KR900001015B1 - 재조합체 dna 발현 벡터의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1 내지 4도는 플라스미드 pNM 575에 대한 제조 프로토콜의 도식적 설명.
제5 내지 8도는 플라스미드 pNM7 789B에 대한 제조 프로토콜의 도식적 설명.
제9도는 플라스미드 pCZ 114 및 pCZ 105.1의 제한 부위 지도.
제10도는 플라스미드 pCZ 1140의 제한 부위 지도.
재11도는 타이모신(Thymosin)α1 합성유전자.
제12도는 뉴클레오티드 단편 T15에 대한 합성 프로토콜.
제13도는 플라스미드 pThα1에 대한 제조 프로토콜.
제14도는 프로인슐린 합성 유전자.
제15도는 플라스미드 pHI7△4△1에 대한 제조 프로토콜.
제16도는 플라스미드 pHI 104에 대한 제조 프로토콜.
본 발명은 1) 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코드화 하는 뉴클레오티드 서열의 판독대(reading frame)에 있는 전사 및 해독(translational)활성화서열; 2)해독 정지 시그날; 3)작용성 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 판독대에 있는 해독 개시 시그날; 및 4)부가 해독 정지 시그날 시리즈를 함유하는 신규의 선택성 및 자발적으로 복제하는 재조합체 DNA 발현 벡터의 제조방법에 관한 것이다. 상기의 뉴클레오티드 서열은 전사 될때에 해독할 수 있는 폴리시스트로닉 mRNA를 생성하도록 설계되어 있다.
유전자 재조합 기술의 개발 및 이용은 고율의 유전자 발현을 유도하는 벡터의 일반적인 부족에 의해 제한되어 왔다. 비록 lac(Roberts et al., 1979, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76 : 5595 및 Guarante et al., 1980, Cell20; 543), trp(Hallewell and Emtage, 1980, Gene9 : 27), 박테리오파지 λPL(Remaut et al., 1981, Gene 15(1) : 81, Bernard et al., 1979, Gene 5 : 59 and Derom et al., 1982, Gene 17 : 45) 및 lpp(Ziebel et al., 1981, J. Bacteriol 145 : 654, Lee et al., 1981 J. Bacteriol 146 : 861 및 Nakamura 및 Inouye 1979, Cell 18 : 1109)프로모터 시스템이, 조립된 재조합체 DNA 벡터에 도입되었더라도 다른 발현 시스템은 거의 이용할 수 없다. 사실, 이들 공지의 발현 벡터를 이용할 때 많은 이종성 유전자가 발현되지 않거나 또는 기껏해야, 미미한 정도로만 발현된다. 그와같이 발현이 제대로 이루어지지 않는 이유는 자주 리보조옴(ribosome)에 적합하지 않거나 또는 리보조옴에 결합하지 못하는 mRNA의 전사에 기인한다. 이는 리보조옴 결합부위가 제거된 부적절한 스템 앤드 루프(stem and loop)구조의 형성, mRNA전사의 일반적인 불안정성 또는 리보조옴 결합 또는 해독 개시를 억제하는 서열의 존재 때문일 수 있다. 어떠한 경우에도, 해독이 이루어지지 않으면 결과적으로 목적하는 폴리펩타이드의 발현 또는 제조가 이루어지지 않는다.
본 발명은 유전자의 합성적 변형을 필요로 하지않고 발현의 문제를 해결하였다. 그와같은 합성적 변형은 시간이 소비되고 비용이 많이 들뿐 아니라 돌발적으로 DNA서열에 에러(error)를 유발할 위험성을 증가시킨다. 본 발명은 문제의 특정 유전자의 서열을 변형하거나 바꾸지 않고 mRNA 전사체의 5'말단을 바꿈으로써 이 문제를 극복하였다.
본 발명의 목적을 위하여 본 명세서에서 사용되는 다음 용어들은 아래와 같이 정의된다.
재조합체 DNA 클로닝 벡터-플라스미드가 포함되나 플라스미드로 한정되지 않고, 하나 이상의 부가 DNA 단편이 첨가될 수 있거나 첨가된 DNA 분자를 함유하는, 특정의 자발적으로 복제하는 제제.
재조합체 DNA 발현 벡터-하나이상의 전사 및 해독 활성화 서열(들)이 삽입된 특정의 재조합체 DNA 클로닝 벡터.
