JP2017093426A - １２量体ｔｒａｉｌ及びｈｓｖ−ｔｋ自殺遺伝子を同時に発現するベクター並びにそれを用いた抗癌幹細胞治療剤 - Google Patents

１２量体ｔｒａｉｌ及びｈｓｖ−ｔｋ自殺遺伝子を同時に発現するベクター並びにそれを用いた抗癌幹細胞治療剤 Download PDF

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Abstract

【課題】１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列及び自殺遺伝子の核酸配列を含むＤＮＡカセットの提供。【解決手段】１２量体ＴＲＡＩＬをコードするヌクレオチド配列及び自殺遺伝子のヌクレオチド配列を含み、両配列の間に転写／翻訳開始配列を更に含むＤＮＡカセット。前記ＤＮＡカセットを含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターを用いて作製された組換えアデノウイルス、前記組換えアデノウイルスでトランスフェクションした宿主細胞、前記宿主細胞を含む癌治療用組成物、並びに前記癌治療用組成物を個体に投与する段階を含む癌治療方法。【効果】前記ＤＮＡカセットが導入されて１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを同時に生産する幹細胞治療剤は、従来の治療剤に比べて抗癌効果に優れるので、様々な固形癌及び転移癌の治療に効果的に用いることができる。【選択図】図７

Description

本発明は、１２量体ＴＲＡＩＬ（TNF related apoptosis inducing ligand）及びＨＳ
Ｖ−ＴＫ（Herpes simplex virus thymidine kinase）自殺遺伝子を同時に発現するベク
ター並びにそれを用いた抗癌幹細胞治療剤に関する。より詳細には、本発明は、１２量体
ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列及び自殺遺伝子の核酸配列を含むＤＮＡカセット、前記
ＤＮＡカセットを含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターを用いて作製された
組換えアデノウイルス、前記組換えアデノウイルスでトランスフェクションした宿主細胞
、前記宿主細胞を含む癌治療用組成物、並びに前記癌治療用組成物を被験体に投与する段
階を含む癌治療方法に関する。
間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）とは、骨芽細胞（osteoblast）、軟骨
細胞（chondrocyte）、脂肪細胞（adipocyte）などに分化可能な多分化性の成体幹細胞で
あり、組織再生が必要な様々な疾患の治療剤として広く用いられている。それだけでなく
、間葉系幹細胞は、生体内で癌病変を特異的に検出して移動させる性質を有することが知
られており、標的抗癌治療のための担体として最近脚光を浴びている（非特許文献１）。
間葉系幹細胞の癌特異的移動性を用いた標的転移癌治療の研究が多く行われてきた。実際
に、抗癌サイトカインであるＩＬ−１２やＩＦＮ−ｂｅｔａ、又はオンコリティックウイ
ルスを間葉系幹細胞に導入して転移癌マウスに全身投与すると、転移癌の大きさとマウス
の生存が向上することが報告されている（非特許文献２）。
ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦ（tumor necrosis factor）ファミリータンパク質であり、選択
的に癌細胞の死滅を誘導するという特徴が知られている（非特許文献３）。実際に、ＴＲ
ＡＩＬは一般細胞に対しては無害であり、かつ様々な癌細胞株に対してのみ毒性を誘導す
るという特徴が知られている（非特許文献４，５）。このような一般細胞に無害な特性は
、一般細胞の表面にのみ存在するおとり受容体１、２（ＤｃＲ１，ＤｃＲ２）の機能によ
るものである（非特許文献６）。ＤｃＲ１、ＤｃＲ２はＴＲＡＩＬと結合することができ
るが、細胞内シグナル伝達部分が欠如しているので一般細胞はＴＲＡＩＬによるアポトー
シス誘導が生じない。このようなＴＲＡＩＬの選択的な癌細胞アポトーシス誘導の特徴は
、癌治療の画期的な媒体として注目されている。本発明者らは、先行特許において、ＴＲ
ＡＩＬを用いた効果的な抗癌遺伝子治療のために、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４、ＤＲ５と反
応するＴＲＡＩＬの細胞外（アミノ酸１１４−２８１）のアミノ末端に分泌シグナル配列
であるｔＰＡ（tissue plasminogen activation）及び１２量体形成ドメインであるＳＰ
Ｄ（surfactant protein D）を連結することにより１２量体ＴＲＡＩＬを考案した（特許
文献１）。
自殺遺伝子治療法とは、抗癌遺伝子治療方法の１つであり、癌細胞に直接ＨＳＶ−ＴＫ
、シトシンデアミナーゼ（Cytosin deaminase）、ニトロレダクターゼ（Nitroreductase
）、カルボキシルエステラーゼ（Carboxylesterase）、シトクロムＰ４５０（Cytochrome
P450）、ＰＮＰ（Purine nucleoside phosphorylase）などの自殺遺伝子を導入する方法
である。自殺遺伝子は、一種の酵素を発現し、この酵素は外部から注入された細胞に無害
なプロドラッグ（prodrug）を酵素反応で細胞毒性を有する物質に変えることにより、自
殺遺伝子を有する細胞だけでなく、ギャップ結合（gap junction）により毒性物質が隣接
する細胞に伝達され、周囲のアポトーシスを誘導するバイスタンダー効果（bystander ef
fect）を有することを特徴とする。実際に、自殺遺伝子を癌組織で発現させ、その後前駆
体を生体に全身投与すると、正常細胞には毒性が現れないが、治療遺伝子が発現する腫瘍
細胞にのみ前駆体が毒性物質に変換されて腫瘍細胞を破壊することができる（非特許文献
７）。
様々な自殺遺伝子のうちＨＳＶ−ＴＫは最も広く用いられている自殺遺伝子であり、実
際に臨床第３相まで終えたことが報告され、効能と安全性が確認されている候補物質であ
る。ＨＳＶ−ＴＫはガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ、ＧＣＶ）というプロドラ
