WO2019245066A1 - 박테리아에서의 고품질 재조합 단백질 생산을 위해 전사 완료 후 번역이 개시되는 유전자 발현 카세트 - Google Patents

박테리아에서의 고품질 재조합 단백질 생산을 위해 전사 완료 후 번역이 개시되는 유전자 발현 카세트 Download PDF

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WO2019245066A1
WO2019245066A1 PCT/KR2018/006924 KR2018006924W WO2019245066A1 WO 2019245066 A1 WO2019245066 A1 WO 2019245066A1 KR 2018006924 W KR2018006924 W KR 2018006924W WO 2019245066 A1 WO2019245066 A1 WO 2019245066A1
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translation
sequence
switch
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mrna
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PCT/KR2018/006924
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Inventor
서상우
양진아
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서울대학교산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression

Definitions

  • the present invention relates to a gene expression cassette for enhancing the productivity of a recombinant protein of full length in the process of producing a recombinant protein by culturing a microorganism, and in particular, by reconstructing the transcription and translation system inherent in an organism, It relates to a gene expression cassette that utilizes switches and triggers to control only translation of mRNA of length into a template.
  • the translation initiation step proceeds at the same time, which is called transcription-translation coupling or cotranscriptional translation.
  • transcription-translation coupling In bacteria, about 4% of intracellular mRNA is present without a stop codon due to premature termination of transcription and cleavage of mRNA.
  • co-translational translation occurs, translation is initiated from mRNA that is prematurely terminated without transcription. .
  • the translation of the prematurely terminated mRNA into a template results in the production of polypeptides without function and the waste of cellular resources such as amino acids and ATP.
  • bacteria have ribosomal repair systems such as tmRNAs that mediate trans-translation and ArfA-Release factor2, which induces ribosome release factors, but only in cells Difficult to solve the problem
  • ribosomal repair systems such as tmRNAs that mediate trans-translation and ArfA-Release factor2
  • ArfA-Release factor2 which induces ribosome release factors
  • both the productivity and the quality of the final product are important for producing recombinant proteins intended for polymers and mostly high functional products.
  • Existing studies for this purpose include removing proteolytic enzymes from production strains, improving cell lines to supply the amino acids contained in the protein of interest, increasing the number of copies of genes, and reengineering promoter engineering and 5'UTR. We are developing technologies to improve transcription and translation efficiency.
  • a gene is composed of a switch that prevents translation initiation so that translation is initiated only from a full-length mRNA template by reconstructing the transcription-translation tuning system inherent in bacteria, and a trigger system capable of activating translation initiation from the switch. It is intended to provide an inventive cassette.
  • the present invention seeks to provide a technique that increases the productivity of high-quality, full-length recombinant protein, while reducing the cost of purification.
  • the present invention provides a transcriptional stem loop structure with mRNA, wherein in the DNA molecule in which the ribosomal binding site is located in the stem loop structure, a partial sequence is used to form the stem loop structure.
  • a DNA sequence encoding an RNA sequence designed to participate (a); The DNA sequence encoding the RNA sequence complementary to the RNA sequence designed to participate in the formation of the stem loop structure, the partial sequence (b) located after the stop codon; Provides a DNA molecule comprising a do.
  • the DNA molecule preferably includes a multiple cloning site after the ribosomal binding site and before the DNA sequence (b).
  • the present invention provides, in a second aspect, a vector comprising the DNA molecule of the first form.
  • a mRNA in which a stem loop structure is formed and ribosomal binding sites are located in the stem loop structure, wherein an RNA sequence (a) in which a partial sequence participates in the stem loop structure; Comprising a complementary sequence capable of binding to the RNA sequence (a), RNA sequence located after the stop codon (b); provides an mRNA comprising a.
  • the stem loop structure is released and translation starts.
  • the translation initiation is preferably initiated by binding the ribosome to the ribosome binding site.
  • the transcriptional and translational phases were unsynchronized by introducing so-called switch and trigger sequences into the mRNA. This allowed translation to be initiated only when transcription proceeded to the targeted 3 'end, thereby producing a full length, high quality recombinant protein.
  • the produced recombinant protein can be applied to a variety of industries, ranging from pharmaceuticals and antibodies to raw materials of functional cosmetics, detergents, fertilizers, animal feed.
  • Figure 1 a is a schematic diagram of the mechanism of operation of the ProQC gene expression cassette in which the trigger sequence for initiating translation from the switch is located in the same mRNA, b) mRNA having a switch and the trigger sequence It is a schematic diagram showing whether or not ribosomal binding to RBS (Ribosome binding site) of mRNA that does not have a switch and a trigger (Trigger) sequence.
  • RBS Rabosome binding site
  • Figure 2 is a schematic of the txtl-Cis-sfGFP gene expression cassette in which the trigger sequence initiating translation from the switch is located in the same mRNA as the switch, and in a plasmid separate from the switch where the trigger expresses the target gene. It is a schematic diagram of a natural gene expression cassette (txtl-Trans-sfGFP).
  • FIG. 4 is a genetic circuit diagram for observing the degree of intramolecular and intermolecular interactions of the switch and trigger sequences of mRNA transcribed in the ProQC gene expression cassette.
  • Figure 5 is a graph showing the ratio of the unit fluorescence of ProIntra cells using the sfGFP protein as an index for initiation of translation by intracellular mRNA interaction.
  • Figure 6 is a mCherry_lacZ_gfp (MLG) fusion protein production method and ProQC-MLG plasmid, ProNC-MLG gene circuit diagram expressing MLG protein.
  • MLG mCherry_lacZ_gfp
  • Figure 7 a) is a graph showing the amino and carboxy terminal amount of the MLG fusion protein of each of the ProQC-MLG strain and ProNC-MLG strain, mCherry, sfGFP fluorescence is divided by the absorbance of 600nm wavelength, the fluorescence per cell is calculated, Fluorescence per cell was converted to the amount of each fluorescent protein and normalized to the amount of mCherry.
  • FIG. 8 shows SDS-PAGE results of proteins expressed from ProQC-MLG strains and ProNC-MLG (control) strains.
  • Full-length shows a fusion protein purified using a carboxy-terminated histidine tag as a full-length marker.
  • the present invention provides gene expression cassettes that release transcription-translational synchronization of bacteria and allow translation to be initiated only on mRNA strands where transcription is complete.
  • the present invention is a nucleic acid sequence that prevents translation initiation so that translation is not initiated in the mRNA template transcribed in incomplete length (so-called 'Switch' in the present invention) and the full length is transferred to the switch
  • a gene expression cassette comprising a nucleic acid sequence capable of binding to activate the translation initiation (so-called 'Trigger' in the present invention).
  • FIG. 1 A schematic diagram of the gene expression cassette of the present invention is shown in FIG. 1.
  • the mRNA molecule transcribed from the DNA on the bacteria has a sequence capable of binding ribosomes, that is, a ribosomal binding site (RBS).
  • RBS ribosomal binding site
  • the time point at which the translation is started is intended to be controlled through the so-called 'switch-trigger system' of the present invention.
  • RNA sequence (a) in the present invention and the trigger (Trigger) sequence (RNA sequence (b) of the present invention) are present on the same mRNA strand.
  • the switch sequence participates in the formation of a stem loop structure, some of which comprise RBS.
  • the trigger sequence (RNA sequence (b) in the present invention) is located at the 3 'end of the same mRNA, preferably after the stop codon.
  • Translation is not initiated when the stem loop structure is formed.
  • the trigger sequence is exposed on the mRNA, and the exposed mRNA is bound to the complementary sequence of the switch sequence to release the stem loop structure to translate.
  • the trigger sequence that initiates translation from the switch is located in the same mRNA as the switch. As shown in a) of FIG. 1, when the trigger sequence at the mRNA 3 'end is exposed on the mRNA through a complete transcription process, paired with the switch sequence of the 5'UTR, complementary binding is initiated. signal to be turned on).
  • the ribosome binding site of the mRNA that does not have a switch-trigger system does not bind to the ribosome, and thus the translation cannot be started. It can be seen that the ribosome is bound only to the mRNA ribosomal binding site of the present invention having a trigger system (Trigger) to initiate translation.
