JPH0669369B2 - 安定化された組換えｄｎａ宿主細胞 - Google Patents

安定化された組換えｄｎａ宿主細胞

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JPH0669369B2
JPH0669369B2 JP4320470A JP32047092A JPH0669369B2 JP H0669369 B2 JPH0669369 B2 JP H0669369B2 JP 4320470 A JP4320470 A JP 4320470A JP 32047092 A JP32047092 A JP 32047092A JP H0669369 B2 JPH0669369 B2 JP H0669369B2
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、機能的ポリペプチドを発現する
組換えＤＮＡを含有する宿主細胞に関し、更に詳しく
は、 i)機能的なポリペプチドを発現する遺伝子、 ii)バクテリオファージλcＩ８５７のcＩリプレッサー
遺伝子、および iii)該リプレッサー遺伝子によって発現されるリプレッ
サーに感受性を有さない複製起点（レプリコン）および
プロモーターを含有する組換えＤＮＡクローニングベク
ターで形質転換され、プロファージとして染色体に組み
込まれた、cＩリプレッサー遺伝子を産生しないバクテ
リオファージλcＩ９０を保持している細菌宿主細胞を
提供するものである。
【０００２】本発明は組換えＤＮＡクローニングベクタ
ー上に担持せしめた遺伝子によって抑制される致死性染
色体マーカーを使用することにより、組換えＤＮＡ宿主
細胞を安定化し、選択する手段を与える、選択系(シス
テム)を提供するものである。このことは、プラスミド
のような組換えＤＮＡクローニングベクターが時折細菌
集団から急激に消失すること、および工場規模の発酵生
産では１０16以上の細胞が必要とされることから、特に
重要である。それ故、所望の生産物をコードする組換え
ＤＮＡをプラスミドに挿入した場合には、必須要件では
ないにしても、培養物を構成する細胞の全てが所望のプ
ラスミドを含むように、該プラスミドを含有する微生物
培養物が安定化されることが望ましい。このことは、外
来ＤＮＡを含有する組換えプラスミドが周知のように不
安定であり、一夜培養後の細胞母集団中、９０％以上が
組換えプラスミドを含まなくなることもあるので、重大
である。プラスミドを保持している細胞のみが所望の遺
伝子を発現し得ることから、生産能力が極端に低下する
結果となる。
【０００３】組換えプラスミドの安定化法は殆んど文献
に記されておらず、また、いずれも極めて不都合な点を
有している。その一例は、抗生物質耐性遺伝子を組換え
プラスミドに包含させておき、適当な抗生物質を培養培
地中に加えることから成る。抗生物質耐性遺伝子含有プ
ラスミドを保持する細胞は選択され、該プラスミドを保
持しない細胞は選択されず、従って排除される。この方
法の主な欠点は、抗生物質耐性菌の生産規模の増殖、発
酵培地中での高価な抗生物質の使用、並びに所望の生産
物から抗生物質を除去するための精製工程を必要とする
点にある。
【０００４】染色体の栄養要求突然変異を補う方法も、
既知の組換えプラスミド安定化法の一つである。この方
法では発酵培地の組成を厳しく制限して宿主細菌が必要
とする栄養を培地に加えずに発酵を行う必要がある。し
かも、栄養共生によって、プラスミドの消失後もなお細
胞が増殖し得る可能性がある。このように、これら２つ
の選択方法は培地の特殊な処理に依存している。そのよ
うな制約は、発酵工程の費用の増大、および生産性向上
のためにとり得る選択自由度の制限を招く。
【０００５】従って、培地組成に依存せず、あらゆる発
酵条件下で組換えＤＮＡクローニングベクターを維持し
得る、他の選択方法が強く望まれている。細胞の自己不
活化(suicide)がこの必要性を満たすために適応でき
る。即ち、染色体に致死性マーカーを有し、組換えＤＮ
Ａクローニングベクターにリプレッサーもしくは相補遺
伝子を有する自己不活化細胞を構築することができる。
これらの内容を組み込まれた細胞は、そのベクターを失
った場合死滅することになろう。本発明はこの原則を具
現化し、培地中の全生存細胞が所望の組換えＤＮＡクロ
ーニングベクターを担持することを保証するものであ
る。このことは、上記のどの欠点をも持たずに、培養の
潜在的生産性を高めることができることを意味してお
り、極めて重要である。本明細書に述べるように、本発
明はプラスミド含有細菌集団を、プラスミドに担持され
ている遺伝子によって抑制される致死性染色体マーカー
を用いて選択し、維持する方法に関するものである。
【０００６】本発明の目的のために、本明細書中、組換
えＤＮＡクローニングベクターとは、組換えプラスミド
に限らず、バクテリオファージ、ウイルスなど、１もし
くはそれ以上の付加的ＤＮＡセグメントを付加すること
ができる、あるいは既に付加されているＤＮＡ分子から
成る物質を指すものとする。本明細書中、リプレッサー
とは、組換えＤＮＡクローニングベクター上にあって、
宿主細胞の染色体中の致死性遺伝子あるいは条件付致死
性遺伝子の発現を抑制もしくは妨げる遺伝子をいう。
【０００７】本明細書中、機能なポリペプチドとは、回
収可能で生物学的に活性な、完全に異種の(ヘテロロー
ガスな)ポリペプチドもしくは前駆体、異種ポリペプチ
ドと同種(ホモローガス)ポリペプチドの一部もしくは全
部から成る回収可能で生物学的に活性なポリペプチド、
または異種ポリペプチドと特異的に切断され得る生物学
的に非活性な同種ポリペプチドとから成る回収可能な生
物学的に非活性な融合ポリペプチドを意味する。
【０００８】本明細書中、融合遺伝子生成物とは、同種
ポリペプチドの一部もしくは全部と融合している、回収
可能な異種ポリペプチドを意味する。本明細書中、マー
カーとは、その機能と染色体もしくは組換えＤＮＡクロ
ーニングベクター上の位置が分かっている遺伝子または
遺伝子の組合せを意味する。上記のように、本発明は組
換えＤＮＡにコードされている生成物を産生する培養物
の培養に用いることができる。効果的な選択システムが
ない場合には、培養物中の多くの細胞が所望のプラスミ
ドを失ってしまい、その結果、所望の生産物の生産が著
しく低下する。本発明は培養物中の全生存細胞が組換え
ＤＮＡクローニングベクターを保持することを保証する
ので、本発明を利用すれば、培養物の潜在的な生産能が
増強される。
【０００９】本発明は、合成が組換えＤＮＡクローニン
グベクターによって決まるあらゆる物質の生産に適用で
きるので、極めて多様性に富んでいる。好ましい組換え
ＤＮＡクローニングベクターはプラスミドであるが、バ
クテリオファージおよび本発明を例示するのに有用な他
のベクターも当業者には明白であろう。本発明の有用性
はクローニングベクター上にクローニングされた他のマ
ーカーとは無関係なので、商業上あるいは研究的に価値
のある１以上の遺伝子を保持する組換え菌株にも本発明
を利用することができる。
【００１０】バクテリオファージλと大腸菌(Ｅ.coli)
Ｋ１２との相互作用を例にとり、組換えＤＮＡ宿主細胞
の維持および安定化における細胞自己不活化の適用性を
説明する。バクテリオファージλはテンペレートバクテ
リオファージであり、大腸菌Ｋ１２に感染した場合、排
他的な２サイクルのいずれかをとる。溶菌段階では、バ
クテリオファージＤＮＡは自律的に複製し、バクテリオ
ファージ要素の合成と組み立てを指示して細胞を死滅さ
せると同時に成熟したバクテリオファージを放出する。
溶原化段階では、バクテリオファージはプロファージと
して宿主染色体中に集積され、染色体上でマーカーとし
て複製し、バクテリオファージ要素の合成を遮断する。
バクテリオファージ遺伝子λcＩは、溶原化状態を維持
するリプレッサーをコードしており、遺伝子がバクテリ
オファージ要素を発現し、成熟することを阻害する。も
しリプレッサーが不活化されるか細胞から除去される場
合には、プロファージは染色体から遊離して溶菌サイク
ルに入り、細胞を死滅させる。欠損λcＩ遺伝子をもつ
バクテリオファージは溶原化状態を維持することができ
ず、機能的なリプレッサーが他の供給源から供給されな
い限り、細胞を死に至らしめる。本発明の一実施態様で
は、例示するリプレッサー依存プロファージとしてλc
Ｉ９０（Ｋaiser,Ａ.Ｄ.（１９５７），Ｖirology ３：
４２−６１；Ｂerg,Ｄ.Ｅ.（１９７４），Ｖirology ６