ッグをリン酸化し、リン酸化したガンシクロビル三リン酸（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ ｔ
ｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＧＣＶ−３Ｐ）はＤＮＡに入り込むことにより正常な遺伝子の
合成を阻害してアポトーシスを誘導する（非特許文献８）。ＧＣＶ−３Ｐは急速に増殖す
る細胞に特異的に作用するので、正常細胞に比べて癌細胞を選択的に除去することのでき
る方法となりうる。実際に、局所部位に形成された腫瘍の場合、病変部位にアデノウイル
スやレンチウイルスによりＨＳＶ−ＴＫを導入し、その後ＧＣＶを投与すると癌細胞特異
的なアポトーシスを期待することができ、癌特異性を一層向上させるために癌特異的プロ
モーターやウイルスの向性（tropism）を改変する戦略が用いられている。
ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫは、癌細胞特異的なアポトーシスを誘導できることから、
抗癌遺伝子治療における安全性に優れた標的抗癌治療物質候補として間葉系幹細胞を用い
た転移癌治療にも研究されているが、その単独治療だけでは抗癌効能が不十分であり、抗
癌治療の成功のための臨床適用が困難な状況である（非特許文献９，１０）。
国際公開第２００７／１０２６９０号 韓国公開特許第１０−２００９−００１５８８５号公報
Aboody et al., Proc Natl Acad Sci, 97: 12846, 2000 Shah et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 2011 Wiley et al., Immunity, 3(6):673-682, 1995 Ashkenazi et al., J. Clin. Invest.,104:155-162, 1999 Walczak et al., Nat. Med.,5:157-163, 1999 Sheridan et al., Science,277:81 8-821, 1997 The FASEB journal, 23:1584, 2009 Moolten et al., Cancer Res. 46: 5276, 1986 Loebinger et al., Cancer Res, 69: 4134, 2009 Miletic et al. Molecular Ther, 15: 1373, 2007 Pitti. R. M. et al., J. Biol. Chem. 271: 12687, 1996
本発明者らは、効能に優れた標的抗癌遺伝子治療のために、１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨ
ＳＶ−ＴＫ自殺遺伝子を同時に発現するベクターを開発して組換えアデノウイルスを生産
し、これを幹細胞に導入すると様々な癌細胞において高いアポトーシス誘導能力を示すこ
とが確認された。１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを同時に発現する幹細胞の抗癌効
能は、ＴＲＡＩＬ、１２量体ＴＲＡＩＬやＨＳＶ−ＴＫを単独で発現する幹細胞より相乗
的に増加することを見出した。また、間葉系幹細胞の癌特異的移動能力を用いて、１２量
体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを同時に発現する間葉系幹細胞をマウス転移性腎臓癌モデ
ルに全身投与すると、細胞が転移癌特異的に移動することができ、転移癌の大きさと数を
大幅に減少させることにより、マウスの生存率を延長できることが確認された。特に、１
２量体ＴＲＡＩＬとＨＳＶ−ＴＫを同時に発現する幹細胞治療剤の反復投与で抗癌効果が
大幅に向上し、３回の反復投与で転移癌マウスが完治したことを確認することにより、本
発明を完成するに至った。
本発明は、１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列、及び自殺遺伝子の核酸配列を含
むＤＮＡカセットを提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ＤＮＡカセットを含む組換え発現ベクターを提供することを目的
とする。
さらに、本発明は、前記組換え発現ベクターを用いて作製された組換えアデノウイルス
を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記組換えアデノウイルスでトランスフェクションした宿主細胞を
提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記宿主細胞を含む癌治療用組成物を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記癌治療用組成物を癌の疑いのある被験体に投与する段階を含む
癌治療方法を提供することを目的とする。
本発明のＤＮＡカセットが導入されて１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを同時に生
産する幹細胞治療剤は、従来の治療剤に比べて抗癌効果に優れるので、様々な固形癌及び
転移癌の治療に効果的に用いることができる。
ヒト１２量体ＴＲＡＩＬ配列、ＩＲＥＳ配列、及びＨＳＶ−ＴＫ配列で構成されたＤＮＡカセット（ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫ）の概略図である。 ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫ ＤＮＡカセットが導入された間葉系幹細胞（ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫ）のＴＲＡＩＬ発現及びＨＳＶ−ＴＫ発現を確認した結果を示す図である。 ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫ ＤＮＡカセットが導入された間葉系幹細胞（ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫ）におけるＧＣＶ処理後の細胞生存及びＴＲＡＩＬ発現を確認した結果を示す図である。 