KR101032871B1 - 비엠피-2와 에이치에스브이-티케이 자살유전자를 동시에 포함하고 발현 할 수 있도록 하는 벡터와 이 벡터가 도입된 자가조절형 줄기세포 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비엠피-2와 에이치에스브이-티케이 자살유전자를 동시에 포함하고 발현 할 수 있도록 하는 벡터와 이 벡터가 도입된 자가조절형 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

본 발명의 발현벡터는 전사/번역 개시 핵산서열을 사이에 두고 BMP의 핵산서열과 자살유전자의 핵산서열을 연결하여 구성된 DNA 카세트를 포함하여 구성된다.

본 발명에 의해, 자살유전자인 HSV-tk와 BMP-2를 동시에 발현하는 벡터를 개발하여 세포 내에서 두 단백질을 동시에 생산할 수 있는 DNA 카세트와 이 DNA 카세트를 포함하는 발현 벡터가 제공됨과 아울러 이 발현 벡터를 도입하여 골 질환의 치료에 효과적으로 이용할 수 있는 자가조절형 줄기세포 치료제를 제공하는데 있다.

BMP-2, 자살유전자, HSV-tk, 줄기세포, 자가조절형, 골재생

Description

비엠피-2와 에이치에스브이-티케이 자살유전자를 동시에 포함하고 발현 할 수 있도록 하는 벡터와 이 벡터가 도입된 자가조절형 줄기세포 치료제{VECTOR INCLUDING THE DNA CASSETTE COMPOSED OF BMP-2 AND SUICIDE GENE HSV-TK, AND SELF-REGULATING STEM CELL MEDICINE EXPRESSING BOTH BMP-2 AND HSV-TK}

본 발명은 비엠피-2와 에이치에스브이-티케이 자살유전자를 동시에 포함하는 DNA 카세트 및 이를 포함하는 벡터와 이 벡터를 이용하여 제조한 BMP-2와 HSV-tk를 동시에 생산하는 아데노바이러스에 관한 것이며, 이를 이용하여 골질환 치료에 효과적인 자가조절형 줄기세포 치료제를 제공하게 된다.

뼈는 우리 몸에 가장 흔하게 존재하는 조직 중의 하나이며, 지속적인 뼈의 형성과 파괴를 통해 균형이 조절된다.

그럼에도 불구하고, 특정 크기이상의 골손실이나 골절 후 부정교합의 경우 뼈의 충분한 재생이 어려우며, 당뇨, 노화와 니코틴 남용 등에 의해 대사의 균형이 파괴될 수 있어 골 재생의 문제가 되고 있다.

이러한 문제는 자가 골 이식을 통해 상당수 극복될 수 있으나, 추가적인 수술의 필요성과 그에 따른 위험성에 따른 제약이 있다.

이와 같은 이유에서 골형성을 유도할 수 있는 성장인자나 뼈대(scaffold)를 이용한 치료가 자가 골이식법을 대체할 수 있는 치료법으로 크게 각광 받고 있다.

뼈 형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP)은 TGF-beta 상과( transforming growth factor beta superfamily)에 속하는 성장인자로서 약 40종 이상이 존재한다.

그 중 BMP-2와 BMP-7은 가장 많이 연구된 골 성장 인자로서, 최근 재조합 사람 BMP-2, BMP-7 단백질이 임상치료를 위해 FDA의 허가를 받은 바 있다.

BMP-2는 32 kDa의 호모다이머 당단백질(homodimeric glycoprotein)로, 생체 내 투여 시 BMP-2는 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSCs)의 모집(recruitment)을 촉진하고 손상부위로 이동한 줄기세포는 BMP-2에 의해 증식 및 연골/조골 세포로 분화함으로써 골형성을 촉진한다고 알려져 있다.

하지만, BMP-2의 보다 안전하고 효율적인 이용을 위해서 조직 특이적 전달이 필요하고, 경제적으로 지속적인 BMP-2의 공급을 가능하게 하는 것이 여전히 해결해야할 과제로 남아 있다.

중간엽 줄기세포는 조골세포(osteoblast)나 연골세포(chondrocyte)로 분화가 가능하며 골 손실 부위나 골 재생이 필요한 부위로 이동할 수 있는 특성을 가지고 있어 골 재생을 위한 세포 치료제로 최근 각광 받고 있다.

