
段落５８：
段落５４～５７のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＧ４が主要後期プロモーターの制御下にある、Ｂ群アデノウイルス。
段落５９：
段落５４～５８のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここでＧ５が主要後期プロモーターの制御下にある、Ｂ群アデノウイルス。
段落６０：
段落１～５９のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該アデノウイルスがＥｎＡｄまたはＡｄ１１（ＥｎＡｄなど）である、Ｂ群アデノウイルス。
段落６１：
段落１～６０のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該アデノウイルスはその複製が可能である（複製能があるなど）、Ｂ群アデノウイルス。
段落６２：
段落１～６１のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスであって；
ここで該アデノウイルスが腫瘍溶解性である、Ｂ群アデノウイルス。
段落６３：
段落１～６２のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスおよび薬学的に許容可能な添加剤、希釈剤または担体を含む組成物。
段落６４：
治療、例えば、癌の治療に用いる段落１～６２のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスまたは段落６３に記載の組成物。
段落６５：
癌治療のための治療薬剤の製造における、段落１～６２のいずれか１段落に記載のＢ群アデノウイルスまたは段落６３に記載の組成物の用途。
段落６６：
治療的有効量の、段落１～６２のいずれか１段落に記載のアデノウイルスまたは段落６３に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌治療の方法。
一実施態様においては、該ウイルス中に、ＩＬ－１５をコードする遺伝子が１つのみ存在する。
一実施態様においては、ＩＬ－１５に用いるリーダー配列は、非天然配列であり、例えば、Ｉｇ、ＣＤ３３またはＩＬ－２のリーダー配列である。これによって発現の最適化を成し得る。
一実施態様においては、ＩＬ－１５ＲアルファＳｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドをコードする遺伝子が１つのみ存在する。
一実施態様においては、Ｓｕｓｈｉドメインは、膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカー、特に、天然の膜貫通ドメインを含む。一実施態様においては、Ｓｕｓｈｉドメインは、膜貫通ドメインもＧＰＩアンカーも含まない、すなわち、発現した場合に、膜に固定されない（特に、可溶型として発現する）。
本明細書中の「可溶性（型）」は、非連結（非固定）の形態を指す（膜および／または他の蛋白質への連結から自由であることを含む）。したがって、可溶型としては、細胞から放出され（分泌されるなど）得る形態が挙げられる。
一実施態様においては、Ｓｕｓｈｉドメインは非連結である（特に、ＩＬ－１５には連結されていない）。一実施態様においては、ＩＬ－１５Ｒアルファに天然のリーダー配列を用いる。
一実施態様においては、ＩＬ－１２をコードする遺伝子が１つのみ存在する。
一般的に、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ５は、導入遺伝子を表し、例えば、それらは、好適な制御性配列（２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドなど）で隔てられている。
本明細書中に開示するアデノウイルスは、ＢＹの位置に１、２、３、４または５種類の導入遺伝子を含んでいてもよい。実質的に、ＢＹの位置に挿入したいずれの「遺伝子」も、導入遺伝子と見なされる；その理由は、その位置が非天然位置だからである。本明細書においては、制御性要素は「遺伝子」とはみなさない。
位置Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ５は、互いに相対的に規定される便宜的名称である。したがって、導入遺伝子が単一でのみ存在する場合には、常にＧ１と称される。導入遺伝子が２つ存在する場合には、通常Ｇ１およびＧ２と称される。導入遺伝子が３つ存在する場合には、一般的にＧ１、Ｇ２およびＧ３と称される。導入遺伝子が４つ存在する場合には、一般的にＧ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４と称される。導入遺伝子が５つ存在する場合には、一般的にＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４およびＧ５と称される。
一実施態様においては、Ｂ１はＥ１Ａ－Ｅ１Ｂを含む。
一実施態様においては、Ｂ２はＥ３を含む。
一実施態様においては、ＢＸは結合である。
一実施態様においては、ＢＸは、１種類以上の導入遺伝子を含む。
一実施態様においては、Ｂ３はＥ４を含む。
一実施態様においては、ＢＹの位置に存在する１つ以上の導入遺伝子（全導入遺伝子など）が、内因性プロモーター（主要後期プロモーターなど）によって決定される。
一実施態様においては、導入遺伝子の発現は、特にＢＹの位置に存在する導入遺伝子の発現は、外因性プロモーターによって決定されるのではない。
一実施態様においては、該ウイルスは複製欠損性である。
一実施態様においては、該膜貫通ドメインは、配列番号：２３８、２３９、２４０、２４１、２４２を含む群から選択される配列を含む；優先権書類の配列表および表１を参照のこと。
一実施態様においては、遺伝子の順序は、本明細書中の図または実施例に開示される。この順序は、請求項の補正の根拠として利用されることがある。しかしながら、重要な事柄は、ＩＬ－１５および／またはｓｕｓｈｉドメインおよび／またはＩＬ－１２および／またはＩＬ－１８の位置である。したがって、必要に応じて、これらの要素のうちの１種類以上についてその特徴の説明を、実施例から抜き出して「個別に」概要を示すこともできる。
独立した一局面においては、本明細書に開示の新規のウイルス、構築物または要素（例えば、配列表に示されるもの）、同上を含む医薬製剤、同上のうちのいずれか１つを含む該ウイルスまたは構築物または製剤の、治療、特に、癌（本明細書に開示の癌など）の治療における用途が提供される。
一実施態様においては、該構築物は、配列番号：３６～７３、１６７～１８８および２３３～２３５のいずれか１つに示される蛋白質配列をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ構築物など）である。
一実施態様においては、該構築物は、配列番号：１１６～１５６および１８９～２１０から独立に選択されるＤＮＡカセットである。
一実施態様においては、本発明のウイルスは、配列番号：７４～１１４および２１１～２３２から独立に選択される。
一実施態様においては、該ウイルスまたは構築物はＮＧ－７９６Ａであるか、またはＮＧ－７９６Ａに関するものであり、あるいはＮＧ－７９６Ａを含む組成物またはその用途、特に、治療におけるその用途に関するものである。
さらなる独立的一局面においては、ＩＬ－１５をコードするウイルスであって、Ｓｕｓｈｉドメインをコードする遺伝子を含まないウイルスが提供される。
さらなる独立的一局面においては、本明細書に記載のようなＩＬ－１２をコードするウイルスであって、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含むウイルスまたは含まないウイルスが提供される。
さらなる独立的一局面においては、本明細書に記載のようなＩＬ－１８をコードするウイルスであって、ＩＬ－１５をコードする遺伝子を含むウイルスまたは含まないウイルスが提供される。
本開示はまた、該ウイルスおよび組成物を調製するプロセスに関する。
本開示のウイルスは、インビボにおいてＩＬ－１５を適切な／良好なレベルで発現するので有利である。一実施態様においては、ウイルスによってコードされる２種類以上（２、３、４または５種類など）の導入遺伝子が良好に発現する。また、ＢＹの位置に存在する導入遺伝子の相対的位置（すなわち、相互に参照することによる、導入遺伝子の順序決め）が、ウイルス安定性および／または導入遺伝子の発現レベルに影響を与えることもあるということについても、本発明者らは明らかにしている。特に、プロモーターが内因性である場合には、所定の導入遺伝子の発現が極度に低かった；これは、該ポリペプチドの局所濃度を低下させるので、その治療有効性が低くなることもある。
該ウイルスのライフサイクルは非常に複雑であり、不明な部分も多い；特に、スプライシング機構は複雑である。後者は、導入遺伝子の局所環境の些細な違いによって影響を受けることもあり、問題が起こった場合に、それを理解することは容易ではなく、解決策も予測可能ではない。そこで、本発明は、個々の導入遺伝子の発現、特に、ＩＬ－１５の発現に関する問題の最小化を実現した最適化ウイルスを提供する。
本明細書中の「Ｂ群アデノウイルス」は、３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５１およびＥｎＡｄを含むＢ群とみなされるアデノウイルスを指す。この名称については、一般的にウイルスカプシドの特性に基づいて帰属決定が行われる。したがって、Ｂ群ウイルスのカプシドを有するキメラアデノウイルスはＢ群とみなされる。
一実施態様においては、本開示のアデノウイルスは、Ｂウイルスの亜群、すなわち、Ａｄ１１、特にＡｄ１１ｐ（Ｓｌｏｂｉｔｓｋｉ株）およびその派生体（ＥｎＡｄなど）を含む。
一実施態様においては、本開示のアデノウイルスは、Ｂ亜群ウイルス、すなわち、Ａｄ１１、特にＡｄ１１ｐ（Ｓｌｏｂｉｔｓｋｉ株）およびその派生体（ＥｎＡｄなど）である。
一実施態様においては、該腫瘍溶解性ウイルスは、同一血清型、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐ、のファイバー、ヘキソンおよびペントン蛋白質（全てのカプシド蛋白質など）、例えば、後者のゲノム配列の３０８１２～３１７８９、１８２５４～２１１００および１３６８２～１５３６７の位置に存在する蛋白質を有する（ここで、該ヌクレオチドの位置は、ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：２１７３０７３９９についてのものである（アクセッション番号：ＧＣ６８９２０８；参照として具体的に本明細書に組み入れられる）。
一実施態様においては、該アデノウイルスは、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄとしても公知である；また、以前はＣｏｌＡｄ１とよばれていた）である。本明細書中の「ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ」は、ＷＯ２０１５／０５９３０３において配列番号：１２として開示されるキメラアデノウイルスを指す；本参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。これは、野生型アデノウイルスと比較して、治療特性が強化された複製可能腫瘍溶解性キメラアデノウイルスである（ＷＯ２００５／１１８８２５を参照のこと；本参考文献は参照として本明細書に組み入れられる）。ＥｎＡｄは、Ａｄ１１ｐおよびＡｄ３に由来するＤＮＡの存在、ならびにＥ３／Ｅ４の欠失を特徴とするキメラＥ２Ｂ領域を有している。ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖにおける構造上の変化によって、そのゲノムは、Ａｄ１１ｐよりもおおよそ３．５ｋｂ小型になっているので、導入遺伝子を挿入するためのさらなる「空間」を提供する。ＥｎＡｄにおいては、Ｅ３領域のほぼ全体およびＥ４領域の一部が欠失している。したがって、そのゲノムには、付加的な遺伝物質を挿入するのに充分大きな余剰スペースを有しているのであるが、それでもなお生存可能である。さらに、ＥｎＡｄはＢ亜群アデノウイルスであるため、ヒトにおける既存の免疫性は、例えば、Ａｄ５と比べて共通性が低い。Ａｄ１１のファイバー、ペントンおよびヘキソンを有する腫瘍溶解性キメラウイルスの他の例としては、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２が挙げられる（ＷＯ２００８／０８０００３を参照のこと；本参考文献は参照として本明細書に組み入れられる）。したがって、一実施態様において、用いられるアデノウイルスはＯｖＡｄ１またはＯｖＡｄ２である。
本明細書中の「腫瘍溶解性ウイルス」は、例えば、選択的に癌細胞に感染するため、および／または癌細胞においてそのウイルスライフサイクルが、無調節性である（例えば、過剰発現する）ｐ５３などの遺伝子に依存するため、選択的に癌細胞を殺滅するなど、癌細胞に対して選択性を有するウイルスを指す。癌細胞に対する選択性（治療指数）は、ＷＯ２００５／１１８８２５に記載されるような方法で試験することができる；本参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。一実施態様においては、該腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、ＥｎＡｄのように、癌細胞に選択的に感染し、そのウイルスゲノムを複製し、カプシド蛋白質を生産して新規にウイルス粒子を生成し続ける。ＥｎＡｄは選択的に腫瘍細胞に感染すると考えられ、これらの細胞で迅速に複製して、細胞溶解を引き起こす。これにより、次に炎症性免疫応答を惹起し得るが、それは身体が癌と戦うための刺激となる。ＥｎＡｄのこのような成功は、部分的には腫瘍におけるウイルスの迅速なインビボ複製に関連すると仮定される。
ＩＬ－１５は、高親和性ＩＬ－１５Ｒアルファ鎖、およびＩＬ－１５Ｒのコモンベータおよびガンマ鎖を含む三量体型ＩＬ－１５受容体複合体との相互作用によって機能するサイトカインである。一実施態様においては、ＩＬ－１５はヒトＩＬ－１５であり、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４０９３３（参照として具体的に本明細書に組み入れられる）で開示されるようなＩＬ－１５または配列番号：２３のＩＬ－１５である。
ＩＬ－１５Ｒアルファは、ＩＬ－１５受容体複合体のサブセットである。ＩＬ－１５Ｒアルファは、３０アミノ酸のシグナルペプチドを含む２６７アミノ酸の配列を有している。したがって、その成熟蛋白質は長さが２３７アミノ酸である。ＩＬ－１５Ｒアルファは、可溶型（例えば、アミノ酸３１～２０５などその細胞外ドメインのみ）として得られることもある；または、膜固定型（例えば、アミノ酸２０６～２２８などの膜貫通ドメイン、および任意選択的にアミノ酸２２９～２６７などの細胞質尾部を含む）として得られることもある。該成熟蛋白質のドメインとしては、Ｎ末端のＳｕｓｈｉドメイン、リンカー領域、Ｐｒｏ／Ｔｈｒに富んだ領域（これら３つの領域が、細胞外ドメインを構成する）；膜貫通ドメイン；および細胞内ドメインが挙げられる。
一実施態様においては、本開示のＩＬ－１５Ｒアルファまたはその断片は、可溶型として提供される；例えば、その場合には、該膜貫通ドメインも該細胞質尾部も含まれない。この可溶型は、ＩＬ－１５とは別個の蛋白質としてコードされるのであってもよく、あるいは該蛋白質がＩＬ－１５に連結される形態でコードされるのであってもよい（例えば、融合蛋白質として連結される）。
一実施態様においては本開示のような膜固定型のＩＬ－１５Ｒアルファまたはその断片が提供される。膜固定型としては、膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーが挙げられる。一実施態様においては、該膜貫通ドメインは、天然の配列であり、例えば、該成熟蛋白質のおおよそアミノ酸１７６～１９８である。一実施態様においては、該膜貫通ドメインは、非天然配列であり（すなわち、ＩＬ－１５Ｒアルファの膜貫通ドメインではない）、例えば、配列番号：２３８、２３９、２４０、２４１、２４２から選択される。
ＩＬ－１５Ｒアルファの細胞外領域は、該成熟蛋白質のおおよそアミノ酸１～１７５である。
本明細書中の「Ｓｕｓｈｉドメイン」は、成熟蛋白質のおおよそアミノ酸１～６５（リーダーを有する該蛋白質の３１～９５）に位置するＮ末端ドメインを指す。この領域は、２つのジスルフィド結合ならびに、Ｎ－グリコシル化部位およびＯ－グリコシル化部位を特徴とする。
該成熟蛋白質のリンカー領域は、おおよそアミノ酸６６～９８に位置する。
該Ｐｒｏ／Ｔｈｒに富んだ領域は、該成熟蛋白質のおおよそアミノ酸９９～１７５であり、Ｏ－グリコシル化部位を含む。
該膜貫通ドメインは、該成熟蛋白質のおおよそアミノ酸１７６～１９８に位置する。
該細胞内ドメインは、該成熟蛋白質のおおよそアミノ酸１９９～２３７に位置する。
したがって、一実施態様においては、該ＩＬ－１５Ｒアルファは、該Ｓｕｓｈｉドメインを含む、あるいは該Ｓｕｓｈｉドメインから成るが、ここで該Ｓｕｓｈｉドメインは、例えば、個別の蛋白質／ポリペプチドとして提供される、あるいはＩＬ－１５に連結される。
一実施態様においては、該ＩＬ－１５Ｒアルファは、該Ｓｕｓｈｉドメインおよび該リンカー領域（例えば、該成熟蛋白質のおおよそアミノ酸１～９８）を含む、あるいは同上から成る。一実施態様においては、当該ＩＬ－１５Ｒアルファは、個別の蛋白質／ポリペプチドとしてコードされる、あるいはＩＬ－１５に連結される。
一実施態様においては、該ＩＬ－１５Ｒアルファは、該Ｓｕｓｈｉドメインおよび該Ｐｒｏ／Ｔｈｒに富んだ領域（例えば、該成熟蛋白質のアミノ酸１～６５および９９～１７５）を含む、あるいは同上から成る。一実施態様においては、当該ＩＬ－１５Ｒアルファは、個別の蛋白質／ポリペプチドとしてコードされる、あるいはＩＬ－１５に連結される。
一実施態様においては、用いる該ＩＬ－１５Ｒアルファは、該Ｓｕｓｈｉドメイン、リンカードメインおよび該Ｐｒｏ／Ｔｈｒに富んだ領域（例えば、該成熟蛋白質のアミノ酸１～１７５）を含む、もしくは同上から成る。一実施態様においては、当該ＩＬ－１５Ｒアルファは、個別の蛋白質／ポリペプチドとしてコードされる、あるいはＩＬ－１５に連結される。
一実施態様においては、該ＩＬ－１５Ｒアルファは、該Ｓｕｓｈｉドメイン、リンカー領域、Ｐｒｏ／Ｔｈｒに富んだ領域、および該膜貫通領域（例えば、該成熟蛋白質のアミノ酸１～１９８）を含む、あるいは同上から成る。一実施態様においては、当該ＩＬ－１５Ｒアルファは、個別の蛋白質／ポリペプチドとしてコードされる、あるいはＩＬ－１５に連結される。
本明細書中の「該ＩＬ－１５に連結される」は、リンカー（例えば、Ｇ４ＳリンカーまたはＷＯ２０１６／１７４２００の３０～３１ページから始まる部分に開示されるリンカー配列番号：２６～９０および該参考文献中のＰＰＰ）を介して連結されること、あるいは結合（アミド結合など）を介して直接的に連結されることを意味する；本参考文献は、参照として具体的に本明細書に組み入れられ、また請求項を補正する根拠として用いられることもある。したがって、本明細書中の「連結される」は、一般的には遺伝子融合蛋白質を指す。
したがって、文脈がそうでないことを明示するのでない限り、本明細書中の「連結される」は、「２つの」物質間の連結を指し、例えば、該導入遺伝子がキメラであり、したがって該ウイルスにおいて単一遺伝子として存在し（２つのヌクレオチド断片を隔てる制御性要素が存在し）、発現した成熟型のポリペプチドもその「連結」を維持するような連結を指す。
一実施態様においては、該ＳｕｓｈｉドメインおよびＩＬ－１５は、例えば、ペプチド結合またはペプチドリンカー（例えば、長さ１～２０アミノ酸）、例えば、本明細書に開示のリンカーまたはＧ４Ｓリンカー（例えば、１、２、３、４または５単位のＧ４Ｓを含む）によって連結される。
一実施態様においては、該ＳｕｓｈｉドメインのＣ末端は、ＩＬ－１５のＮ末端に連結される。一実施態様においては、ＩＬ－１５のＣ末端は、該ＳｕｓｈｉドメインのＮ末端に連結される。
本明細書中の「非連結の（ｕｎｌｉｎｋｅｄ）」は、２つのユニット（ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒアルファなど）が個別の蛋白質／ポリペプチドとして発現する場合を指す。したがって、非連結蛋白質は一般的に、該ウイルス内にコードされる個別の導入遺伝子として存在し（同上を隔てる制御性要素、例えば、２Ａペプチドなどが存在するような様式）、発現した該成熟蛋白質もまた一般的に個別の物質である（すなわち、共有結合によって連結されてはいない）。しかし、個別の蛋白質がアセンブルして複合体を形成することはあり得る。
本明細書中の「ＩＬ－１２」は、ｐ３５（ＩＬ－１２Ａにコードされる；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２９４５９を参照のこと）およびｐ４０（ＩＬ－１２Ｂにコードされる；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２９４６０を参照のこと）を含むヘテロ二量体型サイトカインである。一実施態様においては、該ｐ３５およびｐ４０は非連結である。一実施態様においては、ｐ３５およびｐ４０は、例えば、本明細書に開示のリンカーなどのリンカーによって連結される、あるいはアミド結合などの結合で連結される。
本開示はまた、本明細書に開示の蛋白質およびポリペプチドのバリアントの利用をも対象とするが、ここで、該バリアントは、所望の機能が保持されるのであれば、該アミノ酸の１～１０％（１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％など）が変化または欠失したものである。
蛋白質およびポリペプチドは、文脈がそうでないことを明示するのでない限り、一般的に同義語として用いられる。区別が存在する限りにおいては、蛋白質は一般的に三次構造を有し、ポリペプチドは三次構造を有していないこともある。
一般的に、ポリペプチド／蛋白質に関して「を含む」は、例えば、所望の機能が保持されるのであれば、付加的アミノ酸／断片／ポリペプチド／蛋白質を付け足すことができることを意味する。
本明細書中の「異なる位置に存在する」は、複数の導入遺伝子がポリヌクレオチド配列によって分離していることを指す。アデノウイルスにおいて、該ウイルスは両方の鎖にコードを有するので、遺伝子は異なるＤＮＡ鎖上に位置し得る。したがって、一実施態様においては、異なる位置は異なるＤＮＡ鎖を指す。しかし、一実施態様においては、該導入遺伝子が縦列的に（タンデムに）存在し、本質的に同一鎖内にコードされる。一実施態様においては、異なる位置は該ウイルスの異なる領域であり、例えば、該遺伝子がタンデムに並ぶ場合を含む。一実施態様においては、該遺伝子は、該ウイルスの同一領域内に存在し（例えば、該遺伝子がタンデムに並ぶ場合を含む）、「異なる位置」は、「２か所の位置」を隔てる配列、例えば、制御性要素または導入遺伝子の配列を指す。
一実施態様においては、０個の導入遺伝子が該「異なる位置」を分離し、例えば、１つの制御性要素（または要素）が該２か所の位置を分離する。一実施態様においては、１つの導入遺伝子が該「異なる位置」を分離する（それに付随する制御性要素を含み得る）。一実施態様においては、２つの導入遺伝子が該「異なる位置」を分離する（それに付随する制御性要素を含み得る）。一実施態様においては、３つの導入遺伝子が該「異なる位置」を分離する（それに付随する制御性要素を含み得る）。
本明細書中の「導入遺伝子」は、ゲノム配列に挿入されている遺伝子であって、該ウイルスにとっては非天然の（外因性の）遺伝子であるか、または本来は該ウイルス内のその特定位置には存在しない遺伝子を指す。導入遺伝子の例が、当該技術分野において公知であり、また本明細書において考察される。例えば、該導入遺伝子は、蛋白質、ペプチド、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ分子など）をコードするのであってもよい。導入遺伝子にコードされる遺伝物質の他の例としては、例えば、抗体またはその結合断片、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節剤、酵素（例えば、活性薬剤中のプロドラッグを変換可能なもの）およびＲＮＡｉ分子が挙げられる。
本明細書中の「導入遺伝子」はまた、遺伝子の一部分であって、挿入した場合に、完全長遺伝子の機能または機能の大部分を発揮するために好適である、該遺伝子の機能的断片を含む。
導入遺伝子およびコード配列は、文脈がそうでないことを明示するのでない限り、ウイルスゲノムへの挿入に関して、本明細書において同義語として用いられる。本明細書中の「コード配列」は、例えば、機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡ配列を意味する。典型的には、該コード配列は、目的の機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質をコードする導入遺伝子のｃＤＮＡである。目的の機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質については後述する。
明らかに、ウイルスゲノムはＤＮＡのコード配列を含む。該ウイルスのゲノム配列に内在するもの（天然遺伝子）は、非天然位置または非天然環境に存在するように、組み換え技術によって改変されているのでない限り、本明細書の文脈においては導入遺伝子とはみなされない。
一実施態様においては、本明細書中の「導入遺伝子」は、ある生物から単離されており、かつ異なる生物（すなわち、本開示のウイルス）に導入されている遺伝子またはｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントを指す。一実施態様においては、ＤＮＡのこの非天然セグメントは、機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を産生する能力を保持し得る。
したがって、一実施態様においては、挿入した該導入遺伝子は、ヒトの、またはヒト化した蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
転写、翻訳などの機能は、該遺伝子（導入遺伝子）が制御可能に連結されていることを必要とする。したがって、一般的に、単一の導入遺伝子または複数の導入遺伝子は、該ウイルスゲノムにおいて制御可能に連結される。