インビトロのＲＥＮＣＡ細胞において、１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを同時に発現する間葉系幹細胞（ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫ）の向上した癌細胞殺傷能力を確認した結果を示す図である。 ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの抗癌効能をマウス転移性腎臓癌モデルにおける肺腫瘍結節の減少により確認した結果を示す図である。 ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの投与により延長された転移性腎臓癌マウスの生存期間を確認した結果を示す図である。 ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの反復投与による転移性腎臓癌マウスの増加した生存率及び完治率を確認した結果を示す図である。
上記目的を達成するために、本発明の一態様は、１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸
配列、及び自殺遺伝子の核酸配列を含むＤＮＡカセットを提供する。
本発明における用語「１２量体ＴＲＡＩＬ（TNF related apoptosis inducing ligand
）」とは、発現したＴＲＡＩＬが結合して１２量体（dodecamer）の構造を有する分泌型
ＴＲＡＩＬタンパク質をいい、特許文献１及び２に記載された方法で作製された１２量体
ＴＲＡＩＬであってもよい。本発明の１２量体ＴＲＡＩＬタンパク質は、単量体又は３量
体構造のＴＲＡＩＬより増加した選択的な癌細胞アポトーシス誘導活性を示すことが確認
されている。本発明においては、ＴＲＡＩＬタンパク質を１２量体形態で作製するために
、１２量体形成ドメインをコードする核酸配列がＴＲＡＩＬタンパク質をコードする核酸
配列の５’上流に位置するようにし、タンパク質の細胞外分泌のために、分泌シグナル配
列をコードする核酸配列が１２量体形成ドメインの５’上流に位置するようにした。
本発明においては１２量体ＴＲＡＩＬを用いたが、本発明の自殺遺伝子と共に発現して
治療剤として用いると相乗的な抗癌効果を示すものであれば、３量体以上のＴＲＡＩＬも
本発明の範囲に含まれる。
本発明の１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列は、分泌シグナル配列（secretion
signal sequence）をコードする核酸配列、１２量体形成ドメイン（dodecamer-forming d
omain）をコードする核酸配列、及びＴＲＡＩＬをコードする核酸配列を含んでもよい。
本発明における用語「ＴＲＡＩＬ」とは、アポトーシスと呼ばれる細胞死過程を誘導す
るリガンドとして機能するタンパク質の一種であり、本発明においてＴＲＡＩＬをコード
する核酸配列としては、ヒト、サル、ラット、マウス、又は他種由来のＴＲＡＩＬタンパ
ク質をコードする遺伝子を用いることができ、ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子を用いることが好ま
しい。
本発明のＴＲＡＩＬをコードする核酸配列から発現するタンパク質がＴＲＡＩＬ受容体
ＤＲ４又はＤＲ５と反応する活性を有する場合は、ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列の一
部のみ用いることができる。ＴＲＡＩＬの１１４〜２８１位のアミノ酸配列をコードする
核酸配列を用いることが好ましい。前記ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列は、当該分野に
おける通常の知識を有する者がＧｅｎＢａｎｋ（ＧｅｎｅＩＤ：８７４３，非特許文献１
１）から容易に情報を入手することにより、容易に作製することができる。
本発明において、分泌シグナル配列はＴＲＡＩＬタンパク質が細胞外に分泌されるよう
に誘導する役割を果たす。ＴＲＡＩＬタンパク質は本来細胞膜に位置するタンパク質であ
るので、それ自体は分泌シグナル配列を有さず、ＴＲＡＩＬ細胞外領域はＴＲＡＩＬタン
パク質によるアポトーシスシグナルを誘導することが知られている。本発明において、１
２量体構造のＴＲＡＩＬタンパク質を細胞外に分泌して抗癌効果を増大させるために分泌
シグナル配列を用い、この分泌シグナル配列をコードする核酸配列は１２量体形成ドメイ
ンをコードする核酸配列の５’上流に位置するようにしてもよい。前記分泌シグナル配列
は、これらに限定されるものではないが、ｔＰＡ、ＨＳＶ、ｇＤｓ、ＳＥＣ２、ＳＥＣ（
ＣＶ）などを用いることができ、ｔＰＡ（tissue plasminogen activator）を用いること
が好ましい。
本発明の一実施例においては前記分泌シグナル配列としてｔＰＡを用いたが、これは優
れた分泌誘導性を有する分泌シグナル配列であり、本発明の１２量体ＴＲＡＩＬタンパク
質を細胞外に分泌することに優れるからである。
本発明において、１２量体形成ドメインは、ＴＲＡＩＬタンパク質が１２量体を形成す
るようにする。これは、ＴＲＡＩＬタンパク質を多量体化して安定した形態にするためで
あり、このために前記１２量体形成ドメインをコードする核酸配列がＴＲＡＩＬタンパク
質をコードする核酸配列の５’上流に位置するようにした。前記１２量体形成ドメインは
、これに限定されるものではないが、ＳＰＤ（surfactant protein D）を用いることが好
ましい。
前述したように、本発明の１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列は、分泌シグナル
配列をコードする核酸配列、１２量体形成ドメインをコードする核酸配列、及びＴＲＡＩ
Ｌをコードする核酸配列から構成される。本発明の一実施例においては、配列番号４のｔ
ＰＡ分泌シグナル配列をコードする核酸配列、配列番号５のＳＰＤ １２量体形成ドメイ
ンをコードする核酸配列、及び配列番号６のＴＲＡＩＬをコードする核酸配列を化学的に
合成することにより、コドン最適化された１２量体ヒトＴＲＡＩＬをコードする核酸配列
を作製し、最終的に配列番号１のｔＰＡ−ＳＰＤ−ＴＲＡＩＬ ＤＮＡカセットを作製し