하지만, 줄기세포 치료제의 한정적인 효능을 극대화하기 위해 치료 유전자가 도입된 줄기세포 치료제의 개발이 요구되고 있다.

미국 오하이오 대학의 Bertone 박사와 그 연구진은 BMP-2 유전자가 이입된 중간엽 줄기세포와 BMP-2를 발현하는 아데노바이러스의 효능 및 안전성을 골절 동물 모델에서 연구하였는데, 그 결과 BMP-2 유전자가 이입된 중간엽 줄기세포 치료군은 세포 단독 투여군과 바이러스 투여군에 비해 보다 향상된 뼈와 연골 형성을 보임을 확인하였다.

특히, 안전성 측면에서 BMP-2를 발현하는 아데노바이러스 치료군의 경우 비정상적인 골형성이 바이러스 투여부위에서 관찰되었는데, 이는 BMP-2의 병변 특이적인 전달 및 BMP-2의 발현을 조절하는 것이 BMP-2를 기반으로 하는 줄기세포 치료에 있어 중요한 문제임을 암시하고 있다.

중간엽 줄기세포를 이용한 치료가 새로운 개념의 치료법으로 각광받고 있지만, 아직 해결되지 않은 줄기세포의 여러 가지 위험요인 때문에 임상적 접근에 한계를 가진다.

첫 번째 위험요인은 암 세포로의 형질전환 및 암 유발 가능성이다. 중간엽 줄기세포는 생체 외에서 다중 분화능을 유지하며 지속적으로 증식할 수 있는 특징이 있다.

하지만 지속적인 생체 외 세포 증식이 DNA의 유전적 불안정성을 증가시켜 줄기세포의 특성을 변화시킬 가능성이 있으며, 실제로 지방유래 중간엽 줄기세포를 스트레스 상태에서 지속적으로 배양할 경우 암 세포처럼 형질이 변한다는 보고가 있다.

두 번째 위험 요인은, 비정상적 조직 생성이다. 현재까지의 기술로는 줄기세 포의 특성 중 하나인 다중 분화능을 조절하기 힘들기 때문에, 체내에 주입된 줄기세포가 원하는 부위에서 원하는 조직으로 분화하는 것이 아니라 원하지 않는 부위에서 이상조직을 형성할 가능성이 있다.

한편, 중간엽 줄기세포는 강력한 면역억제 능력을 가지는데, 이러한 이유 때문에 체내에 투여된 중간엽 줄기세포에 의해 체내 전반에서 원하지 않는 면역반응의 저하 및 이에 따른 병원균의 감염 요인이 증가 될 수 있는 가능성이 있다.

따라서 위와 같은 기존 줄기세포 치료의 위험요인을 제거할 수 있는 방법의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 자살유전자인 HSV-tk와 BMP-2를 동시에 발현하는 벡터를 개발하여 세포 내에서 두 단백질을 동시에 생산할 수 있는 DNA 카세트와 이 DNA 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공하는데 있다.

또, 상기 발현 벡터를 도입하여 골 질환의 치료에 효과적으로 이용할 수 있는 자가조절형 줄기세포 치료제를 제공하는데 있다.

본 발명의 DNA 카세트는 전사/번역 개시 핵산서열을 사이에 두고 BMP의 핵산서열과 자살유전자의 핵산서열을 연결하여 구성된다.

이때, 상기 BMP는 서열번호 1의 human BMP-2의 핵산서열을 갖는 것이 특징이다.

상기 자살유전자는 HSV-tk인 것을 특징이며, 특히 이 HSV-tk는 코돈 최적화된 서열번호 3의 핵산서열을 갖는 것이 특징이다.

상기 전사/번역 개시 핵산서열은 서열번호 2의 IRES 핵산서열인 것이 특징이다.

또 다른 발명인 발현벡터는 상기와 같이 형성된 DNA 카세트를 포함하여 구성된다.

이때, 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 특징이다.

또 다른 발명인 재조합 아데노바이러스는 상기 벡터를 패키징 세포에서 증식시켜 얻는 것으로 구성된다.

이렇게 생성된 재조합 아데노바이러스를 줄기세포에 감염시키고 증식시켜 얻은 중간엽 줄기세포를 골 질환의 치료에 사용되는 것이 특징이다.