本明細書中の「制御可能に連結される」は、遺伝子が機能的であることを可能にする、すなわち、該ウイルスが細胞内に入れば、その細胞の機構を利用して、該遺伝子を「発現」させることを可能にするために必要な制御性要素を伴っている導入遺伝子を指す。
一つ以上の実施態様において、該導入遺伝子のカセットは、図および実施例のうちの１つ以上に示されるような構成で配置される。
本明細書中の「導入遺伝子カセット」は、１種類以上のコード配列および１種類以上の制御性要素の形態の、１種類以上の導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列を指す。
１つの導入遺伝子カセットが、１種類以上の単シストロン性および／または多シストロン性ｍＲＮＡ配列をコードするのであってもよい。
一実施態様においては、該導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、単シストロン性または多シストロン性ｍＲＮＡをコードするが、例えば、該カセットは、アデノウイルスゲノムにおいて、内因性プロモーターまたは外因性プロモーターまたはそれらの組み合わせの制御下にある部位への挿入に好適である。特に、該導入遺伝子カセットは、ＢＹ内に位置し、内因性プロモーター（例えば、主要後期プロモーター）の制御下にある。
本明細書中の「単シストロン性ｍＲＮＡ」は、単一機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質をコードするｍＲＮＡ分子を指す。
一実施態様においては、該導入遺伝子カセットは、単シストロン性ｍＲＮＡをコードする。
一実施態様においては、単シストロン性ｍＲＮＡをコードするカセットに関する該導入遺伝子カセットは、外因性プロモーター（該導入遺伝子がいつ、どこで活性であるかを決定する制御性配列である）またはスプライス部位（ｍＲＮＡ分子がスプライソソームによっていつ切断されるのかを決定する制御性配列である）、および、通常、目的の蛋白質／ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに由来するコード配列（すなわち、該導入遺伝子）であって、任意選択的に、ポリＡシグナル配列およびターミネーター配列を含むコード配列を任意選択的に含むＤＮＡのセグメントを意味する。
一実施態様においては、該導入遺伝子カセットは、１種類以上の多シストロン性ｍＲＮＡ配列をコードするのであってもよい。
本明細書中の「多シストロン性ｍＲＮＡ」は、２種類以上の機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質、あるいはそれらの組み合わせをコードするｍＲＮＡ分子を指す。一実施態様においては、該導入遺伝子カセットは、多シストロン性ｍＲＮＡをコードする。
一実施態様においては、多シストロン性ｍＲＮＡをコードするカセットに関する導入遺伝子カセットとしては、外因性プロモーター（該導入遺伝子がいつ、どこで活性であるかを決定する制御性配列である）またはスプライス部位（ｍＲＮＡ分子がスプライソソームによっていつ切断されるのかを決定する制御性配列である）、および通常、目的の蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドについてのｃＤＮＡに由来する２種類上のコード配列（すなわち、該導入遺伝子）（例えば、ここで各コード配列は、ＩＲＥＳまたは高効率２Ａペプチドのいずれかによって隔てられている）を任意選択的に含むＤＮＡのセグメントが挙げられる。該カセットは、転写される最後のコード配列の後に、任意選択的にポリＡ配列およびターミネーター配列を含むのであってもよい。
一実施態様においては、該導入遺伝子カセットは、単シストロン性ｍＲＮＡとそれに続く多シストロン性ｍＲＮＡをコードする。別の一実施態様においては、該導入遺伝子カセットは、多シストロン性ｍＲＮＡとそれに続く単シストロン性ｍＲＮＡをコードする。
該ＩＬ－１５ＲアルファＳｕｓｈｉドメインは、ＩＬ－１５に対して高親和性で結合する。親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅなどの技術によって測定することができる。
本明細書中の「主要後期プロモーター（ＭＬプロモーターまたはＭＬＰ）」は、Ｌ５遺伝子などの「後期に発現する」遺伝子の発現を制御するアデノウイルスプロモーターを指す。ＭＬＰは、「センス鎖」プロモーターである。すなわち、該プロモーターは、該プロモーターの下流に存在する５′－３′方向の遺伝子に作用する。本明細書中の「主要後期プロモーター」は、該ウイルスゲノム中に位置する本来の主要後期プロモーターを指す。
アデノウイルスの構造要素
アデノウイルスの構造は通常、類似しているので、その要素について、構造要素およびそれに言及する際に通常用いられる用語に関して下で説明するが、これらは、当業者にとっては公知である。本明細書において、ある要素について言及する場合には、その要素をコードするＤＮＡ配列を指すか、あるいはアデノウイルス内のその要素の同一構造蛋白質をコードするＤＮＡ配列を指すものとする。ＤＮＡ暗号には冗長性というものが存在するので、後者も含まれる。ウイルスに選択的なコドン使用頻度は、最適化な結果を得るために考慮することが必要な場合もある。
本開示のウイルスに用いるアデノウイルス由来構造要素はいずれも、天然の配列を含むのであってもよく、または天然の配列から成るのであってもよく、あるいは、の所定の長さにわたって、少なくとも９５％（９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）の類似性を有するものであってもよい。本来の配列が改変されて、該遺伝物質の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％が除去されていてもよい。該ウイルスのリーディングフレームに変更を加える場合には、構造蛋白質の発現に破綻が生じるような破壊を加えてはならないことは、当業者であれば理解するであろう。
一実施態様においては、該所定の要素は完全長配列である；すなわち、完全長遺伝子である。
一実施態様においては、該所定の要素は完全長よりも短いが、完全長配列と同一の機能またはそれに対応する機能を保持している。
本開示の構築物において任意選択的である所定の要素についての一実施態様においては、該ＤＮＡ配列は、完全長よりも短く、かつ機能性が全くなくてもよい。
該アデノウイルスの構造蛋白質または機能性蛋白質をコードする構造遺伝子は、一般的にＤＮＡの非コード領域によって連結される。したがって、本開示のウイルスに導入遺伝子を挿入する目的においては、対象とする構造要素のゲノム配列（特にその非コード領域）をどの部位で「切断」するかに関しては、ある程度の融通性がある。したがって、本明細書の目的においては、目的に合致し、かつ外来性材料をコードすることがない限り、該要素は参考構造要素とみなされるであろう。したがって、適切であれば、該遺伝子は、好適な非コード領域、例えば、該ウイルスの天然の構造に存在するような非コード領域に連結されるであろう。
したがって、一実施態様においては、制限酵素認識部位および／または導入遺伝子をコードするＤＮＡなどの挿入物（インサート）をゲノムウイルスＤＮＡの非コード領域（イントロンまたは遺伝子間配列など）に挿入する。しかしながら、アデノウイルスの非コード領域の一部は、例えば、選択的スプライシング、転写制御または翻訳制御において機能を有することもあるので、このことを考慮することが必要となる場合もある。
本明細書において特定する、Ｌ５領域に随伴する部位、例えば、Ｌ５領域とＥ４領域の間の部位は、ＲＮＡｉ、サイトカイン、単一鎖の蛋白質、または抗体などの多量体型蛋白質などの、各種の複雑な物質をコードするＤＮＡ配列を配置するのに好適な部位である。
本明細書中の「遺伝子」は、コード配列および任意選択的にそれに随伴する任意の非コード配列（例えば、イントロンおよびそれに随伴するエクソン）を指す。一実施態様においては、遺伝子は、必須構造要素のみ、例えば、コード領域（ｃＤＮＡなど）のみを含む、または同上から成る。
アデノウイルスの特定の構造要素に関する考察が、ＷＯ２０１６／１７４２００の３３ページの８行目から３５ページの３２行目に記載されている；本参考文献は参照として明示的に本明細書に組み入れられ、また補正の根拠として用いられることもある。言及される事柄に関して疑念がある場合には、該優先権書類が同一開示を含むので、起案者の意図を確認するために用いられるであろう。
一実施態様においては、ＢＸは緩衝（バッファ）配列を含む。この配列は人工の非コード配列であり、この配列中に、ＤＮＡ配列、例えば、導入遺伝子（または導入遺伝子カセット）、制限酵素認識部位またはそれらの組み合わせを含むＤＮＡ配列を挿入してもよい非コード配列である。この配列は、ウイルスの安定性および生存率に対する悪影響を最小化しながらも、該導入遺伝子の正確な配置に対して、幾分かの融通性を可能にする緩衝材として働くことで、利点を有しているのである。
ＷＯ２０１５／０５９３０３などの従来技術に開示されるＥｎＡｄ配列の２８１９２ｂｐ～２８１９３ｂｐの位置に対応する部位内のいずれかの位置に、該挿入物（インサート）を配置することができる。
したがって、一実施態様においては、該制限酵素認識部位（単数または複数）は、上記の区分内に存在するＤＮＡの特異的切断を可能にする。
ＢＹに関して本明細書で用いられる「ＤＮＡ配列」は、ＢＢのＬ５遺伝子の３′末端付近のＤＮＡ配列を指す。本明細書中の「Ｌ５遺伝子の３′末端付近または近傍」という表現は、Ｌ５遺伝子の３′末端または本質的にそれに随伴する非コード領域に隣接（連続）する、すなわち、Ｌ５遺伝子の３′末端または本質的にそれに随伴する非コード領域（すなわち、Ｌ５の内因性の非コード配列の全体またはその一部）の隣に接して存在する（連続する）ことを指す。あるいは、「～の付近または近傍」は、ＢＹ領域とＬ５遺伝子の３′末端の間にコード配列が全く存在しない程度にＬ５遺伝子に近いことを意味することもある。
したがって、一実施態様においては、ＢＹが、非コード配列の「末端」を表すＬ５の塩基に直接的連結されている、あるいは通常Ｌ５に随伴する非コード領域に直接的連結されている。
本来は（ｉｎｈｅｒｅｎｔｌｙ）および通常は（ｎａｔｕｒａｌｌｙ）は、本明細書において同義語として用いられる。一実施態様においては、ＢＹは緩衝（バッファ）配列を含む。この配列は、ウイルスの安定性および生存率に対する悪影響を最小化しながらも、該導入遺伝子の正確な配置に対して、幾分かの融通性を可能にする緩衝材として働くことで、利点を有しているのである。
本明細書中の「Ｅ４」は、アデノウイルスＥ４領域（すなわち、ポリペプチド／蛋白質領域）の一部または全体をコードするＤＮＡ配列を指すが、ここで該Ｅ４領域は変異していることもあり、そのためＥ４遺伝子にコードされる蛋白質が保存性または非保存性のアミノ酸変化を有し、かつ野生型（対応する非変異蛋白質）と同等の機能を有する；または、野生型蛋白質と比較して機能が増強している；または、機能が低下しており、そのため野生型蛋白質と比較して機能を全く有していない；あるいは野生型蛋白質と比較して新規の機能を有している；または、状況に応じて同上の組み合わせを有している。一実施態様においては、該Ｅ４領域はＥ４ｏｒｆ４が欠失している。
一実施態様においては、該Ｅ４領域は部分的に欠失しており、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％が欠失している。一実施態様においては、該Ｅ４領域は、ＷＯ２０１５／０５９３０３などの従来技術に開示されるＥｎＡｄ配列の３２１８８ｂｐ～２９３８０ｂｐの配列を有している。
一実施態様においては、Ｂ３は結合であり、すなわちこの場合にはＥ４が非存在である。
一実施態様においては、Ｂ３は、ＷＯ２０１５／０５９３０３などの従来技術に開示されるＥｎＡｄ配列の３２１８８ｂｐ～２９３８０ｂｐの配列から成る配列を有している。
本明細書においては、数値範囲は端点を含む。
本明細書中の式（式（Ｉ）など）の要素は、連続して存在し、本明細書中で言及する非コードＤＮＡ配列ならびに遺伝子およびコードＤＮＡ配列（構造的特徴）を具体化し得ることは、当業者であれば理解するであろう。一つ以上の実施態様において、本開示の式は、アデノウイルスゲノムの天然配列についての説明を意図している。この点に関して、式がゲノムの対象部位を特徴付ける主要要素を示すものであり、ＤＮＡのゲノム領域の網羅的説明を意図するものではないことは、当業者には明らかであろう。
本明細書中の「Ｅ１Ａ」、Ｅ１Ｂ」、「Ｅ３」および「Ｅ４」はそれぞれ独立に、その野生型およびその同等物、ならびに、本明細書に記載のような、各領域の、特に、公知のアデノウイルスの野生型配列の変異型または部分的に欠失した形態を指す。
本明細書中の「挿入物（インサート）」は、所定のＤＮＡ配列参照セグメントの５′末端、３′末端、またはその内部のいずれかに挿入されて、その参照配列を寸断するＤＮＡ配列を指す。後者は、挿入物（インサート）の位置に関する参照点として用いる参照配列である。挿入物は、例えば、少なくとも１つの制限酵素部位のインサート、少なくとも１つの導入遺伝子カセット、またはその両方のうちのいずれかであり得る。該配列が寸断されても、該ウイルスは元来の配列を依然として有しているが、一般的に該挿入物を挟む２つの断片となる。
一実施態様においては、該導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、非バイアス型挿入トランスポゾン（ＴＮ７トランスポゾンまたはその一部など）を含まない。本明細書中の「Ｔｎ７トランスポゾン」は、ＷＯ２００６／０６０３１４に記載されるような非バイアス型挿入トランスポゾンを指す。
ＢＸおよびＢＹは、独立に制限酵素認識部位、例えば、ＮｏｔＩ、ＦｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＳｇｆＩおよびＳｂｆＩから選択される制限酵素の認識部位を含んでいてもよく、特に、挿入する制限酵素部位は全てが異なる（ＢＸに存在するＮｏｔＩに特異的な部位およびＦｓｅＩに特異的な部位、ならびにＢＹ内に存在するＳｇｆＩおよびＳｂｆＩなど）。
上記で考察されるように、一実施態様においては、ＢＸ領域および／またはＢＹ領域は、制限酵素認識部位を含まない。本開示のウイルスおよび構築物は、制限酵素部位を利用することなく、例えば、合成技術を用いて調製することができる。これらの技術によって、ウイルスおよび構築物の創出に高度融通性が与えられる。さらに、本発明者らは、合成技術によって作成した場合であっても、ウイルスおよび構築物の特性が消失することはないということを明らかにした。
制御性配列は、ＷＯ２０１６／１７４２００の３９ページ１５行目から４１ページ１３行目部分までの部分に開示されている；本参考文献は、参照として具体的、明示的に本明細書に組み入れられ、また補正の根拠として用いられることもある。
本明細書中の「自己開裂高効率２Ａペプチド」または「２Ａペプチド」は、単一ポリペプチド中の切断性配列であって、複数の異なる個別のポリペプチドの生成を促進する切断性配列を指す。好適な２Ａペプチドとしては、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＴ２Ａが挙げられる。所定の２Ａペプチドをコードする特異的ＤＮＡ配列を１か所に用いた場合に、それと同一の特異的ＤＮＡ配列を第２の部位に用いることはできないことを、本発明者らは明らかにした。しかし、同一２Ａペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列を作成するためにＤＮＡ暗号の冗長性を利用することが可能かもしれない。したがって、該カセットが多シストロン性ｍＲＮＡをコードする場合には、２Ａペプチドを用いることが特に有用である；その理由は、２Ａペプチドの利用により、複数の蛋白質またはペプチドが個別のものとして発現されるからである。
一実施態様においては、用いるコードされるＰ２Ａペプチドは、配列番号：４のアミノ酸配列を有する。一実施態様においては、用いるコードされるＴ２Ａペプチドは、配列番号：５のアミノ酸配列を有する。一実施態様においては、用いるコードされるＥ２Ａペプチドは、配列番号：６のアミノ酸配列を有する。一実施態様においては、用いるコードされるＦ２Ａペプチドは、配列番号：７のアミノ酸配列を有する。
一実施態様においては、遺伝子発現の制御因子は、スプライス受容部位の配列、例えば、本明細書に開示するようなスプライス受容部位の配列である。
製剤
本開示はさらに、本明細書に記載のようなウイルスの医薬製剤に関する。
一実施態様においては、非経口液状製剤が提供されるが、ここで該非経口液状製剤は、例えば、本開示にしたがう腫瘍溶解性の複製可能な、点滴または注射用の非経口液状製剤であり、ここで該製剤は、１ｘ１０１０～１ｘ１０１４ウイルス粒子／投与容量の範囲の用量で提供される。
非経口液状製剤は、消化管を通じて送達されるのではないものとして設計される製剤を意味する。典型的な非経口送達経路としては、注射、埋め込み移植または点滴が挙げられる。一実施態様においては、該製剤は、ボーラス送達の形態で提供される。
一実施態様においては、該非経口製剤は注射の形態である。注射としては、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射、または筋肉内注射が挙げられる。本明細書中の「注射」は、注射筒により身体に液体を注入することを意味する。一実施態様においては、本開示の方法は腫瘍内注射を含まない。
一実施態様においては、該非経口製剤は点滴の形態である。
本明細書中の「点滴」は、点滴筒、輸液ポンプ、シリンジポンプ、または同等のデバイスを用いて、より低速度で液体を投与することを意味する。一実施態様においては、該点滴は、１．５分間～１２０分間の範囲の時間（約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、６５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０または１１５分間など）にわたって投与する。
一実施態様においては、該製剤の一回用量は１００ｍｌ未満、例えば、３０ｍｌのシリンジポンプによる投与などである。一実施態様においては、該製剤の一回用量は１０ｍｌ未満、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍｌである。一実施態様においては、該製剤の一回用量は１ｍｌ未満、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｍｌなどである。
一実施態様においては、該注射を低速注入で投与する；例えば、１．５～３０分間の時間をかけて投与する。
一実施態様においては、該製剤は静脈内（ｉ．ｖ．）投与用である。この経路は、大部分の臓器および組織に迅速に到達させることが可能であるため、特に腫瘍溶解性ウイルスの送達に効果的であり、転移の治療には特に有用であり、例えば、既存の転移、特に、肝臓および肺など、高度に血管が発達している領域に局在する転移の治療に特に有用である。
治療製剤は、典型的には滅菌され製造および保存の条件下において安定である。該組成物は、ヒトへの投与に好適な溶液、マイクロエマルション、リポソーム、またはその他の非経口製剤として製剤化することができる；また、注射筒またはバイアルなど、特に単回用量の事前充填デバイスとして製剤化するのであってもよい。
該製剤は一般的に、薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含むが、そのような希釈剤または担体は、例えば、非毒性の等張性担体であって、該ウイルスに適合性であり、必要とされる期間は、その中で該ウイルスが安定である、希釈剤または担体である。
該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。例えば、分散剤または界面活性剤（レシチンなど）または非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０または４０など）を利用することによって、適切な流動性を維持することができる。分散溶液においては、界面活性剤の存在が必要な粒子サイズの維持を助ける。該組成物中の等張化剤の例としては、糖類、ポリアルコール類（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムが挙げられる。
一実施態様において、用いる非経口製剤は、以下の緩衝液のうちの１種類以上を含んでいてもよい：
例えば、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、リン酸緩衝液および／またはＴｒｉｓ緩衝液、糖（例えば、デキストロース、マンノース、スクロースまたはその類似物）、塩（塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、または塩化カリウムなど）、界面活性剤（ｂｒｉｊｉ、ＰＳ－８０、ＰＳ－４０またはその類似物などの非イオン性界面活性剤など）。該製剤はまた、可能性のある分解の１種類以上の経路を阻害すると考えられる防腐剤（ＥＤＴＡまたはエタノール、あるいはＥＤＴＡとエタノールの組み合わせなど）を含んでいてもよい。
一実施態様においては、該製剤は、本開示の精製アデノウイルスを、例えば、１ｘ１０１０～１ｘ１０１４ウイルス粒子／用量（１ｘ１０１０～１ｘ１０１２ウイルス粒子／用量など）で含む。一実施態様においては、該製剤における該ウイルスの濃度は、２ｘ１０８～２ｘ１０１４ｖｐ／ｍＬ（２ｘ１０１２ｖｐ／ｍｌなど）の範囲である。
一実施態様においては、該非経口製剤は、グリセロールを含む。
一実施態様においては、該製剤は、本明細書に記載のようなアデノウイルス、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ´－２－エタンスルホン酸）、グリセロールおよび緩衝液を含む。
一実施態様においては、該非経口製剤は、本開示のウイルス、ＨＥＰＥＳ（例えば、５ｍＭ）、グリセロール（例えば、５～２０％（ｖ／ｖ））、塩酸（例えば、ｐＨを７～８の範囲に調整する）および注射用の水から成る。
一実施態様においては、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０％グリセロール（最終ｐＨ＝７．８）に、０．７ｍＬの本開示のウイルスを２ｘ１０１２ｖｐ／ｍＬの濃度で製剤化する。
一実施態様においては、本開示のウイルスを液状製剤として製剤化するが、該液状製剤は以下を含む：
（ａ）１５～２５％ｖ／ｖグリセロール（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１％ｖ／ｖグリセロール）；
および
（ｂ）０．１～１．５％ｖ／ｖエタノール（例えば、０．２～１％（１％ｖ／ｖエタノールなど））；
（ｃ）緩衝液；
ここで該製剤のｐＨは、８．０～９．６の範囲であり、例えば、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、または９．５である；例えば、ＷＯ２０１９／１４９８２９を参照のこと；本参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。
該製剤は、界面活性剤をさらに含んでいてもよく、例えば、ポリソルベート２０、４０、６０、または８０（０．０５～０．１５％のポリソルベート２０、４０、６０、または８０など、０．０５～０．１５％のポリソルベート８０など、０．１１５％のポリソルベート８０など）を含んでいてもよい。
一実施態様においては、該製剤はメチオニンをさらに含み、例えば、０．０１～０．３ｍＭ、例えば、０．１～０．３ｍＭのメチオニン（０．２５ｍＭメチオニンなど）をさらに含む。
一実施態様においては、該製剤はアルギニンをさらに含み、例えば、５～２０ｍＭのアルギニン（１５ｍＭのアルギニンなど）をさらに含む。
一実施態様においては、該緩衝液はメグルミンを含む。
したがって、特定の一実施態様においては、該液状製剤は以下を含む：
（ａ）１５～２０％ｖ／ｖグリセロール；
（ｂ）１～１．５％ｖ／ｖエタノール；
（ｃ）０．１～０．２％ｖ／ｖポリソルベート８０；
（ｄ）０．２～０．３ｍＭメチオニン；
（ｅ）１０～２０ｍＭアルギニン；
および
（ｆ）緩衝液（メグルミンなど）；
ここで該製剤のｐＨは８．０～９．６の範囲（ｐＨ８など）である。
薬学的に許容可能な担体については、詳細な考察が「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）に記載されている。
一実施態様においては、該製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
好適な吸入可能調製剤としては、吸入可能粉末、噴霧ガスを含む定量エアロゾル剤、または噴霧ガス不含吸入可能溶液が挙げられる。本開示の吸入可能粉末は、一般的に生理学的に許容可能な添加剤と共に本明細書に記載のようなアデノウイルスを含む。
治療
さらなる一局面においては、本開示はさらに、治療、特に、癌治療に用いる本明細書に記載のようなアデノウイルスまたはその製剤を対象とする。
一実施態様においては、該治療法は、腫瘍、特に、固形腫瘍の治療において用いるものである。
本明細書中の「腫瘍」は、非制御性かつ進行性の過剰細胞分裂によってもたらされる組織の異常塊（新生物ともよぶ）を指すことを意図する。腫瘍は、良性（非癌性）または悪性のいずれかであり得る。腫瘍は、癌および転移の全ての形態を含む。一実施態様においては、該腫瘍は良性ではない。
一実施態様においては、該腫瘍は固形腫瘍である。該固形腫瘍は、限局して存在していることもあり、あるいは転移のこともある。
一実施態様においては、該腫瘍は上皮起源である。
一実施態様においては、該腫瘍は、結腸直腸癌、肝癌、前立腺癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌または肺癌などの悪性腫瘍である。
一実施態様においては、該腫瘍は結腸直腸悪性腫瘍である。
本明細書中の「悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）」は癌性細胞を意味する。
一実施態様においては、該アデノウイルスを、転移の治療または予防に用いる。
一実施態様においては、本明細書の方法または製剤を、薬剤耐性癌の治療に用いる。
一実施態様においては、該アデノウイルスの投与を、さらなる治療または療法、特に、さらなる癌治療または癌療法の実施と組み合わせる。
一実施態様においては、癌の治療、例えば、上記の癌の治療のための治療薬剤の製造に用いる本開示のウイルスまたは製剤を提供する。