た。本発明の１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列は、配列番号１の核酸配列を有す
るものであることが好ましい。
本発明における用語「自殺遺伝子」とは、アポトーシスを誘導する遺伝子であり、これ
らに限定されるものではないが、ＨＳＶ−ＴＫ（Herpes simplex virus thymidine kinas
e）、シトシンデアミナーゼ（Cytosin deaminase）、ニトロレダクターゼ（Nitroreducta
se）、カルボキシルエステラーゼ（Carboxylesterase）、シトクロムＰ４５０（Cytochro
me P450）、又はＰＮＰ（Purine nucleoside phosphorylase）であることが好ましく、Ｈ
ＳＶ−ＴＫであることがより好ましい。また、前記ＨＳＶ−ＴＫは、配列番号２で表され
るコドン最適化されたＨＳＶ−ＴＫであることが好ましい。
本発明の１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫタンパク質をコードする核酸配列は、野
生型と同じ配列をそのまま用いることができるが、哺乳類、特にヒト細胞内でタンパク質
の発現頻度が増加するように、１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫタンパク質の遺伝子
コドンを最適化した配列を用いることが好ましい。前記「遺伝子コドンを最適化した配列
」又は本発明における用語「コドン最適化」とは、哺乳類、特にヒト細胞内で標的物質（
例えば、本発明の１２量体ＴＲＡＩＬ、ＨＳＶ−ＴＫタンパク質など）の発現量が増加す
るように、標的物質をコードするアミノ酸コドンのうち一部のアミノ酸コドンを置換する
ことをいう。このようなアミノ酸コドンの一部置換は、当業者であれば様々な組み合わせ
及び応用が可能である。本発明においては、１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫタンパ
ク質のアミノ酸コドン、具体的にはアラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）
、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ：
Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ
）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）
、リジン（Ｌｙｓ：Ｋ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、
セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、及びチロシ
ン（Ｔｙｒ：Ｙ）をコードする少なくとも１つの遺伝子コドンをヒト細胞で高い頻度で認
識される遺伝子コドンに置換してもよい。
本発明の具体的な実施例においては、１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列を構成
するｔＰＡ分泌シグナル配列をコードする核酸配列の１〜２３位のヌクレオチドをコドン
最適化し、それを配列番号４に示し、１２量体形成ドメインであるＳＰＤをコードする核
酸配列の７８〜３１４位のヌクレオチドをコドン最適化し、それを配列番号５に示し、コ
ドン最適化されたＴＲＡＩＬをコードする核酸配列を配列番号６に示す。また、コドン最
適化された１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫをコードする核酸配列をそれぞれ配列番
号１及び２に示す。よって、前記コドン最適化された１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−Ｔ
Ｋをコードする核酸配列は、野生型に比べて発現程度に優れるので、分泌誘導性又は抗癌
効能に優れる。
本発明のＤＮＡカセットは、前記１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列と自殺遺伝
子の核酸配列の間に転写／翻訳開始核酸配列をさらに含んでもよい。これは、１つのベク
ターで２つの遺伝子を同時に発現させるための配列であり、ＩＲＥＳ配列、９−ｎｔ配列
、又はデユアルプロモーターシステム（ｄｕａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を用
いることが好ましく、ＩＲＥＳ配列を用いることがより好ましい。
本発明における用語「ＩＲＥＳ（internal ribosome entry site）」とは、配列内リボ
ソーム進入部位ともいい、真核細胞において１つのｍＲＮＡから複数のタンパク質合成が
可能となるようにリボソームが直接結合するｍＲＮＡ内部に存在する特定の領域を意味し
、本発明の１２量体ＴＲＡＩＬ及び自殺遺伝子を同時に発現させる役割を果たす。本発明
の一実施例においては、配列番号３で表されるＩＲＥＳ配列と１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨ
ＳＶ−ＴＫをコードする核酸配列を化学的に合成してｄＴＲＡＩＬ−ＩＲＥＳ−ＴＫカセ
ットを作製した（図１）。
本発明の他の態様は、前記ＤＮＡカセットを含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明のベクターは、宿主細胞において標的タンパク質、すなわち１２量体ＴＲＡＩＬ
及び自殺遺伝子タンパク質を発現する組換え発現ベクターであり、遺伝子挿入物（前記Ｄ
ＮＡカセット）が発現するように作動可能に連結された必須の調節因子を含んでもよい。
本発明における用語「作動可能に連結された」とは、一般的機能が行えるように、核酸
発現調節配列と目的とするタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結されているこ
とをいう。組換え発現ベクターとの作動的連結は当該技術分野で周知の遺伝子組換え技術
を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野において一
般に知られた酵素などを用いる。ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン
、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びインハンサーなどの発現調節因子を含む。開
始コドン及び終止コドンは一般に標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と
みなされ、遺伝子産物が投与された際にその被験体で必ず作用しなければならず、コード
配列とインフレーム（in frame）でなければならない。
本発明のベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベ
クター、ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではなく、ウイルスベ
クターが好ましく、アデノウイルスベクターがより好ましい。アデノウイルスベクターは
、様々な細胞への遺伝子導入効率に優れたベクターであり、癌患者の遺伝子治療に最もよ
く用いられるベクターの１つである。
本発明に用いられる組換えアデノウイルスは、タイプ５型であり、複製に必須な因子で
あるＥ１Ａ遺伝子が欠如した複製不能のアデノウイルスである。本発明の一実施例におい
ては、１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列、ＩＲＥＳ配列、及びＨＳＶ−ＴＫ配列
を化学的に合成して作製したＤＮＡカセットをアデノウイルスシャトルベクターに挿入す
ることにより、１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを同時に発現する組換え発現ベクタ
ーを構成した。
本発明のさらに他の態様は、前記組換え発現ベクターを用いて作製された組換えアデノ
ウイルスを提供する。
前記組換えアデノウイルスは、本発明のＤＮＡカセットを含むアデノウイルス由来の組
換え発現ベクターをパッケージング細胞に導入し、これを培養してパッケージング細胞か
ら生成された組換えアデノウイルスを取得する方法で生成することができる。
前記組換えアデノウイルスは、誘導性プロモーターを用いて特定の物質により発現を調
節できる誘導性アデノウイルスを含む。前記誘導性プロモーターはＣＭＶ−Ｔｅｔ１０で
あり、テトラサイクリン（tetracyclin）により発現が誘導される。テトラサイクリンを
用いた誘導性システムは、生体内で最も広範囲に用いられており、懸念される副作用がな
いので経済性の面でも優れている。
本発明のさらに他の態様は、前記組換えアデノウイルスでトランスフェクションした宿
主細胞を提供する。本発明の前記宿主細胞は、１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを同
時に発現生産することにより、癌細胞を死滅させることができ、癌治療効能に優れるので
、癌治療用細胞治療剤として用いることができる。
前記宿主細胞は、当業界で周知の宿主細胞を用いることができ、細胞治療剤として用い
ることができる宿主細胞であればいかなるものでもよいが、幹細胞を用いることが好まし
い。前記宿主細胞が幹細胞である場合、癌治療用幹細胞治療剤として用いることができる
。
本発明における用語「幹細胞」とは、各種細胞に分化することができ、自己複製するこ
とができる細胞を意味し、本発明においては胎児幹細胞や成体幹細胞であることが好まし
く、成体幹細胞の間葉系幹細胞であることがより好ましく、抗癌特異的移動性を有するヒ
ト間葉系幹細胞であることがさらに好ましい。
間葉系幹細胞の癌特異的移動能力を用いると、１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを
同時に発現する間葉系幹細胞を癌特異的に移動させることができ、安定して１２量体ＴＲ
ＡＩＬを分泌させることができ、ＨＳＶ−ＴＫ発現物質によりプロドラッグを毒性物質に
変換することにより隣接する癌細胞に導入することができる。特に、１２量体ＴＲＡＩＬ
は、単量体ＴＲＡＩＬより分泌型として安定しており、癌細胞アポトーシス誘導活性が増
加するので、癌細胞に直接注入できるだけでなく、細胞治療剤の作製に特に有用である。
また、１２量体ＴＲＡＩＬ又はＨＳＶ−ＴＫを単独で発現する幹細胞と比較して相乗的に
抗癌効果が増加することが確認された。
本発明の一実施例においては、組換えアデノウイルスを用いて１２量体ＴＲＡＩＬ及び
ＨＳＶ−ＴＫを同時に発現する間葉系幹細胞を作製し、前記間葉系幹細胞がインビトロで
癌細胞と共に培養されると、癌細胞特異的なアポトーシスが大幅に増加することが確認さ
れ（図４）、転移性腎臓癌マウスモデルにおいても前記間葉系幹細胞の投与により肺腫瘍
結節が減少し（図５）、マウスの生存期間が大幅に延長することが確認された（図６）。
これらの結果から、本発明の細胞、特に幹細胞は、癌を治療するための抗癌細胞治療剤と
して使用可能であることが分かる。
本発明のさらに他の態様は、前記宿主細胞を含む癌治療用組成物を提供する。前記宿主
細胞は、前述したように、１２量体ＴＲＡＩＬ及び自殺遺伝子タンパク質を同時に発現す
ることにより、抗癌効能が相乗的に増加するので、癌治療効果を有する。
前記宿主細胞だけでなく、本発明の１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫタンパク質を
同時に生産する組換え発現ベクター、前記ベクターを用いて作製した組換えアデノウイル
スも、本発明の癌治療用組成物の有効成分として含まれる。
本発明の組成物により治療可能な癌には一般的な癌疾患が全て含まれ、本発明の細胞治
療剤により死滅を誘導できる癌細胞による癌は限定されることなく含まれる。その例とし
て、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、子宮頸癌、前立腺癌
、卵巣癌、甲状腺癌など、一般に知られる全ての癌が含まれ、固形癌や転移癌の全てが含
まれ、転移癌であることが好ましい。本発明の一実施例においては、腎臓癌細胞であるＲ
ＥＮＣＡ細胞による転移癌マウスモデルを用いて癌治療効能を確認した（図５〜７）。
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含み、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、
エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤、注射剤などの様々な剤形で作製するこ