상기 해결 수단에 의해, 본 발명은 BMP-2의 발현뿐만 아니라, 줄기세포의 생존을 조절함으로써 바이러스 감염 혹은 유전자 도입으로 인해 발생할 수 있는 형질전환 줄기세포의 암 유발 가능성을 제거할 수 있으며, 줄기세포 치료의 다른 위험요인인 비정상적 조적 분화 가능성, 그리고 체내 면역억제 가능성 등의 인체 내 줄기세포 투여로 인한 부작용을 크게 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 줄기세포 체료제는 BMP-2의 발현과 줄기세포의 생존을 조절할 수 있는 안전성이 우수하므로, 이를 이용하여 골 손실 등의 여러 가지 골 질환의 치료에 효과적으로 이용할 수 있다.

자살유전자(suicide gene) 치료법은 항암유전자치료의 방법의 하나로, 암세포에 직접 Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk), Cytosin deaminase, Nitroreductase, Carboxylesterase, Cytochrome P450, Purine nucleoside phosphorylase 등의 자살유전자를 전달하는 방법이다.

자살유전자는 일종의 효소를 발현하며, 이 효소는 외부에서 주입된 세포에 무해한 전구약물(prodrug)을 효소반응을 통해 세포독성을 가지는 물질로 바꿈으로써 자살유전자를 가지는 세포뿐만 아니라, 간극연접(gap junction)을 통해 독성물질이 인접한 세포에 전달되어 주위의 암세포 사멸을 유도하는 방관자 효과(bystander effect)를 가지는 특징이 있다.

여러 자살유전자 중에서 HSV-tk는 가장 널리 사용되고 있는 자살유전자로 실제 임상3상까지 완료된 보고가 있는 효능과 안전성이 입증된 후보물질이다.

HSV-tk는 갠시클로비어(ganciclovir, GCV)라는 전구약물을 인산화 시키고, 인산화된 갠시클로비어 인산염(ganciclovir triphosphate, GCV-3P)은 DNA에 끼어들어감으로써 정상적인 유전자의 합성을 방해하여 세포사멸을 유도한다.

국소부위에 형성된 종양의 경우, 병변부위에 아데노바이러스나 렌티바이러스를 통해 HSV-tk를 전달한 뒤, GCV를 투여하면 암세포 특이적인 세포사멸을 기대할 수 있으며, 암 특이성을 더욱 높이기 위해 암 특이적 프로모터나 바이러스의 향성(tropism)을 변형하는 전략들이 이용되고 있다.

이에 본 발명자는 자살유전자인 HSV-tk와 BMP-2를 동시에 발현하는 벡터를 개발하고 재조합 아데노바이러스를 생산하였으며, 이를 줄기세포에 전달해 BMP-2의 발현을 조절할 수 있는 높은 안전성의 줄기세포 치료의 효능 및 안전성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이때, 본 발명에 사용된 HSV-tk 서열은 코돈 최적화된 서열이며, 기존의 야생형에 비해 보다 우수한 발현률 및 효능을 가진다.

본 발명에 사용된 BMP-2와 HSV-tk 유전자는 IRES(internal ribosome entry site)를 통해 연결되어 하나의 벡터 내에서 동시에 발현될 수 있다.

결론적으로 HSV-tk와 BMP-2 유전자를 동시에 발현하는 벡터 및 이 벡터가 도입된 줄기세포는 기존의 BMP-2를 발현하는 줄기세포에 비해 보다 향상된 안전성 및 자가조절능을 보인다.

이는, HSV-tk와 BMP-2를 발현하는 줄기세포의 체내 투여 후 충분한 치료과정이 진행된 후 간단한 GCV 투여에 의해 줄기세포의 사멸 및 BMP-2의 발현억제를 유도할 수 있기 때문이며, 이러한 특징은 기존의 발명과 구성 및 성능 면에서 차별화된다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