전사 활성화 서열-DNA를 mRNA 전사체(transcript)로 직접 전사시키거나 또는 전사를 유도하는 특정의 DNA 서열.
해독 활성화 서열-mRNA 전사체를 펩타이드 또는 폴리펩타이드로 해독하거나 또는 해독을 유도하는 특정의 DNA 서열.
해독 개시 시그날-해독 개시 코돈올 코드화하는 특정의 DNA 트리플렛.
해독 정지 시그날-해독 정지 코돈을 코드화하는 특정의 DNA 트리플렛.
형질전환(transfromation)-유전자형을 바꾼 수용균 숙주세포로 DNA를 이입시키는 것.
형질전환제-형질전환을 겪는 수용 숙주 세포.
제한단편-하나 이상의 제한 효소의 작용에 의해 만들어지는 특정의 직선 DNA 서열.
작용성 폴리펩타이드-회수할 수 있는 생물학적 활성의 이종성 폴리펩타이드 또는 전구체, 이종성 폴리펩타이드 및 동종성 폴리펩타이드의 한 부분 또는 전부를 함유하는 회수할 수 있는 생물학적 활성의 폴리펩타이드, 또는 이종성 폴리펩타이드 및 특별하게 절단될 수 있는 생물학적으로 불활성화된 폴리펩타이드를 함유하는 회수할 수 있는 생물학적 활성의 융합 폴리펩타이드.
융합된 유전자 생성물-동종성 폴리펩타이드의 한부분 또는 또는 전부를 함유하는 회수할 수 있는 이중성 폴리펩타이드.
본 발명은 a) 전사 및 해독 활성화 서열, b) 리보조옴 결합 부위 및 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 링커(이때, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 코드화 서열은 이 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 카복시 말단을 코드화하는 뉴클레오티드 트리풀렛 아래쪽에 바로 인접하여 위치하는 해독 정지 시그날 및 이 정지 시그날 아래쪽에 인접하고 있는 해독 개시 시그날을 함유한다), 및 c) 작용성 폴리펩타이드를 코드화 하는 뉴클레오티드서열, (이때, 작용성 폴리펩타이드 코드화 서열은 이 작용성 폴리펩타이드의 카복시 말단을 코드화하는 뉴클레오티드 트리플렛 아래쪽에 바로 인접하여 위치하는 해독 정지 시그날을 함유한다)을 연결시킴을 특징으로 하여, 선택성이 있고 자발적으로 복제되는 재조합체 DNA 발현 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다.
그 벡터는 다음의 XbaaI-HgiAI DNA 링커 서열을 플라스미드 pCZ101의 약 10.2kb
BamHI-XbaI 및 약 0.6kb BamHI-Hgi AI 단편에 연결시킴으로써 제조될 수 있다.
여기에서 A는 데옥시아데닐, G는 데옥시구아닐, C는 데옥시시토실이고, T는 티미딜이다. 생성된 플라스미드(본 명세서에서는 플라스미드 pCZ114로 표시한다)는, 잇달아 1) 리보조옴 결합 부위 및 서열 MET PHE PRO LEU GLU ASP ASP(여기에서, MET는 메티오닌, PHE는 페닐알라닌, PRO는 프롤린, LEU는 로이신, GLU는 글루탐산이고, ASP는 아스파르트산이다)의 펩타이드 모두를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 판독대중에 이·콜라이 리포프로테인 유전자 잔사 및 해독 활성화 서열(Nakamura 및 Inouye, 1979); 2)상기 언급된 펩타이드 코드화 서열의 판독대중에 적절하게 위치한 해독 정지 시그날; 3) 상기 언급된 정지 시그날 아래쪽에 바로 인접되어 있고, 메티오닐-소의 성장 호르몬(met-bGH)을 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 판독대중에 있는 해독 개시 시그날; 및 4) met-bGH 코드화 서열의 판독대중에 적절하게 위치한 해독 정지 시그날을 함유한다.