とができる。薬学的受容可能な担体には、任意のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング
剤、抗菌及び防カビ剤、等張液、吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質に対するこ
れらの媒体及び物質は公知である。
前記組成物は、目的に応じて適切な薬学的組成物の形態で作製することができる。
具体的な態様として、本発明の前記１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫタンパク質を
産生するベクター、前記ベクターを用いて生成されたアデノウイルス又は幹細胞は、癌疾
患治療組成物として提供される。前記治療組成物は、ヒトを含む哺乳類に接種することが
できる。
具体的な態様として、本発明の１２量体ＴＲＡＩＬとＨＳＶ−ＴＫタンパク質とを含む
組成物は、経口投与、又は筋肉、静脈、動脈、腹腔、皮下、皮内などの非経口投与を行う
ことができる。好ましい投与方式及び製剤は、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋
肉注射剤、点滴注射剤、腫瘍内直接注射などである。前記組成物は、単一又は多重投与す
ることができる。特に、本発明の組成物は、ＧＣＶ（ganciclovir）と同時に又はＧＣＶ
投与後に投与することができる。
また、前記組成物は、薬学的有効量で投与されるようにする。薬学的有効量は、投与方
法及び回数、癌の種類及び重症度、患者の年齢及び性別、患者の状態、並びにその他医学
分野で公知の要素により決定される。前記組成物は、単一又は多重投与することができる
。
本発明のさらに他の態様は、前記癌治療用組成物を癌の疑いのある被験体に投与する段
階を含む癌治療方法を提供する。前記癌及び癌治療用組成物については前述した通りであ
り、癌治療用組成物は、前述したように１２量体ＴＲＡＩＬ及び自殺遺伝子タンパク質を
同時に発現することにより、抗癌効能が相乗的に増加して癌治療効果を有するので、被験
体への投与により癌治療方法に用いることができる。
癌の疑いのある被験体に投与する癌治療用組成物は、前述した宿主細胞だけでなく、本
発明の１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫタンパク質を同時に生産する組換え発現ベク
ター、前記ベクターを用いて作製した組換えアデノウイルスを有効成分として含んでもよ
い。
本発明における用語「被験体」とは、本発明による癌治療用の薬学的組成物の投与によ
り症状が好転する疾患である癌を有するヒトや、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、カ
モシカ、イヌなどの動物を意味する。前記癌治療用組成物を個体に投与することにより、
癌を効果的に予防及び治療することができる。
本発明における用語「投与」とは、任意の適切な方法で被験体に所定の物質を導入する
ことを意味し、本発明による癌治療用組成物の投与経路は、前述したように標的組織に送
達できるものであれば、一般的なあらゆる経路を介して経口又は非経口投与することがで
きる。また、本発明による癌治療用組成物は、有効成分を標的細胞に送達できる任意の装
置により投与することができる。
本発明の癌治療方法は、ガンシクロビル（ganciclovir, GCV）を投与する段階をさらに
含んでもよい。前記ＧＣＶは、本発明の癌治療用組成物と共に又は前記癌治療用組成物投
与前もしくは後に投与することができる。本発明の一実施例においては、本発明の幹細胞
治療剤投与後にＧＣＶを投与して癌細胞アポトーシス及び癌治療効能を評価した。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具
体的に説明するためのものにすぎず、本発明の要旨に沿って本発明の範囲がこれらの実施
例に限定されないことは本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって
自明である。
実施例１：ｔＰＡ−ＳＰＤ−ＴＲＡＩＬ ＤＮＡカセット（ｄＴＲＡＩＬ）の構成
配列番号４の核酸配列を有するコドン最適化されたｔＰＡ分泌シグナル配列と、配列番
号５の核酸配列を有するコドン最適化されたＳＰＤ １２量体形成配列とを連結した形態
に化学的に合成した。ベクターに容易に挿入できるように、末端にＫｐｎＩ（５’）とＮ
ｏｔＩ（３’）サイトを添加した。ｔＰＡ−ＳＰＤシグナル配列をＫｐｎＩとＮｏｔＩで
切断された誘導性アデノウイルスシャトルベクターであるｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｔｅｔ１０
ベクターに挿入してｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｔｅｔ１０／ｔＰＡ−ＳＰＤベクターを構成した
。誘導性アデノウイルスシャトルベクターであるｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｔｅｔ１０は、誘導
性プロモーターであるＣＭＶ−Ｔｅｔ１０を有する。次に、配列番号６の核酸配列を有す
るコドン最適化されたヒトＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）を化学的に合成した。同様に、
ベクターに容易に挿入できるように、末端にＮｏｔＩ（５’）とＸｂａＩ（３’）サイト
を添加した。その後、ＮｏｔＩとＸｂａＩで切断されたｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｔｅｔ１０／
ｔＰＡ−ＳＰＤベクターに挿入してｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｔｅｔ１０／ｔＰＡ−ＳＰＤ−Ｔ
ＲＡＩＬを構築し、ｔＰＡ−ＳＰＤ−ＴＲＡＩＬ ＤＮＡカセットを作製した（配列番号
１）。
実施例２：ｄＴＲＡＩＬ−ＩＲＥＳ−ＴＫカセットの構成
実施例１で作製した配列番号１の核酸配列を有するコドン最適化された１２量体ヒトＴ
ＲＡＩＬ配列、配列番号２の核酸配列を有するＩＲＥＳ配列、及び配列番号３の核酸配列
を有するコドン最適化されたＨＳＶ−ＴＫ配列をそれぞれ化学的に合成してＤＮＡカセッ