さらなる一局面においては、治療有効量の本開示のウイルスまたは製剤を、それを必要とする患者、例えば、ヒト患者に投与することを含む癌治療法を提供する。
一実施態様においては、本明細書の該腫瘍溶解性ウイルスまたは製剤を、別の治療法と組み合わせて投与する。
本明細書中の「組み合わせて」は、癌治療また癌療法の前に、癌治療また癌療法と同時に、および／または癌治療後また癌療法後に、該腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含むことを意図する。
癌療法としては、外科手術、放射線療法、標的療法および／または化学療法が挙げられる。
本明細書中の「癌治療」は、治療化合物または生物学的製剤、例えば、癌治療および／またはその維持療法を意図する抗体による治療を指す。
一実施態様においては、該癌治療は、以下を含む他の任意の抗癌療法から選択される：
化学療法剤、標的抗癌剤、放射線療法、放射性同位体療法、生物学的治療、免疫療法（ＰＤ１シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤など（ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブが挙げられる））、さらなる腫瘍溶解性ウイルス、細胞療法（キメラ抗原受容体細胞療法など）、またはそれらの任意の組み合わせ。
したがって、一実施態様においては、該併用療法は、ＰＤ－１阻害剤、例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、ＪＴＸ－４０１４（Ｊｏｕｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、ＩＮＣＭＧＡＯＯＯ１２（ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＡＭＰ－２２４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ａｎｄ ＧＳＫ）およびＡＭＰ－５１４を含む。
一実施態様においては、該組み合わせは、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＫＮ０３５、ＣＫ－３０１（チェックポイント治療剤）、ＡＵＮＰ１２（Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ）、ＣＡ－１７０およびＢＭＳ－９８６１８９を含む。
一実施態様においては、本開示のウイルスまたはその製剤は、外科手術（ネオアジュバント療法）などの治療法の前処置として、例えば、腫瘍を縮小させる、転移を治療する、および／または転移またはさらなる転移を予防する目的で用いるのであってもよい。該腫瘍溶解性アデノウイルスは、外科手術（ネオアジュバント療法）などの治療法の後に、例えば、転移を治療する、および／または転移またはさらなる転移を予防する目的で用いるのであってもよい。
本明細書中の「併用して」は、腫瘍溶解性アデノウイルス製剤の投与と同時またはほぼ同時に実施する付加的な癌治療の投与である。該治療は、同一製剤内に含めるのであってもよく、あるいは個別製剤として投与するのであってもよい。
一実施態様においては、該ウイルスを化学療法剤投与と組み合わせて投与する。
本明細書中の「化学療法剤」は、悪性の細胞および組織に対して選択破壊性である特定の抗腫瘍化学薬または抗腫瘍化学剤を指すことが意図される。例えば、アルキル化薬、代謝拮抗剤、アントラサイクリン類、植物アルカロイド類、トポイソメラーゼ阻害剤、およびその他の抗腫瘍剤。化学療法のその他の例としては、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、パクリタキセル、カペシタビン、イリノテカン、およびプラチン類（シスプラチンおよびオキサリプラチンなど）（同上のうちの２種類以上の組み合わせを含む）が挙げられる。その好ましい用量は、治療中の癌の性質に基づいて医師が選択するのであってもよい。
一実施態様においては、該治療剤は免疫応答および／または腫瘍血管新生の制御を支援し得るガンシクロビルである。
一実施態様においては、本明細書の方法に用いる１種類以上の治療法はメトロノーム治療法であり、他の治療法と併用することの多い、低用量抗癌剤による連続的または頻回の処置である。
Ｂ亜群腫瘍溶解性アデノウイルス、特に、Ａｄ１１、およびそれから派生したウイルス（ＥｎＡｄなど）は、化学療法剤と特に相乗的なものであり得る。さらに、化学療法中に起こる免疫抑制によって、腫瘍溶解性ウイルスがより高効率に機能することが可能になることがある。
一実施態様においては、本開示のウイルスまたはその製剤を、細胞療法、例えば、Ｔ細胞療法、ＮＫＴ細胞療法、ＮＫ細胞療法、またはマクロファージ細胞療法（そのトランスジェニック型（キメラ抗原受容体細胞、特に、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－ＮＫＴ細胞など）を含む）と組み合わせて用いる。
本明細書中の「トランスジェニック細胞」は、工学的に改変した細胞、例えば、非天然ポリヌクレオチドを含むように該細胞の機能を改変する（すなわち、該細胞を改変して、その表面上に合成受容体を発現させる）組み換え技術を用いて工学的に作成した細胞を指す。
本明細書中の「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体、すなわち、シグナル伝達機能（細胞内シグナル伝達機能など）を共役させた抗体結合ドメインなどの合成受容体を指す。ＣＡＲは、最も一般的にはモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を連結することによって作成される。該受容体は、それに対して特異的でありトランスジェニック細胞のシグナル伝達経路を刺激する抗原またはリガンドを結合する。
第一世代のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３－ゼータを基盤とする細胞内シグナル伝達ユニットを有するものであることが多かった。しかし、第二世代ＣＡＲは一般的に、細胞内シグナル伝達ドメインに組み込まれたＣＤ２８および４－１ＢＢ、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７またはＣＤ２７およびＩＣＯＳなどの共刺激要素を有している（本明細書の図１４を参照のこと；例えば、ＵＳ７，４４６，１９０；Ｄｏｔｔｉら、２００９、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０： １２２９－１２３９（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００９）；Ｆｉｎｎｅｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ． １９９８、Ｓｅｐ １５； １６１（６）： ２７９１－２７９７；Ｆｉｎｎｅｙら、２００４ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｊａｎ １、１７２（１）１０４－１１３；Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００９ Ａｕｇ； １７（８）： １４５３－１４６４を参照のこと）。
ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃなどの企業は、これらの産物を市販可能にしている。
したがって、一実施態様においては、該ＣＡＲはＣＤ３ゼータシグナル伝達ユニットを含む。以下は、第一世代のＣＡＲについて開示している： ＩｒｖｉｎｇおよびＷｅｉｓｓ、Ｃｅｌｌ １９９１ Ｍａｒ ８； ６４（５）： ８９１－９０１；Ｌｅｔｏｕｒｍｅｕｒ １９９１ Ｏｃｔ １５； ８８（２０）８９０５－８９０９；Ｒｏｍｅｏ、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ ６８、ｉｓｓｕｅ ５、ｐ８８９－８９７、Ｍａｒｃｈ ０６、１９９２＊
一実施態様においては、該ＣＡＲはＣＤ２８シグナル伝達ユニットを含む（例えば、Ｍａｈｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２ Ｊａｎ； ２０（１）；７０－７５；およびＣａｒｐｅｎｉｔｏら、ＰＮＡＳ Ｍａｒ ３、２００９ １０６（９）３３６０－３３６５を参照のこと）。＊
一実施態様においては、該ＣＡＲはＣＤ２７シグナル伝達ユニットを含む。後者は成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の機能にとって本質的寄与となる。
一実施態様においては、該ＣＡＲはＩＣＯＳシグナル伝達ユニットを含み、ここでＩＣＯＳは誘導可能なＴ細胞共刺激因子を表す。
一実施態様においては、該ＣＡＲは４－１ＢＢを含む（例えば、Ｉｍａｉ、２００４、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １８、６７６－６８４を参照のこと）。＊
一実施態様においては、該ＣＡＲ療法は１種類の共刺激因子を含む。
一実施態様においては、該ＣＡＲ療法は、共刺激因子の組み合わせ、例えば、２種類、３種類、または４種類の組み合わせ（ＣＤ２８および４－１ＢＢ、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ、ＣＤ２７および４－１ＢＢまたはＣＤ２７およびＩＣＯＳなど）を含む。
Ｇｕｅｄａｎら（Ｂｌｏｏｄ ２０１４、１２４（７）：１０７０－１０８０）は、ＩＣＯＳに基づくキメラ抗原受容体について開示している；本参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。＊Ｄｕｏｎｇ（ＰＬｏＳ ２０１３ Ｍａｙ ７；８（５））は、キメラ抗原受容体を用いてＴ細胞機能を工学的に改変することを開示している。＊
本明細書中の「シグナル伝達ユニット」は、該ＣＡＲの細胞内シグナル伝達に寄与する要素である。
キメラＴ細胞受容体については、ＵＳ２００４０４３４０１に開示されている。＊
＊本明細書に開示されるＣＡＲの構造の特徴（特異性ではなく、シグナル伝達の局面）は、参照として本明細書に組み入れられ、また請求項に対する補正の根拠として用いられることもある。
該ＣＡＲの結合ドメインは抗体に類似しており、例えば、ｓｃＦｖを含むことがある（例えば、Ｋｕｗａｎａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８７ Ｄｅｃ ３１、１４９（３）；および、Ｅｓｈｈａｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３ Ｊａｎ １５；９０（２）：２７０－７２４を参照のこと）。＊第二世代ＣＡＲＳ
一実施態様においては、該ＣＡＲの結合ドメインは、血液の癌（ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＤＬＢＣＬ、ＢＣＭＡ、白血病および多発性骨髄腫など）の治療において特に有用な血液抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＦＬＴ、（ＣＤ１９およびＣＤ２０またはＣＤ２２などの組み合わせを含む）に特異的である。Ｐｏｒｔｅｒら（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１； ３６５： １９３７－１９３９）は、ＣＬＬにおけるＣＡＲ改変Ｔ細胞について開示している。Ｇｒｕｐｐら（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３ Ａｐｒｉｌ １８； ３６８ （１６）１５０９－１５１８）は、ＡＬＬにおけるＣＡＲ改変Ｔ細胞について開示している。Ｍａｕｄｅら（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１４、３７１： １５０７－１５１７）は、白血病の持続的寛解に関するＣＡＲ－Ｔ細胞について開示している。Ｇａｒｆａｌｌら（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１５； ３７３： １０４０－１０４７）は、多発性骨髄腫に関してＣＤ１９に対するＣＡＲ Ｔ細胞について開示している。
一実施態様においては、該ＣＡＲは癌抗原に特異的である。
癌抗原（腫瘍抗原ともよぶ）は、癌細胞に特異的に存在する抗原である（すなわち、一般的には、健常細胞には存在せず、あるいは癌細胞で強く上方制御される）；該抗原としては、例えば、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ受容体ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＥＭ、Ａ３３、Ｇ２５０、糖質抗原Ｌｅｙ、Ｌｅｘ、Ｌｅｂ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ１６６、ＣＤ２４、ＣＤ４４、Ｅ－カドヘリン、ＳＰＡＲＣ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、イディオタイプ、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異体、ｐ５３変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＧＤ２、ＰＳＭＡ、ＰＣＳＡ、ＰＳＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、特にＷＴ１、ＭＵＣ１、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、サバイビン、およびｈＴＥＲＴが挙げられる。一実施態様においては、該ＣＡＲ結合ドメインは癌抗原Ｃａｎに特異的である。
一実施態様においては、該ＣＡＲ結合ドメインは、癌細胞表面の異常な糖を標的とする。
一実施態様においては、該ＣＡＲは間質抗原に特異的である。
本明細書中の「間質抗原」は、間質細胞のみに発現する抗原である；本明細書に関しては、例えば、癌細胞および間質細胞に発現する抗原は、癌抗原とみなされる。間質抗原の例としては、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＳＦ１受容体、ＣＤ１５、ＣＤ３３およびＣＤ６６ｂが挙げられる。
一実施態様においては、該ＣＡＲ結合ドメインは、ＨＥＲ－３、ＨＥＲ－４、ＣＥＡ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、ＰＳＭＡ、ＣＤ２０、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ルイスＡ、ＲＯＲ－１、ＣＤ３２６、ＣＤ１３３、ＮＫＧ２ｄ、ＭＵＣ－１、ＰＳＣＡ、ＰＳＡ、ＣＡ－１２５、ＮｏｔｃｈおよびＦＬＴ－３を含む群から選択される抗原に特異的である。
一実施態様においては、該工学的に改変した細胞は、少なくとも２種類の物質をコードする（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲおよびＰＤ－１ ｓｉＲＮＡ、ＣＤ１９ ＴＩＧＩＴ ｓｉＲＮＡ、ＢＣＭＡ－ＣＳ１、またはＢＣＭＡ－ＣＤ３３）。
したがって、一つの実施態様においては、該ＣＡＲは以下に特異的である：
・ ＣＤ１９（例えば、ＣＤ１９－ＣＤ２８、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＣＤ１９ｓｃｆｖ－ＣＤ２８－４－１ＢＢ、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、またはｉＣａｓ９－Ｔ２Ａ－抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＣＤ１９ＦＬＡＧ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、またはｉＣａｓ９ ＨＡ－Ｔ２Ａ－抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ－ＧＧＧＳ－ＦＬＡＧ、ヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－Ｂｅａｍ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、またはヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－Ｂｅａｍ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３－Ｔ２Ａ－ｔＥＧＦＲ、またはＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＧＩＴＲ－ＣＤ３ζ、またはＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＴＭ８－ＧＩＴＲ－ＣＤ３ζ）；
・ メソテリン（例えば、メソテリンｓｃＦｖ－ ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、メソテリンｓｃＦｖ－ ４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、メソテリンｓｃＦｖ－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、メソテリンｓｃＦｖ ＦＬＡＧ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、メソテリンｓｃＦＶ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、メソテリンｓｃＦｖ－Ｂｅａｍ－ＴＭ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、メソテリンｓｃＦｖ－Ｂｅａｍ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、メソテリンｓｃＦｖ－ＴＭ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、メソテリンｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）；
・ ＶＧＦＲ２（例えば、ＶＧＦＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ２８ ＣＤ３ζ）；
・ ＧＰＣ３（例えば、ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＣＤ１３３（ＣＤ１３３ ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）；
・ ＥｐＣＡＭ（例えば、ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＮｈｅＩ制限酵素部位導入、ｓｃＦｖアミノ酸のＮ末端の１バージョンなど））；
・ ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＧＩＴＲ－ＣＤ３ζ、ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ３ζ－ＧＩＴＲ；
・ ＣＤ３３（例えば、ＣＤ３３ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、またはＣＤ３３ ｓｃＦｖ－Ｂｅａｍ ２－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）；
・ ＣＤ３８（例えば、ＣＤ３８ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）；
・ ＣＤ１３８（例えば、ＣＤ１３８ ｓｃＦｖ－ Ｂｅａｍ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＣＤ２２（例えば、ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８ ＣＤ３ζ、－ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－４－１ＢＢ ＣＤ３ζ、またはＣＤ２２ ｓｃＦＶ－Ｂｅａｍ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＢＣＭＡ（例えば、ＢＣＭＡ－４－ＣＤ２８ ＣＤ３ζまたはヒト化、ＢＣＭＡ－４ ｓｃＦｖ－ＴＭ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、またはＢＣＭＡ－２ ｓｃＦｖ－Ｔｍ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＨＥＲ２（例えば、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３Ｚ－ＥＧＦＲｔ、またはＨＥＲ ｓｃＦＶ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－ＧＦＰ）
・ ＣＤ４（例えば、ＣＤ４ ｓｃＦｖ－Ｂｅａｍ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＲＯＲ－１（例えば、ＲＯＲ－１ ｓｃＦｖ ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＲＯＲ－１ ｓｃＦｖ ＴＭ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、またはヒト化ＲＯＲ－１ ｓｃＦｖ ＴＭ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ）
・ ＣＤ１９およびＣＤ２２（例えば、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、またはＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ２２ ｓｃＦｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３－Ｔ２Ａ－ＲＱＲ８）
・ ＣＥＡ（例えば、ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８ ＣＤ３ζ、またはヒト化ＣＥＡ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８ ＣＤ３ζ
・ ＮＧＦＲ（例えば、ＮＧＦＲ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＭＣＡＭ （例えば、ＭＣＡＭ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＣＤ４７（例えば、ＣＤ４７ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－Ｃｄ２８－ＣＤ３ζ、またはヒト化ＣＤ４７ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＰＤＬ－１（例えば、ＰＤＬ－１ ｓｃＦＶ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＣＤ１２３（例えば、ＣＤ１２３ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＣＤ３７（例えば、ＣＤ３７ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＣＤ３７ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ
・ ＣＳ１（例えば、ＣＳ１ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ Ｂ７Ｈ４（例えば、Ｂ７Ｈ４ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＣＤ２４（例えば、ＣＤ２４ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）、および
・ ＣＤ２０（例えば、ＣＤ２０ ｓｃＦｖ－ＴＭ２８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）
・ ＮＫＧ２Ｄ（ＣＹＡＤ－０１など）、
・ ＦＬＴ３（ＡＭＧ ５５３など）
・ ＤＬＬ３。
一実施態様においては、該ＣＡＲはＨＥＲ－２に特異的である；例えば、本明細書に開示の実施例において用いたＣＡＲの特異性。
一実施態様においては、該ＣＡＲは、Ｔ細胞（自家Ｔ細胞または同種異系Ｔ細胞など、より具体的には、ＨＬＡ適合性Ｔ細胞）において提供される。一実施態様においては、該ＣＡＲ－Ｔ細胞は：
チサゲンレクルユーセル、アキシカブタゲンシロルユーセル（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅ）、リソカブタゲンマラルユーセル（ｌｉｓｏｃａｂｔａｇｅｎｅ ｍａｒａｌｅｕｃｅｌ）、イデカブタゲンビクルユーセル（ｉｄｅｃａｂｔａｇｅｎｅ ｖｉｃｌｅｕｃｅｌ）、ブレクスカブタジェンアウトルーセル（ｂｒｅｘｕｃａｂｔａｇｅｎｅ ａｕｔｏｌｅｕｃｅｌ）、ＪＣＡＲ０１５（ＪｕｎｏのＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ）、デカルト－０８（Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ－０８）（ＢＣＭＡ）およびＡＭＧ１１９から選択される。
一実施態様においては、該免疫細胞は、例えば、本明細書中に列挙されるＣＡＲ（ＣＤ１９ ｓｃＦｖ標識ＣＡＲまたはメソテリンｓｃＦｖ ＣＡＲなど）をコードする食細胞である。一実施態様においては、該食細胞はマクロファージ（ＴＨＰ１細胞など）である。
一実施態様では、該ＣＡＲはＮＫＴ細胞において提供される。ＮＫＴ細胞ｃａｒの利点は、それらが患者に対してＨＬＡ適合性を必要としないことである。したがって、それらは、（例えば、本明細書中に列挙する特異性を有する）「既製品」を提供する目的で用いることができる。ＷＯ２０１３／０４０３７１には、ＣＡＲを有する工学的に改変したＮＫＴが開示されている；本参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。一実施態様においては、該ＮＫＴ細胞 ｅｎｃ。