플라스미드 pCZ101 출발물질은 약 10.8kb이고 플라스미드 pNM789B의 약 0.6kb xbaI-BamHI 단편을 유사하게 분해된 플라스미드 pIM-I'-A3에 연결함으로써 제조된다. 플라스미드 pIM-I'A3는 이·콜라이 리포프로테인 유전자의 전사 및 해독 활성화 서열 및 유도성 러너웨이 리플리콘(thermoinducible runaway replicon)을 함유하며, 일리노이스주 페오리아의 NRRL에 기탁된 균주인 이·콜라이K12RV308/pIM-I'-A3으로부터 얻을 수 있다. 이 균주는 기탁번호 NRRL B-15733(KFCC-10167, 한국종균협회(KFCC), 1985, 9. 7)하에서 플라스미드의 바람직한 공급원으로서 및 스톡 저장기로서 유용하다. 플라스미드 pNM 789B 출발물질은 제1 내지 8도 및 실시예1에 설명 및 기술된 단계에 따라 플라스미드 pKEN111로부터 유도된다. 플라스미드 pKEN111은 일리노이스주 페오리아의 NRRL에 기탁된 균주인 이·콜라이 K12CC 620/pKEN111로부터 얻을 수 있다. 이 균주는 기탁번호 NRRL B-15011(KFCC-10168, 한국종균협회(KFCC), 1985, 9. 7)하에서 플라스미드의 바람직한 공급원으로서 및 스톡 저장기로서 유용하다. 플라스미드 pNM 789B는 또한 이·콜라이 리포프로테인 유전자의 전사 및 해독 활성화 서열 및, 이외에 적절하게 위치한 해독 정지 시그날이 포함된, bGH N-말단에 bGH 및 9개의 플리펩타이드를 함유하는 융합 프로테인을 위한 코드화 서열을 함유한다. 상기의 XbaI-BamHI 단편중에 함유된 전사 활성화 및 융합 프로테인-코드화 서열을 적절하게 절단된 플라스미드 pIM-I'-A3에 연결시키는 공정으로 상기의 플라스미드 pCZ101출발물질을 얻는다.
그분야 전문가들이면 상기에 기술된 XbaI-HgiAI DNA링커가 플라스미드 pCZ114의 중요한 구성원임을 이해할 것이다. 이 링커는 1) 펩타이드 및 리보조옴 결합 부위를 동시에 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 판독 대중에 있는 해독 활성화 서열; 2) 상기의 펩타이드 코드화 서열의 판독대중에 적절히 위치한 해독 정지 시그날; 및 3) 상기의 정지 시그날 아래쪽에 바로 인접하고 있으면서 met-bGH코드화 서열의 한 부분의 판독대중에 있는 해독 개시시그날을 코드화한다. 남은 met-bGH코드화 서열(적절하게 위치한 해독 정지 시그날을 포함한) 및 전사 활성화 서열은 상기와 같이, 플라스미드 pCZ101의 적절한 단편의 연결에 의해서 쉽게 제조될 수 있다. 그와같은 연결공정으로 약 10.8kb 메틸오닐-소의 성장 호르몬(met-bGH)발현 플라스미드 pCZ114가 만들어진다. 그분야 전문가들이면 제1펩타이드 및 met-bGH 작용성 폴리펩타이드가 융합된 유전자 생성물은 함유하지 않고, 오히려, 단일 폴리시스트로닉 mRNA 전사체로부터 프로테인을 분리시키는 것처럼 해독되는 것을 이해할 것이다. 플라스미드 pCZ114의 제한 부위 지도는 제9도에 나타나 있다.
본 발명을 더욱 설명해 주는 많은 관련 bGH 발현 플라스미드를 또한 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정 DNA 링커 서열은 단일 mRNA 전사체로부터 2개 이상의 분리 폴리펩타이드를 발현시켜야 하지만, 그와 같은 제조에 사용될 수 있는 다수의 링커 DNA 서열은 실제적으로 제한이 없다. 이들 서열은 통상적으로는 완전히 보호된 디데옥시리보뉴클레오티드 빌딩블록을 사용하여 변형된 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성될 수 있다. 그와같은 합성법은 그분야에서 공지되어 있으며 이다꾸라등(Itakura et al., 1977, Science 198 : 1056) 및 크레아등(Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75 : 5765)의 공정에 따라 수행될 수 있다. 예가 되는 서열에는, 한정되어 있는 것은 아니지만, 다음과 같은 데옥시리보뉴클레오티드가 포함된다.
상기에 표시된 서열은 독립적으로 플라스미드 pCZ101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 및 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편에 연결되어 각각, 예로는 플라스미드 pCZ101.1, pCZ1000, pCZ1000.1, pCZ1060 및 pCZ1120을 제조할 수 있다. 이들 플라스미드는, 잔사에 따라, 제1펩타이드 및 또한 met-bGH모두를 코드화하는 단일 폴리시스트로닉 mRNA를 만들어 낸다.