トを作製した（図１）。作製されたＤＮＡカセットをアデノウイルスシャトルベクターで
あるｐＳｈｕｔｔｌｅベクターに挿入してｐＳｈｕｔｔｌｅ／ｄＴＲＡＩＬ−ＩＲＥＳ−
ＴＫベクターを構成した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ｄＴＲＡＩＬ−ＩＲＥＳ−ＴＫをＰｍｅＩ
で切断し、その後複製不可能なｐＡｄ／ＥａｓｙベクターとＢＪ５１８３コンピテントセ
ル（competent cell）で相同組換え（homologous recombination）反応を行った。その後
、カナマイシン抗生剤を用いてｄＴＲＡＩＬ−ＩＲＥＳ−ＴＫカセットが存在するｐＡｄ
／ｄＴＲＡＩＬ−ＩＲＥＳ−ＴＫを選択した。正確な確認のために、ＰａｃＩで切断して
３５＋４．５ｋｂのＤＮＡバンドを確認した。次に、ｐＡｄ／ｄＴＲＡＩＬ−ＩＲＥＳ−
ＴＫをパッケージング細胞である２９３細胞株に形質転換し、１０日後にｄＴＲＡＩＬ−
ＩＲＥＳ−ＴＫカセットを発現する組換えアデノウイルスｒＡｄ／ｄＴＲＡＩＬ−ＩＲＥ
Ｓ−ＴＫを得た。
実施例３：ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫのＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫ発現の確認
前記ｄＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫの両方を発現する間葉系幹細胞（mesenchymal stem
cell, MSC）であるＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの作製のために、実施例２で作製したｒ
Ａｄ／ｄＴＲＡＩＬ−ＩＲＥＳ−ＴＫ及び鉄イオンを用いて３０分間骨髄由来マウス間葉
系幹細胞（rBM−MSC）を感染させた。感染２４時間後に、細胞溶解物（cell lysate）を
用いてヒトＴＲＡＩＬの発現をウェスタンブロッティング（westernblotting）で確認し
、ＨＳＶ−ＴＫの発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した（図２）。その結果、作製されたＭＳＣ
／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫはＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを発現することが確認された。
実施例４：ＧＣＶ処理によるＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの細胞生存率及びＴＲＡＩＬ
発現率の確認
ＧＣＶ処理によるＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの自殺誘導効果を確認するために、１０
、３０、１００μＭのＧＣＶで細胞を処理した。ＧＣＶ処理１日後から２日間隔でＭＳＣ
／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの細胞生存率をＭＴＳ方法で確認した。実験の結果、１００μＭの
ＧＣＶで処理して１週間経過したときに、ほとんど全ての細胞が除去されることが確認さ
れた（図３）。
次に、前述したように誘導されたＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫアポトーシスによりＴＲ
ＡＩＬの発現が減少する程度を確認するために、前述した濃度でＧＣＶ処理し、２４時間
間隔で培養液を集めてＴＲＡＩＬの発現をＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent as
say）で確認した。実験の結果、ＧＣＶ／ＴＫ処理によるアポトーシスによりＴＲＡＩＬ
発現が減少することが確認された（図３）。
実施例５：インビトロでｄＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫの同時発現により大幅に増加し
た癌細胞アポトーシスの確認
１２量体ＴＲＡＩＬ及びＨＳＶ−ＴＫを同時に発現するＭＳＣが癌細胞アポトーシスに
おいて複合効果（シナジー効果）があるか否かをｉｎ ｖｉｔｒｏで確認するために、癌
細胞とＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫを共に培養してアポトーシスが起こった細胞と死んだ
細胞を分析した。ここで、比較のために、何も発現しないＭＳＣ／Ｍｏｃｋ、ＨＳＶ−Ｔ
Ｋのみ発現するＭＳＣ／ＴＫ、及びｄＴＲＡＩＬのみ発現するＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬを共
に培養した群を対照群として用いた。癌細胞特異的なアポトーシスを確認するために、Ｃ
ＦＳＥ（Carboxyfluorescein succinimidyl ester）で標識して前記ＭＳＣを腎臓癌細胞
であるＲＥＮＣＡ細胞と４８時間培養し、その後ＧＣＶ １００μＭで処理した。さらに
４８時間又は７２時間培養し、その後全ての細胞を集め、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖと７−ＡＡ
Ｄ染色を行ってアポトーシスをＦＡＣＳ（fluorescense activated cell sorter）で測定
した。その結果、ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ又はＭＳＣ／ＴＫと共に培養された細胞に比べて
、ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫで処理したＲＥＮＣＡ細胞において大幅に増加した癌細胞
アポトーシスが観察され、特に７２時間後には９０％以上の癌細胞が除去されることが確
認された（図４）。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ実験
結果から、本発明のＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫにより１２量体ＴＲＡＩＬとＨＳＶ−Ｔ
Ｋが同時に発現すると、癌細胞アポトーシス誘導のシナジー効果が発揮されることが確認
された。