２：２２４−２３３）を用い、組換えＤＮＡクローニン
グベクター中にクローニングされたcＩ遺伝子が機能な
リプレッサーとして働く。
【００１１】本発明の選択システムおよびその有用性
は、バクテリオファージ・ラムダのλcＩ８５７のリプ
レッサー遺伝子をインシュリン・プラスミドpＩＡ２Ａ
７△４△１およびpＩＢ７△４△１上にクローニングす
ることで示すことができる。プラスミドpＰＲ１は、バ
クテリオファージλcＩ８５７の２.５ＫbＢglIIフラグ
メントをプラスミドpＩＡ７△４△１のユニークＢamＨ
Ｉ制限部位に挿入することにより構築された。pＩＡ７
△４△１の制限部位と機能地図を添付の図１に示す。以
下に説明するように、pＩＡ７△４△１は大腸菌のトリ
プトファン・プロモーター、抗生物質耐性マーカー、お
よびヒト・インシュリンのＡポリペプチド鎖と融合した
trpＥ蛋白の一部からなる融合遺伝子生産物を発現する
遺伝子を含有している。
【００１２】プラスミドpＩＡ７△４△１はpＢＲ３２２
から誘導されたものであり、実施例１Ａ−Iに開示した
方法で構築される。約束として、記号「△」は欠失を意
味する。例えば、「△ＥcoＲＩ−ＸbaＩ」を有するプラ
スミドは、ＥcoＲＩとＸbaＩの制限酵素切断部位間のヌ
クレオチド配列部分が、これらの酵素で消化されて除か
れていることを意味する。便宜上、ある欠失部分を数字
で表示している。従って、親プラスミドpＢＲ３２２に
おけるテトラサイクリン耐性に係る遺伝子に先行するＥ
coＲＩ認識部位の最初の塩基対(「bp」)から始めて、
「△１」は１−３０bpの欠失(即ち、△ＥcoＲＩ−Ｈind
III)を意味し、結果としてテトラサイクリン・プロモー
ター／オペレーター系が無能力になっていることを意味
する。「△２」は１−３７５bpの欠失(即ち、△ＥcoＲ
Ｉ−ＢamＨＩ)を意味し、結果として、テトラサイクリ
ンのプロモーター／オペレーターと、テトラサイクリン
耐性をコードしている構造遺伝子の一部との双方が除去
されていることを意味する。「△４」はtrpオペロン断
片の〜９００−〜１５００bpが欠失しており、trpＤポ
リペプチドの構造遺伝子が除去されていることを意味す
る。
【００１３】バクテリオファージ・ラムダのλcＩ８５
７のcＩリプレッサー遺伝子をプラスミドpＩＡ７△４△
１にクローニングすると、pＰＲ１と呼ぶ新しいプラス
ミドが生成し、これはバクテリオファージ・ラムダの溶
菌性の発展を阻害すると同時に、上記融合遺伝子生産物
の生産物をもコードしている。pＰＲ１の制限部位と機
能地図を添付の図２に示す。図中、ＢglII−ＢamＨＩ結
合(ライゲーション)部位は記号「[Ｂ／Ｂ]」で表されて
いる。この新しいpＰＲ１組換えプラスミドで、例えば
大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８[マウエルら(Ｍauer)、Ｊ.Ｍo
l.Ｂiol.、１３９：１４７−１６１(１９８０)]、大腸
菌Ｋ１２Ｃ６００[バッハマン(Ｂachman)，Ｂacteriol.
Ｒev．３６，５２６−５５７(１９７２)]および大腸菌
Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−[チャン(Ｃhang)およびコー
エン(Ｃohen)，Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci．７１，１０３
０−１０３４(１９７４)]を形質転換し、得られた株を
バクテリオファージλcＩ９０で溶原化することができ
る。λcＩ９０は機能的なcＩ、リプレッサーを産生しな
いので、構築された菌株、大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８λc
Ｉ９０／pＰＲ１、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００λcＩ９０／p
ＰＲ１および大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−λcＩ９
０／pＰＲ１はpＰＲ１プラスミドを保持しなければなら
ないが、構築された菌株大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８／pＰ
Ｒ１、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００／pＰＲ１および大腸菌Ｋ
１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−／pＰＲ１はプラスミドなしで
も同様によく生存する。これら菌株中のプラスミド保持
について比較すると、本発明の菌株については、実質
上,全ての生存細胞が明らかに所望のプラスミドを保持
している。更に、大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８λcＩ９０／p
ＰＲ１、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００λcＩ９０／pＰＲ１およ
び大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk-Ｍk−λcＩ９０／pＰＲ１
の各菌株はpＰＲ１プラスミドをも保持し、所望の融合
遺伝子生産物(ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法に
より検出できる)を産生するであろう。
【００１４】プラスミドpＰＲ３はバクテリオファージ
λcＩ８５７の２.５kbＢglIIフラグメントをプラスミド
pＩＢ７△４△１のユニークＢamＨＩ制限部位に挿入す
ることにより構築された。pＩＢ７△４△１の制限部位
と機能地図を添付の図３に示す。以下に説明するよう
に、pＩＢ７△４△１はヒトインシュリンのＢポリペプ
チド鎖と融合したtrpＥ蛋白の一部からなる融合遺伝子
生産物を発現する遺伝子を含有している。プラスミドp
ＩＢ７△４△１はpＩＡ７△４△１について記載した方
法と同様の方法でpＢＲ３２２から誘導される。詳細な
構築法は、実施例９に示されている。
【００１５】バクテリオファージ・ラムダλcＩ８５７
のcＩリプレッサー遺伝子をpＩＢ７△４△１にクローニ
ングすると、新規プラスミドpＰＲ３が得られる。この
プラスミドはバクテリオファージ・ラムダの溶解的増殖
を阻止すると同時に上記融合遺伝子生産物の生産物をも
コードしている。pＰＲ３の制限部位と機能地図を添付
の図４に示す。図中、ＢglII−ＢamＨＩ結合部位は記号
「[Ｂ／Ｂ]」で表されている。
【００１６】この新しいpＰＲ３組換えプラスミドで、
例えば大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８、大腸菌Ｋ１２Ｃ６０
０、および大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−を形質転換
体し、得られた菌株をバクテリオファージλcＩ９０で
溶原化することができる。溶原化pＰＲ１含有菌株につ
いて既に記載したように、構築された菌株大腸菌Ｋ１２
ＲＶ３０８λcＩ９０／pＰＲ３、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００
λcＩ９０／pＰＲ３および大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−
Ｍk−λcＩ９０／pＰＲ３はpＰＲ３プラスミドの保持を
必要とするが、構築された大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８／p
ＰＲ３、大腸菌Ｋ１２Ｃ６００／pＰＲ３および大腸菌
Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−／pＰＲ３はプラスミドを必
要とせず、プラスミドなしでも同様によく生存する。こ
れら菌株中のプラスミド保持について比較すると、本発
明の菌株については、実質的に全ての生存細胞が所望の
プラスミドを保持していることが分かる。更に、大腸菌
Ｋ１２ＲＶ３０８λcＩ９０／pＰＲ３、大腸菌Ｋ１２Ｃ
６００λcＩ９０／pＰＲ３および大腸菌Ｋ１２Ｃ６００
Ｒk−Ｍk−λcＩ９０／pＰＲ３の菌株は自身のプラスミ
ドを保持しており、所望の融合遺伝子生産物(ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動法により検出できる)を産生
するであろう。