도 1은 사람 BMP-2 서열, IRES 서열, 그리고 자살유전자 HSV-tk 서열로 구성된 DNA 카세트의 개략도, 도 2는 BMP2-IRES-tk DNA 카세트를 포함하는 아데노바이러스의 BMP-2 발현을 줄기세포에서 나타낸 도면, 도 3는 제조한 아데노바이러스 (rAd/BMP2-IRES-tk)로 감염된 줄기세포의 BMP-2 발현이 자살유전자인 HSV-tk와 GCV 투여에 의해 조절되는지 나타낸 도면, 도 4는 제조한 아데노바이러스 (rAd/BMP2- IRES-tk)로 감염된 줄기세포의 세포사멸이 자살유전자인 HSV-tk와 GCV 투여에 의해 이루어지는지를 현미경으로 확인한 도면, 도 5는 제조한 아데노바이러스 (rAd/BMP2-IRES-tk)로 감염된 줄기세포의 세포증식이 자살유전자인 HSV-tk와 GCV 투여에 의해 저해되는 정도를 세포의 수를 통해 측정하여 나타낸 도면, 도 6은 BMP2-IRES-tk가 도입되어 BMP-2와 HSV-tk를 동시에 발현하는 줄기세포의 골질환 치료 효능을 골손실 동물모델에서 micro CT로 확인한 삼차원 이미지를 나타낸 도면이다.

도면에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 첫째, BMP-2와 HSV-tk 자살유전자를 동시에 포함하는 DNA 카세트에 관한 것이다.

여기서“BMP-2"란 사람, 원숭이, 쥐, 생쥐 혹은 다른 종 유래 BMP-2 단백질을 암호화하는 유전자를 말하며, 바람직하게는 서열번호 1번의 사람 BMP-2 유전자이다.

본 발명에서 사용되는 "자살유전자"는 세포사멸을 유도할 수 있는 유전자로 Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk), Cytosin deaminase, Nitroreductase, Carboxylesterase, Cytochrome P450, Purine nucleoside phosphorylase 등이 있으며, 바람직하게는 HSV-tk이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 3번의 코돈 최적화된 HSV-tk이다.

이 HSV-tk 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 야생형과 동일한 서열을 그대로 사용할 수 있으나, 바람직하게는 포유류, 특히 인간 세포 내에서 HSV-tk단백질의 발현 빈도가 증가하도록 HSV-tk 단백질의 유전자 코돈을 최적화한 서열을 사용한 다.

상기 “유전자 코돈을 최적화한 서열” 또는 본 발명에서 사용된 용어 “코돈 최적화”는 포유류, 특히 인간 세포 내에서 목적 물질(예를 들어, 본 발명의 HSV-tk단백질 등)의 발현량이 증가하도록 목적 물질을 암호화하고 있는 아미노산 코돈 중 일부 아미노산 코돈을 치환하는 것을 말한다.

본 발명에서는, HSV-tk 단백질의 아미노산 코돈, 구체적으로 알라닌(Ala: A), 아르기닌(Arg: R), 아스파라긴(Asn: N), 아스파테이트(Asp: D), 시스테인(Cys: C), 글루타민(Gln: Q), 글루타메이트(Clu: E), 글리신(Gly: G), 히스티딘(His: H), 이소류신(Ile: I), 류신(Leu: L), 라이신(Lys: K), 페닐알라닌(Phe: F), 프롤린(Pro: P), 세린(Ser: S), 쓰레오닌(Thr: T), 발린(Val: V) 및 타이로신(Tyr: Y)을 암호화하는 하나 이상의 유전자 코돈을 인간 세포에서 높은 빈도로 인지되는 유전자 코돈으로 치환한다.

본 발명의 구체적인 실시에서는, HSV-tk의 야생형 핵산서열을 코돈 최적화하였으며, 이를 서열번호 3으로 나타내었다.

종래 세포사멸유도에 사용된 HSV-tk의 핵산서열이 모두 야생형인 경우와 비교하여 본 발명의 코돈 최적화된 HSV-tk를 세포사멸유도에 이용할 경우 아생형에 비해 세포사멸 유도 효과가 보다 향상될 것이다.

본 발명에서 한 벡터에서 두 유전자를 동시에 발현하도록 하기위한 서열은 전사/번역 개시 서열을 이용하며, 바람직하게는 IRES 서열, 혹은 dual promoter system이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2번의 IRES 서열이다.

이와 같이, 본 발명은 BMP-2, HSV-tk 자살유전자, 그리고 IRES를 동시에 포함하는 DNA 카세트에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 BMP-2 서열은 서열번호 1의 핵산 서열을 가지고 있으며, 상기 코돈 최적화된 HSV-tk는 서열번호 3의 핵산 서열을 가지고 있으며, 상기 IRES는 서열번호 2의 핵산 서열을 가지고 있으며, 이의 배열을 도 1에 도시하였다.