一実施態様においては、該免疫細胞はＮＫ細胞である；例えば、Ｔｒａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９５ Ｊｕｌ、１５５（２）； １０００－１００９を参照のこと；本参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。
したがって、一実施態様においては、該免疫細胞療法は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５から選択されるサイトカインをコードする導入遺伝子（すなわち、工学的に改変した遺伝子）をさらに含む。
Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞など免疫細胞は、本発明のウイルスで発現するＩＬ－１５によって活性化し得る、または持続性活性を有し得る。これは、腫瘍のアネルギー／低酸素な微小環境に対抗することへの支援となり得る。後者は、天然細胞の殺滅力、および本発明と組み合わせて用いる工学的細胞療法の殺滅力さえも中和する能力を有することがある。したがって、本開示のウイルスの利用は、特に、細胞療法と組み合わせて用いる場合に、癌殺滅に関して複数の機構を惹起するのであってもよい。
本明細書中の「治療用量」は、好適な処置レジメンで用いた場合に、意図する治療効果を達成する（例えば、症状または病態を改善する）ことに好適な腫瘍溶解性アデノウイルスなどのウイルスの量を指す。ある用量は、癌または転移の治療において、ウイルス粒子の数が以下の結果を達成するのに充分であり得る場合に、治療用量とみなすことができる：
腫瘍増殖または転移性増殖を緩徐にする、または停止させる、あるいは腫瘍または転移のサイズに縮小が認められる、および／または患者の生存期間が延長する。本開示のウイルスを全身性送達した後の癌細胞の感染は、治療用量の指標である；すなわち、該標的細胞にそれが送達されている。好適な治療用量は一般的に、治療効果と忍容毒性との間のバランスである（例えば、その療法によって恩恵が得られることを考慮すれば、その副作用と毒性が忍容性である場合）。
一実施態様においては、本開示のウイルスまたは治療用構築物（同上を含む製剤を含む）を、１週間毎に投与する；例えば、第１週目において、該用量（１用量）を１日目、３日目、５日目に投与し、例えば、その後毎週１用量、あるいは第２週目に複数回投与する。
一実施態様においては、本開示のウイルスまたは治療用構築物（同上を含む製剤を含む）を、２週間毎または３週間毎に投与する；例えば、第１週目において、１用量を１日目、３日目、５日目に投与し、第２または第３週目にも１日目、３日目、５日目に投与する。この投与レジメンを必要な回数反復するのであってもよい。
一実施態様においては、第１の用量はその後の用量よりも低量である；例えば、第１の用量を１ｘ１０１０～１ｘ１０１２ウイルス粒子の範囲とし、その後の用量を１ｘ１０１１～１ｘ１０１３ウイルス粒子の範囲とする。
一実施態様においては、２週間にわたって６用量を投与する；例えば、１日目、３日目、５日目、８日目、１０日目および１２日目に投与（各用量を＋／－１日に投与するのであってもよい場合など（１日目の用量が他の用量よりも低量である場合を含む））。
一実施態様においては、本開示のウイルスまたは治療用構築物（同上を含む製剤を含む）を１か月毎に投与する。
一実施態様においては、本開示のウイルスまたは治療用構築物は組み換え技術によって調製される。武装化（ａｒｍｅｄ）アデノウイルスゲノムが、その他の技術的手段（ゲノムの全合成、あるいはゲノムの一部または全体を含むプラスミドを含む）によって製造することができることは、当業者であれば理解するであろう。該ゲノムの合成プロセスでは、挿入領域が該制限酵素部位ヌクレオチドを含まないことがあるが、後者（プラスミド）における該制限酵素部位ヌクレオチドはクローニング法を用いた遺伝子挿入後のアーティファクトであることは、当業者であれば理解するであろう。
本明細書の開示はさらに、導入遺伝子または導入遺伝子カセットの挿入によって取得した、あるいは取得可能な、式（Ｉ）またはその副次的式のアデノウイルスをも対象とする。
本明細書中の「である（ｉｓ）」は、「～を含む」を意味する。
本明細書に関しては、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈すべきである。
特定の特徴／要素を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）本発明の実施態様はまた、別の実施態様である該関連要素／特徴「から成る」または「本質的に該関連要素／特徴から成る」にも及ぶことを意図する。
技術的に適切である場合には、本発明の複数の実施態様を組み合わせるのであってもよい。
特許および出願書などの技術的参考文献は参照として本明細書に組み入れられる。
本明細書において具体的かつ明示的に列挙されるいずれの実施態様も、単独のまたは１つ以上のさらなる実施態様と組み合わせた「除くクレーム」の根拠を形成することもある。
「背景技術」の節は、補正の根拠として用いられることもある。
本願は２０２１年２月１３日付けで出願された英国特許出願第ＧＢ２１０２０４９．０号に基づく優先権を主張するものである。その優先出願の開示内容が参照として本明細書に組み入れられるが、特にその配列が明示的に本明細書に組み入れられる。該優先権書類は、本明細書中の誤りの訂正に用いられることもある。
下の添付図を参照する後述の実施例において、実例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、実例は例示のみを目的とするものである。
乳癌（Ｔ６３）、結腸直腸腫瘍（Ｔ６４）および腎臓腫瘍（Ｔ６５）の初代細胞調製物の培養において、組み換えＩＬ－１２、ＩＬ１５およびＩＬ－１８蛋白質の異なる組み合わせがＩＦＮｇ産生に及ぼす効果を示す。 ＩＬ－１２、ＩＬ１５およびＩＬ－１８の異なる組み合わせで処理した乳癌（６０）初代細胞調製物の培養物中のＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞のＣＤ２５活性化マーカー発現を示す。 ＩＬ－１２、ＩＬ１５およびＩＬ－１８の異なる組み合わせで処理した乳癌（６０）初代細胞調製物の培養物中のＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞における、活性化脱顆粒ＣＤ１０７ａマーカーの発現を示す。 ＩＬ－１２、ＩＬ１５およびＩＬ－１８の異なる組み合わせで処理したＰＢＭＣのＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞における細胞内ＩＦＮｇ発現を示す。 ＩＬ－１２、ＩＬ１５およびＩＬ－１８の組み合わせの存在下または非存在下における、標的細胞である線維芽細胞の、ＦＡＰ特異的Ｔ細胞活性化因子（ＦＡＰ－ＴＡｃ）によるＰＢＭＣ由来Ｔ細胞媒介性殺滅（アポトーシス誘導）に関する速度論的解析を示す。 ＩＬ－１２、ＩＬ１５およびＩＬ－１８の組み合わせの存在下または非存在下における、標的細胞である線維芽細胞の、ＦＡＰ特異的Ｔ細胞活性化因子（ＦＡＰ－ＴＡｃ）によるＰＢＭＣ由来Ｔ細胞媒介性殺滅（アポトーシス誘導）のＩＦＮａによる増強を示す。 ＩＬ－１２、ＩＬ１５およびＩＬ－１８の組み合わせの存在下または非存在下における、標的細胞である線維芽細胞の、ＦＡＰ特異的Ｔ細胞活性化因子（ＦＡＰ－ＴＡｃ）で刺激した腫瘍由来初代リンパ球（腎臓腫瘍７０）による、Ｔ細胞媒介性殺滅（アポトーシス誘導）の速度論的解析を示す。 ＩＬ－１２、ＩＬ１５およびＩＬ－１８の組み合わせの存在下または非存在下における、標的細胞である線維芽細胞の、ＦＡＰ特異的Ｔ細胞活性化因子（ＦＡＰ－ＴＡｃ）で刺激した腫瘍由来初代リンパ球（腎臓腫瘍７０）による、Ｔ細胞媒介性殺滅（アポトーシス誘導）のＩＦＮａによる増強を示す。 ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞が媒介する標的腫瘍Ｋ５６２細胞殺滅に対する、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の効果を示す。 腫瘍由来初代ＮＫ細胞が媒介する標的腫瘍Ｋ５６２細胞殺滅に対する、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＦＮａの効果を示す。 ＰＢＭＣから調製されるナイーブＴ細胞の培養物における、組み換えケモカインを用いたケモカイン刺激性遊走を示す。 ＰＢＭＣから調製されるエフェクターＴ細胞の培養における、組み換えケモカインを用いたケモカイン刺激性遊走を示す。 乳癌（初代細胞）試料（５３）から調製されるＣＤ４５＋ ＴＩＬＳの培養における、組み換えケモカインを用いたケモカイン刺激性遊走を示す。 乳癌外科手術由来リンパ節の初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞および非Ｔ細胞（ＣＤ３－）のケモカイン刺激性遊走を示す。 マトリゲルをコーティングしたトランスウェルにおける単球由来樹状細胞のケモカイン刺激性遊走を示す。 マトリゲルをコーティングしたトランスウェルにおける樹状細胞のＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１ケモカイン刺激性遊走のリアルタイム画像分析（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）を示す。 ＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定した、リンパ節初代Ｔ細胞のＭｕｃ－１腫瘍抗原またはＣＥＦＴペプチドに対する応答に関する、ＩＬ－１２の存在下または非存在下でのＩＬ－１５の効果を示す。 ＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定した、リンパ節初代Ｔ細胞のＨｅｒ２腫瘍抗原（ＨＥＲ２－ＥＣＤおよびＨＥＲ２－ＩＣＤ）またはＣＥＦＴペプチドに対する応答に関する、ＩＬ－１２の存在下または非存在下でのＩＬ－１５の効果を示す。 ヒトＩＬ－１２をコードする導入遺伝子カセットの概略図を示す。ここで、ヒトＩＬ－１２は、個別のｐ３５およびｐ４０蛋白質として、あるいはｐ３５およびｐ４０鎖を共有結合によって連結するリンカーを用いた単一鎖ＩＬ－１２分子としてコードされる。 Ａ５４９細胞におけるＮＧ－７０１、ＮＧ－７０２およびＮＧ－７０３のゲノム複製を示す。 ＮＧ－７０１、ＮＧ－７０２およびＮＧ－７０３を感染させたＡ５４９細胞によるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質産生を示す。 ＮＧ－７０１、ＮＧ－７０２およびＮＧ－７０３を接種したＡ５４９細胞による導入遺伝子ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。 ＮＧ－７０１またはＮＧ－７０２を接種したＡ５４９細胞の上清のＥＬＩＳＡアッセイで測定したＩＬ－１２ｐ４０およびＩＬ－１２ｐ７０産生を示す。 ＮＧ－７０２またはＮＧ－７０３を接種したＡ５４９細胞によって産生されるＩＬ－１２の機能的活性を示す。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞ＩＬ－１２のシグナル伝達レポーターアッセイによって評価した。 抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体で刺激したＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ発現に対する、組み換えヒトＩＬ－１２の効果、またはＮＧ－７０２感染Ａ５４９細胞の上清の効果を示す。 組み換えヒトＩＬ－１２またはＮＧ－７０２感染Ａ５４９細胞の上清の、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体で刺激したＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａ発現に対する効果を示す。 ＩＬ１２ｐ４０－Ｌｉｎｋｅｒ－ＩＬ１２ｐ３５一本鎖ヒトＩＬ－１２と共に１種類以上の他の導入遺伝子をコードする導入遺伝子カセットの概略図を示す。一実施態様においては、これらの構築物はＢＹの位置に挿入される。 Ａ５４９細胞におけるＥｎＡｄ、ＮＧ－７０２、ＮＧ－７０４およびＮＧ－７０６のゲノム複製を示す。 ＮＧ－７０７、ＮＧ－７０４またはＮＧ－７０６を接種したＡ５４９細胞によって産生されるＩＬ－１２ｐ７０蛋白質のレベルを示す。 ＮＧ－７０４またはＮＧ－７０６で処理した同一Ａ５４９細胞によって産生されるＩＦＮａ蛋白質のレベルを示す。 ＮＧ－７０７を接種したＡ５４９細胞におけるＦｌｔ３Ｌ、ＭＩＰ１ａ、ＩＦＮａ、ＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２導入遺伝子のｍＲＮＡ発現を示す。 ＮＧ－７０７を接種したＡ５４９細胞におけるＦｌｔ３Ｌ、ＭＩＰ１ａ、ＩＦＮａ、ＣＸＣＬ９およびＩＬ－１２導入遺伝子の蛋白質発現を示す。 ＮＧ－７０９を接種したＡ５４９細胞におけるＩＦＮａ、ＣＣＬ１９、ＩＬ－１８およびＩＬ－１２導入遺伝子の蛋白質発現を示す。 ＮＧ－７０４、ＮＧ－７０６、ＮＧ－７０７またはＮＧ－７０９を接種したＡ５４９細胞の上清における機能的ＩＬ－１２の活性を示す。 ＮＧ－７０８を接種したＡ５４９細胞によるＩＬ－１２、Ｆｌｔ３ＬおよびＣＣＬ２１導入遺伝子蛋白質の産生を示す。 ＮＧ－７０８およびＮＧ－７０９を接種したＡ５４９細胞によるコード導入遺伝子蛋白質の産生を示す。特異的ＥＬＩＳＡにより測定した。 上記の図７Ａに示す異なるウイルスを接種したＡ５４９細胞（１ｘ１０６細胞）による、コード導入遺伝子蛋白質の産生を示す。 ＮＧ－７０２またはＮＧ－７０４を接種した結腸直腸腫瘍（６８）および腎臓腫瘍（７０）の腫瘍初代細胞調製物による、ＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質の産生を示す。 ＥｎＡｄ、ＮＧ－７０２またはＮＧ－７０４ウイルスを接種した、あるいは接種していない腎臓腫瘍初代細胞調製物であって、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の異なる組み合わせ存在下で培養した培養物によるＩＦＮｇ産生を示す。 腎臓腫瘍（７０）および結腸直腸腫瘍（７１）に由来する初代細胞調製物であって、ＮＧ－７０７を接種した腫瘍細胞調製物によるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質産生の経時的追跡を示す。 ＮＧ－７０２、ＮＧ－７０４、ＮＧ－７０７またはＮＧ－７０９を接種した乳癌初代細胞調製物（６６および６７）によるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質の産生を示す。 ＮＧ－７０７を２種類の異なる用量レベルで接種した結腸直腸腫瘍（７５）の初代細胞調製物によるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質産生の経時的追跡を示す。 ＮＧ－７０７を２種類の異なる用量レベルで接種した結腸直腸腫瘍（７６）の初代細胞調製物によるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質産生の経時的追跡を示す。 ＮＧ－７０７を２種類の異なる用量レベルで接種した結腸直腸腫瘍（７９）の初代細胞調製物によるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質産生の経時的追跡を示す。 ＮＧ－７０７を２種類の異なる用量レベルで接種した腎臓腫瘍（腫瘍７０）の初代細胞調製物によるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質産生の経時的追跡を示す。 ＩＬ－１５を有する、あるいは有していない膜貫通型または可溶性分泌型のＩＬ－１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインをコードする導入遺伝子カセットの概略図を示す。 ＩＬ－１５受容体アルファ型を発現しない３種類のウイルスと比較したＮＧ－７４０によるＩＬ－１５の産生を示す。 膜貫通型（ｓｕｓｈｉ－ＴＭ）または可溶性分泌型（ｓｕｓｈｉ）のＩＬ－１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインのうちのいずれかを有するＩＬ－１５プラスミドによる共形質転換後のＩＬ－１５産生を示す。 図９Ｃの試料におけるＩＬ－１５の機能的活性を示す。 膜貫通型または可溶性分泌型のＩＬ－１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインをそれぞれ発現するＮＧ－７４０およびＮＧ－７４８を接種したＡ５４９細胞によるＩＬ－１５産生を示す。 膜貫通型または可溶性分泌型のＩＬ－１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインをそれぞれ発現するＮＧ－７４０およびＮＧ－７４８を接種した結腸直腸腫瘍初代細胞によるＩＬ－１５産生を示す。 ＮＧ－７４８またはＮＧ－７０２で処理した腎臓腫瘍初代細胞による、それぞれ異なる量のＩＬ－１２またはＩＬ－１５の存在下でのＩＦＮｇ産生を示す。 膜貫通型または可溶性分泌型のＩＬ－１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインと共にＩＬ－１２およびＩＬ－１５をコードする導入遺伝子カセットの概略図を示す。 図１０Ａに示すウイルスで処理したＡ５４９細胞によるＩＬ－１２およびＩＬ－１５の産生を示す。ＥＬＩＳＡにより測定した。 図１０Ｂと同一の試料におけるＩＬ－１２およびＩＬ－１５の機能的活性を示す。 異なるウイルスを接種したＡ５４９細胞によるＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＦＮｇの産生を示す。２４時間後の培養物にＰＢＭＣを添加した。 異なるウイルスを接種したＡ５４９細胞によるＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＦＮｇの産生を示す。２４時間後の培養物に、精製ＣＤ３＋ Ｔ細胞を添加した。 異なるウイルスで処理したＡ５４９細胞と直接接触させながら、あるいはトランスウェル形態で分離した状態で培養したＴ細胞によるＩＦＮｇの産生を示す。 異なるウイルスを接種したＡ５４９細胞によるＩＬ－１５およびＩＦＮｇの産生を示す。２４時間後の培養物にＰＢＭＣまたは精製Ｔ細胞を添加した。 異なるウイルスで処理してから７２時間後の結腸直腸腫瘍初代細胞（腫瘍９８）によるＩＦＮｇ、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の産生を示す。 異なるウイルスで処理してから９６時間後の結腸直腸腫瘍初代細胞（腫瘍９９）によるＩＦＮｇの産生を示す。 膜貫通型または可溶性分泌型のＩＬ－１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインおよびさらに導入ケモカイン遺伝子（ＣＸＣＬ９またはＣＣＬ２１）と共にＩＬ－１２およびＩＬ－１５をコードする導入遺伝子カセットの概略図を示す。 異なるウイルスで処理したＡ５４９細胞によるＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９およびＣＣＬ２１の産生を示す。 異なるウイルスで処理したＡ５４９細胞によるＩＬ－１５の産生を示す。 異なるウイルスで処理した腫瘍初代細胞（腫瘍１０５）による、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５およびＣＸＣＬ９の導入遺伝子蛋白質の産生およびＩＦＮｇサイトカインの分泌を示す。 異なるウイルスで処理した結腸直腸腫瘍初代細胞（腫瘍１０５）によるＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９およびＩＦＮｇの産生を示す。 異なるウイルスで処理した結腸直腸腫瘍初代細胞（腫瘍１０７）によるＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１５、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ２１およびＩＦＮｇの産生を示す。 ＮＧ－７９５Ａで処理したＡ５４９細胞上清中のＣＣＬ２１導入遺伝子蛋白質で刺激した、単球由来樹状細胞の遊走および添加した抗ＣＣＬ２１抗体の存在下における遊走阻害を示す。 ＮＧ－７９５Ａで処理したＡ５４９細胞上清中のＣＣＬ２１導入遺伝子蛋白質で刺激した、単球由来樹状細胞の遊走および添加した抗ＣＣＬ２１抗体の存在下における選択的遊走阻害を示す。 ヒト腫瘍異種移植片を含むマウスであって、ＮＧ－７８６Ａ、ＮＧ－７９１ＡまたはＮＧ－７９６Ａを注射したマウスの血漿におけるＩＬ－１２ ｐ７０のレベルを示す。ＥｎＡｄを投与したマウスまたは未処置マウスと比較した。 キメラ抗原受容体の一般的構造を示す。 ＮＧ－７９６Ａ処理したＡ５４９細胞の上清中のＣＣＬ２１導入遺伝子蛋白質で刺激した、単球由来樹状細胞の遊走および添加した抗ＣＣＬ２１抗体の存在下における遊走阻害に関するグラフを示す。 ＣＡＲ－Ｔ単独またはＣＡＲ－Ｔ＋ＥｎＡｄ事前投与と比較した、Ｈｅｒ２特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞導入前に静注投与したＮＧ－７０４によるＡ５４９腫瘍異種移植細胞の増殖制御を示す。 ＣＡＲ－Ｔ単独またはＣＡＲ－Ｔ＋ＥｎＡｄ事前投与と比較した、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞導入前に静注投与したＮＧ－７９６ＡによるＡ５４９腫瘍異種移植細胞の増殖制御を示す。 ＮＧ－７９６ＡまたはＥｎＡｄの静注投与後のＡ５４９異種移植細胞腫瘍におけるＣＣＬ２１のレベルを示す。 ＮＧ－７９６Ａを感染させたＡ５４９細胞の上清におけるＩＬ－１２、ＣＣＬ２１、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン蛋白質のレベルを示す。 培養物に添加した異なる濃度の組み換えＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン蛋白質の存在下または非存在下における、ｐＵＣ－７９６ＡまたはｐＲＥＳ－１２８で形質転換したＡ５４９細胞の培養上清中に検出されたＩＬ－１５のレベルを示す。 分泌型ＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインをコードする配列を有する（ｐＵＣ－７９６Ａ）または有していない（ｐＲＥＳ－１２８）、単一鎖のＩＬ－１２（ｓｃＩＬ１２）、ＣＣＬ２１およびＩＬ－１５をコードするＣＭＶ ｐＵＣベクターにおける導入遺伝子カセットの概略図を示す。
配列
配列番号：１ 短いスプライス受容部位（ＳＳＡ）ＤＮＡ配列 － ＣＡＧＧ
配列番号：２ スプライス受容部位（ＳＡ）ＤＮＡ配列
配列番号：３ スプライス受容部位ＤＮＡ配列
配列番号：４ 高効率自己開裂可能Ｐ２Ａペプチド配列
配列番号：５ 高効率自己開裂可能Ｔ２Ａペプチド配列
配列番号：６ 高効率自己開裂可能Ｅ２Ａペプチド配列
配列番号：７ 高効率自己開裂可能Ｆ２Ａペプチド配列
配列番号：８ ポリアデニル化（ＰＡ）配列（ＳＶ４０後期ポリＡ配列）
配列番号：９ シグナル配列を有するヒトＩＬ－１２ ｐ３５蛋白質（ＩＬ１２ｐ３５）
配列番号：１０ シグナル配列を有するヒトＩＬ－１２ ｐ４０蛋白質（ＩＬ１２ｐ４０）
配列番号：１１ ヒトＩＬ－１２ ｐ７０単一鎖蛋白質であって、シグナル配列を有するＩＬ１２ｐ４０蛋白質を、シグナル配列を有していないＩＬ１２ｐ３５蛋白質のＮ末端側に連結するリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を有するヒトＩＬ－１２ ｐ７０単一鎖蛋白質（ＩＬ１２ｐ４０ＬｉｎｋｅｒＩＬ１２ｐ３５）
配列番号：１２ ヒトＩＬ－１２ ｐ７０単一鎖蛋白質であって、シグナル配列を有するＩＬ１２ｐ３５蛋白質を、シグナル配列を有していないＩＬ１２ｐ４０蛋白質のＮ末端側に連結する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを有するヒトＩＬ－１２ ｐ７０単一鎖蛋白質（ＩＬ１２ｐ３５ＬｉｎｋｅｒＩＬ１２ｐ４０）
配列番号：１３ ヒトインターフェロンアルファ２蛋白質配列
配列番号：１４ ヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）可溶性細胞外ドメインの蛋白質配列
配列番号：１５ ヒトＭＩＰ１アルファＬＤ７８ベータ（ＭＩＰ１ａ）蛋白質配列
配列番号：１６ ヒトＣＸＣＬ９蛋白質配列
配列番号：１７ ヒトＣＣＬ２１蛋白質配列
配列番号：１８ ヒトＣＣＬ５蛋白質配列
配列番号：１９ ヒトＣＣＬ１９蛋白質配列
配列番号：２０ ヒトＩＬ－１８の長いイソ型
配列番号：２１ ヒトＩｇＮ末端リーダー配列を有するヒトＩＬ－１５蛋白質
配列番号：２２ ヒトＩｇリーダーペプチド配列
配列番号：２３ リーダー配列を含まないヒトＩＬ－１５の蛋白質配列
配列番号：２４ ヒトＣＣＬ２１Ｃ末端短縮蛋白質配列（ＣＣＬ２１ｔ）
配列番号：２５ Ｎ末端にＩＬ－１５受容体アルファのリーダー配列を有し、ＰＤＧＦ受容体膜貫通ドメインに連結するＣ末端ｍｙｃペプチドを有するヒトＩＬ－１５受容体アルファＳｕｓｈｉドメインの蛋白質配列（ＩＬ１５ＲｓｕｓｈｉｍｙｃＴＭ）
配列番号：２６ Ｎ末端にＩＬ－１５受容体アルファのリーダー配列を有するヒトＩＬ－１５受容体アルファＳｕｓｈｉドメインの蛋白質配列
配列番号：２７ Ｍｙｃペプチド配列
配列番号：２８ ＰＤＧＦ受容体膜貫通ドメインの蛋白質配列
配列番号：２９ Ｎ末端にＩＬ－１５受容体アルファのリーダー配列を有するヒトＩＬ－１５受容体アルファＳｕｓｈｉドメインの蛋白質配列であって、それをＰＤＧＦ受容体膜貫通ドメインに連結するＣ末端Ｇｌｙ４Ｓｅｒペプチド配列を有するヒトＩＬ－１５受容体アルファＳｕｓｈｉドメインの蛋白質配列（ＩＬ１５ＲｓｕｓｈｉＧ４ＳＴＭ）
配列番号：３０ Ｇｌｙ４Ｓｅｒペプチドリンカー配列
配列番号：３１ （Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドリンカー配列
配列番号：３２ 配列番号：１７をコードするヒトＣＣＬ２１コードＤＮＡ配列