【００１７】本発明の例示に用いるバクテリオファージ
λcＩ８５７のcＩリプレッサー遺伝子は、温度感受性
で、３８℃〜４４℃もしくはそれ以上の温度で不活化す
る。それ故、温度を３８℃〜４４℃に変化させると本発
明によってあらかじめ宿主細胞菌株中に包含せしめてあ
るラムダ・プロファージの溶解サイクルが誘発され、細
胞が溶解されてしまう。容易に判るように、宿主細胞の
溶解を惹き起す致死性マーカーを抑制する温度感受性リ
プレッサーを使用し、リプレッサーを不活化する温度で
宿主細胞を培養することにより、本発明はまた細胞内生
産物を精製するために、簡単で便利かつ安価に細胞を溶
解する方法を提供するものである。本明細書に示すよう
に、本発明の好ましい実施態様では、致死性染色体マー
カーを抑制するために、プラスミド担持遺伝子を利用す
る。細胞の選択はレプリコンおよび他のプラスミド上遺
伝子と無関係である。更に、ここに示した具体例はバク
テリオファージλcＩ８５７を使用しているが、機能的
なリプレッサーを産生する他のλcＩ遺伝子を使用する
こともできる。本発明を例示するのに用いたプロファー
ジはλcＩ９０突然変異を担っているので、機能的λcＩ
リプレッサーを産生しない。他のバクテリオファージλ
突然変異株も、もしそれらが機能的cＩ遺伝子またはリ
プレッサーを欠失しているならば使用することができ
る;容易に理解できるように、そのような突然変異株が
溶原化状態を維持するためには他の供給源からのリプレ
ッサーが必要である。
【００１８】本発明の選択システムでは、プラスミド含
有宿主細胞に種々の有用産物を発現する遺伝子を担った
ベクターを含有させることができる。例えば、プラスミ
ド担持遺伝子は、天然遺伝子、非天然遺伝子、または一
部天然一部合成もしくは非天然遺伝子であってよい。具
体的には、本発明はヒトプレ−プロインシュリン、ヒト
プロインシュリン、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシ
ュリンＢ鎖、ヒト成長ホルモン、非ヒト成長ホルモン、
非ヒトインシュリン、ヒトインターフェロン、非ヒトイ
ンターフェロン、ウイルス抗原、ウロキナーゼ、ペプチ
ドホルモン類、酵素類、ポリペプチド類、あるいは実質
上研究または商業上価値ある他の遺伝子をコードしてい
るプラスミド担持遺伝子を含有する細胞を選択し維持す
るのに使用することができる。
【００１９】本明細書に記載の、本発明の特定の実施態
様では、プラスミドの複製および遺伝子生産物の発現
は、それぞれpＭＢ１からのレプリコン「ボリバー(Ｂol
ivar)、Ｌife Ｓci．２５、８０７〜８１８(１９７
９)」、およびlacもしくはtrpプロモーターによって決
定される。他のレプリコンおよびプロモーターも、それ
らが大腸菌Ｋ１２において機能的であり、用いられる特
定のリプレッサーに対して感受性でない限り使用するこ
とができる。当業者であれば、どのレプリコンとプロモ
ーターが大腸菌Ｋ１２で機能的であり、特定のリプレッ
サーに対し感受性でないかを直ちに理解し決定すること
ができる。他のレプリコンの例としてはＣolＥ１、ＮＲ
１、ＲＫ２、ＲＫ６、pＳＣ１０１、ＲＰ１、ＲＰ４、
Ｆ由来のレプリコン、および大腸菌Ｋ１２中で複製が起
こるバクテリオファージ等が挙げられるが、これらに限
定されるものでない。プロモーターの他の例として、バ
クテリオファージλＰL' プロモーター、リポタンパク
質プロモーター、リボゾームタンパク質もしくはＲＮＡ
プロモーター、および実質上他のあらゆるプロモーター
が挙げられる。他のレプリコンおよびプロモーターも構
築可能であって、当業者には自明である。
【００２０】本発明は、上記の如く、また以下に説明す
るようにプラスミド担持遺伝子によって抑制される致死
性染色体マーカーを利用して、プラスミド含有細菌集団
を選択し維持する方法を開示する。多くの態様が本発明
に可能である。例えば、種々のバクテリオファージがバ
クテリオファージλと交換可能であり、他の種類の致死
性突然変異も、それらがプラスミド担持遺伝子によって
抑制される限り利用可能である。本発明に有用な致死性
突然変異の具体例を以下に示すがこれらに限定されるも
のではない。染色体ＤＮＡの複製、細胞壁の合成、リボ
ゾーム機能、ＲＮＡポリメラーゼ、tＲＮＡ合成と修
飾、アミノアシルtＲＮＡ合成酵素、ＤＮＡの制限およ
び修飾、および細胞分裂突然変異である。他の致死性突
然変異も当業者には自明のものである。
【００２１】大腸菌Ｋ１２は、それにについての遺伝的
生化学的情報が豊富にあるので、本発明目的の宿主細胞
として好都合である。しかし、本発明は一つの属、種、
株に限定されるものではなく、致死性突然変異およびリ
プレッサーが利用可能であるか、単離あるいは構築でき
る生物であれば、何でも使用することができる。例え
ば、本発明は、バシラス属(Ｂacillus)、バシラス・サ
ブチリス(Ｂacillus subtilis)、スタフィロコッカス属
(Ｓtaphylococcus)、ストレプトコッカス属(Ｓtreptoco
ccus)、アクチノマイセテス属(Ａctinomycetes)、スト
レプトマイセス属(Ｓtreptomyces)、セラチア属(Ｓerra
tia)、アグロバクテリウム属(Ａgrobacterium)、および
シュードモナス属(Ｐseudomonas)等の細菌類に適用可能
であるが、これらに限定されない。
【００２２】本発明の実施態様は全て、培地組成に非感
受性であるという共通の特徴を有する。それ故、本発明
は広範な発酵操作を可能とし、生産性を改善せしめる。
以下に実施例を挙げ本発明の好適な実施態様を示す。本
発明を構成するための説明および実際の処方を適宜記載
する。
【００２３】実施例１ プラスミドpＩＡ７△４△１の
構築 Ａ.プラスミドpＢＲＨtrpの構築 プラスミドpＧＭ１は欠失△ＬＥ１４１３を含有する大
腸菌トリプトファン・オペロンを担持しているので、tr
pリーダーの最初の６アミノ酸とtrpＥポリペプチドの後
方約１／３との融合蛋白(以下、ＬＥ'と表わす)、並び
にtrpＤポリペプチドの全てを、いずれもtrpプロモータ
ー−オペレーターの制御下に発現する[ミオザリ(Ｍiozz
ari)ら、Ｊ.Ｂacteriology、１４５７−１４６６(１９
７８)]。大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０tna２trp△１０２／p
ＧＭ１はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection)(ＡＴＣＣ
Ｎo．３１６２２)に寄託されており、該菌体からpＧＭ
１を好都合に除去して下記の工程に使用することができ
る。
【００２４】約２０μgのプラスミドを、このプラスミ
ドを５部位で開裂する制限酵素ＰvuIIで消化した。次
に、この遺伝子フラグメントをＥcoＲＩリンカー(配列p
ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧで表わされる自己相補性オリ
ゴヌクレオチドから成る)と結合させて、ＥcoＲＩ部位
含有プラスミドにクローニングするためのＥcoＲＩ開裂
部位を調製した。pＧＭ１から得た２０μgのＤＮＡフラ
グメントを２００ピコモルの５'−りん酸化合成オリゴ
ヌクレオチドpＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧの存在下、２
０μlＴ4ＤＮＡリガーゼ・バッファー(２０mＭトリス、
pＨ７.６、０.５mＭＡＴＰ、１０mＭ ＭgＣl2、５mＭジ
チオスレイトール)中、１０単位のＴ4ＤＮＡリガーゼに
より、４℃で一夜、処理した。この溶液を結合が停止す
るまで１０分間、７０℃に加熱した。リンカーをＥcoＲ
Ｉ消化により開裂し、得られたＥcoＲＩ末端を持つフラ
グメントを５％ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法
(以下ＰＡＧＥという)により分離した。先ずゲルを臭化
エチジウムで着色し、ＵＶ光線で各フラグメントの位置
を確かめ、必要な部分をゲルから切断することにより、
３つの大きいフラグメントをゲルから単離した。各ゲル
フラグメントを３００μlの０.１×ＴＢＥと共に透析バ
ッグに入れ、０.１×ＴＢＥバッファー中１００Ｖで１
時間電気泳動に付した(ＴＢＥバッファー：水１l中に１
０.８gトリス塩基、５.５gホウ酸、０.０９gＮa2ＥＤＴ
Ａを含有)。水溶液を透析バッグから集め、フェノール
抽出、クロロホルム抽出を行い、塩化ナトリウムで０.