특정 서열의 선택으로 본 발명의 가능성이 한정되지 않기 때문에 본 발명은 특정의 전사 활성화 서열의 사용에 의해 결코 제한 받지 않는다. 앞에서 예로 든 리포프로테인 활성화 서열 대신 치환될 수 있는 활성화 서열은, 한정되어 있지는 않지만, 이·콜라이 트립토판(trp), 이·콜라이 락토즈(lac), 박테리오파지 λ PLOL, 박테리오파지 λ PROR, 바실루스 서브틸리스 베지테이티브(Bacillus Subtillis vegetative)(veg) 및 스트렙토 마이세스 아주레우스 티오스트렙톤 내성(tsr)유전자 전사 활성화 서열이 포함된다. 그외에, 예를 들어, trp 및 lac 전사 활성화 서열과 같은 하나 이상의 전사 활성화 서열이 직렬로 사용될 수 있다. 상기 언급된 모든 서열은 이미 특징화 되었으며 합성적으로 또는 공지의 플라스미드로부터 제조될 수 있다.
더욱 특히, 트립토판(trp)전사 활성화 서열은 플라스미드 pHI 7△4△1의 EcoRI-ClaI분해에 의해서 얻어질 수 있다. 플라스미드 pHI 7△4△1은 실시예5의 공정에 따라 제조될 수 있다. 플라스미드 pHI 7△4△1중에 다수의 Tag I제한 부위가 존재하기 때문에, 미리 연결된 pHI 7△4△1 EcoRI-HpaI 및 HpaI-TagI 단편을 EcoRI-ClaI-표시된 플라스미드 pBR322로 클로닝 시킴으로써, 목적하는 EcoRI-TagI 단편을 가장 합리적으로 제조, 증폭시킬 수 있다. 생성된 약 4.6kb플라스미드(플라스미드 pNM 608로서 표시된다)는 trp 전사 활성화 서열을 함유하고 따라서 본 발명의 부가 태양을 제조하는 데 유용하다.
상기의 trp활성화 서열을 함유하는 대표적인 플라스미드는 1) 플라스미드 pNM 608의 약 0.29kb EcoRI-TagI 단편; 2) 플라스미드 pCZ101 약 10kb EcoRI-BamHI 단편; 3) 플라스미드 pCZ101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편; 및 4) 다음과 같은 데옥시리보 뉴클레오티드 서열의 어느것을 연결시킴으로써 제조될 수 있다 :
상기에 기술된 연결로 각각, 대표적인 약 10.8kb 플라스미드 pCZ105.1, pCZ105.2, pCZ106.1, pCZ112.1 및 pCZ112.2가 만들어진다. 이들 플라스미드는, 전사에 따라, 제1펩타이드 및 또한 met-bGH를 코드화 하는 단일 폴리시스트로닉 mRNA를 만들어 내므로 더욱 본 발명을 설명한다. 대표적인 플라스미드 pCZ105.1의 제한 부위 지도는 제9도에 나타나 있다.
본 발명은 상기에 예로든 met-bGH코드화 서열 대신 작용성 폴리펩타이드를 코드화 하는 어는 뉴클레오티드 서열로도 치환될 수 있을 만큼 아주 다양하다. 그와 같은 코드화 서열에는, 한정되어 있지는 않지만, 인체 성장 호르몬(hGH), 인체 전-성장 호르몬(pre-hGH), 돼지 성장 호르몬(pGH), 포유동물 성장 호르몬, 조류 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출-인자, 인체 인슐린 A 사슬, 인체 인슐린 B 사슬, 인체 프로인슐린, 인체 프리-프로인슐린, 인체 및 비-인체 인터페론, 유로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인터로이킨 II, 어느 폴리펩타이드 호르몬, 어느 폴리펩타이드 효소 및 리서치 또는 상업적으로 유용한 어느 생물학적 활성폴리펩타이드가 포함된다.
더욱 특히, hGH의 발현을 입증하는 대표적은 벡터는 플라스미드 pCZ101의 약 10.2bp BamHI-XbaI 단편 및 플라스미드 pNM575의 약 0.5kb BamHI-FunDII단편 모두를 다음 링커 서열과 연결시킴으로써 제조될 수 있다.
여기에서 A는 데옥시아데닐, G는 데옥시구아닐, C는 데옥시시토실이고 T는 티미딜이다.