配列番号：３３ 配列番号：３２によってコードされるものと同一の蛋白質配列をコードするヒトＣＣＬ２１の改変コドン配列（ＣＣＬ２１ｍｏｄ）
配列番号：３４ Ｃ末端短縮蛋白質配列（配列番号：２４）を産生する目的で３′末端が短縮されているヒトＣＣＬ２１コード配列
配列番号：３５ Ｃ末端短縮蛋白質配列（配列番号：２４）を産生する目的で３′末端が短縮されているヒトＣＣＬ２１短縮改変コード配列（ＣＣＬ２１ｔｍｏｄ）；配列番号：３４によってコードされるものと同一の蛋白質配列
配列番号：３６ ＮＧ－７０４導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：３７ ＮＧ－７０６導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：３８ ＮＧ－７０７導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：３９ ＮＧ－７０８導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４０ ＮＧ－７０９導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４１ ＮＧ－７２０導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４２ ＮＧ－７２１導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４３ ＮＧ－７２２導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４４ ＮＧ－７２３導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４５ ＮＧ－７２４導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４６ ＮＧ－７２５導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４７ ＮＧ－７２６導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４８ ＮＧ－７４０導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：４９ ＮＧ－７４２導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５０ ＮＧ－７４４導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５１ ＮＧ－７４６導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５２ ＮＧ－７５０導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５３ ＮＧ－７５１導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５４ ＮＧ－７５２導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５５ ＮＧ－７５３導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５６ ＮＧ－７５４導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５７ ＮＧ－７５５導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５８ ＮＧ－７５６導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：５９ ＮＧ－７５７導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６０ ＮＧ－７５８導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６１ ＮＧ－７５９導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６２ ＮＧ－７６０導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６３ ＮＧ－７６１導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６４ ＮＧ－７６２導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６５ ＮＧ－７６３導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６６ ＮＧ－７６４導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６７ ＮＧ－７６５導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６８ ＮＧ－７６８導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：６９ ＮＧ－７６９導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：７０ ＮＧ－７７０導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：７１ ＮＧ－７７１導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：７２ ＮＧ－７７２導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：７３ ＮＧ－７７３導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：７４ ＮＧ－７０１ウイルスのゲノム配列
配列番号：７５ ＮＧ－７０２ウイルスのゲノム配列
配列番号：７６ ＮＧ－７０３ウイルスのゲノム配列
配列番号：７７ ＮＧ－７０４ウイルスのゲノム配列
配列番号：７８ ＮＧ－７０６ウイルスのゲノム配列
配列番号：７９ ＮＧ－７０７ウイルスのゲノム配列
配列番号：８０ ＮＧ－７０８ウイルスのゲノム配列
配列番号：８１ ＮＧ－７０９ウイルスのゲノム配列
配列番号：８２ ＮＧ－７２０ウイルスのゲノム配列
配列番号：８３ ＮＧ－７２１ウイルスのゲノム配列
配列番号：８４ ＮＧ－７２２ウイルスのゲノム配列
配列番号：８５ ＮＧ－７２３ウイルスのゲノム配列
配列番号：８６ ＮＧ－７２４ウイルスのゲノム配列
配列番号：８７ ＮＧ－７２５ウイルスのゲノム配列
配列番号：８８ ＮＧ－７２６ウイルスのゲノム配列
配列番号：８９ ＮＧ－７４０ウイルスのゲノム配列
配列番号：９０ ＮＧ－７４２ウイルスのゲノム配列
配列番号：９１ ＮＧ－７４４ウイルスのゲノム配列
配列番号：９２ ＮＧ－７４６ウイルスのゲノム配列
配列番号：９３ ＮＧ－７５０ウイルスのゲノム配列
配列番号：９４ ＮＧ－７５１ウイルスのゲノム配列
配列番号：９５ ＮＧ－７５２ウイルスのゲノム配列
配列番号：９６ ＮＧ－７５３ウイルスのゲノム配列
配列番号：９７ ＮＧ－７５４ウイルスのゲノム配列
配列番号：９８ ＮＧ－７５５ウイルスのゲノム配列
配列番号：９９ ＮＧ－７５６ウイルスのゲノム配列
配列番号：１００ ＮＧ－７５７ウイルスのゲノム配列
配列番号：１０１ ＮＧ－７５８ウイルスのゲノム配列
配列番号：１０２ ＮＧ－７５９ウイルスのゲノム配列
配列番号：１０３ ＮＧ－７６０ウイルスのゲノム配列
配列番号：１０４ ＮＧ－７６１ウイルスのゲノム配列
配列番号：１０５ ＮＧ－７６２ウイルスのゲノム配列
配列番号：１０６ ＮＧ－７６３ウイルスのゲノム配列
配列番号：１０７ ＮＧ－７６４ウイルスのゲノム配列
配列番号：１０８ ＮＧ－７６５ウイルスのゲノム配列
配列番号：１０９ ＮＧ－７６８ウイルスのゲノム配列
配列番号：１１０ ＮＧ－７６９ウイルスのゲノム配列
配列番号：１１１ ＮＧ－７７０ウイルスのゲノム配列
配列番号：１１２ ＮＧ－７７１ウイルスのゲノム配列
配列番号：１１３ ＮＧ－７７２ウイルスのゲノム配列
配列番号：１１４ ＮＧ－７７３ウイルスのゲノム配列
配列番号：１１５ ヒトの成熟ＩＬ－１２ ｐ７０単一鎖蛋白質であって、シグナル配列を有していないＩＬ１２ｐ４０蛋白質を、シグナル配列を有していないＩＬ１２ｐ３５蛋白質のＮ末端側に連結する（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを有するヒトの成熟ＩＬ－１２ ｐ７０単一鎖蛋白質（成熟ＩＬ１２ｐ４０ＬｉｎｋｅｒＩＬ１２ｐ３５）
配列番号：１１６ ＮＧ－７０１導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１１７ ＮＧ－７０２導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１１８ ＮＧ－７０３導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
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配列番号：１５０ ＮＧ－７６５導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１５１ ＮＧ－７６８導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
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配列番号：１５３ ＮＧ－７７０導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１５４ ＮＧ－７７１導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１５５ ＮＧ－７７２導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１５６ ＮＧ－７７３導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１５７ ＰＤＧＦ受容体Ａ膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号：１５８ ＰＤＧＦ受容体Ｂ膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号：１５９ インスリン様増殖因子１受容体膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号：１６０ ＩＬ－６受容体膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号：１６１ ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列
配列番号：１６２ 開始コドン － （ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧｇを含む配列
配列番号：１６３ ヒトＣＤ３３Ｎ末端リーダー配列を有するヒトＩＬ－１５蛋白質
配列番号：１６４ ヒトＣＤ３３リーダーペプチド配列
配列番号：１６５ ヒトＩＬ－２Ｎ末端リーダー配列を有するヒトＩＬ－１５蛋白質
配列番号：１６６ ヒトＩＬ－２リーダーペプチド配列
配列番号：１６７ ＮＧ－７４８導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１６８ ＮＧ－７７４導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１６９ ＮＧ－７７５導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７０ ＮＧ－７７６導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７１ ＮＧ－７７７導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７２ ＮＧ－７８１導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７３ ＮＧ－７８２導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７４ ＮＧ－７８４導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７５ ＮＧ－７８５導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７６ ＮＧ－７８５Ａ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７７ ＮＧ－７８６Ａ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７８ ＮＧ－７８７導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１７９ ＮＧ－７８７Ａ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８０ ＮＧ－７８８Ｐ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８１ ＮＧ－７８９Ｐ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８２ ＮＧ－７９０Ｐ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８３ ＮＧ－７９１Ａ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８４ ＮＧ－７９２Ａ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８５ ＮＧ－７９４Ａ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８６ ＮＧ－７９５Ａ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８７ ＮＧ－７９６Ａ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８８ ＮＧ－７９９Ａ導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：１８９ ＮＧ－７４８導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９０ ＮＧ－７７４導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９１ ＮＧ－７７５導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９２ ＮＧ－７７６導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９３ ＮＧ－７７７導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９４ ＮＧ－７８１導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９５ ＮＧ－７８２導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９６ ＮＧ－７８４導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９７ ＮＧ－７８５導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９８ ＮＧ－７８５Ａ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：１９９ ＮＧ－７８６Ａ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２００ ＮＧ－７８７導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２０１ ＮＧ－７８７Ａ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２０２ ＮＧ－７８８Ｐ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２０３ ＮＧ－７８９Ｐ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２０４ ＮＧ－７９０Ｐ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２０５ ＮＧ－７９１Ａ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２０６ ＮＧ－７９２Ａ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２０７ ＮＧ－７９４Ａ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２０８ ＮＧ－７９５Ａ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２０９ ＮＧ－７９６Ａ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２１０ ＮＧ－７９９Ａ導入遺伝子カセットの蛋白質コード配列についてのＤＮＡ配列；停止コドンを含む
配列番号：２１１ ＮＧ－７４８ウイルスのゲノム配列
配列番号：２１２ ＮＧ－７７４ウイルスのゲノム配列
配列番号：２１３ ＮＧ－７７５ウイルスのゲノム配列
配列番号：２１４ ＮＧ－７７６ウイルスのゲノム配列
配列番号：２１５ ＮＧ－７７７ウイルスのゲノム配列
配列番号：２１６ ＮＧ－７８１ウイルスのゲノム配列
配列番号：２１７ ＮＧ－７８２ウイルスのゲノム配列
配列番号：２１８ ＮＧ－７８４ウイルスのゲノム配列
配列番号：２１９ ＮＧ－７８５ウイルスのゲノム配列
配列番号：２２０ ＮＧ－７８５Ａウイルスのゲノム配列
配列番号：２２１ ＮＧ－７８６Ａウイルスのゲノム配列
配列番号：２２２ ＮＧ－７８７ウイルスのゲノム配列
配列番号：２２３ ＮＧ－７８７Ａウイルスのゲノム配列
配列番号：２２４ ＮＧ－７８８Ｐウイルスのゲノム配列
配列番号：２２５ ＮＧ－７８９Ｐウイルスのゲノム配列
配列番号：２２６ ＮＧ－７９０Ｐウイルスのゲノム配列
配列番号：２２７ ＮＧ－７９１Ａウイルスのゲノム配列
配列番号：２２８ ＮＧ－７９２Ａウイルスのゲノム配列
配列番号：２２９ ＮＧ－７９４Ａウイルスのゲノム配列
配列番号：２３０ ＮＧ－７９５Ａウイルスのゲノム配列
配列番号：２３１ ＮＧ－７９６Ａウイルスのゲノム配列
配列番号：２３２ ＮＧ－７９９Ａウイルスのゲノム配列
配列番号：２３３ ＮＧ－７０１導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：２３４ ＮＧ－７０２導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：２３５ ＮＧ－７０３導入遺伝子カセットによってコードされる蛋白質配列
配列番号：２３６ ヒトＩＬ－１５蛋白質であって、ヒトＩｇＮ末端リーダー配列を有し、それをシグナル配列を有していないヒトＩＬ－１５受容体アルファＳｕｓｈｉドメインに連結するペプチドリンカーを有するヒトＩＬ－１５蛋白質
配列番号：２３７ ＮＧ－７８７およびＮＧ－７８７Ａにおいて、ＩＬ－１５をＩＬ－１５受容体アルファのｓｕｓｈｉドメインに連結するリンカーペプチド
配列番号：２３８ ヒトＰＤＧＦＲ受容体Ａ膜貫通領域ペプチド
配列番号：２３９ ヒトＰＤＧＦＲ受容体Ｂ膜貫通領域ペプチド
配列番号：２４０ ヒトインスリン様増殖因子１膜貫通領域ペプチド
配列番号：２４１ ヒトＩＬ６－Ｒ膜貫通領域ペプチド
配列番号：２４２ ヒトＣＤ２８膜貫通領域ペプチド
配列番号：２４３ ヒトＩＬ－１５受容体アルファＳｕｓｈｉドメインの蛋白質配列
配列番号：２４４ Ｎ末端にＨｉｓタグを付加した組み換えＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン蛋白質の蛋白質配列；Ｃ末端Ｐ２Ａペプチド配列を有する
配列番号：２４５ ＣＭＶ ｐＵＣベクター ｐＵＣ－７９６ＡのＤＮＡ配列
配列番号：２４６ ＣＭＶ ｐＵＣベクター ｐＲＥＳ－１２８のＤＮＡ配列
実施例
実施例１：ヒト腫瘍初代（細胞）試料における組み換えＩＬ－１５、ＩＬ－１８およびＩＦＮα蛋白質の活性
サイトカインおよび／またはケモカインの異なる組み合わせが、腫瘍初代細胞培養の応答に与える潜在的な相加的活性または相乗的活性を評価する目的で、ウイルス中で導入遺伝子としてコードされる分子のモデルとして組み換え蛋白質を用いた。初代ヒト腫瘍細胞に及ぼす影響に関しては、外科切除した腫瘍試料をＡｑｉｘ臓器輸送メディウム（アンフォテリシンＢ、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびメトロニダゾールを含む）に入れ４℃で臨床現場から発送して、処理のために２４時間以内に実験室がそれを受け取った。試料はメスを用いて細切して小片化した後、Ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ組織ホモジナイザー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて腫瘍解離混合液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で酵素的に解離させた。濾過によって単一細胞懸濁液を取得し、細胞収量に応じて、ウシ胎仔血清、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）、または癌細胞株培地（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｍｅｄｉｕｍ）ＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）のいずれかを含む９６穴プレートまたは２４穴プレートに播種した。培地処方には両方とも、さらにアンフォテリシンＢ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した。これらの懸濁液に含まれる細胞の種類については常にフローサイトメトリーによる分析を行い、腫瘍細胞および異なる免疫細胞サブセット（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を含む）が含まれることを確認した。
３種類の腫瘍（初代細胞）試料、腫瘍６３（乳癌）、腫瘍６４（ＣＲＣ）および腫瘍６５（腎臓腫瘍）を受領し、上記のように処理した。解離させた腫瘍細胞培養物に、組み換えＩＬ－１２ ｐ７０（１５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を単独または組み合わせて添加した。刺激から７２時間後に、上清試料を回収して、上記のように澄明化した。ＩＦＮγ蛋白質はＥＬＩＳＡによって定量した。ＩＬ－１２およびＩＬ－１５はいずれも単独で腫瘍６４および６５の培養物のＩＦＮγ産生を刺激した（ただし、腫瘍６３では刺激が得られなかった）；他方、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の組み合わせ、またはＩＬ－１２およびＩＬ－１５およびＩＬ－１８の組み合わせでは、これらの単独刺激よりもより高いＩＦＮγレベルの産生を刺激した；これは、腫瘍６３をも含むものであったが、腫瘍６３では、他の組み合わせの場合にはいずれも検出可能レベルの産生は起こらなかった（図１Ａ）。これらの腫瘍細胞培養物においては、組み換えＩＬ－１８はＩＦＮγ産生を刺激せず、ＩＬ－１５単独またはＩＬ－１２とＩＬ－１５の組み合わせによって惹起されるＩＦＮγ産生に対して無効果であるか、またはほとんど効果を示さなかった。
第２の実験では、乳癌試料（腫瘍６０）を上記のような方法で解離し、組み換え蛋白質と共に培養した。感染から７２時間後に、単層をこすり取り、穏やかにピペッティングすることによって生細胞を回収した。３００ｘｇの遠心分離によって細胞を沈殿させた後、１μＬのＬｉｖｅ－Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む２００μＬのＰＢＳを添加して、暗所にて氷上で１０分間インキュベートした。次いで、遠心分離によって試料を沈殿させてから、２％ＦＢＳを含む５０μＬの冷ＰＢＳ（フロー緩衝液）中に、複数の細胞表面蛋白質を標的とする抗体（ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１０７ａおよびＣＤ２５）のカクテルを含む溶液を添加した。暗所にて氷上で試料を２０～３０分間インキュベートした後、遠心分離で沈殿させ、フロー緩衝液で２回洗浄してから、フロー緩衝液に再懸濁した。次いで、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーにより試料の分析を行った。そのデータによって、ＩＬ－１５単独、またはＩＬ－１２およびＩＬ－１８との組み合わせで、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の表面上のＣＤ２５活性化マーカーの発現が増加することが明らかとなった（図１Ｂ）。ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８またはそれらの組み合わせの存在下では、ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現が増加した。ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ発現は、ＩＬ－１５が存在することによって増加したが、ＩＬ－１２またはＩＬ－１２とＩＬ－１８組み合わせによってその発現がさらに増強した。ベースライン（図１Ｃ）。