２Ｍ濃度とした。ＤＮＡをエタノール沈澱の後、水中に
回収した。ＥcoＲＩ粘着末端をもつtrpプロモーター／
オペレーター含有遺伝子を、このプロモーター／オペレ
ーターを挿入することによりテトラサイクリン耐性とな
るテトラサイクリン感受性プラスミドに挿入する方法で
同定した。以下に記載する全てのＤＮＡフラグメントの
単離は、上記のＰＡＧＥ処理の後、電気溶出法に付す方
法で行うものとする。
【００２５】Ｂ.Ｔrpプロモーター／オペレーターの制
御下にテトラサイクリン耐性を発現するプラスミドpＢ
ＲＨtrpの構築および上記「Ａ」で単離したＤＮＡフラ
グメントを含有するＴrpプロモーター／オペレーターの
同定と増幅 プラスミドpＢＲＨ１「ロドリゲツ(Ｒodriguez)ら、Ｎu
cleic Ａcids Ｒesearch ６、３２６７−３２８７(１９
７９)」はアンピシリン耐性を発現し、テトラサイクリ
ン耐性に対する遺伝子を含有しているが、それに関連し
たプロモーターがないのでその耐性は発現しない。従っ
て、このプラスミドはテトラサイクリンに感受性を示
す。ＥcoＲＩ部位にプロモーター／オペレーター・シス
テムを導入すると、該プラスミドはテトラサイクリン耐
性となる。
【００２６】プラスミドpＢＲＨ１をＥcoＲＩで消化し
た。この酵素をフェノール抽出、次いでクロロホルム抽
出で除去した後、該ＤＮＡをエタノール沈澱の後、水中
に回収した。得られたＤＮＡ分子を、別々の反応混液
中、上記実施例１Ａで得た３つのＤＮＡフラグメントの
それぞれと上記の如く、Ｔ4ＤＮＡリガーゼによって結
合(ライゲート)させた。反応混液中に存在するＤＮＡを
用いて、コンピテントな大腸菌Ｋ１２株２９４「バック
マン(Ｂackman)ら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、７
３、４１７４−４１９８(１９７６)；ＡＴＣＣ Ｎo．３
１４４８」を標準的な手法[ハーシュフイールド(Ｈersh
field)ら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、７１、３４
５５−３４５９(１９７４)]で形質転換し、次いで、該
細菌を２０μg／mlのアンピシリンと５μg／mlのテトラ
サイクリンを含んだＬＢ平板培地(ミラー(Ｍiller)、１
９７２年)で平板培養した。
【００２７】数個のテトラサイクリン耐性コロニーを選
択し、プラスミドＤＮＡを単離してpＢＲＨtrpと命名し
た。所望フラグメントの存在を制限酵素分析で確認し
た。プラスミドpＢＲＨtrpはβ−ラクタマーゼを発現
し、アンピシリン耐性を伝え、trpプロモーター／オペ
レーターを含むＤＮＡフラグメントを保持している。こ
のＤＮＡフラグメントはまた、trpリーダーの最初の６
アミノ酸とtrpＥポリペプチドの後方約１／３との融合
物である第一蛋白質(ＬＥ'と命名)、trpＤポリペプチド
の最初の約半分に相当する第二の蛋白質(Ｄ'と命名)、
およびテトラサイクリン耐性遺伝子によってコードされ
ている第三の蛋白質をもコードしている。
【００２８】Ｃ.プラスミドpＳＯＭ７△２の構築 プラスミドpＢＲＨtrpをＥcoＲＩ制限酵素で消化し、Ｐ
ＡＧＥおよび電気溶出法で単離したフラグメントをＥco
ＲＩ−消化プラスミドpＳＯＭ１１[板倉らＳci．１９
８、１０５６(１９７７)；英国特許公報Ｎo．２００７
６７６Ａ]と結合させた。混合物をＴ4ＤＮＡリガーゼで
ライゲート(結合)させ、得られたＤＮＡを上記の如く大
腸菌Ｋ１２株２９４に導入した。形質転換体をアンピシ
リン含有平板培地上で選択し、得られたアンピシリン耐
性コロニーをコロニーハイブリダイゼーション[グルー
エンシュタイン(Ｇruenstein)ら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓ
ci.ＵＳＡ、７２、３９５１−３９６５(１９７５)]によ
りスクリーニングした。pＢＲＨtrpから単離し、放射性
Ｐ32で放射活性に標識したtrpプロモーター／オペレー
ター含有フラグメントを上記手法のプローブとして使用
した。いくつかのコロニーがコロニーハイブリダイゼー
ション陽性として選択された。プラスミドＤＮＡを単離
し、挿入したフラグメントの方向を、制限分析、即ちＢ
glIIおよびＢamＨＩ酵素を用いる二重消化により決定し
た。trpプロモーター／オペレーター・フラグメントを
適切な方向で保持する所望のプラスミドを含有するコロ
ニーを１０μg／mlのアンピシリンを含有するＬＢ培地
(ミラー(Ｍiller)、１９７２)中で増殖させた。所望の
プラスミドをpＳＯＭ７△２と命名し、引き続き以下の
構築に使用した。
【００２９】Ｄ.プラスミドpＴrp２４の構築 １.暗号鎖の５'および３'末端にＢglIIとＥcoＲＩ制限
部位とを持つＬＥ'ポリペプチドの遠隔領域のコドンを
含有する遺伝子フラグメントの構築 プラスミドpＳＯＭ７△２をＨindIII消化した後、ＬＥ'
暗号化領域内のＢglII制限部位を越えて消化するように
選んだ条件下でラムダ・エキソヌクレアーゼ(５'→３'
エキソヌクレアーゼ)で消化した。約２０μgのＨindIII
消化pＳＯＭ７△２をバッファー(２０mＭグリシンバッ
ファー、pＨ９.６、１mＭ ＭgＣl2、１mＭβ−メルカプ
トエタノール)に溶かした。この混合物を５単位のラム
ダ・エキソヌクレアーゼで室温において６０分間処理し
た。得られた反応混合物をフェノール抽出、クロロホル
ム抽出し、エタノールで沈澱させた。
【００３０】ＬＥ'遺伝子フラグメントの遠位末端にＥc
oＲＩ残基を創成するために、プライマー32Ｐ ＣＣＴＧ
ＴＧＣＡＴＧＡＴを改良ホスホトリエステル法[クレア
(Ｃrea)ら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、７５、１
０５７６５(１９７８)]により合成し、ラムダエキソヌ
クレアーゼ消化により生成したＬＥ'遺伝子フラグメン
トの一本鎖末端とハイブリダイズさせた。ハイブリダイ
ゼーションは、プラスミドpＳＯＭ７△２のラムダ・エ
キソヌクレアーゼ処理したＨindIII消化生成物２０μg
を水２０μlに溶かし、上記５'−りん酸化オリゴヌクレ
オチド約８０ピコモルを含有する溶液６μlと混合する
ことにより行われた。この合成フラグメントをＬＥ'暗
号配列の３'末端にハイブリダイズし、ＬＥ'フラグメン
トの残る一本鎖部分を、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰお
よびdＣＴＰを用い、クレノウ(Ｋlenow)のポリメラーゼ
Iで充填した。クレノウ・ポリメラーゼIはＤＮＡポリメ
ラーゼIを蛋白分解的に開裂することで得られるフラグ
メントである。このフラグメントは５'→３'重合活性お
よび３'→５'エキソヌクレオチド分解(exonucleolytic)
活性を有するが、元の酵素の５'→３'エキソヌクレオチ
ド分解活性は示さない「コーンバーグ(Ｋornberg)、１
９７４年、Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and Ｃo.,ＳＦＯ、９８」。
【００３１】反応混合物を５０℃に加熱し、１０℃まで
徐々に冷却し、次いでクレノウ酵素４μlを加えた。室
温で１５分間、次いで３７℃で３０分間インキュベーシ
ョンした後、５μlの０.２５Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応
を停止した。反応混合物をフェノール抽出、次いでクロ
ロホルム抽出し、エタノールで沈澱させた。このＤＮＡ
を制限酵素ＢglIIで開裂し、そのフラグメントをＰＡＧ
Ｅで分離した。ゲルのオートラジオグラムから、所望の
鎖長約４７０bpの32Ｐ−標識フラグメントが存在するこ
とが判明し、これを電気溶出で回収した。概説したよう
に、このフラグメントＬＥ'(d)はＢglII末端とプライマ
ーの始まりと一致する平滑末端を有する。
【００３２】２.プラスミドpＴhα１の構築 プラスミドpＴhα１はチモシンアルファ１の合成遺伝子
をプラスミドpＢＲ３２２に挿入することにより構築し
た。チモシンアルファ１をコードしているＤＮＡの合成
には、１６−オリゴヌクレオチド(Ｔ1〜Ｔ16)の合成と
結合が含まれており、添付の図５では両矢印で示してあ
る。ＭetコドンＡＴＧをＮ−末端に挿入し、５'−末端
が容易にＥcoＲＩおよびＢamＨＩで開裂したプラスミド
と結合するよう、一本鎖粘着端を形成するように設計し
た。遺伝子の中心部にあるＢglII部位が組換プラスミド
の分析に役立つことは容易に理解されるであろう。オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドＴ1〜Ｔ16は完全に保護し
たトリデオキシリボヌクレオチド構築ブロックを用いる
改良ホスホトリエステル法により合成した[板倉ら、Ｓc
ience、１９８、１０５６(１９７７)およびクレアら(Ｃ
rea)(１９７８)]。種々のオリゴデオキシリボヌクレオ
チドを表１に示す。
【００３３】
【表１】チモシンα１遺伝子のための合成オリゴヌクレオチド 化合物 配 列 鎖長 HLPC分析保持時間(分)＊ T1 A-A-T-T-C-A-T-G-T-C 10 17.4 T2 T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A 15 24.3 T3 T-A-C-T-T-C-T-TOC-T-G-A 12 20.3 T4 G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A 13 22.0 T5 G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G 15 24.8 T6 G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A 12 20.1 T7 A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A 13 22.6 T8 A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T 12 20.2 T9 G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G 12 20.4 T10 A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T 12 21.1 T11 G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T 12 20.5 T12 G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G 12 20.4 T14 T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C 12 20.5 T15 G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C 12 20.2 T16 G-A-T-C-C-T-A-T-T-A 10 17.2 ＊：室温
【００３４】上記の合成は図６に要約したフラグメント
Ｔ15についての下記手法により代表される。Ｔ15合成に
用いる種々のヌクレオチド・フラグメントは、図面に番
号を付して示してある。使用した略記号は次のとおりで
ある。ＴＰＳＴe:２,４,６−トリイソプロピルベンゼン
スルホニルテトラゾール; ＢＳＡ:ベンゼンスルホン酸;
ＴＬＣ:薄層クロマトグラフィー; ＨＰＬＣ:高速液体
クロマトグラフィー;ＤＭＴ:４,４'−ジメトキシトリチ
ル; ＣＥ:２−シアノエチル; Ｒ:p−クロロフェニル;
Ｂz:ベンゾイル; Ａn:アニソール; iＢu:イソブチリル;
Ｐy:ピリジン;ＡcＯＨ:酢酸; Ｅt3Ｎ:トリエチルアミ
ン。
【００３５】完全に保護したトリデオキシリボヌクレオ
チド４(８５mg、０.０５mmol)および２(１８０mg、０.