  • Trigger Trigger
  • the switch sequence in the present invention it is preferred that 'part' of the sequence participates in the formation of the stem loop structure. If all of the switch sequences participate in forming the stem loop structure, even if the trigger sequence binds complementarily to the switch sequence, the binding force participating in the stem loop structure formation and the trigger sequence are mutually different. It is because it becomes the same and it is not easy to eliminate stem loop structure formation.
  • a transcription system stem loop structure may be formed by mRNA, and in the DNA molecule in which the ribosomal binding site is located in the stem loop structure, a partial sequence of the stem loop structure is present.
  • vectors comprising DNA molecules.
  • the present invention according to the second embodiment implements a switch-trigger system at the level of mRNA on DNA, and the DNA of the present invention serves as a gene expression cassette system to ensure high efficiency expression of the target protein.
  • the vector containing the DNA molecule according to the second aspect of the present invention serves to transport this expression system. Bacteria transformed with the vector of the present invention can produce the target protein in an intact form as described in the present invention, it is possible to produce a recombinant target protein with high efficiency.
  • the present invention it is possible to configure a variety of promoters and terminators required for the start and end of expression, it is possible to adjust the amount of the target protein according to the intensity of the promoter.
  • the ribosome binding site after the ribosome binding site, before the DNA sequence (b) (so-called 'Trigger' sequence), it includes a multiple cloning site (mutiple cloning site), the multiple cloning site genes encoding various target proteins Can be inserted.
  • the T7 promoter a strong promoter widely used in recombinant protein production, was used to construct synthetic gene expression cassettes (ProQC gene expression cassettes) that only initiate translation in the mRNA strand where transcription was completed in bacteria.
  • synthetic gene expression cassettes ProQC gene expression cassettes
  • the Chloramphenicol resistance gene (Cam R ) using the pACYC_Duet plasmid as a template and the EcoNI-PT7-NheI-TT7-F / SpeI-pACYC-R primer set in Table 2 to remove unnecessary restriction enzyme sites from the vector Amplifying a vector section including the.
  • the pACYC_Duet plasmid was cloned using EcoNI and NheI and the amplified PCR using EcoNI and SpeI restriction enzymes, respectively, to remove the NheI restriction enzyme sequence of the existing plasmid and to clone the gene expression cassette between the T7 promoter and T7 terminator sequences. PACYC * with site inserted was produced.
  • sfGFP was first amplified using the PBR322-J23100-sfGFP plasmid as a template using the Swit-sfGFP-F1 / SpeI-SacI-sfGFP-R primer set of Table 2, followed by BsaI-Swit-sfGFP-F2 / BsaI- Amplified with Trig-R2 primer set, the toehold switch was attached to the 5 'end of the sfGFP and the Trigger sequence was attached to the 3' end.
  • the pACYC * vector was cut with BsaI and NheI restriction enzymes, and then the amplification product was cloned using the BsaI restriction enzyme sequence to clone the txtl-Cis-sfGFP plasmid and the txtl-Trans-sfGFP plasmid using the BsaI and SpeI restriction enzyme sequences. Each was produced.
  • a plasmid was prepared to transcribe a trigger for gene expression of the txtl-Trans-sfGFP plasmid.
  • the pCDF-Term plasmid was constructed by cloning the sequence from the T7 promoter to the T7 terminator of pACYC * to the pCDF_Duet vector using EcoNI and Bsu36I restriction enzyme sequences, and the BsaI-Trigger # 3-F / BsaI-Trig-R2 in Table 2.
  • the trigger sequence amplified using the primer set was cut with a BsaI restriction enzyme and cloned into a pCDF-Term vector cut with BsaI and NheI restriction enzymes to prepare a pCDF-Trigger plasmid.
  • the pCDF-Trigger plasmid has a higher copy number than the pACYC_Duet plasmid, which is about 40 copies per cell, about 12-15 copies per cell, and thus is continuously supplied and translated from a natural gene expression cassette independent of transcription termination of sfGFP. Is initiated.
  • txtl-Cis-sfGFP plasmid and pCDF-Term plasmid pair, txtl- were used in Escherichia coli BL21 (DE3), which is widely used for recombinant protein production.
  • the pairs were transformed with Trans-sfGFP plasmid and pCDF-Trigger plasmid, respectively.
  • Spectinomycine Spec, 50 ug / mL
  • chloramphenicol Chloramphenicol, Cam, 34 ug / mL
  • the existing mCherry sequence was intended to remove the translation initiation sequence in order to be completely controlled by the switch because an unintended translation initiation sequence exists at the amino terminus, and the BsaI-Trc-mcherry shown in Table 2 using pET28a-mCherry plasmid as a template. Amplify the mCherry gene except for the N-terminal 8 amino acid sequence using the -F / SpeI-mCherry-R primer set and then use pACYC * using BsaI and SpeI (vectors use BsaI and NheI restriction enzymes) restriction enzyme sequences.
  • the interaction between mRNA molecules caused the 3 'terminal trigger sequence of txtl-Cis-sfGFP to initiate translation from the switch of pCDF-txtl-Trans-mCherry, at 6.3%.
  • the incidence of translation initiation from the switch by intramolecular interaction was 93.7%. In other words, even if the same switch is on different mRNA strands, the translation initiation efficiency by intramolecular interaction, which has a trigger on the same mRNA strand, was superior.
  • Amplification product BL21 (DE3) with a linker attached and a starter codon and a stop codon using a KpnI-lacZ-F / BsaI-lacZ-R primer set as a template
  • Each of the three amplification products was cut by mCherry with BsaI and KpnI restriction enzymes, lacZ with KpnI and BsaI restriction enzymes, sfGFP with BsaI and SpeI restriction enzymes, purified and ligated in one tube, and finally BsaI-Trc- After amplification with mcherry-F / SpeI-sfGFP-R primer set, three genes were sequentially linked to amplified strands, and TA cloning was performed.
  • the BsaI-Swit # 3-R / SpeI- template was used as the txtl-Cis-sfGFP plasmid.
  • the mCherry, lacZ, and sfGFP (MLG) fusion proteins produced through the above process have mCherry fluorescent protein at the amino terminus (5 'terminus) and sfGFP fluorescent protein at the carboxy terminus (3' terminus). By measuring the ratio of sfGFP fluorescence, one could see if both ends of the long protein produced intracellularly were lost.
  • the unit fluorescence was calculated to convert the two types of fluorescence emitted from the cell into the number of molecules.
  • the txtl-Trans-sfGFP plasmid was used as a template.
  • Txtl-Trans-sfGFP_CH plasmid was prepared by attaching 6 repeated histidine tags (6XHis) to the carboxy terminus of sfGFP and cloning it to the pACYC * vector using EcoNI and SacI restriction enzyme sequences.
  • pCDF-txtl-Trans-mCherry plasmid as a template was amplified with Duet-F / His-MR primer set of Table 2, and the histidine tag (6XHis) was attached to the carboxy terminus of mCherry, followed by EcoNI and SacI restriction enzymes.
  • the txtl-Trans-mCherry_CH plasmid was constructed by cloning into the pACYC * vector using the sequence.
  • Unit-sfGFP, txtl-Trans-mCherry-CH plasmid and pCDF-Trigger transformed with a txtl-Trans-sfGFP plasmid and a pCDF-Trigger plasmid pair to BL21 (DE3) to calculate the fluorescence per mass of fluorescent protein.
  • Unit-mCherry was constructed in which plasmid pairs were transformed into BL21 (DE3).
  • Unit-sfGFP and Unit-mCherry were expressed in 4 hours after fluorescence protein expression as described in Experiment 1 to harvest the cells.
  • Ni-NTA purification a protein purification method using histidine tags, was performed from the harvested cells to purify sfGFP and mCherry, respectively, to derive a correlation between protein amount and fluorescence intensity.
  • the protein amount was measured by the Bradford assay and the fluorescence was measured by the fluorescence of the purified sample diluted with PBS buffer at various ratios to establish the formula for the protein amount and fluorescence intensity of each of sfGFP and mCherry. (Formulate formula for fluorescence intensity per gram protein when measured by Hydex).
  • FRT-Kan-FRT amplification was performed using pFRT72 plasmid as a template using lacZ-Del-F1 / lacZ-Del-R1 / lacZ-Del-F2 / lacZ-Del-R2 primer set shown in Table 2.