第３の実験では、表示の組み換え蛋白質と共にウシ胎仔血清、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を含むＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で、健常ドナーのＰＢＭＣを培養した。刺激から４８時間後に生細胞を回収してフローサイトメトリーで分析した。しかし、この場合には回収の１２時間前に細胞をブレフェルジンＡで処理して、上記の（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（登録商標）キットを用いた）細胞外染色後に固定／透過化の付加的工程を実施した後、暗所にて氷上で細胞を抗ＩＦＮγ抗体と共に３０分間インキュベートした。次いで、遠心分離によって細胞沈殿させ、フロー緩衝液で２回洗浄してから、フロー緩衝液に再懸濁した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーにより試料の分析を行った。このデータによって、ＩＬ－１５と組み合わせたＩＬ－１２が、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞ならびにＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生を増加させ、この増加はＩＬ－１８の存在によってさらに増強されることが明らかになった（図１Ｄ）。
実施例２：他の組み換えサイトカインの存在下および非存在下でのＩＬ－１２によるＴ細胞媒介性標的細胞殺滅の増強
ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８およびＩＦＮα（単独または組み合わせによる）のＴ細胞媒介性標的細胞殺滅増強能を評価する目的で、本発明者らは、腫瘍関連線維芽細胞表面上の線維芽細胞活性化蛋白質（ＦＡＰ）およびＦＡＰ発現細胞のＴ細胞媒介性殺滅を司るＴ細胞上のＣＤ３（ＦＡＰ－ＴＡｃ）の両方を標的とする二重特異性Ｔ細胞活性化因子（ＴＡｃ）をコードするウイルスを用いた（Ｆｒｅｅｄｍａｎら、２０１８、Ａｎ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｎｏｖ １８：１－１４； ＷＯ２０１８／０４１８３８およびＷＯ２０１８／０４１８２７）。
ＦＡＰ－ＴＡｃ（上記文献においては二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）とも記載されている）を発現するＮＧ－６１７を１ｐｐｃの量でＡ５４９細胞に感染させた。感染から１１日後に、上清を回収して、３００ｘｇ、５分間の遠心分離により澄明化した後、分注して－８０℃で凍結した。ＦＡＰ発現性肺線維芽細胞株ＭＲＣ－５を１ｘ１０４細胞／ウェルの密度で９６穴プレートに播種して、５μＭのカスパーゼＧｒｅｅｎ試薬（ＩｎｃｕＣｙｔｅ；Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色する前に、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。培地を除去し、新鮮解凍した上清（ＮＧ－６１７で処理した細胞の上清であって、ＦＡＰ－ＴＡｃ蛋白質を含む上清）で置換した。ヒトＰＢＭＣドナーから単離したＴ細胞（６ｘ１０５細胞／ウェル）と共に、組み換えＩＬ－１２ ｐ７０（１５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を単独またはＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ－１５（５０ｎｇ／ｍＬ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）および／またはＩＦＮα（１，５００Ｕ／ｍＬ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）と組み合わせて、のいずれかで添加した。次いで、プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞撮像装置中で３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートしながら、ウェル当たり４イメージを３０分毎に撮影した；インキュベーションは２４時間行った。このデータにより、ＩＬ－１２単独では、ＦＡＰ－ＴＡｃが媒介するＴ細胞によるＭＲＣ５細胞殺滅を、ＦＡＰ－ＴＡｃのみで刺激した場合よりも増強する（カスパーゼ陽性ＭＲＣ５細胞の増加として観察される）ことはないが、ＩＬ－１８の共存下または非共存下において、ＩＬ－１２とＩＬ－１５の組み合わせでは、殺滅を増強することが明らかになった（図２Ａ）。同一の実験において、サイトカインを添加した場合にも、あるいは添加していない場合にも、ＩＦＮαはＴ細胞媒介性殺滅をさらに増強した（図２Ｂ）。
第２の実験では、ＡｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）でＴＩＬ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、腫瘍７０からＣＤ４５＋腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）を単離した。次いで、上記の方法でＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の代わりにＴＩＬを用いて、Ｔ細胞媒介性殺滅アッセイを実施した。このデータにより、ＩＬ－１２単独では、ＦＡＰ－ＴＡｃ単独の場合よりもＴ細胞によるＭＲＣ５細胞殺滅を増強することはないが、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の組み合わせ、ならびにＩＬ－１２およびＩＬ－１５およびＩＬ－１８の組み合わせでは殺滅増強が起こり、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の組み合わせで増強が最大となることが明らかになった（図２Ｃ）。同一の実験において、ＩＬ－１２単独を除き、上記いずれかの組み合わせと共にＩＦＮαを添加した場合には、殺滅増強が起こった（図２Ｄ）。
別の実験では、ＰＢＭＣからＮＫ細胞を単離して、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－１５で２４時間の予備刺激を行った後に、１２時間休止させた。次いで、細胞をＭＨＣクラスＩ低発現Ｋ５６２細胞株と共にインキュベートした。Ｋ５６２細胞（標的細胞）は予めＶｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ ｔｒａｃｋｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて製造元のプロトコルにしたがって標識を行った。次いで、５μＭのカスパーゼＧｒｅｅｎ試薬存在下にて、Ｋ５６２細胞をＮＫ細胞（１：１の比；９６穴プレート中、５ｘ１０４細胞／ウェル）と共に３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。次に、細胞を３００ｘｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄してフロー緩衝液に再懸濁した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーで試料を分析して、カスパーゼ陽性Ｋ５６２細胞の割合（％）をプロットした（図２Ｅ）。このデータから、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５はいずれも個々にＮＫ媒介性殺滅を増強可能であるが、これら２種類のサイトカインを組み合わせた場合にはさらなる増強が得られることが明らかになった。
類似の実験において、腎臓腫瘍（初代細胞）に由来するＴＩＬと共にＫ５６２細胞を、上記のような方法でインキュベートした。解離させた腫瘍細胞（全生細胞に対する割合で約１６％、ＮＫ細胞を含む）を、コラーゲンでコーティングした２４穴プレートに播種し、４時間後に、非接着細胞（ＴＩＬ濃縮細胞）を、コラーゲンでコーティングした別のプレートに移して、表記のサイトカインで１８時間刺激した、あるいは刺激を行わなかった。次いで、細胞をカウントし、標識した標的Ｋ５６２細胞と共に４時間インキュベートした（０日目のＮＫ数に基づき、エフェクター：標的細胞の比＝２：１）。ＩＬ－１２またはＩＬ－１５単独で刺激した腫瘍浸潤性初代ＮＫ細胞は、標的Ｋ５６２細胞殺滅の増強を示したが、これら２種類のサイトカインの組み合わせでは、最大の殺滅増強が得られた（図２Ｆ）。
実施例３：組み換えケモカインに応答する免疫細胞遊走
ＰＢＭＣ調製物中の免疫細胞サブセットならびに腫瘍（初代細胞）試料から単離したＴＩＬの遊走に対するケモカインの効果を評価する目的で、複数の実験を実施した。遊走アッセイは、トランスウェルアッセイシステム（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて実施したが、このアッセイでは、９６穴または２４穴プレート中の培地にケモカインを添加してから、直径３μｍの細孔を含む透過性膜を有するプレートインサートを上部に取り付けた。次いで、プレートインサートに、上記の細胞を添加した。ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて磁気により、ＰＢＭＣからＴ細胞およびそのサブセットを単離した；実施例１に記載されるような方法で解離させた腫瘍試料からＴＩＬを単離した。培地単独、あるいは５０ｎＭのＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１９、またはＣＣＬ２１を含む培地を、トランスウェルプレートの底部に添加した後、ナイーブＴ細胞（１００，０００細胞／ウェル）またはエフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞（８０，０００細胞／ウェル）を上部槽に加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３時間３０分インキュベートした後、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いたフローサイトメトリーで下部槽の細胞を計数した。全てのケモカインが、ナイーブＴ細胞およびエフェクターＴ細胞の両方の遊走を、培地単独の対照よりも強く刺激した；ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１は、ＣＸＣＬ９またはＣＸＣＬ１０よりも、多くのナイーブＴ細胞の遊走を刺激した（図３Ａ）；また、逆にエフェクターＴ細胞では、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０がより多くの細胞の遊走を刺激した（図３Ｂ）。
第２の実験では、乳癌（腫瘍５３）から単離したＴＩＬをおおよそ２４時間休止させた後、上記のようなトランスウェルプレートに添加した。４種類のケモカインはいずれも、バックグラウンド（培地のみの対照）を超える遊走を刺激し、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１が最大数のＴＩＬ遊走を刺激した（図３Ｃ）。
第３の実験では、乳癌の外科手術の一部として切除した初代リンパ節から解離させた白血球（上記実施例１において説明される処置であって腫瘍（初代細胞）に用いる処置と同一の処置）を、フラスコ（３７℃、５％ＣＯ２）に入れて３時間放置し、プラスチック面に接着させた後、遊走アッセイで非接着細胞を除去した。上記のような方法で、トランスウェル遊走アッセイを実施した；すなわち、２４穴プレートの上部槽に１．２ｘ１０５細胞を添加した。各条件は２回繰り返して実施し、遊走後に下部槽に存在する細胞を計数して、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ （Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いたフローサイトメトリーで染色／分析した（図３Ｄ）。このデータにより、ＣＸＣＬ９およびＣＣＬ２１の両方が、リンパ節由来のＴ細胞（ＣＤ３＋）および非Ｔ細胞（ＣＤ３－リンパ球）の遊走を誘導することが明らかになった。
別の実験では、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４と共に細胞を７日日間培養することにより、健常ドナーから単球由来樹状細胞を調製した後、遊走アッセイで試験する前に、その細胞をＬＰＳで２４時間成熟させた。トランスウェルアッセイは２４穴プレートを用いて実施したが、このプレートは挿入槽を有し、挿入槽は直径８μｍの細孔を含む透過性膜を備えており、１００μｇ／ｍＬのマトリゲルで予めコーティングが施された。次いで、遊走アッセイを３７℃、５％ＣＯ２で６時間実施し、上記の方法で分析を行った。図３Ｅに示すように、単球由来樹状細胞は、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１の両方に強く応答する。マトリゲルでコーティングした８μｍの細孔膜を有する９６穴プレート（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて製造元のプロトコルにしたがい、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ走化性アッセイも実施した（図３Ｆ）。膜上の細胞を走査し、化学走化性分析ソフトウェアを用いて経時的に定量した。図３Ｆに示されるように、培地対照の場合と比較して、上部槽では組み換えＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１に応答して、樹状細胞の数が経時的に減少した；このことは、これらケモカインに対する樹状細胞の走化性応答を実証している。
実施例４：乳癌外科手術リンパ節に由来するＴ細胞の腫瘍Ａｇ特異的応答のサイトカイン媒介性増強
ＩＬ－１２およびＩＬ－１５サイトカインが抗原特異的抗腫瘍Ｔ細胞応答を増強し得るか否かを評価する目的で、乳癌の外科手術によって得たリンパ節由来初代細胞を用いたＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。解離後（上記の実施例３のような方法で）、リンパ節細胞を丸底９６穴プレートに播種して、乳癌関連ペプチドプール、またはＣＥＦＴ（破傷風菌、エプスタインバーウイルス（ＨＨＶ－４）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＨＶ－５）、インフルエンザＡ）ペプチドプールのいずれか、あるいは対照としてＤＭＳＯ含有培地のみで処理した。このアッセイでは以下の乳癌関連ペプチドプール（ＪＰＴから購入）を用いた：
ＭＵＣ－１（ムチン－１）、ＨＥＲ２－ＥＣＤ（受容体チロシン蛋白質キナーゼｅｒｂＢ－２－細胞外ドメイン）およびＨＥＲ２－ＩＣＤ（受容体チロシン蛋白質キナーゼｅｒｂＢ－２－細胞内ドメイン）。１時間後に、組み換えＩＬ－１２またはＩＬ－１５、またはそれらサイトカインの組み合わせを表示濃度で培養物に添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６日間静置した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの前日に、細胞を休止させた（細胞培養培地を除去して、完全培地のみに置換することによる）。ＥＬＩＳｐｏｔ実施日に、細胞を計数し、プレートに播種して（２．５ｘ１０４／ウェル）、細胞刺激を行ったのと同一のペプチドでブースター刺激を実施した。また同時に、同一試料の（リンパ節解離の日に）予め凍結した細胞を解凍して、抗原提示細胞として添加した（１．８５ｘ１０５／ウェル）。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔプレートを製造元（Ｍａｂｔｅｃｈ）のプロトコルにしたがって発色させ、ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダー（ＣＴＬ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）を用いてスポット数を読み取った。図４に示されるように、ＩＬ－１５は、ＭＵＣ－１（図４Ａ）およびＨＥＲ２（図４Ｂ）に対するＴ細胞応答を有意に増加させた。
実施例５：ヒトＩＬ－１２ ｐ３５およびＩＬ－１２ ｐ４０のいずれかを個別の蛋白質として、あるいは柔軟なリンカーで連結してした蛋白質をコードするウイルスの作成
ヒトＩＬ－１２導入遺伝子を別々にコードする３種類のウイルス（ＮＧ－７０１、ＮＧ－７０２、ＮＧ－７０３）を作成した（表１、図５Ａ）。
Figure 2024510712000003
各導入遺伝子カセットにおいて、ＩＬ－１２配列をコードするｃＤＮＡの５′末端に、短いスプライス受容部位配列（ＳＳＡ、配列番号：１ － ＣＡＧＧ）を隣接して配置した。ＩＬ－１２配列の３′末端には、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列（ＰＡ、配列番号：８）をコードさせた。ウイルスＮＧ－７０１では、ＩＬ－１２ ｐ３５およびＩＬ－１２ ｐ４０の両方のＩＬ－１２鎖を個別鎖として翻訳および産生することを可能にするため、ＩＬ－１２ ｐ３５およびＩＬ－１２ ｐ４０の配列を個々にＰ２Ａリボソームスキッピング配列（配列番号：４）に連結した。ウイルスＮＧ－７０２およびウイルスＮＧ－７０３では、ＩＬ－１２導入遺伝子は単一鎖バリアントをコードし、これはＩＬ－１２のｐ３５鎖およびｐ４０鎖の２つの個別の配列を、柔軟なリンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）をコードする配列で連結することで作成された。
ウイルス産生
プラスミドｐＮＧ－７０１、ｐＮＧ－７０２およびｐＮＧ－７０３を作成する目的で、プラスミドｐＣｏｌｏＡｄ２．４（ＷＯ２０１５／０９７２２０）を用いて、導入遺伝子蛋白質をコードする合成導入遺伝子カセットを直接挿入した。制限酵素ＡｓｉＳＩおよびＳｂｆＩを用いて、プラスミドｐＣｏｌｏＡｄ２．４および導入遺伝子カセットを消化した。消化した各導入遺伝子カセットを、消化したプラスミドｐＣｏｌｏＡｄ２．４に直接的に連結した。ｐＮＧ－７０１導入遺伝子カセットは、ＩＬ－１２ ｐ３５およびＩＬ－１２ ｐ４０の２つを、個別の導入遺伝子蛋白質（配列番号：９および１０）としてコードし、一方、ｐＮＧ－７０２導入遺伝子カセットは、リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号：３１）を介してＩＬ－１２ ｐ３５蛋白質のＮ末端に共有結合で連結されるＩＬ－１２ ｐ４０蛋白質を含む単一鎖ＩＬ－１２分子（配列番号：１１）をコードする；また、ｐＮＧ－７０３導入遺伝子カセットは、リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を介してＩＬ－１２ ｐ４０蛋白質のＮ末端に共有結合で連結されるＩＬ－１２ ｐ３５蛋白質を含む単一鎖ＩＬ－１２分子（配列番号：１２）をコードする。導入遺伝子カセットの模式図を図５Ａに示す。構築したプラスミドＤＮＡの構造は、制限酵素分析およびサンガー法による配列決定により確認した。
ウイルスゲノムを作成するため、酵素ＡｓｃＩによる制限酵素消化でプラスミドｐＮＧ－７０１、ｐＮＧ－７０２およびｐＮＧ－７０３を線状化した。ウイルスは、下記の方法にしたがって増幅・精製した。
消化ＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出により精製し、６００μｌの＞９５％分子生物学グレードのエタノールおよび１５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムで、－２０℃にて１６±２時間沈殿させた。１３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で、沈殿ＤＮＡをペレットにし、５００μｌの７０％エタノールで２回洗浄した。この清浄なＤＮＡ沈殿を空気乾燥し、１５μｌのリポフェクタミン形質転換試薬を含む５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭに再懸濁して、室温で３０分間インキュベートした。次いで、７０％細胞被覆率に増殖させた２９３細胞を含むＴ－２５フラスコに、滴下によって形質転換混合物を添加した。細胞を形質転換混合物と共に、３７℃、５％ＣＯ２でおおよそ２時間インキュベーションした後、４ｍｌの細胞培地（グルタミンおよび２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース）を細胞に加えて、フラスコを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
形質転換した２９３細胞を２４時間毎に観察し、必要に応じて、さらに培地を加えた。単層細胞における有意な細胞変性効果（ＣＰＥ）を調べることにより、ウイルス産生をモニターした。過度のＣＰＥが認められた時点で、３回の凍結／解凍サイクルを行うことにより、２９３細胞からウイルスを回収した。ウイルスストックを増幅するために、回収ウイルスを用いて２９３細胞を再感染させた。単層細胞における有意なＣＰＥを調べることにより、増幅中の生ウイルス産生を確認した。ＣＰＥが認められた場合には、３回の凍結／解凍サイクルを行うことにより、２９３細胞からウイルスを回収した。このウイルス増幅ストックを用いてさらなる増幅を実施した。その後、精製ウイルスストックを作成するために、塩化セシウムによる２バンド形成により、ウイルスを精製した。
ウイルス粒子の感染性およびＩＬ－１２ ｐ７０の定量
ヒト肺腺癌Ａ５４９細胞を細胞密度７．５ｘ１０５細胞／ウェルで１２穴プレートに播種し、ＥｎＡｄ、ＮＧ－７０１、ＮＧ－７０２またはＮＧ－７０３のいずれかを０．０１粒子／細胞（ｐｐｃ）で感染させた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、３日、４日または７日後に細胞および上清を回収した。３００ｘｇ、５分間の遠心分離により、上清試料を澄明化した。各ウェルにＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）＋βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を加え最大の回収を得るためにピペッティングを行い、細胞画分を取得した。次いで、この細胞画分を上清澄明化で得た沈殿と共にプールし、各時点でｑＰＣＲによりウイルスゲノムを定量した。このデータは、試験したウイルスのそれぞれが同程度の量のウイルスゲノムを類似の速度論で産生することを実証した（図５Ｂ）。同一の実験の上清試料におけるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質をＥＬＩＳＡで定量した。このＥＬＩＳＡデータは、ＩＬ－１２をコードする３種類のウイルス全てが、ＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質を産生し、ＮＧ－７０１およびＮＧ－７０２はＮＧ－７０３よりも多く産生することを示した（図５Ｃ）。異なるｐｐｃレベルを用いた同様な第２の試験においては、ＮＧ－７０１、ＮＧ－７０２およびＮＧ－７０３による導入遺伝子ｍＲＮＡの発現が同程度であることがＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって実証された（図５Ｄ）。
第３の実験では、Ｔ１７５フラスコにヒト肺腺癌Ａ５４９細胞を播種し、細胞密度１．４５ｘ１０７細胞／フラスコで、１０ｐｐｃのＮＧ－７０１またはＮＧ－７０２に感染させた。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートしてから、細胞および上清を回収した。３００ｘｇの遠心分離により上記の方法で、細胞および上清を分離した。上清試料中のＩＬ－１２ ｐ４０およびＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質をＥＬＩＳＡで定量した。このデータにより、個別の蛋白質としてＩＬ－１２ ｐ４０およびＩＬ－１２ ｐ３５をコードするＮＧ－７０１は、主にＩＬ－１２ ｐ４０蛋白質を産生しＩＬ－１２ ｐ７０はほとんど産生しない；他方、柔軟なリンカーで連結した２つのＩＬ－１２サブユニットをコードするＮＧ－７０２は、主にＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質を産生することが示された（図５Ｅ）。
別の実験では、Ｔ１７５フラスコにヒト肺腺癌Ａ５４９細胞を播種し、細胞密度２．６ｘ１０７細胞／フラスコで、１０ｐｐｃのＮＧ－７０２またはＮＧ－７０３に感染させた。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートしてから、細胞および上清を回収した。３００ｘｇの遠心分離により上記の方法で、細胞および上清を分離した。産生ＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質の機能的活性を、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポーター細胞株を用いて評価した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ＩＬ－１２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、ＳＴＡＴ４誘導可能な分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子と共に、ヒトＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１２シグナル伝達経路の遺伝子を安定発現する細胞である。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を５ｘ１０４細胞／ウェルで９６穴プレートに播種した後、上清または１００ｎｇ／ｍＬの組み換えＩＬ－１２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）によって刺激を行い、３７℃、５％ＣＯ２で１８～２４時間インキュベーションした。アッセイプレートを３００ｘｇで５分間遠心分離してから、澄明化上清を取り、２０μＬを別の９６穴プレートに移して１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬を加えた。このプレートを３７℃で１時間インキュベートしてから、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘプレートリーダーでプレートの吸光度（６２０ｎｍ）を測定した。このデータから、ＮＧ－７０３感染細胞の上清と比較して、ＮＧ－７０２感染細胞の上清は、レポーター細胞からのＳＥＡＰ分泌を促進することが明らかになった（図５Ｆ）。