実施例６：マウス転移癌モデルにおけるＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの癌治療効能の評
価
Ｉｎ ｖｉｔｒｏで確認されたＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの抗癌効果をＲＥＮＣＡ転
移癌マウスモデルで確認するために、５×１０５のＲＥＮＣＡ細胞を静脈注射し、７日後
に同数のＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫを静脈注射した。ここで、比較のために、ＭＳＣ／
ＥＧＦＰ、ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ、ＭＳＣ／ＴＫを対照群として用いた。２日後から５０
ｍｇ／ｋｇのＧＣＶを７日間毎日腹腔注射し、腫瘍を注射した１４日後に肺に転移した腫
瘍結節の数を観察した。その結果、ＭＳＣ／ＴＫ及びＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ投与群に比べ
て、ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫ投与群において約３５％の肺腫瘍結節の減少が確認され
た（図５）。また、転移癌マウスの生存率の観察を続けた結果、ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−
ＴＫ投与により転移癌マウスの生存期間が８０日まで延長されることが確認された（図６
）。これらの結果から、本発明のＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫがｉｎ ｖｉｖｏ動物モデ
ルを用いた実験においても優れた抗癌効果を示すことが確認された。
実施例７：ＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの反復投与により誘導された転移癌の１００％
完治率
反復投与によりＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫの転移癌治療効能を向上させることができ
るかを確認するために、実施例６と同じマウス転移癌モデルにＭＳＣ／ｄＴＲＡＩＬ−Ｔ
Ｋを腫瘍投与の７日後から２週間間隔で２回又は３回投与した。転移癌マウスの生存率を
観察した結果、１回投与した群では９０日までに全ての転移癌マウスが死んだのに対して
、２回投与した群ではマウスの７０％が完治したことが確認された（図７）。また、ＭＳ
Ｃ／ｄＴＲＡＩＬ−ＴＫを３回投与した転移癌マウスは１００％が完治したことが分かっ
た。転移癌は従来の化学療法、放射線療法による治療が非常に難しいだけでなく、従来の
遺伝子治療を単独で用いた転移癌治療研究において完治率１００％の結果を得た報告がな
いことからも、本研究の結果は非常に優れたものであり、差別化された結果といえる。

Claims (19)

  1. １２量体ＴＲＡＩＬ（TNF related apoptosis inducing ligand）をコードする核酸配
    列、及び自殺遺伝子の核酸配列を含むＤＮＡカセット。
  2. 前記１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列と自殺遺伝子の核酸配列の間に転写／翻
    訳開始核酸配列をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡカセット。
  3. 前記転写／翻訳開始核酸配列がＩＲＥＳ（internal ribosome entry site）核酸配列で
    ある、請求項２に記載のＤＮＡカセット。
  4. 前記１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列が、分泌シグナル配列（secretion sign
    al sequence）をコードする核酸配列、１２量体形成ドメイン（dodecamer-forming domai
    n）をコードする核酸配列、及びＴＲＡＩＬをコードする核酸配列を含む、請求項１に記
    載のＤＮＡカセット。
  5. 前記分泌シグナル配列がｔＰＡ（tissue plasminogen activator）である、請求項４に
    記載のＤＮＡカセット。
  6. 前記１２量体形成ドメインがＳＰＤ（surfactant protein D）である、請求項４に記載
    のＤＮＡカセット。
  7. 前記ＴＲＡＩＬが、ＴＲＡＩＬタンパク質配列全体において１１４〜２８１位のアミノ
    酸配列範囲に対応する細胞外ドメインである、請求項４に記載のＤＮＡカセット。
  8. 前記自殺遺伝子がＨＳＶ−ＴＫ（Herpes simplex virus thymidine kinase）である、
    請求項１に記載のＤＮＡカセット。
  9. 前記１２量体ＴＲＡＩＬをコードする核酸配列が配列番号１の核酸配列を有する、請求
    項１に記載のＤＮＡカセット。
  10. 前記ＨＳＶ−ＴＫをコードする核酸配列が配列番号２の核酸配列を有する、請求項８に
    記載のＤＮＡカセット。
  11. 前記ＩＲＥＳ核酸配列が配列番号３の核酸配列を有する、請求項３に記載のＤＮＡカセ
    ット。
  12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡカセットを含む組換え発現ベクター。
  13. 前記組換え発現ベクターがアデノウイルス由来である、請求項１２に記載の組換え発現
    ベクター。
  14. 請求項１３の組換え発現ベクターを用いて作製された組換えアデノウイルス。
  15. 請求項１４の組換えアデノウイルスでトランスフェクションした宿主細胞。
  16. 前記宿主細胞が幹細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
  17. 請求項１５の宿主細胞を含む癌治療用組成物。
  18. 請求項１７の癌治療用組成物を癌の疑いのある被験体に投与する段階を含む癌治療方法
    。
  19. ガンシクロビル（ganciclovir, GCV）を投与する段階をさらに含む、請求項１８に記載
    の癌治療方法。
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