둘째, 본 발명은 상기 DNA 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 벡터는 숙주세포에서 목적 단백질, 즉 BMP-2와 HSV-tk 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물(상기 DNA 카세트)이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적 조절요소를 포함한다.

본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다.

재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트를 포함한다.

개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 아데노바이러스 벡터이다.

아데노바이러스 벡터는 다양한 세포에 유전자 전달 효율이 우수한 벡터로, 암 환자의 유전자 치료에 가장 흔하게 사용되는 벡터 중의 하나이다.

본 발명에 사용된 재조합 아데노바이러스는 타입 5이고 복제에 필수 요소인 E1A 유전자가 결여된 복제 불능의 아데노바이러스이다.

섯째, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 제조한 BMP-2와 HSV-tk를 동시에 생산하는 아데노바이러스에 관한 것이다.

아데노바이러스는 상기 벡터를 패키징 세포에 전달하고 이를 배양하고 패키징 세포로부터 생성된 재조합 아데노바이러스를 수확하는 방법으로 아데노바이러스의 생성이 가능하다.

상기의 아데노바이러스는 유도성 프로모터를 이용해서 특정 물질에 의해 발현을 조절할 수 있는 유도성 아데노바이러스를 포함한다.

상기 유도성 프로모터는 CMV-Tet10이며 테트라사이클린(tetracyclin)에 의해 발현이 유도된다.

테트라사이클린을 이용한 유도성 시스템은 생체 내에서 가장 광범위하게 사용되고 있으려 우려할 만한 부작용이 없으며 경제성 측면에서도 우수하다.

넷째, 본 발명은 상기 DNA 카세트가 도입된 자가조절형 BMP-2 발현 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

여기서“자가조절형"이란 세포에서의 BMP-2 등의 치료단백질의 발현양과 발현기간을 인위적으로 조절할 수 있는 형태를 말한다.

또한, 줄기세포의 생존을 조절함으로써 치료 후 세포를 제거 함으로써 줄기세포 주입으로 인한 부작용을 줄일 수 있다.

본 발명에서 "줄기세포"는 여러 종류의 세포로 분화가능하고 자가 재생 (self-renewal)이 가능한 태아 줄기세포나 성체 줄기세포이며, 바람직하게는 성체줄기세포인 중간엽 줄기세포를 말하며, 더욱 바람직하게는 조골세포나 연골세포로 분화가 가능한 사람 중간엽 줄기세포이다.

상기의 BMP-2와 HSV-tk 단백질을 동시에 생산하는 벡터, 상기 벡터를 이용하여 제조한 BMP-2와 HSV-tk 단백질을 생산하는 아데노바이러스, 그리고 BMP-2와 HSV-tk 단백질을 생산하는 줄기세포는 골질환 치료 조성물로 제공될 수 있으며, 이 치료 조성물은 사람을 포함하여 다른 포유류에 백신 접종될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼, 주사제 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있다.

약제학적 수용가능한 담체는 임의 모든 용매, 분산 매체, 피복제, 항균 및 항곰팡이제, 등장액, 흡수 지연제 등이 포함된다.

약제학적으로 활성 물질에 대한 이와 같은 매체 및 물질은 공지되어 있다.

상기 조성물은 목적에 따라 적절한 약제학적 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

이때, 본 발명의 BMP-2와 HSV-tk 단백질를 포함하는 조성물은 경구 투여, 또는 근육, 정맥, 동맥, 복강, 피하, 피내 등의 비경구 투여될 수 있다.

바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제, 종양내에 직접 주사 등이다. 상기 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 약제학적으로 유효량 투여되도록 하며, 약제학적 유효량은 투여 방법 및 횟수, 암의 종류 및 중증도, 환자의 연령과 성별, 환자의 상태, 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 투여 유효량은 결정될 수 있다.

상기 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 이들은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> BMP2-IRES-tk 카세트의 구성

서열번호 1의 핵산서열을 가지는 사람 BMP-2 서열, 서열번호 2의 핵산서열을 가지는 IRES 서열, 및 서열번호 3의 코돈 최적화된 HSV-tk 서열을 각각 화학적으로 합성하였다.