  • the template plasmid was removed.
  • the amplification product was subjected to PCR purification and ethanol concentration to transform the BL21 (DE3) / pKD46 strain expressing the recombinant enzyme.
  • colony PCR was performed using a set of lacZ-check-F / lacZ-check-R primers, and then transformed into a pCP20 plasmid.
  • Kanamycin resistance gene Kan R
  • ProCh-MLG strain was prepared by transforming the txtl-Cis-MLG / pCDF-Term plasmid pair into BL21 (DE3) ⁇ lacZ and transforming the ProQC-MLG strain and the txtl-Trans-MLG / pCDF-Trigger plasmid pair. It was.
  • the protein was allowed to be expressed.
  • the sfGFP and mCherry fluorescence of the cells were measured, divided into unit fluorescence, converted into the amino and carboxy terminal amounts of the MLG fusion protein in the cell, and then normalized to the mCherry amount in each system.
  • sfGFP the ratio of the full-length protein from the ProQC gene expression cassette to the carboxy terminus
  • MLG fusion protein expressed from each strain of ProQC-MLG and ProNC-MLG was used for the amino terminal 6X histidine tag through the Ni-NTA method. Purification was carried out.
  • the amino terminal tag can be used to recover the peptide synthesized in the expression cassette without distinction. At this time, peptides which are not terminated early or due to degradation of mRNA are not purified until the termination codon is purified.
  • the txtl-Cis-MLF_CH plasmid was transformed into BL21 (DE3) ⁇ lacZ, purified with histidine tag at the carboxy terminus, and the MLG fusion protein was fully purified to the terminus. Indicated as.
  • Proteins purified from ProQC and ProNC for differentiation on SDS-PAGE gels were measured in concentrations by a Bradford assay and injected with the same amount of protein in one compartment.
  • SDS-PAGE of the protein as shown in FIG. 8, the protein purified from ProQC has a relatively full length and a shorter amount of protein compared to the protein purified from ProNC. Compared with, it is clearly distinguished.

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Abstract

본 발명은 박테리아에서의 고품질 재조합 단백질 생산을 위해 전사 완료 후 번역이 개시되는 유전자 발현 카세트에 관한 것으로, 상세하게는, 박테리아에 내재된 전사-번역 동조 시스템을 재구성하여 완전한 길이의 mRNA 주형으로부터만 번역이 개시되도록 번역 개시를 막는 스위치와 해당 스위치로부터 번역 개시를 활성화시킬 수 있는 Trigger 시스템으로 구성된 유전자 발현 카세트에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 전사-번역이 동조화된 자연계의 5'UTR을 스위치로 교체하여 스위치로부터 번역개시를 활성화시키는 트리거(Trigger) 서열을 목적 재조합 유전자의 하류(3'말단)에 삽입하면, 박테리아의 전사 단계와 번역 단계를 비동조화시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 완전한 길이의 고품질 재조합 단백질 생산성을 높이면서도 정제과정의 비용의 부담을 줄일 수 있고, 생산한 재조합 단백질을 의약품, 항체부터 기능성 화장품의 원료, 세제, 비료, 가축의 사료에 이르기까지 다양한 산업에 적용할 수 있다.

Description

박테리아에서의 고품질 재조합 단백질 생산을 위해 전사 완료 후 번역이 개시되는 유전자 발현 카세트
본 발명은 미생물을 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 공정에서 완전한 길이의 재조합 단백질 생산성을 높이기 위한 유전자 발현 카세트에 관한 것으로, 상세하게는 생물체에 내재된 전사, 번역 시스템을 재구성하여 말단이 손상되지 않은 완전한 길이의 mRNA만을 주형으로 번역이 개시되도록 제어하는데 스위치와 트리거(Trigger)를 활용하는 유전자 발현 카세트에 관한 것이다.
박테리아에서는 자연적으로 전사 단계 진행 중 번역 개시 서열이 노출되면 동시에 번역 개시 단계가 진행되며, 이를 전사-번역 동조(transcription translation coupling) 혹은 동시 전사 번역(cotranscriptional translation)이라고 한다. 박테리아에서는 전사의 조기 종결 및 mRNA의 쪼개짐 현상으로 인해 세포내 mRNA의 ~4% 정도가 종결 코돈 없이 존재하는데, 동시 전사 번역이 일어나게 되면 전사가 완료되지 못한 채 조기 종료된 mRNA로부터도 번역이 개시된다. 조기 종료된 mRNA를 주형으로 번역이 진행되면서 기능이 없는 폴리펩티드가 만들어지고 아미노산, ATP 등의 세포 자원이 낭비되는 문제가 일어나게 된다.
상기와 같은 문제로 인해, 박테리아는 트랜스-트랜스레이션(trans-translation)을 매개하는 tmRNA, 리보솜 해방인자를 유도하는 ArfA-Release factor2 등의 리보솜 회복 시스템을 보유하고 있지만, 세포에 내재하는 시스템만으로는 이러한 문제를 해결하기 어렵다. 게다가, 재조합 단백질을 과발현시키는 경우 조기 종료된 mRNA가 누적되어 종결코돈 미보유 mRNA들을 해결하기 어려워지게 된다.
한편, 고분자 및 대부분 고기능성 제품을 목적으로 하는 재조합 단백질을 생산하기 위해서는, 생산성과 최종 산물의 품질이 모두 중요하다. 이를 위한 기존 연구에서는 생산 균주의 단백질 분해효소를 제거하거나, 목적 단백질에 많이 들어있는 아미노산을 자체적으로 공급하도록 세포주를 개량하거나, 유전자의 복제수를 늘리거나, 프로모터 엔지니어링 및 5'UTR의 재설계를 통해 전사, 번역 효율을 개선하는 기술들을 개발하고 있다.
또한, 최근에는, 숙주에 맞춰 최적화된 코돈으로 유전자를 재구성하는 기술 및 코돈 빈도수 패턴을 유전자의 출처와 동질화시키는 연구가 리보솜 프로파일링 기술과 함께 시도되고 있고, 대량으로 발현된 단백질을 정제 후에 기능성 구조로 재접힘(refolding)시키는 기술 및 고처리능의 스크리닝 방법을 사용하여 재조합 단백질의 기능성 발현을 위한 신호 펩티드들이 개발되고 있다.
기능성 발현을 위한 신호 펩티드들이 개발되고 있다.
하지만, 현재까지 개발된 기술들은 주로 난발현 단백질의 수율 증대 및 기능성 구조로의 발현, 발현된 단백질의 정제를 목적으로 하는 기술들로, 고분자인 재조합 단백질이 동일한 효능을 유지하기 위해서는 정제 과정에서의 불순물이 제거되는 과정이 필요하며, 정제과정의 비용이 부담으로 발생하는 문제가 있다.
따라서, 손상되지 않으면서도 정제과정의 비용의 부담을 줄이고, 높은 생산성 및 고품질의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 시스템을 개발하는 것이 필요한 실정이다.
본 발명에서는 박테리아에 내재된 전사-번역 동조 시스템을 재구성하여 완전한 길이의 mRNA 주형으로부터만 번역이 개시되도록 번역 개시를 막는 스위치와 해당 스위치로부터 번역 개시를 활성화시킬 수 있는 트리거(Trigger) 시스템으로 구성된 유전자 발명 카세트를 제공하고자 한다. 또한, 완전한 길이의 고품질 재조합 단백질 생산성을 높이면서도, 정제과정의 비용의 부담을 줄이는 기술을 제공하고자 한다.
본 발명은 제1형태로, mRNA로 전사시 스템 루프 (stem loop) 구조를 형성할 수 있고, 상기 스템 루프 구조 내에 리보솜 결합 사이트가 위치하고 있는 DNA 분자에 있어서, 일부분 서열이 상기 스템 루프 구조 형성에 참여할 수 있도록 설계된 RNA 서열을 암호화하는 DNA서열(a); 상기 일부분 서열이 스템 루프 구조 형성에 참여할 수 있도록 설계된 RNA 서열에 상보적으로 결합하는 RNA 서열을 암호화하는 것으로, 종결코돈 뒤에 위치하는 DNA서열(b);을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명 제1형태에 있어서, 상기 DNA 분자는, 바람직하게 리보솜 결합 사이트 뒤, DNA서열(b) 전에, 멀티플 클로닝 사이트 (mutiple cloning site)를 포함하는 것이 좋다.