１mmol)を７:３(v／v)のクロロホルム／メタノール(各
１０mlおよび２０ml)中２％ＢＳＡで０℃において１０
分間処理し、５'−ヒドロキシ位で脱保護した。飽和重
炭酸アンモニウム水溶液２mlを加えて反応を停止し、ク
ロロホルム２５mlで抽出し、水(２×１０ml)で洗浄し
た。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、少量(約５m
l)まで濃縮して、石油エーテル(３５〜６０℃画分)を加
えて沈澱させた。無色の沈澱物を遠心分離して得、デシ
ケーター中で真空乾燥し、シリカゲルtlc(メルク６０Ｆ
２５４、クロロホルム／メタノール、９:１)で同質(ホ
モジーニアス)の６および８を得た。トリマー１および
３(２７０mg、０.１５mmol；１４５mg、０.０７５mmol)
をトリエチルアミン／ピリジン／水(１:３:１、v／v／
v、１０ml)で室温において２５分間処理し、対応するホ
スホジエステル(５および７)に変換した。試薬をロータ
リー・エバポレーターで除去し、残渣を無水ピリジン
(３×１０ml)と共に繰り返し蒸留して乾燥した。トリマ
ー８(０.０５mmol)とトリマー７を、無水ピリジン３ml
中でＴＰＳＴe(５０mg、０.１５mmol)と一緒にし、反応
混合物を減圧下室温で２時間放置した。ＴＬＣで分析す
ると、９５％のトリマー８がヘキサマー生成物に変換し
ていた(１０％硫酸水をスプレーし、６０℃に加熱する
ことによりＤＭＴ基を肉眼視、検出する)。水１.０mlを
加えて反応を停止し、減圧下に溶媒を留去した。ピリジ
ンをトルエンと共沸蒸留し、トリマー４および２につい
て上述したように、このヘキサマーの５'位を２％ＢＳ
Ａ(８ml)で脱保護した。生成物(１０)をシリカゲル・カ
ラム(メルク６０Ｈ、３.５×５cm)にかけ、クロロホル
ム／メタノール溶媒系(９８:２〜９５:５、v／v)で段階
グラデイエント溶出した。生成物１０を含むフラクショ
ンを蒸発乾固した。
【００３６】同様に、トリマー５を６に結合させ、完全
に保護した生成物を直接シリカゲル上で精製した。後者
の化合物を上記のようにトリエチルアミン／ピリジン／
水で処理して３'末端で脱保護し、フラグメント９を得
た。最後に、ヘキサマー９と１０とを無水ピリジン２ml
中、縮合剤としてＴＰＳＴe(７５mg、０.２２５mmol)を
用いて結合させた。反応終了後(４時間、室温)、混合物
をロータリー・エバポレーターで留去し、残渣をシリカ
ゲルによるクロマトグラフにかけた。生成物１１(１６
０mg)を石油エーテルによる沈澱処理で取得した。本品
はＴＬＣ上単一であった。化合物１１の一部(２０mg)を
ピリジン(０.５ml)にとかし、濃水酸化アンモニウム(７
ml)で処理(８時間、６０℃)、次いで８０％酢酸で処理
(１５分間、室温)して完全に脱保護した。酢酸を留去
し、固型残渣を４％水酸化アンモニウム水溶液(v／v、
４ml)にとかし、エチルエーテル(３×２ml)で抽出し
た。水層を１〜２mlに濃縮し、一部をＨＰＬＣに付して
１２を精製した。主要ピークに対応するフラクションを
集め(約２.００、Ｄ254単位)、約５mlに濃縮した。最終
産物１２をバイオゲル(Ｂio−gel １.５×１００cm)Ｐ
−２上、２０％エタノール水で溶出して脱塩し、濃縮乾
固して水２００μlに再懸濁し、Ａ254＝１０の溶液とし
た。１２の配列は二次元配列分析により確認した。
【００３７】完全なチモシンアルファ１遺伝子を、ソマ
トスタチン[板倉ら、１９７７年]、インシュリン[ゲッ
デル(Ｇoeddel)ら、１９７９年]および成長ホルモン[ゲ
ッデル、ヘイネカー(Ｈeyneker)ら、Ｎature、２８１、
５４４(１９７９)]について既に詳細に記載されている
方法に従い、１６個の合成オリゴヌクレオチドから組立
てた。１０μgのオリゴヌクレオチドＴ2〜Ｔ15をＴ4ポ
リヌクレオチド・キナーゼ[ゲッデルら、１９７９年]の
存在下、[Ｙ−32Ｐ]−ＡＴＰ(ニュー・イングランド・
ヌクレアー)により定量的にリン酸化し、約１Ｃi／mmol
の比活性のものを得た。放射性標識フラグメントを２０
％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル電気泳動法により
精製し、溶出したフラグメントの配列を二次元電気泳動
法／部分的蛇毒消化によるホモクロマトグラフィー「ジ
ェイ(Ｊay)ら、Ｎucleic ＡcidsＲes.１、３３１(１９
７４)」により証明した。フラグメントＴ1およびＴ16は
以後のライゲーション反応において不要な重合を最小に
止めるためにリン酸化せずにおいた。これらオリゴヌク
レオチド(各２μg)を、公知の手法[ゲッデルら、１９７
９年]により、Ｔ4ＤＮＡリガーゼを用い、４フラグメン
トからなる４群で結合させた(図７参照)。反応生成物を
７Ｍの尿素を含む１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により精製した[マクサム(Ｍaxam)およびギルバー
ト(Ｇilbert)、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、７１、
３４５５(１９７７)]。４個の別個の生成物を一緒にラ
イゲートさせ、反応混合物を１０％ポリアクリルアミド
・ゲル電気泳動法により分割した。チモシンアルファ１
遺伝子(９０−１０５塩基対)の大きさに相当するＤＮＡ
を電気溶出した。
【００３８】プラスミドpＢＲ３２２(０.５μg)をＢam
ＨＩおよびＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼで処理し、
そのフラグメントをポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により分離した。大きなフラグメントを電気溶出により
ゲルから回収し、次いで組立てた合成ＤＮＡとライゲー
トさせた[ゲッデル、ハイネカーら、１９７９年]。この
混合物を用いて大腸菌Ｋ１２株２９４、ＡＴＣＣ Ｎo．
３１４４６を形質転換した。５％形質転換混合物を２０
μg／mlアンピシリン含有ＬＢ平板培地で平板培養し
た。得られた４個のアンピシリン耐性コロニーはテトラ
サイクリンに感受性を示し、テトラサイクリン耐性遺伝
子の挿入を示唆した。これら４個のコロニーから得たプ
ラスミドを分析すると、それぞれの場合に、pＴhα１と
命名されたプラスミドは、(a)pＢＲ３２２自身には見出
されないＢglII部位を有し、図５に示すチモシンアルフ
ァ１遺伝子の存在を意味し、(b)ＢamＨＩ／ＥcoＲＩ開
裂によって生じた約１０５の対のフラグメントを有する
ことが判った。プラスミドpThα１(一定の比率で描かれ
ていない)の構築工程を図７に示す。図中、濃い点は５'
−リン酸基を示す。
【００３９】３.処理pＴhα１とＬＥ'(d)フラグメント
の反応 プラスミドpＴhα１は、アンピシリン耐性を特定する遺
伝子と、５'暗号鎖末端をコードするＥcoＲＩ部位に、
３'末端をＢamＨＩ部位にクローニングしているチモシ
ンアルファ１を特定する構造遺伝子とを含有している。
また、チモシン遺伝子はＢglII部位を有する。上で調製
したＬＥ'(d)フラグメントを受け入れることのできるプ
ラスミドを創成するために、pＴhα１をＥcoＲＩで消化
し、次いでクレノウポリメラーゼIにより、dＴＴＰおよ
びdＡＴＰと反応させてＥcoＲＩ残基を平滑末端化し
た。生成物をＢglIIで消化すると、アンピシリン耐性に
関る遺伝子を有し、対向する両側に粘着性のＢglII残基