합성시 BMP-2와 IRES의 연결부위 그리고 IRES와 HSV-tk의 연결부위에 각각 Nhe I과 Nco I 사이트를 생성하여 세 핵산 서열을 연결하였고, 벡터에 삽입하기 용이하기 위해 양 말단에 Kpn I (5')과 Xba I (3') 사이트를 첨가하였다 (도1).

BMP2-IRES-tk를 Kpn I과 Xba I으로 절단된 유도성 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pShuttle-Tet10 벡터에 삽입시켜 pShuttle-Tet10/BMP2-IRES-tk 벡터를 구성하였다.

유도성 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pShuttle-Tet10은 유도성 프로모터인 CMV-Tet10을 가지고 있다.

<실시예 2> BMP2-IRES-tk 카세트를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 생성

pShuttle/BMP2-IRES-tk를 PmeI으로 절단한 후 복제 불가능한 pAd/Easy 벡터와 BJ5183 competent cell에서 상동 재조합(homologous recombination) 반응을 수행하였다.

이 후 카나마이신(Kanamycin) 항생제를 이용하여 BMP2-IRES-tk 카세트가 내재된 pAd/BMP2-IRES-tk를 선별하였다.

정확한 확인을 위해 PacI으로 절단하여 35+4.5kb의 DNA 밴드를 확인하였다.

그리고 pAd/BMP2-IRES-tk를 293 세포주에 형질전환시켜 10일 후 BMP2-IRES- tk카세트를 발현하는 재조합 아데노바이러스 rAd/BMP2-IRES-tk를 얻었다.

<실시예 3> rAd/BMP2-IRES-tk의 huamn BMP-2 발현 확인

rAd/BMP2-IRES-tk가 human BMP-2을 정상적으로 발현하는지를 확인하기 위해 골수 유래 사람 중간엽 줄기세포 (hBM-MSC)를 50, 100, 그리고 500 MOI로 30분 동안 감염시켰다.

감염 후 24시간 뒤에 배양배지 (Culture supernatant)를 채취한 후, BMP-2 발현양을 확인하기위해 정량 ELISA을 수행하였다. 실험 결과, rAd/BMP2-IRES-tk가 농도에 의존적으로 BMP-2를 발현한다는 것을 확인하였다 (도2).

<실시예 4> BMP2-IRES-tk가 도입된 줄기세포에서 HSV-tk의 BMP-2 발현 조절 및 세포자살유도 능력 확인

rAd/BMP2-IRES-tk의 GCV 처리 후, 자살유도효과를 확인하기 위해 hBM-MSC를 100 MOI의 rAd/BMP2-IRES-tk 혹은 대조군으로서 rAd/EGFP로 30분 동안 감염시켰다.

배양액을 교체한 뒤, 1일, 4일, 7일, 또는 12일 뒤에 10 ug/ml 농도의 GCV를 처리하였다.

HSV-tk/GCV에 의해 BMP-2 발현이 저해되는지 알아보기 위해 GCV 처리 후 24시간 동안의 배양액을 모아 BMP2 ELISA를 수행한 결과, GCV 처리에 의해 BMP-2의 발현량이 대조군에 비해 4일째부터 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다 (도3).

또한, 줄기세포의 사멸이 유도되는 것을 현미경 (도4)과 CCK8 kit를 이용한 세포 증식 실험을 통해서 관찰하였다 (도5).

즉, HSV-tk 유전자가 도입되지 않은 세포는 GCV의 처리에 상관없이 잘 증식하지만 HSV-tk 유전자가 도입된 세포는 GCV 처리에 의해 1~4일 사이에 현저히 세포 증식이 감소함을 알 수 있었다.

이는 BMP2 핵산서열, IRES 번역 개시 서열, HSV-tk 자살유전자 서열로 구성되는 본 발명의 DNA 카세트가 도입된 줄기세포가 기존의 유전자가 이입되지 않았거나, 치료유전자만 이입된 줄기세포에 비해 보다 효율적으로 BMP-2 발현의 양과 기간을 조절할 수 있는 높은 안전성을 가진 골 질환 치료제의 성능을 가짐을 말해 준다.