본 발명은 제2형태로, 제1형태의 DNA 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 제3형태로, 스템 루프 (stem loop) 구조를 형성하고, 스템 루프 구조 내에 리보솜 결합 사이트가 위치한 mRNA에 있어서, 일부분 서열이 상기 스템 루프 구조에 참여하고 있는 RNA서열(a); 상기 RNA서열(a)에 결합할 수 있는 상보적 서열로 구성되어 있는 것으로, 종결코돈 뒤에 위치하는 RNA서열(b);을 포함하는 것을 특징으로 하는 mRNA를 제공한다.
본 발명의 제3형태에 있어서, 상기 mRNA는, 바람직하게 RNA서열(b)가 RNA서열(a)에 결합하면, 스템 루프 구조가 풀리면서 번역이 개시되는 것이 좋다. 이때, 상기 번역 개시는, 바람직하게 리보솜이 리보솜 결합 사이트에 결합함으로써 개시되는 것이 좋다.
본 발명에 의할 경우, 소위 스위치 (Switch) 서열과 트리거 (Trigger) 서열을 mRNA에 도입함으로써 전사 단계와 번역 단계를 비동조화였다. 이를 통해 전사가 목표한 3‘말단까지 진행되는 경우에만 번역이 개시되도록 하여, 완전한 길이의 고품질 재조합 단백질을 생산할 수 있었다.
한편, 본 발명을 이용할 경우, 생산한 재조합 단백질을 의약품, 항체부터 기능성 화장품의 원료, 세제, 비료, 가축의 사료에 이르기까지 다양한 산업에 적용할 수 있다.
도 1의 a)는 스위치로부터의 번역을 개시하는 트리거(Trigger) 서열이 동일한 mRNA에 위치하는 ProQC 유전자 발현 카세트의 작동 기작에 대한 모식도이고, b)는 스위치와 트리거(Trigger) 서열을 가지고 있는 mRNA와 스위치와 트리거(Trigger) 서열을 가지고 있지 않은 mRNA의 RBS(Ribosome binding site)에 대한 리보솜 결합 여부를 나타내는 모식도이다.
도 2는 스위치로부터의 번역을 개시하는 트리거(Trigger) 서열이 스위치와 동일한 mRNA에 위치하는 txtl-Cis-sfGFP 유전자 발현 카세트 모식도 및 트리거(Trigger)가 목적 유전자를 발현시키는 스위치와 별개의 플라스미드에 위치하는 자연적 유전자 발현 카세트(txtl-Trans-sfGFP) 모식도이다.
도 3은 ProQC 유전자 발현 카세트와 자연적 유전자 발현 카세트에서 리포터 단백질인 sfGFP를 발현시키고, 각 시스템에서의 단위 형광을 자연적 유전자 발현 카세트의 발현 값으로 표준화하여 비교한 그래프이다. (ProNC-sfGFP의 단위형광 = 1)
도 4는 ProQC 유전자 발현 카세트에서 전사된 mRNA의 스위치와 트리거(Trigger) 서열의 분자 내, 분자 간 상호작용 정도를 관찰하기 위한 유전자 회로도이다.
도 5는 sfGFP 단백질을 mRNA 분자 내 상호작용에 의한 번역개시 지표로 사용하여 ProIntra 세포의 단위 형광의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 mCherry_lacZ_gfp (MLG) 융합 단백질 제작 방법 및 MLG 단백질을 발현하는 ProQC-MLG 플라스미드, ProNC-MLG 유전자 회로도이다.
도 7의 a)는 ProQC-MLG 균주 및 ProNC-MLG 균주 각각의 MLG 융합단백질의 아미노 말단과 카르복시 말단 양을 나타내는 그래프이며, mCherry, sfGFP 형광을 600nm 파장의 흡광도로 나눠 세포당 형광을 계산하고, 세포당 형광을 각 형광단백질의 양으로 환산한 후 mCherry의 양으로 표준화한 것이다. b)는 ProQC-MLG와 ProNC-MLG에서의 단위 세포의 융합단백질 생산성을 확인하기 위해 완전한 길이의 단백질(카르복시 말단의 sfGFP를 기준으로 함)양 발현량을 ProNC-MLG의 발현량을 1로 표준화 하여 비교한 그래프이다.
도 8은 ProQC-MLG 균주 및 ProNC-MLG (대조군) 균주로부터 발현된 단백질의 SDS-PAGE 결과이며, Full-length는 완전한 길이의 마커로서 카르복시 말단의 히스티딘 태그를 사용하여 정제한 융합단백질을 나타낸다.
본 발명은 박테리아의 전사-번역 동조화를 해제하고, 전사가 완료된 mRNA 가닥에서만 번역이 개시되도록 하는 유전자 발현 카세트를 제공한다. 즉, 본 발명은 불완전한 길이로 전사된 mRNA 주형에서는 번역이 개시되지 않도록 번역 개시를 막고 있는 핵산서열(본 발명에서는 소위 '스위치(Switch)'라 칭하기로 함)와 완전한 길이로 전사되면 상기 스위치에 결합하여 번역 개시를 활성화시킬 수 있는 핵산서열(본 발명에서는 소위 '트리거(Trigger)'라 칭하기로 함)을 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공한다. 더욱 상세하게는, 전사가 완전히 종결되어 mRNA의 3' 말단에 있는 트리거(Trigger) 핵산서열이 mRNA 상에 노출되고, mRNA의 5'UTR에 있는 스위치 서열과 상보적으로 결합하면, 스위치 서열이 참여하고 있는 스템 루프 (stem loop) 구조를 풀게 되어 번역이 개시되게 하는 것이다. 이와 같은 본 발명의 전사 번역 비동조화 시스템을 통해 박테리아 내에서 완전한 길이의 고품질 재조합 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명의 유전자 발현 카세트에 대한 모식도를 도 1에 도식화하였다. 박테리아 상에서 DNA로부터 전사되어 나온 mRNA 분자 위에는 리보솜과 결합할 수 있는 서열, 즉 리보솜 결합 사이트(ribosome binding site, RBS)를 가지고 있다. 이 리보솜 결합 사이트에 리보솜이 결합하게 될 때, 번역이 개시될 수 있다. 그런데, 본 발명에서는 번역이 개시되는 시점을 소위 본 발명의 '스위치-트리거 시스템'을 통해 조절하고자 하였다.
도 1의 모식도를 구체적으로 기술하면, 소위 본 발명의 스위치 서열(본 발명에서 RNA서열(a))과 트리거(Trigger) 서열(본 발명의 RNA서열(b))는 동일한 mRNA 가닥에 존재한다. 스위치 서열은 그 서열 중 일부가 RBS를 포함하는 스템 루프 구조의 형성에 참여한다. 트리거(Trigger) 서열(본 발명에서 RNA서열(b))는 동일한 mRNA의 3' 말단에 위치하는데, 바람직하게는 종결코돈 뒤에 위치하게 된다.
스템 루프 구조가 형성되어 있으면 번역이 개시되지 않는데, 온전히 전사가 종결된 mRNA의 경우 트리거 서열이 mRNA 상에 노출되고, 노출된 mRNA는 상보적 서열인 스위치 서열에 결합하여 스템 루프 구조를 해제하면서 번역이 개시되게 한다. 즉, 스위치로부터의 번역을 개시하는 트리거(Trigger) 서열은 스위치와 동일한 mRNA에 위치한다. 도 1의 a)와 같이, mRNA 3' 말단에 있는 트리거(Trigger) 서열이 완전한 전사 과정을 통해 mRNA 상에 노출되면 5'UTR의 스위치 서열과 짝을 이루어 상보적으로 결합하면서 번역을 개시(turn on)할 신호가 된다. 스위치-트리거(Trigger) 서열이 상보적으로 결합한 상태에서, 리보솜 결합 사이트에 리보솜이 결합하게 되면 번역이 정상적으로 개시되게 되고, 트리거(Trigger) 서열 앞에 위치하는 종결코돈에 의해 번역이 종결될 때, 3' 말단이 손실되지 않은 완전한 mRNA 주형으로부터 완전한 단백질을 생산할 수 있게 된다.