と平滑末端とを有する直鎖状のＤＮＡフラグメントが生
じた。この生成物をＴ4リガーゼの存在下、ＢglII粘着
末端と平滑末端とを有するＬＥ'(d)フラグメントと反応
させて再環化し、プラスミドpＴrp２４を得る。その
際、平滑末端ライゲーションが起きた位置にＥcoＲＩ部
位が再生される。
【００４０】Ｅ.プラスミドpＳＯＭ７△２△４の構築 pＴrp２４をＢglIIおよびＥcoＲＩで連続的に消化し、
次いでＰＡＧＥ、電気溶出処理すると、ＢglII粘着末端
と、３'暗号末端に隣接したＥcoＲＩ粘着末端とをもつ
ＬＥ'(d)ポリペプチドのコドンを有するフラグメントが
生成する。ＬＥ'(d)フラグメントをプラスミドpＳom７
△２のＢglII部位にクローニングすると、トリプトファ
ン・プロモーター／オペレーターの制御下で発現される
ＬＥ'ポリペプチド／ソマトスタチン融合蛋白が生成さ
れる。そうするためには、(１)pＳom７△２を部分的に
ＥcoＲＩ消化してトリプトファン・プロモーター／オペ
レーターから遠位のＥcoＲＩ部位を開裂すること、およ
び(２)コドンリーディングフレームを適当に維持し、Ｅ
coＲＩ開裂部位を再生させるためにプライマー配列を適
切に選択すること、が必要である。
【００４１】１６μgのプラスミドpＳom７△２を、２０
mＭトリス、pＨ７.５、５mＭ ＭgＣl2、０.０２ＮＰ４
０界面活性剤および１００mＭ ＮaＣlから成る２００μ
lのバッファーで希釈し、０.５単位のＥcoＲＩで処理し
た。３７℃で１５分間処理した後、反応混合物をフェノ
ール抽出、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱の後、
ＢglII消化に付した。大きい方のフラグメントをＰＡＧ
Ｅ処理、次いで電気溶出により単離した。このフラグメ
ントはＬＥ'ポリペプチドの近位末端のコドン「ＬＥ'
(p)」、即ちＢglII部位から上流部分を含有している。
このフラグメントを、次いで、Ｔ4ＤＮＡリガーゼの存
在下、上記ＬＥ'(d)フラグメントとライゲートしてプラ
スミドpＳom７△２△４を得、これを用いて大腸菌２９
４株を形質転換すると、トリプトファン・プロモーター
／オペレーターの制御下に、完全に再構築されたＬＥポ
リペプチドとソマトスタチンとの融合蛋白質が効率よく
生産された。
【００４２】Ｆ.テトラサイクリン耐性を特定する遺伝
子を囲んで、その３'末端にＰstI残基を有し、５'末端
にＢglII残基を有する線状ＤＮＡの構築 プラスミドpＢＲ３２２をＨindIII消化し、ＨindIII突
出末端をＳ１ヌクレアーゼで消化した。Ｓ１ヌクレアー
ゼ消化は、１０μgのＨindIII−開裂pＢＲ３２２を３０
μlのＳ１バッファー(０.３ＭＮaＣl、１mＭＺnＣl2、
２５mＭ酢酸ナトリウム、pＨ４.５)中で１０３００単位
のＳ１ヌクレアーゼにより１５℃で３０分間処理するこ
とにより行った。反応は１μlの３０×Ｓ１ヌクレアー
ゼ停止溶液(０.８Ｍトリス塩基、５０mＭ ＥＤＴＡ)を
加えて停止させた。混合物をフェノール抽出、クロロホ
ルム抽出し、エタノールで沈澱させた後、上述のように
ＥcoＲＩで消化した。ＰＡＧＥ処理および電気溶出によ
り、ＥcoＲＩ粘着末端と暗号鎖がヌクレオチドチミジン
で始まる平滑末端を有するフラグメントを得た。チミジ
ンで始まるＳ１消化ＨindIII残基はクレノウ・ポリメラ
ーゼI処理ＢglII残基と結合することができ、結合によ
りＢglII制限部位が再構築される。
【００４３】そこで、実施例１Ｃで調製したプラスミド
pＳＯＭ７△２をＢglII消化し、生成したＢglII粘着末
端を４種全てのデオキシヌクレオチド・トリリン酸エス
テルを使用し、クレノウ・ポリメラーゼIで処理して二
本鎖とした。得られた生成物をＥcoＲＩで開裂し、ＰＡ
ＧＥ処理して小さい方のフラグメントを電気溶出し、ト
リプトファン・プロモーター／オペレーターとＢglII部
位から上流のＬＥ'の「近位」配列(ＬＥ'(p))のコドン
を含むＤＮＡの線状片を生成した。この生成物はＥcoＲ
Ｉ末端とＢglII部位を充填したことによる平滑末端とを
所有していた。しかし、上記Ｓ１−消化ＨindIIIフラグ
メントの平滑末端に、この平滑末端を結合せしめること
によりＢglII部位は再構成された。即ち、２個のフラグ
メントをＴ4ＤＮＡリガーゼの存在下でライゲートさ
せ、受容能力のある(コンピテント)大腸菌株２９４細胞
に導入することにより増幅させ、再環化されたプラスミ
ドpＨＫＹ１０を形成した。組換えプラスミドpＨＫＹ１
０を担持するテトラサイクリン耐性細胞を選択し、プラ
スミドＤＮＡを抽出した。ＢglIIおよびＰstIで消化
し、ＰＡＧＥ法で単離することにより、ＰstIとＢglII
粘着末端を有する所望の線状ＤＮＡを得た。このように
してpＨＫＹ１０から生成したＤＮＡフラグメントは複
製起源を有し、trpプロモーター／オペレーターの制御
下に、trpＬＥ'ポリペプチド融合蛋白とテトラサイクリ
ン耐性をコードしている２個の遺伝子の両者をコードし
ているプラスミドpＩＡ７４△１構築の際の成分として
有用である。
【００４４】Ｇ.Ｔrpプロモーター／オペレーターをも
つ線状ＤＮＡの構築 実施例１Ｅで調製したプラスミドpＳＯＭ７△２△４を
部分的ＥcoＲＩ消化、次いでＰstI消化に付した。生成
したフラグメントはtrpプロモーター／オペレーターを
含有しており、ＰＡＧＥ処理、次いで、電気溶出により
単離した。ソマトスタチン遺伝子の５'末端隣接位で開
裂されているが、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロモ
ーター／オペレーター間に存在するＥcoＲＩ部位が開裂
されていないフラグメントを得るために、部分的ＥcoＲ
Ｉ消化を行った。アンピシリン耐性遺伝子内のＰstIを
切断することで失われたアンピシリン耐性は、上記実施
例１Ｆで調製した最終のpＨＫＹ１０線状ＤＮＡ誘導体
とのライゲーションにより回復することができる。
【００４５】Ｈ.インシュリンＡ鎖構造遺伝子の単離 インシュリンＡ鎖構造遺伝子を、プラスミドpＩＡ１の
ＥcoＲＩおよびＢamＨＩ消化によって得た。プラスミド
pＩＡ１の構築法は、ゲッデルら、Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓ
ci.ＵＳＡ、７６、１０６(１９７９)に開示されてい
る。所望のフラグメントをＰＡＧＥおよび電気溶出によ
り精製したところ、それはＥcoＲＩ末端とＢamＨＩ末端
とを有していた。
【００４６】Ｉ.インシュリンＡ鎖構造遺伝子、Ｔrpプ
ロモーター／オペレーター、およびＰstIならびにＢglI
I末端を有するpＨＫＹ１０線状ＤＮＡフラグメントの結
合 インシュリンＡ鎖構造遺伝子、trpプロモーター／オペ
レーター含有線状ＤＮＡフラグメント(実施例１Ｇにて
調製)、およびpＨＫＹ１０線状ＤＮＡフラグメント(実
施例１Ｆにて調製)を図１に示したように、適切な方向
でライゲートさせ、所望のプラスミドpＩＡ７△４△１
を構築した。プラスミドpＩＡ７△４△１はアンピシリ
ンおよびテトラサイクリン耐性を回復しているので、容
易に選択することができる。
【００４７】実施例２ 組換えプラスミドpＰＲ１の構
築 プラスミドpＩＡ７△４△１はバクテリオファージλcＩ
８５７の２.５ＫbＢglIIフラグメントを含むλcＩとλr
exの挿入が可能な１個のＢamＨＩ制限部位を有してい
る。バクテリオファージλcＩ８５７はＢglIIに感受性
の６個の部位を有する。１個のＢglIIフラグメントは