생성된 플라스미드(플라스미드 pCZ1140으로 표시한다)는 연속적으로, 1) 리보조옴 결합 부위 및 서열 MET PHE PRO LEU GLU ASP ASP펩타이드 모두를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 판독대에 있는 이·콜라이 리포프로테인 유전자 전사 및 해독 활성화 서열(여기에서, MET는 메티오닌, PHE는 페닐알라닌, PRO는 프롤린, LEU는 로이신, GLU는 글루탐산이고, ASP는 아스파르트산이다); 2) 상기 언급된 펩타이드 코드화 서열의 판독대중에 적절하게 위치한 해독 정지 시그날; 3) 상기 언급된 정지 시그날 아래쪽에 바로 인접되어 있고 메틸오닐-인체 성장 호르몬(met-hGH)*을 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 판독대중에 있는 해독 개시 시그날; 및 4) met-hGH코드화 서열의 판독대 중에 적절하게 위치한 해독 정지 시그날을 함유한다. 상기의 링커 서열은 통상적으로는 이다꾸라등(Itakura et al., 1977) 및 크레아등(Crea et al., 1978)이 이미 밝힌 공정에 따라 합성될 수 있고 플라스미드 pNM575출발 물질은 제1 내지 4도에 설명된 스텝에 따라서 제조될 수 있다. 대표적인 플라스미드 pCZ1140의 제한 부위 지도는 제10도에 나타나 있다.
본 명세서에 기술되는 특정 태양에 있어서, 플라스미드 복제는 영국 특허 공보 제1,557,774호 및 울린등(Uhlin et al., 1979, Gene 6 : 91)에 의해 기술된 열유도성 러너웨이 리플리콘(thermoinducible runaway replicon)에 의해 측정된다. 30℃ 미만, 특히 25℃의 온도에서, 리플리콘은 세포당 약 10 내지 15카피(copy)의 비교적 낮은 카피수를 나타낸다. 온도가 37℃로 상승되는 경우에는, 카피 제어 기능이 마비되어, 리플리콘을 함유하는 플라스미드 DNA는 세포당 1000 내지 2000카피로 증폭된다. 본 명세서에서 예로 든 특정의 러너웨이 리플리콘은 이미 기술된 플라스미드 pIM-I'-A3 출발 물질중에 함유되어 있다.
본 발명이 어느 특정의 러너웨이 리플리콘 또는 카피수 돌연변이주의 사용에 제한을 받지 않음은 주지의 사실이다. 다른 유도성 러너웨이 또는 높은 카피수 리플리콘은 적절한 선택에 의해 얻어질 수 있거나 또는 국제 공보 제wo 82/02901호 및 비트너 및 바프넥(Bittner and Vapnek 1981, Gene 15 : 319)에 기술된 공정에 따라 제조될 수 있다. 그외에도, 이·콜라이, 바실루스, 스트렙토마이세스 또는 다른 적절한 미생물의 숙주 세포에서 작용할 수 있는 비-러너웨이 리플리콘이면 또한 이용될 수 있다. 대표적인 리플리콘의 예에는, 한정되어 있는 것은 아니지만, 이·콜라이에서 복제하는 박테리오로파지가 포함된 pMBl, ColEl, RK2, NR1, RK6, pSC101, RP1, RP4, F등으로부터 얻어지는 리플리콘; 스트렙토마이세스에서 복제하는 박테리오파지가 포함된, pEL7, pEL103, SCP2*등으로부터 얻어지는 리플리콘; 및 바실루스에서 복제하는 박테리오파지가 포함된, pC194, pBS1, pE194, pUB110, pT127등으로부터 얻어지는 리플리콘이 포함된다. 그 분야 전문가이면 이들 리플리콘 및 또한 여러 가지의 다른 러너웨이 리플리콘을 대신 사용하여 본 발명의 범위내에 있는 발현벡터를 제조할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 대표적인 DNA서열 및 플라스미드의 많은 다른 변형이 있을 수 있다. 예를 들어, 유전 코드의 퇴화로
해독 정지 시그날이
또는
해독 정지 시그날로 치환되는 것뿐 아니라 특정의 아미노산 코드화 부분의 치환이 일어난다.