본 발명의 유전자 발현 카세트를 사용하면 도 1의 b)와 같이, 스위치-트리거(Trigger) 시스템을 가지고 있지 않은 mRNA의 리보솜 결합 사이트에는 리보솜이 결합하지 못해서 번역이 개시될 수 없는 것과 비교하여, 스위치-트리거(Trigger) 시스템을 가지고 있는 본 발명의 mRNA 리보솜 결합 사이트에만 리보솜이 결합되어 번역이 개시되는 것을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명에서 스위치 서열은 그 서열의 '일부'가 스템 루프 구조의 형성에 참여하는 것이 좋다. 만약 스위치 서열의 전부가 스템 루프 구조 형성에 참여하면, 트리거(Trigger) 서열이 스위치 서열에 상보적으로 결합한다 하더라도, 스템 루프 구조 형성에 참여하고 있는 결합력과 트리거(Trigger) 서열과의 결합력이 서로 같게 되어 스템 루프 구조 형성의 해소가 용이하지 않기 때문이다.
한편, 본 발명에서는 제2형태로, mRNA로 전사시 스템 루프 (stem loop) 구조를 형성할 수 있고, 상기 스템 루프 구조 내에 리보솜 결합 사이트가 위치하고 있는 DNA 분자에 있어서, 일부분 서열이 상기 스템 루프 구조 형성에 참여할 수 있도록 설계된 RNA 서열을 암호화하는 DNA서열(a); 상기 일부분 서열이 스템 루프 구조 형성에 참여할 수 있도록 설계된 RNA 서열에 상보적으로 결합하는 RNA 서열을 암호화하는 것으로, 종결코돈 뒤에 위치하는 DNA서열(b);을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자 및 이 DNA 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
제2형태에 따른 본 발명은 mRNA 수준에서 이루어지는 스위치-트리거(Trigger) 시스템을 DNA 상에서 구현한 것으로, 본 발명의 DNA는 목적 단백질의 고효율 발현을 담보하는 유전자 발현 카세트 시스템으로서의 역할을 수행하게 되고, 본 발명 제2형태에 따른 DNA 분자를 포함하는 벡터는 이 발현 시스템을 수송하는 역할을 수행하게 된다. 이러한 본 발명의 벡터로 형질전환된 박테리아는 상기 본 발명에서 기술한 바와 같이 온전한 형태의 목적 단백질을 생산할 수 있어, 고효율로 재조합 목적 단백질을 생산할 수 있게 된다.
한편, 본 발명에서는 발현의 개시 및 종결에 필요한 프로모터 및 터미네이터를 다양하게 구성할 수 있는데, 프로모터의 세기 조절에 따라 목적 단백질의 양을 조절할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 리보솜 결합 사이트 뒤, DNA서열(b) (소위 '트리거(Trigger)' 서열) 전에, 멀티플 클로닝 사이트 (mutiple cloning site)를 포함하는데, 멀티플 클로닝 사이트에는 다양한 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 전사-번역 비동조화 유전자 발현 카세트 제작]
박테리아에서 전사가 완료된 mRNA 가닥에서만 번역이 개시되도록 하는 합성 유전자 발현 카세트(ProQC 유전자 발현 카세트)를 제작하기 위해 재조합 단백질 생산에 널리 사용되는 강한 프로모터인 T7 프로모터를 사용하였다. 실시예에서 클로닝 수행시에는 모두 Mach-T1R 균주가 사용되었다.
먼저, 벡터에서 불필요한 제한 효소 자리를 제거하기 위해 pACYC_Duet 플라스미드를 주형으로 표 2의 EcoNI-PT7-NheI-TT7-F/SpeI-pACYC-R 프라이머 세트를 이용하여 클로람페니콜(Chloramphenicol) 내성 유전자(CamR)를 포함하는 벡터 구간을 증폭하였다. pACYC_Duet 플라스미드는 EcoNI과 NheI, 증폭한 PCR 산물은 EcoNI과 SpeI 제한 효소를 각각 사용하여 클로닝함으로써 기존 플라스미드의 NheI 제한 효소 서열을 제거하고, T7 프로모터와 T7 터미네이터 서열 사이에 유전자 발현 카세트가 들어갈 수 있는 클로닝 사이트가 삽입된 pACYC*를 제작하였다.
기존의 번역개시 제어를 위한 스위치, 트리거(Trigger) 시스템은 트리거(Trigger) 서열을 높은 복제수를 가지는 플라스미드, 혹은 상대적으로 강한 프로모터로부터 전사시켜 트리거(Trigger)가 존재할 때 번역 개시가 원활히 일어나도록 하였다. 그런데, 본 발명에서는 번역 개시를 위한 스위치 1개 당 트리거(Trigger) 분자 1개로 동일한 비율로 존재하기 때문에 트리거(Trigger) 분자가 많지 않은 조건에서도 번역 개시가 원활하게 일어나는지 검증하기 위해 도 2와 같이, 녹색형광단백질(sfGFP)를 리포터로 사용하여 유전자 회로를 제작하였다.
다음으로, pBR322-J23100-sfGFP 플라스미드를 주형으로 표 2의 Swit-sfGFP-F1/SpeI-SacI-sfGFP-R 프라이머 세트를 이용하여 sfGFP를 1차로 증폭한 후 BsaI-Swit-sfGFP-F2/BsaI-Trig-R2 프라이머 세트로 증폭하여 sfGFP의5' 말단에 toehold switch를, 3' 말단에 Trigger 서열을 달아주었다. pACYC* 벡터를 BsaI과 NheI 제한 효소로 자른 후 증폭 산물을 BsaI 제한 효소 서열을 사용하여 클로닝하여 txtl-Cis-sfGFP 플라스미드를, BsaI과 SpeI 제한 효소 서열을 사용하여 클로닝하여 txtl-Trans-sfGFP 플라스미드를 각각 제작하였다. 추가적으로 txtl-Trans-sfGFP 플라스미드의 유전자 발현을 위해 트리거(Trigger)를 전사시키기 위한 플라스미드를 제작하였다.
pACYC*의 T7 프로모터로부터 T7 터미네이터까지의 서열을 EcoNI과 Bsu36I 제한 효소 서열을 사용하여 pCDF_Duet 벡터에 클로닝 하여 pCDF-Term 플라스미드를 제작하였고, 표 2의 BsaI-Trigger#3-F/BsaI- Trig-R2 프라이머 세트를 이용해 증폭한 Trigger 서열을 BsaI 제한 효소로 자른 후, BsaI과 NheI 제한 효소로 자른 pCDF-Term 벡터에 클로닝 하여 pCDF-Trigger 플라스미드를 제작하였다.
상기 pCDF-Trigger 플라스미드는 세포당 약 40카피로, 세포당 약 12~15 카피인 pACYC_Duet 플라스미드보다 높은 복제수를 가지며 지속적으로 공급되기 때문에 자연적 유전자 발현 카세트로부터는 sfGFP의 전사 종결에 비의존적으로 번역이 개시된다.
[실험예 1: ProQC 유전자 발현 카세트 효율 확인]
제작된 ProQC 유전자 발현 카세트로부터의 번역개시효율을 자연적 유전자 발현 카세트와 비교하기 위해, 재조합 단백질 생산에 널리 쓰이는 Escherichia coli BL21(DE3)에 txtl-Cis-sfGFP 플라스미드와 pCDF-Term 플라스미드 쌍을, txtl-Trans-sfGFP 플라스미드와 pCDF-Trigger 플라스미드를 쌍을 각각 형질전환시켰다.
플라스미드 유지를 위해 스펙티노마이신(Spectinomycine, Spec, 50 ug/mL), 클로람페니콜(Chloramphenicol, Cam, 34 ug/mL) 항생제가 첨가된 플레이트에서 선별하였고, 형성된 콜로니를 Spec, Cam이 첨가된 액상 LB(Lysogeny broth) 배지에 접종하여 밤새 키운 뒤 UV-1700 스펙트로포토미터(Spectrophotometer)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
초기 흡광도(OD600;opticaldensityat600nm)를 0.05로 희석한 뒤 OD600=0.8에 도달할 때까지 배양한 후 0.2 mM IPTG로 인덕션시켰고, 4시간째에 세포들의 일정 부피를 수확하여 PBS 버퍼(Phosphate buffered saline)로 세척하였고, 하이덱스(Hidex)를 사용하여 486 nm/535 nm 파장의 필터로 형광을 측정하였다. 상기의 형광을 측정하는 실험은 3반복 수행되었으며 멀티플레이트 리더(multiplate reader)에서 측정된 값은 각 샘플의 OD600으로 나눠 줌으로써 세포 당 형광으로 전환하였다.