２.５Ｋbであり、λcＩ遺伝子およびλrex遺伝子を含有
する[スジバルスキー(Ｓzybalski)およびスジバルスキ
ー(Ｓzybalski)、１９７９、遺伝子(Ｇene)、７、２１
７〜２８０；1980年、３月号、オブライエン(Ｏ'Ｂrie
n)出版、遺伝子地図(Ｇenetic Ｍaps)、第１巻、ＮＩ
Ｈ]。ＢglIIフラグメントはＢamＨＩフラグメント上の
５'−延長部と同一で且つ相補的なＧＡＴＣ配列をもつ
５'−延長部を有する。ヒト・インシュリンプラスミドp
ＩＡ２はＢamＨＩにより開裂される単一の部位を有す
る。このＢamＨＩ部位にクローニングするとpＩＡ７△
４△１のＴc耐性遺伝子が不活化される。ＢglIIフラグ
メントとＢamＨＩフラグメントをライゲートさせるとそ
の結合部位で
【化１】ＡＧＡＴＣＣ ＴＣＴＡＧＧ または
【化２】ＧＧＡＴＣＴ ＣＣＴＡＧＡ 配列を有する組換え体が得られる。これらの配列はＢgl
IIまたはＢamＨＩによって開裂されない。従って、両酵
素による制限処理で、pＩＡ７△４△１のＢamＨＩ部位
にλＢglIIフラグメントがライゲートされているもの以
外の全ライゲーション生成物が除去される。このように
して、λＢglIIフラグメントをpＩＡ７△４△１のＢam
ＨＩ部位にライゲートすることにより、所望のpＰＲ１
プラスミドが得られる。
【００４８】これらの制限酵素は市販品を購入したもの
で、その使用法は業者の説明書に依った。「制限酵素お
よび説明書は下記製造元より簡単に入手できる：ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリー、私書函６０１０、ロック
ビル、メリーランド２０８５０(Ｂethesda Ｒesearch
Ｌaboratories Ｉnc．Ｂox６０１０,Ｒockville,Ｍaryl
and ２０８５０)；ベーリンガー・マンハイム・バイオ
ケミカル、７９４１、キャスルウェイ・ドライブ、私書
函５０８１６、インディアナポリス、インディアナ４６
２５０(Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemicals，７９４
１Ｃastleway Ｄrive，Ｐ.Ｏ.Ｂox ５０８１６、Ｉndia
napolis,Ｉndiana ４６２５０)；リサーチ・プロダクト
・マイルス・ラボラトリーズ、エルクハート、インディ
アナ４６５１５(Ｒesearch Ｐroducts,Ｍiles Ｌaborat
ories Ｉnc.，Ｅlkhart,Ｉndiana４６５１５)」。組換
えＤＮＡ分子は、３.０×１０-13モルの制限ベクターと
６.０×１０-13モルのバクテリオファージλ制限フラグ
メントを含む０.１０mlの反応混合物中でＴ4ＤＮＡリガ
ーゼを用いて形成された。他の、あるいはより完全な反
応条件は、タナカ(Ｔanaka)およびワイスブラム(Ｗeiss
blum)のジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Ｔanaka
and Ｗeissblum,Ｊ.Ｂacteriol.)、１２１、３５４〜３
６２(１９７５)に開示されている。
【００４９】実施例３ 組換えプラスミドpＰＲ１によ
る大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−の形質転換 大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−〔チャン,コーエン,プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス(Ｃhang and Ｃohen,Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.),
７１,１０３０〜１０３４(１９７４)に記載〕の新鮮な
一夜培養物を新鮮なＬ−ブロス〔ミラー,１９７２,エク
スペリメント・イン・モレキュラー・ジェネティック
ス,コールド・スプリング・ハーバーラボ,コールド・ス
プリング・ハーバー,ニューヨーク(Ｍiller,１９７２,
Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetics,Ｃold Ｓpring
Ｈarbor Ｌabs,Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎew Ｙork)に
開示〕に１:１０で継代培養し、３７０℃で１.０時間増
殖させた。総量６６０クレット単位(Ｋlett unit)の細
胞を取得し、２.５mlの１００mＭ塩化ナトリウム水で洗
浄し、グリセロール１０.０％を含む１５０mＭ塩化カル
シウム中に懸濁し、室温で２０分間インキュベートし
た。細胞を遠心分離により取得し、０.５mlの塩化カル
シウム−グリセロールに再懸濁し、３〜５分間氷で冷却
した後、凍結させた。この細胞懸濁物を使用するまで液
体窒素中に保存した。共有結合的に閉環した環状ＤＮＡ
の形質転換能あるいは頻度は保存ならびに貯蔵によって
殆んど影響されなかった。細胞を氷浴中で融解し、ＤＮ
Ａ(実施例２に記載の方法で調製)０.０５ml当り細胞０.
１mlの割合で、２.０μg／mlの濃度となるように混合し
た。こうして調製した標品を氷上で１０.０分間冷却
し、次いでＬ−ブロス０.８５mlで希釈し、３２℃で２.
０時間培養した後、Ｌ−寒天〔ミラー(Ｍiller)により
開示(１９７２年)〕上に５×１０9λb２と共に広げ、３
２℃でインキュベートした。
【００５０】形質転換体を大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−
Ｍk−／pＰＲ１と命名し、選択して培養した。得られた
コロニーが予期した表現型であるかどうかを試験し、プ
ラスミドpＰＲ１の単離と増幅に使用した。プラスミドp
ＰＲ１の制限酵素分析によれば、λc１よりもλrex遺伝
子の方がtrpＥ−インシュリンＡ鎖遺伝子に近かった。
上で生成した形質転換体には逆配向のプラスミドは認め
られなかった。
【００５１】実施例４ プラスミドpＰＲ１の増幅、単
離、および大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８の形質転換 大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−／pＰＲ１のプラスミ
ドＤＮＡをクロラムフェニコールと一緒に増幅し、透明
化リゼイト法(cleared lysate procedure)〔バザラル,
ヘリンスキー,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー(Ｂazaral and Ｈelinski,Ｊ.Ｍol.Ｂiol.),３
６,１８５〜１９４(１９６８)に開示〕により単離し
た。共有結合的に閉環した環状ＤＮＡを、ＣsＣlと二沃
化プロピジウム中での平衡化超遠心法により精製した。
二沃化プロピジウムを２−プロパノールで抽出し、ＤＮ
ＡをＣsＣl中、−２０℃で貯蔵した。有効なＤＮＡ溶液
をセファデックス(Ｓephadex)ＰＤ１０〔ファルマシア
(Ｐharmacia)８００センテニラル・アベニュー,ピスカ
ータウエイ,ニュー・ジャージー・０８８５１(Ｃentenn
ial Ａve,Ｐiscataway,Ｎew Ｊersey)〕上クロマトグラ
フィーに付し、ＳＳＣ／１０バッファー(０.０１５Ｍ−
ＮaＣl,０.００１５Ｍ−クエン酸ナトリウム、pＨ７.