<실시예 5> BMP2-IRES-tk가 도입된 줄기세포의 골손실 동물모델에서의 골 형성 효능 확인

50 MOI의 rAd/BMP2-IRES-tk로 감염된 5 x 10⁵ 개의 hBM-MSC를 미리 직경 8mm의 골손실을 유도한 쥐 두개골에 이식한 뒤, 4주와 6주 후에 골 형성 효능을 확인하였다.

대조군으로서, PBS 처리그룹과 세포 단독 투여 그룹을 포함하였으며 이 경우 micro CT를 이용한 3D공 형성 이미지에서 보듯이 골형성이 거의 일어나지 않았다 (도6).

반면 BMP2를 발현하는 중간엽 줄기세포가 투여된 쥐의 경우 4주째부터 거의 손실부위 전체에 새로운 뼈 형성이 이루어 졌으며, 6주째에는 거의 완벽한 골 생성을 보였다.

도 1은 사람 BMP-2 서열, IRES 서열, 그리고 자살유전자 HSV-tk 서열로 구성된 DNA 카세트의 개략도.

도 2는 BMP2-IRES-tk DNA 카세트를 포함하는 아데노바이러스의 BMP-2 발현을 줄기세포에서 나타낸 도면.

도 3는 제조한 아데노바이러스 (rAd/BMP2-IRES-tk)로 감염된 줄기세포의 BMP-2 발현이 자살유전자인 HSV-tk와 GCV 투여에 의해 조절되는지 나타낸 도면.

도 4는 제조한 아데노바이러스 (rAd/BMP2-IRES-tk)로 감염된 줄기세포의 세포사멸이 자살유전자인 HSV-tk와 GCV 투여에 의해 이루어지는지를 현미경으로 확인한 도면.

도 5는 제조한 아데노바이러스 (rAd/BMP2-IRES-tk)로 감염된 줄기세포의 세포증식이 자살유전자인 HSV-tk와 GCV 투여에 의해 저해되는 정도를 세포의 수를 통해 측정하여 나타낸 도면.

도 6은 BMP2-IRES-tk가 도입되어 BMP-2와 HSV-tk를 동시에 발현하는 줄기세포의 골질환 치료 효능을 골손실 동물모델에서 micro CT로 확인한 삼차원 이미지를 나타낸 도면.