그 결과, 도 3과 같이, 자연적 유전자 발현 시스템에서의 형광을 1로 놓았을 때 상대적 형광은 ProQC 유전자 발현카세트(ProQC-sfGFP)에서의 번역개시 효율이 자연적 유전자 발현 시스템(ProNC-sfGFP)과 거의 유사하게 나타났다.
[실험예 2: mRNA의 스위치와 트리거(Trigger) 서열의 분자 내, 분자 간 상호작용 측정을 위한 유전자 회로 제작 및 mRNA 분자 내 , 분자 간 상호작용 측정]
세포 내부는 다양한 분자들이 존재하여, 특히 강한 세기를 가지는 T7 프로모터로부터 많은 mRNA가 전사되면 다른 mRNA의 3’말단의 트리거(Trigger)에 의한 분자 간 상호작용에 의해 트리거(Trigger)가 없는 mRNA가닥의 스위치로부터도 번역이 개시될 수 있다.
전사가 종결되는 시점에 노출되는 3’말단의 트리거(Trigger)에 의해 번역이 개시되도록 제어함으로써, 손상되지 않은 완전한 길이의 mRNA로부터 번역이 개시되도록 하는 시스템이 충족되기 위해서는 mRNA 분자 간 상호작용보다 동일 mRNA 분자 내 상호작용이 우세해야 한다.
따라서, 이를 검증하기 위해 동일한 스위치에 서로 다른 리포터 단백질을 도입하되, 하나의 리포터 단백질의 mRNA에는 트리거(Trigger)를 제외함으로써 해당 mRNA만으로는 번역이 개시되지 않는 유전자 회로를 설계, 제작하였다.
기존의 mCherry서열은 아미노말단에 의도치 않은 번역개시 서열이 존재하므로 온전히 스위치의 제어를 받도록 하기 위해, 상기 번역개시 서열을 제거하고자 했고, pET28a-mCherry 플라스미드를 주형으로 표 2의 BsaI-Trc-mcherry-F/SpeI-mCherry-R 프라이머 세트를 이용해 N 말단의 8개 아미노산 서열을 제외하고 mCherry 유전자를 증폭한 뒤 BsaI과 SpeI (벡터는 BsaI과 NheI 제한 효소를 사용함) 제한 효소 서열을 사용하여 pACYC*벡터에 삽입한 뒤, 다시 EcoNI과 Bsu36I 제한 효소 서열을 사용하여 T7 프로모터로부터 T7 터미네이터까지의 서열을 pCDF_Duet 벡터에 클로닝함으로써 스위치의 제어는 받지만 트리거(Trigger)가 없는 mRNA가 전사되도록 하는 유전자 회로를 제작하였다(도 4).
다음으로, BL21(DE3)를 txtl-Cis-sfGFP와 pCDF-txtl-Trans-mCherry 플라스미드로 형질전환 후 세포의 GFP와 mCherry 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 5와 같이, mRNA 분자 간 상호작용에 의해 txtl-Cis-sfGFP의 3’말단 트리거(Trigger) 서열이 pCDF-txtl-Trans-mCherry의 스위치로부터 번역개시를 일으키는 비율은 6.3%, mRNA 분자 내 상호작용에 의해 스위치로부터 번역개시를 일으키는 비율은 93.7%로 나타났다. 즉, 동일한 스위치가 서로 다른 mRNA 가닥에 있더라도 동일 mRNA 가닥에 트리거(Trigger)가 있는, 분자 내 상호작용에 의한 번역 개시 효율이 우세하였다.
[실험예 3: ProQC 유전자 발현 카세트로부터 생산된 단백질 품질 비교]
긴 단백질을 코딩하고 있는 긴 mRNA는 전사 도중 손상될 위험이 높으므로, 상기 실시예 1에서 제작한 ProQC 유전자 발현 카세트를 사용할 때 긴 단백질의 생산성이 향상되는지를 확인하고자 하였다.
모델시스템으로서 4581bp 길이의 mCherry, lacZ, sfGFP (MLG) 융합단백질을 제작하기 위해 먼저, pET28a 플라스미드를 주형으로 표 2의 BsaI-Trc-mcherry-F/KpnI-Lnk-M-R/Lnk-M-R 프라이머 세트를 이용하여 mCherry의 종결코돈을 제거하고 링커(linker)를 부착한 증폭 산물 BL21(DE3), 크로모좀을 주형으로 KpnI-lacZ-F/BsaI-lacZ-R 프라이머 세트를 이용하여 개시코돈 및 종결코돈이 제거된 lacZ 유전자 증폭 산물, pBR322-J23100-sfGFP 플라스미드를 주형으로 BsaI-Lnk-sfGFP-F/SpeI-sfGFP-R 프라이머 세트를 이용하여 아미노 말단에 링커(linker)를 부착한 sfGFP 유전자 증폭 산물을 준비하였다. 상기의 증폭 산물 3가지는 각각 mCherry는 BsaI과 KpnI 제한 효소, lacZ는 KpnI과BsaI 제한 효소, sfGFP는 BsaI과 SpeI 제한 효소로 잘라준 뒤 정제하여 하나의 튜브에서 라이게이션 시킨 뒤 최종적으로 BsaI-Trc-mcherry-F/SpeI-sfGFP-R 프라이머 세트로 증폭하여 3개의 유전자가 순서대로 연결된 가닥을 증폭한 뒤 TA 클로닝을 수행하였다.
pMD19-MLG 플라스미드를 주형으로 BsaI-his-M-F/SpeI-SacI-sfGFP-R 프라이머 세트를 이용하여 MLG를 증폭한 후, txtl-Cis-sfGFP 플라스미드를 주형으로 BsaI-Swit#3-R/SpeI-Trig-F 프라이머 세트를 이용하여 벡터 서열을 증폭한 뒤 BsaI과 SpeI 제한 효소 서열을 사용하여 클로닝하여 txtl-Cis-MLG_NH 플라스미드를, BsaI과 NheI 제한 효소 서열을 사용하여 클로닝하여 txtl-Trans-MLG_NH 플라스미드를 각각 제작하였다(도 6).
상기 과정을 통해 제작된 mCherry, lacZ, sfGFP (MLG) 융합단백질은 아미노 말단 (5’말단)에 mCherry 형광 단백질을, 카르복시 말단 (3’말단)에 sfGFP 형광단백질을 가지고 있기 때문에 개별 세포의 mCherry, sfGFP 형광의 비율을 측정하면 세포내 생산된 긴 단백질의 양 말단이 손실되었는지 확인할 수 있다.
다음으로, 세포에서 방출하는 두 종류의 형광을 분자 수로 환산하기 위해 단위 형광을 계산하고자 하였고, 이를 위해 sfGFP 유전자의 경우에는, txtl-Trans-sfGFP 플라스미드를 주형으로 표 2의 Duet-F/His-G-R 프라이머 세트로 증폭하여 sfGFP의 카르복시 말단에 6개의 반복된 히스티딘 태그(6XHis)를 달아준 뒤 EcoNI과 SacI 제한 효소 서열을 사용하여 pACYC* 벡터에 클로닝함으로써 txtl-Trans-sfGFP_CH 플라스미드를 제작하였다. mCherry 유전자의 경우에는, pCDF-txtl-Trans-mCherry 플라스미드를 주형으로 표 2의 Duet-F/His-M-R 프라이머 세트로 증폭하여 mCherry의 카르복시 말단에 히스티딘 태그(6XHis)를 달아준 뒤 EcoNI과 SacI 제한 효소 서열을 사용하여 pACYC* 벡터에 클로닝함으로써 txtl-Trans-mCherry_CH 플라스미드를 제작하였다.