さらなる試験においては、精製したヒトＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の両方で活性化させた、あるいは非活性化状態のままにした；これらの細胞を、組み換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）またはＮＧ－７０２に６日間感染させたＡ５４９細胞の上清（ＳＮ）の存在下で培養した。次いで、細胞を回収し、細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機能の活性化の尺度としてＮＧ－１０７ａの発現をフローサイトメトリーで分析した。ＮＧ－７０２上清は、ｒｈＩＬ－１２を用いた場合と同程度にＣＤ１０７ａの発現を促進した（図５Ｇおよび５Ｈ）。
実施例６：他の導入遺伝子と共に一本鎖ＩＬ－１２をコードするウイルスの作成
単一鎖ＩＬ－１２導入遺伝子ならびに１種類以上のさらなる導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットを有する一群のウイルスを設計、調製、および精製した。実施例５の方法にしたがって、ウイルスＮＧ－７０４、ＮＧ－７０６、ＮＧ－７０７、ＮＧ－７０８およびＮＧ－７０９を作成した。残りのウイルス（ＮＧ－７２０およびそれより大きい番号のウイルス）については、制限酵素ＡｓｉＳＩおよびＳｂｆＩを用いてプラスミドｐＣｏｌｏＡｄ２．４を消化し、増幅ＰＣＲ産物の５′末端および３′末端に２０ｂｐ配列が付加されるように各合成導入遺伝子カセットをＰＣＲでプライマーを用いて増幅した。この付加配列はプラスミドｐＣｏｌｏＡｄ２．４の導入遺伝子カセット挿入部位を挟む配列に相補的であり、ＰＣＲ増幅した導入遺伝子カセットを消化したプラスミドｐＣｏｌｏＡｄ２．４に対する直接的アセンブリを可能にした。以降の工程は実施例５に記載するものと同一であった。一本鎖ＩＬ－１２と共に少なくとも１種類の他の導入遺伝子をコードするウイルスを表２に列挙し、図６に具体的に示す。一部のウイルス調製物については、塩化セシウムを用いる代わりに、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（イオジキサノール）の密度勾配を用いて、１０℃で１５５，０００ｇの遠心分離を１時間行い、より小規模に精製した。
Figure 2024510712000004
Figure 2024510712000005
Figure 2024510712000006
実施例７：ヒトＩＬ－１２およびその他の導入遺伝子をコードするウイルスの作成と活性
ウイルス粒子の感染性および導入遺伝子蛋白質産生の定量
実施例５に記載されるような方法で、ＥｎＡｄ、ＮＧ－７０２、ＮＧ－７０４またはＮＧ－７０６のいずれかを１００ｐｐｃでＡ５４９細胞に感染させた。２４時間後または４８時間後に、上清および細胞を回収し、上清を澄明化した。各時点で、ｑＰＣＲによりウイルスゲノムを定量した。このデータは、試験したウイルスのそれぞれが同程度の量のウイルスゲノムを類似の速度論で産生することを実証した（図７Ａ）。同一の実験の上清試料におけるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質をＥＬＩＳＡで定量した。このＥＬＩＳＡデータは、単一鎖ＩＬ－１２をコードする３種類のウイルス全てが、ＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質を産生し、ＮＧ－７０６の場合に最大産生であり、またＮＧ－７０４の場合には産生が最少であることを示した（図７Ｂ）。同一の上清におけるＩＦＮαレベルのＥＬＩＳＡ定量は、ＮＧ－７０６感染腫瘍細胞におけるＩＦＮα導入遺伝子蛋白質産生がＮＧ－７０４感染細胞よりも少ないことを示した（図７Ｃ）。
第２の実験では、ヒト肺腺癌Ａ５４９細胞を９６穴プレートに細胞密度５ｘ１０４細胞／ウェルで播種して、ＥｎＡｄまたはＮＧ－７０７のいずれかを１ｐｐｃで感染させた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートしてから、細胞および上清を回収した。細胞および上清の試料を、上記のような方法で澄明化し、また溶解も行った。コード導入遺伝子のそれぞれを標的とするプライマーを用いたＲＴ－ｑＰＣＲにより、細胞画分の分析を行った；そのデータは、ＮＧ－７０７がコードする５種類の遺伝子のそれぞれをコードするｍＲＮＡが同程度の量で産生されるが、ＥｎＡｄではそのような産生は起こらないことを実証した（図７Ｄ）。同一の実験の上清試料を用い、ＩＬ－１２ ｐ７０、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＭＩＰ１α、ＩＦＮαおよびＣＸＣＬ９の導入遺伝子蛋白質の産生をＥＬＩＳＡで定量した。ＥＬＩＳＡデータによって、ＮＧ－７０７がコードする５種類の蛋白質それぞれの産生が示された（図７Ｅ）。
第３の実験では、肺癌Ａ５４９細胞を播種しＮＧ－７０９に感染させて、上記のような方法で上清を回収した。ＩＬ－１２ ｐ７０、ＩＦＮα、ＭＩＰ１ａ、ＣＣＬ１９およびＩＬ－１８導入遺伝子蛋白質の産生をＥＬＩＳＡによって定量した；これにより、ＮＧ－７０９がコードする４種類の蛋白質それぞれの産生が示された（図７Ｆ）。
第４の実験では、肺癌Ａ５４９細胞を播種し、ＥｎＡｄ、ＮＧ－７０４、ＮＧ－７０６、ＮＧ－７０７およびＮＧ－７０９を１ｐｐｃで７２時間感染させた後、上記のような方法で上清を回収し澄明化した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を５ｘ１０４細胞／ウェルで９６穴プレートに播種した後、上清（それぞれ事前に１０倍希釈した）、または１００～１．６ｎｇ／ｍＬの濃度範囲の組み換えＩＬ－１２（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で刺激した。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で２０～２４時間インキュベートした後、３００ｘｇの遠心分離を５分間行い、澄明化上清を取り、次いでその２０μＬを９６穴プレートに移し、１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ試薬を加えた。このアッセイプレートを３７℃で１時間インキュベートしてから、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘプレートリーダーでプレートの吸光度（６２０ｎｍ）を測定した。このデータから、ＮＧ－７０４は、ＩＬ－１２をコードする他のウイルスよりも、機能的ＩＬ－１２を産生する量が少ないことが明らかになった（図７Ｇ）。
第５の実験では、肺癌Ａ５４９細胞を播種し、ＮＧ－７０８を１ｐｐｃで９６時間感染させ、上記のような方法で上清を回収して澄明化した。ＩＬ－１２ ｐ７０、ＣＣＬ２１およびＦｌｔ３Ｌ導入遺伝子蛋白質の産生をＥＬＩＳＡによって定量した；これにより、ＮＧ－７０８がコードするこれら３種類の蛋白質それぞれの産生が明らかになった（図７Ｈ）。
第６の実験では、Ａ５４９細胞播種し、ＮＧ－７０８またはＮＧ－７０９を１０ｐｐｃで７２時間感染させ、上記のような方法で上清を回収して澄明化した。ＩＬ－１２、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５、ＩＦＮａおよびＩＬ－１８導入遺伝子蛋白質の産生をＥＬＩＳＡによって定量した；これにより、ＮＧ－７０９がコードする４種類の蛋白質それぞれが産生され、またＮＧ－７０８ではＩＬ－１２、ＣＣＬ２１およびＦｌｔ３Ｌが産生されたが、ＣＣＬ５についてはこの実験では検出されない（ＮＤ）ことが明らかになった（図７Ｉ）。
さらなる実験では、図６に示す他のウイルスを１ｐｐｃで用いてＡ５４９細胞に９６時間感染させ、上記のような方法で上清を回収して澄明化して、導入遺伝子蛋白質の産生をＥＬＩＳＡにより定量した。異なる導入遺伝子蛋白質のレベルは異なるウイルス間で異なっていたが、ＩＬ－１５のレベルに関しては一貫して低いか、あるいは検出不能であった（図７Ｊ）。これらのウイルスの一部においては、導入遺伝子蛋白質レベルの測定を行わなかった（ＮＤ）ものもあり、あるいは測定したがアッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）を下回る場合もあった。
実施例８：ヒト腫瘍（初代細胞）試料におけるウイルスによるＩＬ－１２ ｐ７０産生
ヒト腫瘍初代細胞を用いて、ウイルスおよび導入遺伝子蛋白質の活性を評価する目的で、外科的に切除した腫瘍試料をＡｑｉｘ臓器輸送メディウム（アンフォテリシンＢ、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびメトロニダゾールを含む）に入れ４℃で臨床現場から発送して、処理のために２４時間以内に実験室がそれを受け取った。２回の別個の実験において、結腸直腸腫瘍（ＣＲＣ、腫瘍６８）および腎臓腫瘍（腫瘍７０）の試料を、メスを用いて細切して小片化した後、Ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ組織ホモジナイザー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて腫瘍解離混合液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で酵素的に解離させた。濾過によって単一細胞懸濁液を取得し、細胞収量に応じて、ウシ胎仔血清およびインスリン－トランスフェリンを添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）、または癌細胞株培地（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｍｅｄｉｕｍ）ＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）のいずれかを含む９６穴プレートまたは２４穴プレートに播種した。培地処方には両方とも、さらにアンフォテリシンＢ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した。これらの懸濁液に含まれる細胞の種類については常にフローサイトメトリーによる分析を行い、腫瘍細胞および異なる免疫細胞サブセット（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を含む）が含まれることを確認した。各腫瘍試料から取得した単一細胞懸濁液について、非感染状態を保持するか、あるいは１０００ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ－７０２またはＮＧ－７０４に感染させるか、のいずれかの処理を行った。さらに、組み換え蛋白質を（ＩＬ－１２ ｐ７０を１５ｎｇ／ｍＬで、ＩＬ－１５を５０ｎｇ／ｍＬで、ＩＬ－１８を５０ｎｇ／ｍＬで）単独、または組み合わせて、あるいは（異なる組み合わせの種類を網羅するように）いずれかを除外して添加した。ＩＬ－１２発現ウイルスを含むウェルには、組み換えＩＬ－１２ ｐ７０を添加しなかった。感染から４８時間後（腫瘍６８）または９６時間後（腫瘍７０）に、実施例７に記載する方法で、上清試料を回収して澄明化した。両方の実験の上清試料について、ＥＬＩＳＡによるＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質の定量を行った。ＥＬＩＳＡデータは、ＩＬ－１２をコードする両ウイルスが、腫瘍７０においてＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質を産生し、ＮＧ－７０２で産生が最大であり；一方、腫瘍６８では、ＮＧ－７０２のみが定量可能レベルに産生することを示した（図８Ａ）。腫瘍７０の培養における上清試料についても、ＩＦＮγ蛋白質に関するＥＬＩＳＡ分析を実施した。ＩＬ－１２とＩＬ－１５との組み合わせは、ＩＦＮγ産生を刺激した；両者とも組み換えＩＬ－１２を含んでおり、ＩＬ－１２はＮＧ－７０２またはＮＧ－７０４に感染した培養物によって産生された。ＩＬ－１２単独では、組み換え体であるか、ＮＧ－７０２またはＮＧ－７０４にコードされるかにかかわらず、ＩＦＮγ産生を刺激することはなかった。一部の場合には、組み換えＩＬ－１８をこれらの培養物に添加することによってＩＦＮγ産生がさらに増強されることもあった（図８Ｂ）。ＩＬ－１５単独の対照については、この実験には含めていなかったが、概要を示した図１Ａの試験では、ＩＬ－１５単独で、ＩＬ－１２単独の場合と類似のＩＦＮγレベルを誘導することが実証されている；この試験では、ＩＬ－１２による誘導は低いか、あるいは定量化不可能レベルであった。ＮＧ－７０４感染ウェルでＩＦＮγがより低産生であることは、この実験におけるＮＧ－７０２と比較して、ＩＬ－１２産生がより低レベルであることに相関する（図８Ａ）。
第２の実験では、腫瘍７０細胞および解離させた別のＣＲＣ腫瘍（腫瘍７１）の細胞の両者を培養して、１０００ｐｐｃのＮＧ－７０７に感染させた。感染から３日後、４日後、５日後、７日後および１０日後に、上清および細胞の試料を回収した。細胞および上清の試料を澄明化して、上記のような方法で溶解を行った。上清試料をＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質についてＥＬＩＳＡで定量した。ＥＬＩＳＡデータによって、両腫瘍試料においてＮＧ－７０７が全ての測定時点でＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質を産生することが明らかになった（図８Ｃ）。
第３の実験では、上記のような方法で、２種類の乳癌試料（腫瘍６６および６７）を解離させて、非感染（ＵＩＣ）状態のまま培養するか、あるいは１０００ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ－７０２、ＮＧ－７０４、ＮＧ－７０７またはＮＧ－７０９に感染させるか、のいずれかを実施した。感染から４日後に、上清と細胞の試料を回収した。上記のような方法で、上清試料を澄明化した。上清試料をＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質についてＥＬＩＳＡで定量した。このＥＬＩＳＡデータによって、両腫瘍試料においてＮＧ－７０７およびＮＧ－７０９はＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質を検出可能に産生し、他方、腫瘍６７では、ＮＧ－７０２のみが検出可能に蛋白質を産生し、ＮＧ－７０４ではいずれの腫瘍試料においても検出可能に蛋白質を産生することはないことが明らかになった（図８Ｄ）。
第４の実験では、結腸直腸腫瘍試料（腫瘍７５）を上記のような方法で解離させて培養し、非感染（ＵＩＣ）状態のままにするか、あるいは１ｐｐｃまたは１００ｐｐｃのＮＧ－７０７に感染させるか、のいずれかを実施した。接種から１日後、４日後、６日後、８日後、および１１日後に、上清試料を回収し、上記のような方法で澄明化して、ＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質についてＥＬＩＳＡで定量した。このＥＬＩＳＡデータから、ＮＧ－７０７は、１００ｐｐｃの場合に４日目から、および１ｐｐｃの場合には８日目から、検出可能にＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質を産生することが明らかになった（図８Ｅ）。注記：非感染対照において４日目に検出したＩＬ－１２蛋白質は、腫瘍試料の不均一混合細胞中に存在する免疫細胞による低レベル産生に起因する可能性が高い。
第５の実験では、結腸直腸腫瘍試料（腫瘍７６）を上記のような方法で解離させて培養し、非感染（ＵＩＣ）状態のままにするか、あるいは１ｐｐｃまたは１０００ｐｐｃのＮＧ－７０７に感染させるか、のいずれかを実施した。接種から１日後、４日後、６日後、８日後、および１１日後に、上清試料を回収し、上記のような方法で澄明化して、ＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質についてＥＬＩＳＡで定量した。このＥＬＩＳＡデータから、ＮＧ－７０７は、１０００ｐｐｃの場合には１日目から、および１ｐｐｃの場合には４日目から、検出可能にＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質を産生することが明らかになった（図８Ｆ）。
第６の実験では、結腸直腸腫瘍試料（腫瘍７９）を上記のような方法で解離させて培養し、非感染（ＵＩＣ）状態のままにするか、あるいは１ｐｐｃまたは１０００ｐｐｃのＮＧ－７０７に感染させるか、のいずれかを実施した。接種から１日後、４日後、６日後、８日後、および１１日後に、上清試料を回収し、上記のような方法で澄明化して、ＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質についてＥＬＩＳＡで定量した。このＥＬＩＳＡデータから、ＮＧ－７０７は、１０００ｐｐｃの場合には４日目から検出可能にＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質を産生し、１ｐｐｃの場合には、いずれの時点でもＩＬ－１２の検出可能な産生は起こらないことが明らかになった（図８Ｇ）。
第７の実験では、初代腎細胞癌試料（腫瘍７０）を上記のような方法で解離させて、非感染（ＵＩＣ）状態のままにするか、あるいは１００ｐｐｃまたは１０００ｐｐｃのＮＧ－７０７に感染させるか、のいずれかを実施した。接種から３日後、４日後、５日後、７日後、および１０日後に、上清試料を回収し、上記のような方法で澄明化して、ＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質についてＥＬＩＳＡで定量した。このデータから、ＮＧ－７０７は、１００ｐｐｃの場合よりも１０００ｐｐｃの場合に検出可能ＩＬ－１２ ｐ７０蛋白質をより高いレベルで産生した（図８Ｈ）。
実施例９：導入遺伝子カセット中にヒトＩＬ－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒａ）のＩＬ－１５結合領域と共にヒトＩＬ－１５をコードするウイルスの活性
ＩＬ－１５による機能的シグナル伝達は、まずＩＬ－１５のＩＬ－１５Ｒａ分子への結合を含み、次いで、それが、コモンガンマ鎖（ｇｃ）およびＩＬ－２受容体ベータ（ＩＬ－２Ｒｂ）を含む受容体を有する細胞に結合する。ＩＬ－１５結合ドメインをコードさせることによる、ＩＬ－１５導入遺伝子の機能的活性への影響を調べる目的で、ＩＬ－１５Ｒａの主要なＩＬ－１５結合領域（「Ｓｕｓｈｉ」ドメイン）の膜固定型を作成した；すなわち、その配列を、ｃＭｙｃペプチドまたはＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーのいずれかを介してＰＤＧＦ受容体の膜貫通領域に連結することによって膜固定型を作成した。これらの導入遺伝子配列を用いて、ウイルスＮＧ－７４４およびＮＧ－７４６、ならびにＩＬ－１５をもコードするＮＧ－７４０およびＮＧ－７４２を作出した（表３、図９Ａ）。
Figure 2024510712000007
ウイルスは、実施例６に記載されるプロトコルを用いて作成し精製した。
第１の実験において、ＥＬＩＳＡによれば、ＮＧ－７４０をＡ５４９細胞に接種することによって、ＩＬ－１５の産生が増加した（ＩＬ－１５導入遺伝子をコードするがＩＬ－１５Ｒａはコードしていない他のウイルス（ＮＧ－７５７、ＮＧ－７５８、ＮＧ－７５９）との比較）（図９Ｂ）。
膜貫通固定型または可溶性分泌型のＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインのいずれかを発現することによる、ＩＬ－１５産生への影響を評価する目的で、まず、ＣＭＶプロモーターの制御下で遺伝子産物を発現するＣＭＶ ｐＵＣベクターを用いる形質転換アプローチを試みた。ＩＬ－１５ ｐＵＣベクター単独で、またはＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインの可溶性分泌型または膜貫通固定型いずれかを発現する個別のベクターとの併用によって、ＨＥＫ－２９３細胞を形質転換した場合には、ＥＬＩＳＡによる測定（図９Ｃ）、または機能的レポーターアッセイを用いて測定（図９Ｄ）で、いずれかの型のＩＬ－１５Ｒａの産生が増大した。このレポーターアッセイでは、ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ－２細胞（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ）を用いたが、ＨＥＫ２９３細胞は細胞表面に天然ＩＬ－１５Ｒａを構成的に発現するので、ＩＬ－１５ならびにＩＬ－２に応答して分泌型アルカリホスファターゼレポーター蛋白質を産生する；発色酵素アッセイを用いてレポーター蛋白質の測定を行う。
次に、さらなるウイルスとしてＮＧ－７４８を構築し、（実施例６のような方法で）調製した；これは、ＩＬ－１５と共に可溶性（分泌される）形態のＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインを産生するものであった（表３、図９Ａ）。ＮＧ－７４０またはＮＧ－７４８のいずれかをＡ５４９細胞（図９Ｅ）または結腸直腸腫瘍初代細胞試料（図９Ｆ）に接種することによって、ＥＬＩＳＡによる測定では、いずれの場合にもＩＬ－１５産生が起こることが示され、分泌型可溶性ＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインをコードするＮＧ－７４８では産生レベルがより高かった。
別の試験では、添加した異なるレベルの組み換えＩＬ－１２またはＩＬ－１５の存在下で、腎臓腫瘍初代細胞（腫瘍１０１）を、それぞれＮＧ－７４８またはＮＧ－７０２で処理した。培養物中の初代ＴＩＬによるＩＦＮｇ産生を、培養上清のＥＬＩＳＡによって測定した。このデータ（図９Ｇ）は、ＩＬ－１５産生性ＮＧ－７４８ウイルスと添加したＩＬ－１２とによる強力な用量依存性のＩＦＮｇ誘導相乗効果、ならびにＩＬ－１２産生性ウイルスＮＧ－７０２と添加したＩＬ－１５とによる同様な用量依存性相乗効果を示した。
実施例１０：ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の両方を分泌するように設計したＩＬ－１５Ｒｓｕｓｈｉをコードするウイルス
ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の両導入遺伝子と共に異なる形態のＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインが組み込まれるようにさらなるウイルスを設計した。ウイルスＮＧ－７８５、ＮＧ－７８５Ａ、ＮＧ－７８６Ａ、ＮＧ－７８７およびＮＧ－７８７Ａ（表４；図１０Ａ）を作成して、実施例６に記載されるような方法で精製した。
Figure 2024510712000008
これらのウイルスによる導入遺伝子蛋白質の産生を評価する目的で、Ａ５４９細胞を１ｐｐｃのウイルスに感染させ、９６時間後に上清を回収して、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５についてのＥＬＩＳＡおよび機能的レポーターアッセイを行った。このＥＬＩＳＡデータにより、５種類全てのウイルスで、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５は良好な発現レベルであることが示されたが、例外は、ＮＧ－７８５によって産生されるＩＬ－１２が非常に低レベルであったことである（図１０Ｂ）。ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の機能レポーターアッセイにおいて、これら同一の上清を異なる希釈率で（実施例５および実施例９に記載されるような方法で）試験したところ、ＥＬＩＳＡの結果と整合するデータが得られ、作成した導入遺伝子蛋白質の機能性が実証された（図１０Ｃ）。
第２の試験では、Ａ５４９細胞を未処置状態のままにするか、あるいは１ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ－７４０、ＮＧ－７４８または表４に列挙したウイルスを接種した。２４時間後にＰＢＭＣを加えて、ウイルスによって産生されるサイトカインが免疫細胞反応を刺激する能力について評価した。次いで、７２時間後に上清を回収して、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の導入遺伝子蛋白質のレベルならびに添加した免疫細胞によって産生されるＩＦＮｇのレベルをＥＬＩＳＡで評価した。このデータによって、ＩＬ－１５Ｒｓｕｓｈｉバリアントと共にＩＬ－１２およびＩＬ－１５の両方を発現する５種類のウイルスは、ＩＬ－１５Ｒ ｓｕｓｈｉバリアントと共にＩＬ－１５のみを発現し、ＩＬ－１２については発現しないＮＧ－７４０およびＮＧ－７４８よりも、ＩＦＮｇ産生をさらに強く誘導することが明らかになった（図１０Ｄ）。
さらなる実験において、Ａ５４９細胞に１ｐｐｃのＮＧ－７８５Ａ、ＮＧ－７８６ＡまたはＮＧ－７８７Ａあるいは対照を接種し２４時間培養した後に、（ＰＢＭＣから精製した）ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞を加えた。７２時間後に、ウイルスによる導入遺伝子蛋白質産生の機能的評価として、培養上清のＩＦＮｇレベルをＥＬＩＳＡで調べた。導入遺伝子を含む３種類のウイルス全てが、コードするＩＬ－１２およびＩＬ－１５蛋白質を産生し、それによって高レベルのＩＦＮｇ産生が起こった。これは加えたＴ細胞の活性化を示唆している；他方、対照ウイルスＥｎＡｄでは上記のような産生は認められなかった（図１０Ｅ）。