０)中に移し換えた。
【００５２】組換えプラスミドpＰＲ１による大腸菌Ｋ
１２ＲＶ３０８の形質転換は、３００mＭ塩化カルシウ
ムを用いる他は実施例３の操作法に従って実施した。標
品を０.８５mlのＬ−ブロスで希釈し、３２℃で２.０時
間培養し、５×１０9λb２と共にＬ−寒天上に広げ、３
２℃でインキュベートした。生存コロニーが予期した表
現型であるか否かを試験すると、所望の大腸菌Ｋ１２Ｒ
Ｖ３０８／pＰＲ１形質転換体を構成していた。
【００５３】実施例５ λcI９０を用いた溶原化による
大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８λcI９０／pＰＲ１の構築 大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８／pＰＲ１(実施例４に従って調
製)を３５クレット単位になるまで３２℃で増殖させ、
次いで４５℃で６０.０分間保持した。細胞を感染多重
度２０でλcI９０に感染させ、４５℃で４０分間培養し
た。コロニーを１０μg／mlのアンピシリンを含むＬ−
寒天上、３２℃でインキュベートした。生成した大腸菌
Ｋ１２ＲＶ３０８λcI９０／pＰＲ１のコロニーは３２
℃で生育し、４２℃で感受性を有することが試験の結果
証明された。
【００５４】実施例６ 組換えプラスミドpＰＲ１によ
る大腸菌Ｋ１２Ｃ６００の形質転換 所望の構築は、実質上、実施例４の方法に従って実施す
る。生存コロニーが予期した表現型であるかどうかを試
験することにより、所望の大腸菌Ｋ１２Ｃ６００／pＰ
Ｒ１形質転換体を構成しているか否かを確認することが
できる。
【００５５】実施例７ λcI９０での溶原化による大腸
菌Ｋ１２Ｃ６００λcI９０／pＰＲ１の構築 所望の構築は、実質上、実施例５の方法に従って実施す
る。得られる大腸菌Ｋ１２Ｃ６００λcI９０／pＰＲ１
コロニーは３２℃における増殖および４２℃における感
受性を試験し、確認することが出来る。
【００５６】実施例８ λcI９０での溶原化による大腸
菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−λcI９０／pＰＲ１の構築 所望の構築は、実施例３の方法に従って大腸菌Ｋ１２Ｃ
６００Ｒk−Ｍk−／pＰＲ１を製造し、次に、この形質
転換体を実質上、実施例５の操作法に従ってバクテリオ
ファージλcI９０で溶原化することにより行われた。生
存コロニーが予期した表現型であるかどうかを試験した
ところ、所望の株を構成していた。
【００５７】実施例９ プラスミドpIＢ７△４△１の構
築 所望のプラスミドは、最終的なライゲーションにインシ
ュリンＡ鎖ではなくインシュリンＢ鎖を特定する構造遺
伝子を用いる他は実施例１Ａ−Iの操作法に従って構築
された。但し、インシュリンＢ鎖構造遺伝子はプラスミ
ドpIＢ１〔構築は、ゲッデルら(Ｇoeddel)により１９７
９年に開示〕のＥcoＲIおよびＢamＨI消化によって得ら
れた。インシュリンＢ鎖をコードしているＤＮＡフラグ
メントを、ＰＡＧＥ処理および電気溶出によって精製す
ると、ＥcoＲI末端およびＢamＨI末端を有するフラグメ
ントが得られた。プラスミドpIＢ７△４△１は図３に示
したとおりであって、アンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性が再生されているので、容易に選択される。
【００５８】実施例１０ 組換えプラスミドpＰＲ３の
構築 バクテリオファージλcI８５７の２.５ＫbＢglIIフラグ
メントを含有するλcIおよびλrex遺伝子をpIＢ７△４
△１にクローニングするには、プラスミドpIＢ７△４△
１のユニークＢamＨI制限部位を利用する。この操作は
実質上、実施例２の方法に従って実施する。λＢglIIフ
ラグメントをpIＡ７△４△１のＢamＨI部位にライゲー
ションさせると所望のプラスミドpＰＲ３が得られる。
【００５９】実施例１１ 組換えプラスミドpＰＲ３に
よる大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−の形質転換 実施例２ではなくて、実施例１０で調製したＤＮＡを用
いる他は、実質上、実施例３の操作法に従って大腸菌細
胞を形質転換した。この形質転換体を大腸菌Ｋ１２Ｃ６
００Ｒk−Ｍk−／pＰＲ３と命名し、選択して培養し
た。得られたコロニーが所期の表現型であるかどうかを
試験し、プラスミドpＰＲ３の単離および増幅に利用し
た。プラスミドpＰＲ３の制限酵素分析によればλcIよ
りもλrex遺伝子の方がtrpＥ−インシュリンＢ鎖遺伝子
に近かった。上記の形質転換体には、逆配向のプラスミ
ドは認められなかった。
【００６０】実施例１２ 組換えプラスミドpＰＲ３の
増幅、単離、および大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８への導入 大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−／pＰＲ３のプラスミ
ドＤＮＡを実質上、実施例４の操作法に従って増幅およ
び単離した。プラスミドpＰＲ３を大腸菌Ｋ１２ＲＶ３
０８に導入して大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８／pＰＲ３を得
る操作は実質上、実施例４に従った。
【００６１】実施例１３ 組換えプラスミドpＰＲ３に
よる大腸菌Ｋ１２Ｃ６００の形質転換 プラスミドpＰＲ３を大腸菌Ｋ１２Ｃ６００に導入して
大腸菌Ｋ１２Ｃ６００／pＰＲ３を得る操作は実質上、
実施例３の方法に従った。生存コロニーが所期の表現型
であるかどうかを試験すると、所望の大腸菌Ｋ１２Ｃ６
００／pＰＲ３形質転換体を構成していた。
【００６２】実施例１４ λcI９０での溶原化による大
腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８λcI９０／pＰＲ３の構築 所望の構築は、実質上、実施例５の方法に従って大腸菌
Ｋ１２ＲＶ３０８／pＰＲ３をバクテリオファージλcI
９０で溶原化することにより実施される。得られる大腸
菌Ｋ１２ＲＶ３０８λcI９０／pＰＲ３コロニーは３２
℃における増殖と４２℃における感受性を試験すること
で確認できる。
【００６３】実施例１５ λcI９０での溶原化による大
腸菌Ｋ１２Ｃ６００λcI９０／pＰＲ３の構築 所望の構築は、実質上、実施例５の方法に従って、大腸
菌Ｋ１２Ｃ６００／pＰＲ３をバクテリオファージλcI
９０で溶原化することにより実施される。得られる大腸
菌Ｋ１２Ｃ６００λcI９０／pＰＲ３コロニーは３２℃
における増殖と、４２℃における感受性とを試験するこ
とで確認できる。
【００６４】実施例１６ λcI９０での溶原化による大
腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−λcI９０／pＰＲ３の構
築 所望の構築は、実施例１１記載の方法に従って大腸菌Ｋ
１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−／pＰＲ３を調製し、次いで、
実質上、実施例５の方法に従って形質転換体をバクテリ
オファージλcI９０で溶原化することにより実施した。
得られた大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−λcI９０／p
ＰＲ３コロニーは、３２℃における増殖と、４２℃にお
ける感受性とを試験することで確認された。
【００６５】実施例１７ 選択および非選択性の組換え
プラスミドpＰＲ３含有宿主細胞の安定性を測定する方
法 プラスミドの保持を試験するための株を、周期的に新鮮
な培地に継代培養することにより、非選択性培地(Ｌ−
ブロス)で対数増殖させた。組換えプラスミド上のＡpr
遺伝子を用いて、プラスミド含有細胞の頻度を検定する
ことにより求めた。段階希釈した培養株をＬ−寒天培地
上に展開し、１０μg／mlアンピシリンの存在もしくは
非存在下に３２℃で増殖させた。プラスミド+細胞の頻
度は、アンピシリン非存在下、Ｌ−寒天培地上で生育し
たコロニーの総数に対するアンピシリン耐性コロニーの
比で表わした、または、Ｌ−寒天上のコロニーを１０μ
g／mlアンピシリン含有Ｌ−寒天上にレプリカ平板培養
し、３２℃で増殖させてもよい。プラスミド+細胞の頻
度は、アンピシリン非存在下における、Ｌ−寒天上で生
育したコロニー総数に対するアンピシリン耐性コロニー
の割合で示される。
【００６６】組換えプラスミドの安定性は、上記実施例
１７の記載に従って測定された。大腸菌Ｋ１２Ｃ６００
Ｒk−Ｍk−λcI９０／pＰＲ３および大腸菌Ｋ１２Ｃ６
００Ｒk−Ｍk−／pＰＲ３株に関する結果を％で表２に
示した。
【００６７】
【表２】
【００６８】表２の結果は、本発明の選択システムが組
換えプラスミドを細菌集団に保持せしめる上で、非常に
すぐれた選択システムであるということを明確に示すも
のである。大腸菌Ｋ１２Ｃ６００Ｒk−Ｍk−／pＰＲ３
培養物の約１００％の細胞が３４回の培希釈培養後にプ
ラスミドを欠損していた。しかし本発明の選択システム
を有する大腸菌Ｃ６００Ｒk−Ｍk−λcI９０／pＰＲ３
培養物中の細胞では３４回の培希釈培養後でもプラスミ
ドを欠損している細胞は全くみとめられなかった。さら
に増殖させるとわずかにプラスミドの分離が認められ
た。しかしながら、結果はおそらく、プロファージとプ
ラスミドとの組換えを反映しているものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpＩＡ７△４△１の制限部位およ
び機能地図である。
【図２】 プラスミドpＰＲ１の制限部位および機能地
図である。
【図３】 プラスミドpＩＢ７△４△Iの制限部位および
機能地図である。
【図４】 プラスミドpＰＲ３の制限部位および機能地
図である。
【図５】 チモシンアルファI遺伝子の塩基配列および
それによってコードされているアミノ酸配列の模式図で
ある。
【図６】 フラグメントＴ15の合成工程図である。
【図７】 プラスミドpＴhα１の構築模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ポール・アール・ロステック・ジュニア アメリカ合衆国インディアナ州ビーチ・グ ローブ・ディプロマ・コート，141番地

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 i)機能的なポリペプチドを発現する遺伝
    子、 ii)バクテリオファージλcＩ８５７のcＩリプレッサー
    遺伝子、および iii)該リプレッサー遺伝子によって発現されるリプレッ
    サーに感受性を有さない複製起点およびプロモーターを
    含有する組換えＤＮＡクローニングベクターで形質転換
    され、プロファージとして染色体に組み込まれた、cＩ
    リプレッサー遺伝子を産生しないバクテリオファージλ
    cＩ９０を保持している細菌宿主細胞。
  2. 【請求項２】 ベクターがプラスミドである請求項１に
    記載の細胞。
  3. 【請求項３】 大腸菌である請求項１または２に記載の
    細胞。
  4. 【請求項４】 プラスミドpＰＲ１またはpＰＲ３で形質
    転換されているものである請求項１、２または３に記載
    の細胞。
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