또한, 형광단백질의 질량당 형광을 계산하기 위해 txtl-Trans-sfGFP 플라스미드와 pCDF-Trigger 플라스미 쌍을 BL21(DE3)에 형질전환시킨 Unit-sfGFP, txtl-Trans-mCherry-CH 플라스미드와 pCDF-Trigger 플라스미드 쌍을 BL21(DE3)에 형질전환시킨 Unit-mCherry를 제작하였다. Unit-sfGFP와 Unit-mCherry를 상기 실험예 1에서 수행한 대로 형광단백질을 발현시켜 4시간 후 세포를 수확하였다. 수확한 세포로부터 히스티딘 태그를 활용한 단백질 정제 방법인 Ni-NTA 정제를 수행하여 sfGFP, mCherry 각각을 정제한 후 단백질 양과 형광세기와의 상관관계를 도출하였다. 이 때, 단백질 양은 브래드포드 어세이(Bradford assay)를 수행하여 측정하였으며 형광은 다양한 비율로 PBS 버퍼로 희석시킨 정제된 시료의 형광을 측정하여 sfGFP, mCherry 각각의 단백질 양과 형광 세기에 관한 식을 세웠다(하이덱스(Hidex)로 측정하는 경우 그람 단백질당 형광 세기에 관한 수식을 세움).
다음으로, BL21(DE3)가 가지고 있는 lacZ가 MLG 융합단백질과 같이 정제되거나 결합하는 것을 방지하기 위해 크로모좀에서 lacZ 유전자를 제거시키고자 했고, 이 때, 유전자 제거는 전통적으로 사용되는 상동성을 이용한 유전자 재조합 방법을 사용하였다.
이를 위해 pFRT72 플라스미드를 주형으로 표 2의 lacZ-Del-F1/lacZ-Del-R1/lacZ-Del-F2/lacZ-Del-R2 프라이머 세트를 이용해 FRT- Kan-FRT 증폭한 후 DpnI 제한 효소를 처리하여 주형 플라스미드를 제거하였다. 상기 증폭 산물은 PCR 정제 및 에탄올 농축을 수행하여 재조합 효소를 발현시켜 둔 BL21(DE3)/pKD46 균주를 형질전환시켰다. 그리고, FRT-Kan-FRT 서열이 lacZ 유전자를 대체하여 삽입된 것을 lacZ-check-F/lacZ-check-R 프라이머 세트로 콜로니 PCR을 수행하여 확인한 뒤, pCP20 플라스미드로 형질전환시켰고, FLP 재조합효소를 발현시켜 카나마이신(Kanamycin) 내성 유전자(KanR)를 제거하여 BL21(DE3)△lacZ 균주를 제작하였다.
상기 BL21(DE3)△lacZ에 txtl-Cis-MLG/pCDF-Term 플라스미드 쌍을 형질전환 시켜 ProQC-MLG 균주를, txtl-Trans-MLG/pCDF-Trigger 플라스미드 쌍을 형질전환시켜 ProNC-MLG 균주를 제작하였다.
상기 ProQC-MLG, ProNC-MLG 균주를 Spec, Cam 항생제가 들어있는 LB(Lysogeny broth) 배지에서 밤새 배양한 후 OD600=0.05로 희석하여 OD600=0.8에 도달하였을 때 0.2 mM IPTG로 인덕션하여 재조합 단백질이 발현되도록 하였다. 4시간 후 세포의 sfGFP, mCherry 각각의 형광을 측정하여 단위 형광으로 나누어 세포 내 MLG 융합단백질의 아미노 말단, 카르복시 말단의 양으로 환산한 후, 각 시스템에서의 mCherry 양으로 표준화 시킨 값을 보면 도 7의 a)와 같이, ProQC 유전자 발현 카세트에서 카르복시 말단 (sfGFP)까지 포함하는 완전한 길이의 단백질의 비율이 자연적 유전자 발현 카세트와 비교할 시 훨씬 높은 것을 확인하였다.
또한, ProQC-MLG와 ProNC-MLG에서의 단위 세포의 융합 단백질 생산성을 확인하기 위해, 카르복시 말단 (sfGFP)까지 포함하는 완전한 길이의 단백질의 발현량을 확인한 결과, 도 7의 b)와 같이, ProNC-MLG의 발현량을 1로 표준화하였을 때, 개별 세포에서의 완전한 길이의 MLG 융합단백질의 양 또한 ProQC 유전자 발현 카세트를 적용하였을 때 ProNC-MLG에 비해 1.7배 많은 것을 확인하였다.
다음으로, 실제 세포 내에서 생산된 MLG 융합단백질의 길이 분포를 확인하기 위해, ProQC-MLG와 ProNC-MLG 각 균주로부터 발현된 MLG 융합단백질을 Ni-NTA 방법을 통해 아미노 말단의 6X 히스티딘 태그를 이용하여 정제하였다. 아미노 말단의 태그를 사용하면 해당 발현 카세트에서 합성된 펩티드를 구분 없이 회수할 수 있으며, 이때 조기종결 되거나, mRNA의 분해로 인해 종결코돈까지 번역이 진행되지 못한 펩티드들도 같이 정제된다. 해당 실험군의 대조군으로는 BL21(DE3)△lacZ에 txtl-Cis-MLF_ CH 플라스미드를 형질전환시킨 후 카르복시 말단의 히스티딘 태그로 정제하며, 말단까지 완전히 번역이 진행된 MLG 융합단백질을 정제하였고, Full-length로 표기하였다.
SDS-PAGE 젤에서의 구분을 위해 ProQC, ProNC에서 정제된 단백질은 브래드포드 어세이(Bradford assay)를 통해 농도를 측정하여 동일한 양의 단백질을 한 칸에 주입하였다. 단백질의 SDS-PAGE 결과, 도 8과 같이, ProQC로부터 정제한 단백질이 ProNC로부터 정제한 단백질에 비해 상대적으로 완전한 길이의 단백질이 많고, 짧아진 단백질의 양이 적음을 알 수 있고, 이는 Full-length와 비교할 시 뚜렷하게 구분되었다.
한편, 상기 실시예 및 실험예에서 사용된 서열, 균주, 플라스미드 및 프라이머 서열을 하기 표 1 내지 3에 기재하였다.