<110> postech academy-industry foundation Biod Co.,LTD <120> Vector including the DNA cassette composed of BMP-2 and suicide gene HSV-tk, and self-regulating stem cell medicine expressing both BMP-2 and HSV-tk <130> 1 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1191 <212> DNA <213> Human BMP-2 <400> 1 atggtggccg ggacccgctg tcttctagcg ttgctgcttc cccaggtcct cctgggcggc 60 gcggctggcc tcgttccgga gctgggccgc aggaagttcg cggcggcgtc gtcgggccgc 120 ccctcatccc agccctctga cgaggtcctg agcgagttcg agttgcggct gctcagcatg 180 ttcggcctga aacagagacc cacccccagc agggacgccg tggtgccccc ctacatgcta 240 gacctgtatc gcaggcactc aggtcagccg ggctcacccg ccccagacca ccggttggag 300 agggcagcca gccgagccaa cactgtgcgc agcttccacc atgaagaatc tttggaagaa 360 ctaccagaaa cgagtgggaa aacaacccgg agattcttct ttaatttaag ttctatcccc 420 acggaggagt ttatcacctc agcagagctt caggttttcc gagaacagat gcaagatgct 480 ttaggaaaca atagcagttt ccatcaccga attaatattt atgaaatcat aaaacctgca 540 acagccaact cgaaattccc cgtgaccaga cttttggaca ccaggttggt gaatcagaat 600 gcaagcaggt gggaaagttt tgatgtcacc cccgctgtga tgcggtggac tgcacaggga 660 cacgccaacc atggattcgt ggtggaagtg gcccacttgg aggagaaaca aggtgtctcc 720 aagagacatg ttaggataag caggtctttg caccaagatg aacacagctg gtcacagata 780 aggccattgc tagtaacttt tggccatgat ggaaaagggc atcctctcca caaaagagaa 840 aaacgtcaag ccaaacacaa acagcggaaa cgccttaagt ccagctgtaa gagacaccct 900 ttgtacgtgg acttcagtga cgtggggtgg aatgactgga ttgtggctcc cccggggtat 960 cacgcctttt actgccacgg agaatgccct tttcctctgg ctgatcatct gaactccact 1020 aatcatgcca ttgttcagac gttggtcaac tctgttaact ctaagattcc taaggcatgc 1080 tgtgtcccga cagaactcag tgctatctcg atgctgtacc ttgacgagaa tgaaaaggtt 1140 gtattaaaga actatcagga catggttgtg gagggttgtg ggtgtcgcta g 1191 <210> 2 <211> 586 <212> DNA <213> IRES <400> 2 gaattccccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg 60 ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag 120 ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc 180 caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg 240 aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag 300 gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca 360 gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt 420 caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc 480 tcggtgcaca tgctttacgt gtgtttagtc gaggttaaaa aacgtctagg ccccccgaac 540 cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat atggcg 586 <210> 3 <211> 1131 <212> DNA <213> HSV-tk <400> 3 atggccagct acccctgtca ccagcacgcc agcgccttcg accaggccgc tagaagcaga 60 ggccacagca acagaagaac cgccctgaga cccagaagac agcaggaggc cacagaggtg 120 agactggagc agaagatgcc caccctgctg agagtgtaca tcgatggacc ccacggcatg 180 ggcaagacca caacaaccca gctgctggtg gccctgggca gcagagacga catcgtgtac 240 gtgcccgagc ccatgaccta ctggcaggtg ctgggagcca gcgagaccat cgccaacatc 300 tacaccacac agcacagact ggaccagggc gagatcagcg ccggcgacgc tgccgtggtg 360 atgaccagcg cccagatcac aatgggcatg ccctacgccg tgaccgatgc cgtgctggct 420 ccccacgtgg gcggagaggc cggcagcagc cacgcccctc cccctgccct gaccctgatc 480 ttcgacagac accccatcgc cgccctgctg tgctaccccg ccgctagata cctgatgggc 540 agcatgacac cccaggccgt gctggccttc gtggccctga tcccccctac cctgcccggc 600 accaacatcg tgctgggcgc cctgcccgag gacagacaca tcgacagact ggctaagaga 660 cagagacccg gcgagagact ggacctggcc atgctggccg ccatcagaag agtgtacggc 720 ctgctggcca acaccgtgag atacctgcag ggaggcggca gctggtggga ggactggggc 780 cagctgagcg gcaccgccgt gcctccccag ggcgccgagc cccagagcaa cgccggccct 840 agaccccaca tcggcgacac cctgttcacc ctgtttagag cccccgagct gctggccccc 900 aacggcgacc tgtacaacgt gttcgcctgg gccctggacg tgctggccaa gagactgaga 960 cccatgcacg tgttcatcct ggactacgac cagagccccg ccggctgcag agatgccctg 1020 ctgcagctga ccagcggcat ggtgcagacc cacgtgacca cacccggcag catccccacc 1080 atctgcgacc tggccagaac ctttgccaga gagatgggcg aggccaactg a 1131

Claims (10)

1. 전사/번역 개시 핵산서열을 사이에 두고 BMP의 핵산서열과 자살유전자의 핵산서열을 연결하여 구성된,

   DNA 카세트.
2. 제1항에 있어서,

   상기 BMP는 서열번호 1의 human BMP-2의 핵산서열을 갖는 것을 특징으로 하는,

   DNA 카세트.
3. 제1항에 있어서,

   상기 자살유전자는 HSV-tk인 것을 특징으로 하는,

   DNA 카세트.
4. 제3항에 있어서,

   상기 HSV-tk는 코돈 최적화된 서열번호 3의 핵산서열을 갖는 것을 특징으로 하는,

   DNA 카세트.
5. 제1항에 있어서,

   상기 전사/번역 개시 핵산서열은 서열번호 2의 IRES 핵산서열인 것을 특징으로 하는,

   DNA 카세트.
6. 제1항의 DNA 카세트를 포함하여 구성된,

   발현 벡터.
7. 제6항에 있어서,

   상기 발현 벡터는 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는,

   발현 벡터.
8. 제6항 또는 제7항의 벡터를 패키징 세포에서 증식시켜 얻은,

   재조합 아데노바이러스.
9. 제8항의 재조합 아데노바이러스를 감염시킨 줄기세포를 증식시켜 얻은 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는,

   자가조절형 줄기세포 치료제.
10. 제9항에 있어서,

    골 질환의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는,

    자가조절형 줄기세포 치료제.

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