これらと同一の３種類のウイルスを用いたさらなる実験では、培養条件の比較を行った。このとき、トランスウェルプレートでの培養において、ウイルス接種Ａ５４９腫瘍細胞が、添加した応答者Ｔ細胞に接触するようにした。ただし、このトランスウェルプレートでは、Ｔ細胞はウイルス接種腫瘍細胞から隔てられており、両者間の直接接触は回避した。これによって、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５導入遺伝子蛋白質と共にＩＬ－１５Ｒ ｓｕｓｈｉ導入遺伝子蛋白質がトランスウェルのフィルターを越えることができる場合（ＮＧ－７８６Ａ）に達成されるＴ細胞活性化の比較が可能となった；比較の対象は、ＩＬ－１５ＲｓｕｓｈｉｍｙｃＴＭであり、ＩＬ－１５ＲｓｕｓｈｉｍｙｃＴＭは接種した腫瘍細胞の細胞膜に留まるのでトランスウェルのフィルターを越えて移動することができないのである（ＮＧ－７８５Ａ）。比較基準対照として、ＥｎＡｄまたはＥｎＡｄを用い、かつ組み換えＩＬ－１２およびＩＬ－１５を添加した。ウイルスは１ｐｐｃで用い、２４時間後に２種類の培養物にＴ細胞を加えた。Ｔ細胞培養上清中のＩＦＮｇをＥＬＩＳＡで測定した結果から以下のことが明らかになった：導入遺伝子蛋白質産生腫瘍細胞からＴ細胞を分離した場合には、分泌型のＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインを用いる（ＮＧ－７８６Ａ）ことにより、膜貫通型ＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン（ＮＧ－７８５Ａ）と比較してより高い活性化レベルが得られ、それは、組み換えＩＬ－１２およびＩＬ－１５と共に、ＥｎＡｄ接種を用いた場合に示されるような、ＩＬ－１５Ｒａ導入遺伝子のない状況で達成される活性化よりも高いものであった（図１０Ｆ）。
図１０Ｄに示される試験に類似の試験では、ＰＢＭＣまたは精製Ｔ細胞のいずれかを添加することによって、ＩＬ－１２／ＩＬ－１５媒介性免疫細胞活性化を評価した。このデータから再び、試験した５種類の導入遺伝子含有ウイルスの全てでＩＦＮｇ産生の活性化が起こることが示された（図１０Ｇ）。
実施例１１：ヒト腫瘍初代細胞培養物におけるウイルスＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒｓｕｓｈｉの活性評価
２名の結腸直腸癌患者に由来する原発ヒト腫瘍試料を、実施例１に記載するような方法で処理し培養した。同型培養物に１０００ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ－７８５Ａ、ＮＧ－７８６ＡまたはＮＧ－７８７Ａを接種した、あるいは培養物を未処置のままにした。７２時間後（腫瘍９８、図１１Ａ）または９６時間後（腫瘍９９、図１１Ｂ）に、上清を取り、腫瘍試料における内因性の腫瘍浸潤リンパ球活性化の尺度として、ＩＦＮｇのレベルをＥＬＩＳＡで測定した。図１１に示されるように、すべての導入遺伝子発現ウイルスが、腫瘍初代細胞によるＩＬ－１２およびＩＬ－１５の産生を引き起こし、かつＩＦＮｇ産生刺激を惹起した。
実施例１２：さらに第４の導入遺伝子を発現するＩＬ－１５Ｒｓｕｓｈｉ、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５ウイルスの作成と特徴付け
さらなる一群のウイルスであって、ＩＬ－１５Ｒｓｕｓｈｉ、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５と共に、導入遺伝子カセットにコードされるさらなる１種類または２種類の導入遺伝子として、ＩＦＮａ、ＣＸＣＬ９またはＣＣＬ２１を有するウイルスを設計し、実施例６に記載されるような方法で調製した（表５；図１２Ａ）。
Figure 2024510712000009
ウイルスＮＧ－７８８Ｐ、ＮＧ－７９４Ａ、ＮＧ－７９５Ａ、ＮＧ－７９６ＡおよびＮＧ－７９９Ａの特徴付けを、導入遺伝子蛋白質に関する特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより実施した；このアッセイでは、Ａ５４９細胞に上記ウイルスを感染させ、また対照として非感染（ＵＩＣ）Ａ５４９細胞またはＥｎＡｄ感染Ａ５４９細胞を用いた。ＮＧ－７９９Ａを例外として、全ウイルスで、コードする導入遺伝子蛋白質全てが検出可能レベルとなり、ＮＧ－７９４ＡおよびＮＧ－７９６Ａでは、ＩＬ－１５レベルが顕著に高くなった（図１２Ｂ）。ＮＧ－７９９Ａでは、ＣＣＬ２１が検出レベルに達することなく、またＩＬ－１５も低かった。
類似の第２の試験では、表４、実施例１０に列挙されているウイルスと共に、上記と同一の５種類のウイルスを試験して、ＩＬ－１５Ｒｓｕｓｈｉと共にＩＬ－１２およびＩＬ－１５を共発現するウイルスが産生するＩＬ－１５導入遺伝子蛋白質のレベルと比較した。Ａ５４９細胞の培養上清におけるＩＬ－１５のＥＬＩＳＡデータ（図１２Ｃ）は、全ウイルスでＩＬ－１５が検出可能であることを示し、ＮＧ－７９４ＡおよびＮＧ－７９６Ａを用いた場合に最高レベルであった。
次に、ＮＧ－７９４ＡおよびＮＧ－７９６Ａの試験を行った；すなわち、１０００ｐｐｃのウイルスを接種した結腸直腸腫瘍試料（腫瘍１０５）を用いて実施例１に記載されるような方法で確立したヒト腫瘍初代細胞培養物に対するＮＧ－７９４ＡおよびＮＧ－７９６Ａの効果を調べた。４８時間後に、上清を回収してＥＬＩＳＡによるサイトカイン分析を行った。そのデータ（図１２Ｄ）は、上記の導入遺伝子含有ウイルスの両方が、それぞれの導入遺伝子を産生しＩＦＮｇ産生の活性化を惹起することを示している。
類似の試験では、異なる結腸直腸腫瘍試料（腫瘍１０７）をＮＧ－７８６ＡまたはＮＧ－７９６Ａで処理し、ＥｎＡｄまたは非処理と比較した。図１２Ｅに示されるように、両方の導入遺伝子含有ウイルスが、それらの導入遺伝子蛋白質を産生し、この腫瘍初代細胞におけるＩＦＮｇ産生の活性化を惹起した。
さらなる試験では、別の結腸直腸腫瘍試料（腫瘍１１２）をＮＧ－７８６Ａ、ＮＧ－７９１Ａ、ＮＧ－７９４ＡまたはＮＧ－７９６Ａで処理し、ＥｎＡｄまたは非処理と比較した。図１２Ｆに示されるように、全ての導入遺伝子含有ウイルスが、それら導入遺伝子蛋白質を産生し、この腫瘍初代細胞におけるＩＦＮｇ産生の活性化を惹起した。
ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞または腫瘍初代細胞培養物によるＩＦＮｇ産生を利用して、ＩＬ１２およびＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒｓｕｓｈｉ導入遺伝子蛋白質の機能性を試験した。ＣＣＬ２１導入遺伝子産物の機能性を実証するために、（実施例３に記載されるような方法でＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４と共にそれらの細胞を培養することにより）ＰＢＭＣから調製した単球由来樹状細胞をＬＰＳで２４時間刺激した後、トランスウェル遊走アッセイを行った。５００ｍｇ／ｍＬマトリゲルでコーティングした８ｍｍ細孔サイズのトランスウェルを用いて、実施例３に記載されるような方法により、遊走アッセイを実施した。非感染Ａ５４９細胞、あるいはＥｎＡｄまたはＮＧ－７９５Ａで処理したＡ５４９細胞の培養上清を、（室温で１時間予備インキュベートした）ＣＣＬ２１に対するブロッキング抗体を含む、あるいは含まない下部のウェルに入れ、上部ウェルには樹状細胞を加えた。１２時間培養した後、下部チャンバーに遊走した樹状細胞の数をフローサイトメトリーで計数した。図１２Ｇのデータは、ＮＧ－７９５Ａ由来のＣＣＬ２１を含む上清によって、樹状細胞の遊走が選択的に増加したが、この増加は抗ＣＣＬ２１抗体によって阻害されたことを示している。このことは、ＣＣＬ２１導入遺伝子産物が樹状細胞に関するケモカインとして機能的であることを示している。反復実験でも類似のデータを得た；この場合には、ＬＰＳ刺激後であって、遊走アッセイに用いる前に、樹状細胞を１ｍＭのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅｒ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した；また、抗ＣＣＬ２１による遊走阻害の特異性を実証するため、非関連抗体対照としてアイソタイプ適合抗体も含めた（図１２Ｈ）。
実施例１３：インビボでのマウス試験におけるウイルスのＩＬ－１２ ｐ７０産生
ウイルスおよび導入遺伝子蛋白質産生および活性を全身性に評価する目的で、本発明者らは、Ａ５４９細胞（５０：５０の比でマトリゲルと混合した２百万細胞）をＳＣＩＤマウスの片方の脇腹に皮下移植するインビボ試験を計画した。腫瘍が約２００ｍｍ３の容積に達したところで、マウスを異なる群に無作為化し（７マウス／群）、０日目、２日目、および５日目のそれぞれの時点で、ウイルスＥｎＡｄ、ＮＧ－７８６Ａ、ＮＧ－７９１ＡまたはＮＧ－７９６Ａの５ｘ１０９ウイルス粒子（または「ウイルス非存在」対照においてはＰＢＳ）を静脈内に投与した。７日目に、ＣＸＣＬ９およびＣＣＬ２１のケモカイン勾配に応答性である標識細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉの特異的キットを用いて、健常ドナーのＰＢＭＣから単離したエフェクターメモリーおよびナイーブＴ細胞）のカクテルを静注した。４８時間後に、Ｔ細胞浸潤、導入遺伝子ＲＮＡ発現およびケモカイン蛋白質発現に関して、腫瘍異種移植片をＥＬＩＳＡにより分析し、血漿試料をＩＬ－１２導入遺伝子蛋白質産生についてＥＬＩＳＡで分析した。
図１３に示すデータは、ＩＬ－１２導入遺伝子をコードするウイルスで処置した全てのマウスの血液中にＩＬ－１２ｐ７０が検出されたことを示しており、このことは、ウイルスが腫瘍細胞に感染しコードする導入遺伝子の発現が起こったことを示唆している。
実施例１４：ＣＣＬ２１に応答した樹状細胞のインビトロ遊走
ＮＧ－７９６Ａにより産生される導入遺伝子ＣＣＬ２１の機能性を実証する目的で、（実施例３に記載されるような方法を用いて、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下で培養することにより）ＰＢＭＣから調製した単球由来樹状細胞をＬＰＳで２４時間刺激してから、ＮＧ－７９５Ａについて実施例１２に記載されるようなトランスウェル遊走アッセイに用いた。図１５のデータは、非感染（ＵＩＣ）またはＥｎＡｄ感染細胞の上清と比較して、ＮＧ－７９６ＡのＣＣＬ２１を含む上清では、樹状細胞の遊走が選択的に増加するが、抗ＣＣＬ２１ブロッキング抗体の存在下では、それが阻害される（そのアイソタイプ対照ではそのような阻害は起こらなかった）ことを示している。
実施例１５：マウス腫瘍異種移植片インビボモデルにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞とＮＧ－７０４およびＮＧ－７９６Ａの相乗効果
ヒト腫瘍異種移植片システムにおけるウイルスおよび導入遺伝子の活性を評価する目的で、本発明者らは、ＮＳＧマウスの片方の脇腹に５ｘ１０６細胞の数のＡ５４９細胞（ＨＥＲ－２陽性）を皮下移植するインビボ試験を計画した。腫瘍が約２００ｍｍ３の容積に達したところで、マウスを異なる群に無作為化し（５マウス／群）、０日目、３日目のそれぞれの時点で、ウイルスＥｎＡｄ、ＮＧ－７０４またはＮＧ－７９６Ａの５ｘ１０９ウイルス粒子（または「ＣＡＲ－Ｔのみ」の対照においてはＰＢＳ）を静脈内に投与した。６日目に、１ｘ１０７のＨＥＲ－２特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＰｒｏＭａｂ）を静注した。腫瘍を週当たり２回測定し、試験の終わりまで腫瘍増殖を追跡した（約９０日間）。図１６Ａおよび１６Ｂのデータは、ＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＧ－７０４およびＮＧ－７９６Ａの両方と相乗効果を示し、それぞれ、腫瘍の長期クリアランスを引き起こすことを示している。ＣＡＲ－Ｔ細胞単独と比較して、ＥｎＡｄ処置は、単に腫瘍増殖を遅延させるのみであった；このことは、ＮＧ－７０４およびＮＧ－７９６Ａによってコードされる導入遺伝子が、腫瘍抗原（ＨＥＲ－２）特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在下での抗腫瘍活性に重要であることを示している。
実施例１６：ヒト腫瘍異種移植片におけるＮＧ－７９６Ａ媒介性ＣＣＬ２１産生
Ａ５４９細胞（５０：５０の比でマトリゲルと混合した２百万細胞）をＳＣＩＤマウスの片方の脇腹に皮下移植した。腫瘍が約２００ｍｍ３の容積に達したところで、マウスを異なる２つの群に無作為化し（８マウス／群）、０日目、１日目、および３日目のそれぞれの時点で、ウイルスＥｎＡｄまたはＮＧ－７９６Ａを５ｘ１０９ウイルス粒子量で静脈内に投与した。１５日目に、血漿および腫瘍を採取して腫瘍を溶解し、試料をＣＣＬ２１についてＥＬＩＳＡで分析した。図１６Ｃのデータは、ＮＧ－７９６Ａで処置したマウスの腫瘍全てにおいてＣＣＬ２１が検出されたことを示しており、これは、ウイルスが腫瘍細胞に感染してコードする導入遺伝子を発現したことを示唆している。血漿試料にはＣＣＬ２１がまったく検出されなかったが、これはＮＧ－７９６Ａ処置マウスの腫瘍では、ＣＣＬ２１ケモカイン勾配が成立したことを示唆する。
実施例１７：ウイルスＮＧ－７９６Ａに感染した腫瘍細胞培養物におけるＩＬ１５－Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインの産生
Ｃ末端Ｐ２Ａペプチドおよび付加したＮ末端Ｈｉｓタグ（配列番号：２４４）を含む組み換えＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン蛋白質を、標準的な大腸菌蛋白質発現および精製技術（Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）により作成・精製した。この組み換え蛋白質を、形質転換およびウイルス感染実験において、ＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン産生を検出するＥＬＩＳＡの標準として用いた。
ウイルスＮＧ－７９６Ａ（または対照としてのＥｎＡｄ）に感染させたＡ５４９細胞の上清における、（他のコード導入遺伝子と共に）ＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン分泌について、（実施例１２に記載されるような方法で）組み換えＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン蛋白質の標準曲線を用いてＥＬＩＳＡによる特徴付けを行った。図１７に示される結果は、ＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン蛋白質がＩＬ－１５サイトカインと類似のレベルで産生分泌されることを示している。
実施例１８：ＩＬ１５－Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインは、ＩＬ－１５分泌を促進する
ＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインの役割を評価し、またウイルス配列ＮＧ－７９６Ａにおける役割を支持する目的で、本発明者らは、実施例９に記載されるアプローチに類似のアプローチにしたがい、ＣＭＶプロモーターの制御下で導入遺伝子カセットを含むｐＵＣベクターを用いて形質転換実験を実施した。ｐＵＣ－７９６Ａ（ＮＧ－７９６Ａの導入遺伝子カセット配列を有する；配列番号：２４５）またはｐＲＥＳ－１２８（ＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメイン配列を欠如するバージョン；配列番号：２４６）のいずれかでＡ５４９細胞を形質転換した（図１８Ｂを参照のこと）。上清に分泌されたＩＬ－１５サイトカインをＥＬＩＳＡで定量した。図１８Ａに示す結果においては、ウイルス感染細胞による産生を目的としてＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインをコードさせることにより、ＩＬ－１５分泌に顕著な増強が見られた。組み換えＩＬ－１５Ｒａ ｓｕｓｈｉドメインを培養物に添加することによって、細胞から放出されるＩＬ－１５に対して相互作用が可能となるが、このような添加により、検出可能なＩＬ－１５の量が僅かに増えた；このことは、細胞からのＩＬ－１５分泌の促進に加えて、ＩＬ－１５の安定性を増加し得ることも示唆している。

Claims (29)

  1. 式（Ｉ）：
    ５’ＩＴＲ－Ｂ１－ＢＡ－Ｂ２－ＢＸ－ＢＢ－ＢＹ－Ｂ３－３’ＩＴＲ （Ｉ）
    の配列を含むＢ群アデノウイルスであって；
    ここで
    Ｂ１が、結合であるか、
    または
    Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ－Ｅ１Ｂを含み；
    ＢＡが、－Ｅ２Ｂ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｅ２Ａ－Ｌ４を含み；
    Ｂ２が、結合であるか、
    またはＥ３を含み；
    ＢＸが、結合であるか、
    または
    制限酵素認識部位、１種類以上の導入遺伝子、またはその両方を含むＤＮＡ配列であり；
    ＢＢが、Ｌ５を含み；
    ＢＹが、配列－Ｇ１－Ｇ２ｎ－Ｇ３ｍ－Ｇ４ｐ－Ｇ５ｑを含み；
    ここで
    Ｇ１が第１の導入遺伝子であり、Ｇ２が第２の導入遺伝子であり、Ｇ３が第３の導入遺伝子であり、Ｇ４が第４の導入遺伝子であり、Ｇ５が第５の導入遺伝子であり；
    Ｂ３が、結合であるか、
    または
    Ｅ４を含み；
    ｎが０または１であり；ｍが０または１であり；ｐが０または１であり；ｑが０または１であり；
    Ｂ３が、結合であるか、
    または
    Ｅ４を含み；
    ここで
    導入遺伝子中においてＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、および同上のうちの２つまたは３つの組み合わせから選択される位置に、ＩＬ－１５がコードされ；
    ならびにＢＹが、ＩＬ－１５Ｒアルファのｓｕｓｈｉドメインを含むポリペプチドをもコードする（例えば、ｓｕｓｈｉドメインが配列番号：２６に示される配列を有する）ことを特徴とする、
    Ｂ群アデノウイルス。
  2. 請求項１に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ポリペプチドが完全長ＩＬ－１５Ｒアルファ細胞外ドメインを含む、Ｂ群アデノウイルス。
  3. 請求項１または２に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここでＩＬ－１５Ｒアルファのｓｕｓｈｉドメインをコードする該ポリペプチドが膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカー、例えば、配列番号：２８および２３８～２４２に示される膜貫通ドメインを含む、Ｂ群アデノウイルス。
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ポリペプチドが該ＩＬ－１５に連結される、Ｂ群アデノウイルス。
  5. 請求項１～３のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ポリペプチドが、該ＩＬ－１５に対して異なる位置に存在する（すなわち、ＩＬ－１５から隔てられている［非連結である］）、Ｂ群アデノウイルス。
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５がＧ５の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５がＧ４の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５がＧ３の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５がＧ２の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  10. 請求項１～９のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５がＧ１の位置にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  11. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ５にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ４にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ３にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ２にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  15. 請求項１～１４のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ＩＬ－１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインを含む該ポリペプチドがＧ１にコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  16. 請求項１～１５のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって；ここで該ウイルスがさらにＩＬ－１２を、例えば、特に、配列番号：１１５に示されるような融合蛋白質としてコードする、Ｂ群アデノウイルス。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで少なくとも１種類のさらなるサイトカインがＢＹにコードされ、例えば２種類または３種類のサイトカインがコードされる、Ｂ群アデノウイルス。
  18. 請求項１７に記載のＢ群アデノウイルスであって；
    ここで該単一のサイトカインまたは複数のサイトカインが：
    ＴＮＦスーパーファミリー；ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）；ＴＧＦ－ベータスーパーファミリー；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）ファミリー；ＩＬ－１ファミリー；サイトカイン受容体コモンγ鎖（γｃ）ファミリー；ＩＬ－１０ファミリー；ＩＬ－１２ファミリー；ＩＬ－１７ファミリー；増殖因子ファミリー；およびインターフェロンファミリーから独立に選択される、
    Ｂ群アデノウイルス。
  19. 請求項１７または１８に記載のＢ群アデノウイルスであって；
    ここで該単一のサイトカインまたは複数のサイトカインが：
    ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１５４、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、ＥＤＡ－Ａ、ＥＤＡ－Ａ２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－κ、およびＩＦＮ－ω、Ｆｌｔ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、およびＩＬ－２９から独立に選択される、
    Ｂ群アデノウイルス。
  20. 請求項１７～１９のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該サイトカインがＩＬ－１８である、Ｂ群アデノウイルス。
  21. 請求項１～２０のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここでＢＹが、インターフェロン－αなどのＩ型インターフェロンをコードする、Ｂ群アデノウイルス。
  22. 請求項１～２１のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここでＢＹが、少なくとも１種類のケモカイン、例えば、１種類のケモカインをコードする、Ｂ群アデノウイルス。
  23. 請求項２２に記載のＢ群アデノウイルスであって、
    ここで該ケモカインが：
    ＭＩＰ－１アルファ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ－８、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、およびＣＣＬ２（ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ１９、またはＣＣＬ２１など）から選択される、
    Ｂ群アデノウイルス。
  24. 請求項１～２３のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここでＢＹにおける該１種類以上の導入遺伝子（全導入遺伝子など）が、主要後期プロモーターの制御下にある、Ｂ群アデノウイルス。
  25. 請求項１のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスであって、ここで該ウイルスが配列番号：２３１である、Ｂ群アデノウイルス。
  26. 請求項１～２５のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスおよび薬学的に許容可能な添加剤、希釈剤または担体を含む組成物。
  27. 治療、例えば、癌治療に用いる、請求項１～２５のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスまたは請求項２６に記載の組成物。
  28. 癌治療のための治療薬剤の製造における、請求項１～２５のいずれか１項に記載のＢ群アデノウイルスまたは請求項２６に記載の組成物の用途。
  29. 治療的有効量の請求項１～２５のいずれか１項に記載のアデノウイルスまたは請求項２６に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌の治療法。
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