사용한 균주 및 플라스미드
균주이름 관련특징 출처
Mach-T1R E. coliF- 80(lacZ)ΔM15 ΔlacX74 hsdR(rK-mK+)ΔrecA1398 endA1 tonA Invitrogen
BL21(DE3) E. colistr. B F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) 선행연구
BL21(DE3)△lacZ BL21(DE3)△lacZ 본발명
BL21(DE3)-NC BL21(DE3)/pACYC_Duet/pCDF-Term 본발명
ProQC-sfGFP BL21(DE3)/txtl-Cis-sfGFP/ pCDF-Term 본발명
ProNC-sfGFP BL21(DE3)/txtl-Trans-sfGFP/ pCDF-Trigger 본발명
ProIntra BL21(DE3)/txtl-Cis-sfGFP/pCDF-txtl-Trans-mCherry 본발명
Unit-sfGFP BL21(DE3)/txtl-Trans-sfGFP_NH/ pCDF-Trigger 본발명
Unit-mCherry BL21(DE3)/txtl-Trans-mCherry_NH/ pCDF-Trigger 본발명
BL21(DE3)△lacZ-NC BL21(DE3)△lacZ/pACYC_Duet/pCDF-Term 본발명
ProQC-MLG BL21(DE3)△lacZ/txtl-Cis-MLG_NH/ pCDF-Term 본발명
ProNC-MLG BL21(DE3)△lacZ/txtl-Trans-MLG_NH/ pCDF-Trigger 본발명
플라스미드이름 관련특징 출처
pACYC_Duet Expression vector, CmR,p15Aori Novagen
pACYC* pACYC_Duet△NheI/PT7-BsaI-NheI-TT7 본발명
pCDF_Duet Expression vector, SmR,cloDF13ori Novagen
pBR322-J23100-sfGFP pBR322/BBaJ23100-UTR-sfGFP 선행연구
pET28a-mCherry pET28a-BBaJ23100-UTR-mCherry 선행연구
pMD19 TA cloning vector TaKaRa
txtl-Cis-sfGFP pACYC*/PT7-Switch#3-sfGFP-Trigger-TT7 본발명
txtl-Trans-sfGFP pACYC*/PT7-Switch#3-sfGFP-TT7 본발명
pCDF-Term pCDF_Duet/PT7-BsaI-NheI-TT7 본발명
pCDF-Trigger pCDF_Duet/PT7-Trigger-TT7 본발명
pCDF-txtl-Trans-mCherry pCDF_Duet/PT7-Switch#3-mCherryTrc-TT7 본발명
txtl-Trans-sfGFP_CH pACYC*/PT7-Switch#3-sfGFP_6XHis-TT7 본발명
txtl-Trans-mCherry_CH pACYC*/PT7-Switch#3-mCherryTrc_6XHis-TT7 본발명
pMD19-MLG pMD19/PT7-Switch#3-mCherryTrc_lacZ_sfGFP-Trigger-TT7 본발명
txtl-Cis-MLG_NH pACYC*/PT7-Switch#3-6XHis_mCherryTrc_lacZ_sfGFP-Trigger-TT7 본발명
txtl-Trans-MLG_NH pACYC*/PT7-Switch#3-6XHis_MLG-TT7 본발명
txtl-Cis-MLG_CH pACYC*/PT7-Switch#3-MLG_6XHis-Trigger-TT7 본발명
txtl-Trans-MLG_CH pACYC*/PT7-Switch#3-MLG_6XHis-TT7 본발명
pKD46 Red recombinase expression vector, AmpR 선행연구
pFRT72 pGEM-FRT-Kan-FRT variant 선행연구
pCP20 FLP recombinase expression vecotor, AmpR,CmR 선행연구
사용한 프라이머 서열
프라이머이름 서열
EcoNI-PT7-NheI-TT7-F ACTCCTGCATTAGGAAATTAATACGACTCACTATAggagaccCGCAGCGcTAGCATAACCCCTTGGGGC
SpeI-pACYC-R ACCACTAGTGCTGATGTCCGGCG
BsaI-Swit-sfGFP-F2 cccGGTCTCCTATAGGGATCTATTACTACTTACCATTGTCTTGCTCTATacagaaacagaggagatATAGAatgAGACAATGGAACCTGGCGGCAGCGCAAAAG
Swit-sfGFP-F1 AGGAGATATAGAATGAGACAATGGAACCTGGCGGCAGCGCAAAAGGCTAGCAAGGGCGAGGAGC
SpeI-SacI-sfGFP-R GGGACATCGGAATGTCCCATCAGACTAGTCAATACGATTACTTTCTGTGAGCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC
BsaI-Trig-R2 TATggtctctCTAgCTTATCTATTACTACTTACCATTGTCTTGCTCTTATTGATGGGACATCGGAATGTCCCATC
BsaI-Trigger#3-F cccGGTCTCCTATAGGGTGATGGGACATTCCGATGTCC
BsaI-Trc-mcherry-F ACAGGTCTCTCTAGCGCTATCATTAAAGAGTTCATGCG
SpeI-mCherry-R CAGACTAGTCAATACGATTACTTTCTGTGAGCTCATTTGTACAGCTCATCCATGC
Duet-F CGGGATCTCGACGCTCTCC
His-G-R TGTACTAGTGAGCTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
His-M-R TGTACTAGTGAGCTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGTTTGTACAGCTCATCCATG
lacZ-Del-F1 GCCGTTCGACGATTCTCCATATGGGAGTACTCGCGGTTGACTGAG
lacZ-Del-R1 CTAGCAAGAATCATATGGAGAGCGAGTGCTGGAGCGAACTGCGAAG
lacZ-Del-F2 GCAGACATGGCCTGCCCGGTTATTATTATTTTTGACACCAGAGCCGTTCGACGATTCTCCATATG
lacZ-Del-R2 GGCTCGTATGTTGTGTGAAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACACTAGCAAGAATCATATGGAGAGCG
lacZ-check-F TCACTTTTGCTGATATGGTTGATGTC
lacZ-check-R CGACTGGAAAGCGGGCAGTGAG
KpnI-Lnk-M-R ACGGTCTCCATGGTACCAGCACTACCAGCAC
Lnk-M-R CTTGCTAGCACCAGCACTACCAGCACTACCAGCACTATCTTTGTACAGCTCATCCATG
KpnI-lacZ-F AGTGGTCTCACCATGATTACGGATTCACTG
BsaI-lacZ-R ACCGGTCTCTGAATCTTTTTGACACCAGACCAAC
BsaI-Lnk-sfGFP-F AGCGGTCTCGATTCAGCAGGCTCAGCAGGCTCAGCAGGCGCTAGCAAGGGCGAGG
SpeI-sfGFP-R CAGACTAGTCAATACGATTACTTTCTGTGAGCTC
BsaI-Swit#3-R ATTGGTCTCTCTAGCCTTTTGCGCTGCCGCCAGG
SpeI-Trig-F TGACTAGTCTGATGGGACATTCCGATGTCCCATCAATAAGAGCAAGACAATGGTAAGTAG
BsaI-his-M-F AAGGGTCTCACTAGCCATCACCATCACCATCACGCTATCATTAAAGAGTTCATGCG
사용한 toehold switch 및 유전자 서열
Toehold switch 비고
switch#3 (DNA서열) 서열번호1
switch#3 (RNA서열) 서열번호2
Trigger#3 (DNA서열) 서열번호3
Trigger#3 (RNA서열) 서열번호4
유전자 비고
mCherryTrc 서열번호5
sfGFP 서열번호6
mcherry_lacZ_sfGFP 서열번호7

Claims (6)

  1. mRNA로 전사시 스템 루프 (stem loop) 구조를 형성할 수 있고, 상기 스템 루프 구조 내에 리보솜 결합 사이트가 위치하고 있는 DNA 분자에 있어서,
    일부분 서열이 상기 스템 루프 구조 형성에 참여할 수 있도록 설계된 RNA 서열을 암호화하는 DNA서열(a);
    상기 일부분 서열이 스템 루프 구조 형성에 참여할 수 있도록 설계된 RNA 서열에 상보적으로 결합하는 RNA 서열을 암호화하는 것으로, 종결코돈 뒤에 위치하는 DNA서열(b);을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 분자는,
    리보솜 결합 사이트 뒤, DNA서열(b) 전에,
    멀티플 클로닝 사이트 (mutiple cloning site)를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  3. 제1항의 DNA 분자를 포함하는 벡터.
  4. 스템 루프 (stem loop) 구조를 형성하고, 스템 루프 구조 내에 리보솜 결합 사이트가 위치한 mRNA에 있어서,
    일부분 서열이 상기 스템 루프 구조에 참여하고 있는 RNA서열(a);
    상기 RNA서열(a)에 결합할 수 있는 상보적 서열로 구성되어 있는 것으로, 종결코돈 뒤에 위치하는 RNA서열(b);을 포함하는 것을 특징으로 하는 mRNA.
  5. 제4항에 있어서 ,
    상기 mRNA는,
    RNA서열(b)가 RNA서열(a)에 결합하면, 스템 루프 구조가 풀리면서 번역이 개시되는 것을 특징으로 하는 mRNA.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 번역 개시는,
    리보솜이 리보솜 결합 사이트에 결합함으로써 개시되는 것을 특징으로 하는 mRNA.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000057704A (ko) * 1996-12-19 2000-09-25 유니버시티 오브 메디신 앤드 댄티스트리 오브 뉴저지 박테리아에서 단백질 발현을 억제하는 방법과 제조물
KR100454533B1 (ko) * 1998-12-31 2004-11-05 주식회사 바이로메드 전사 조절부위로서 이종 유전자의 프로모터와 원래 유전자시작 코돈의 상부에 위치한 모든 5' 비해독 부위를 갖는고효율 동물세포 발현벡터
KR101032871B1 (ko) * 2009-07-10 2011-05-06 주식회사 바이오드 비엠피-2와 에이치에스브이-티케이 자살유전자를 동시에 포함하고 발현 할 수 있도록 하는 벡터와 이 벡터가 도입된 자가조절형 줄기세포 치료제
KR101349070B1 (ko) * 2011-06-20 2014-01-08 한국생명공학연구원 외래 유전자 강제 발현 벡터

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