또한, 벡터의 전사 활성화 서열 및 제2해독 개시코돈 사이의 뉴클레오티드 수와 종류는 적절한 해독 시그날(리보조옴 결합부위 및 제1해독 개시 및 정지 시그날)이 제공됨에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 범위내에서의 다른 변형에는 1)하나 이상의 뉴클레오티드를 첨가함에 따른 제2해독 개시 시그날에 상응하는 제1해독 정지 시그날의 판독대의 쉬프팅(shifting); 2)그 판독대를 유지함에 따른, 제1해독 정지 시그날과 제2해독 개시 시그날 사이의 하나 이상의 뉴클레오티드 트리플렛의 배석; 및 3)제1해독 개시 및 정지 시그날 사이에 뉴클레오티드 트리플렛을 첨가함에 따른 제1시스트론(전사활성화 서열 및 제1해독 정지 시그날 사이 및 이들을 포함한 부분)의 길이의 변화가 포함된다.
시스트론의 길이는 정해져 있지는 않지만, 2 내지 20개의 아미노산을 코드화하는 비교적 짧은 제1시스트론이 바람직하다. mRNA중의 상보적 염기의 생성을 방지하기 위해서는, 주커 및 스티글러(Zuker 및 Stiegler, 1981, Nucleic Acids Research 9(1) : 133)가 밝힌 원리에 따라, 제1시스트론을 함유하는 뉴클레오티드 트리플렛을 선택해야 한다. 그와같은 상보적 염기 사이의 수소 결합으로 스템 앤드 루프 배위 및 해독의 효능을 감소시키는 것으로 믿어지는 폴딩(folding)이 이루어진다. 바람직하게는, 전사에 따라, 제1시스트론을 함유하는 뉴클레오티드 트리플렛은 또한, 제2해독개시 코돈으로부터 위쪽에 위치한 리보조옴 결합 부위를 제공해야 한다. 이것은 아미노산을 지정할 뿐아니라 또한 함께 취해질 경우에는, 목적하는 리보조옴 결합부위를 함유하는 적어도 2개의 코돈을 생성하는 뉴클레오티드 트리플렛들을 선택하므로써 가능하다.
그 분야 전문가들은 상기에 기술된 변이체 모두가 이미 밝혀진 합성법에 따라 통상적으로 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 특별히 예로드는 DNA서열 및 플라스미드로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 1)콘피턴트 세포(Competent cell)를 a)펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 판독대 중에 있는 전사 및 해독 활성화 서열(이때, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 코드화 서열은 이 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 카복시 말단을 코드화하는 뉴클레오티드 트리플렛 아래쪽에 바로 인접하여 위치하는 해독 정지 시그날을 함유한다) b)상기의 정지 시그날 아래쪽에 바로 인접하여 있고 작용성 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 판독대중에 있는 해독 개시 시그날(이때, 작용성 폴리펩타이드코드화 서열은 이 작용성 폴리펩타이드의 카복시 말단을 코드화하는 뉴클레오티드 트리플렛 아래쪽에 바로 인접하여 위치하는 해독 정지 시그날을 함유한다)을 함유하는 선택성 및 자발적으로 복제하는 재조합체 DNA발현 벡터로 형질 전환시키고 2)이 형질전환 세포를 유전자 발현에 적합한 증식 조건하에서 배양시킴을 특징으로 하여 작용성 폴리펩타이드를 제조하는 신규의 방법에 관한 것이다.
본 발명에 이르러서야, 비로소, mRNA가 불안정하고, 적절한 배위가 부족하거나 또는 리보조옴의 아주 유효한 결합에 적합한 서열이 부족한 경우에 발생하는 유전자 발현이 아주 낮은 비율로 이루어지거나 또는 전혀 이루어지지 않는 문제를 해결할 수 있게 되었다. 본 발명은 2개의 시스트론을 함유하는 단일 mRNA전사체를 생성함으로써 이 문제를 해결하였다. 전사에 따라, 정보의 제1시스트론을 함유하게 되는 벡터의 제1펩타이드 또는 폴리펩타이드 코드화 서열은, mRNA중에서 스템 앤드 루프의 제2구조가 형성되지 않도록 설계되어 있다. 그와 같은 배위는(적절한 리보조옴 결합을 방해하고 및 따라서 해독 및 발현을 방해하는 것으로 믿어지는, 전사에 따라, 상보적 염기를 생성하지 않는 뉴클레오티드를 선택함으로써 피할 수 있다. 이 공정은 유전 코드의 퇴화 및 이미 보고된 원리 및 방법(Zuker and Stiegler, 1981)모두에 따라 수행될 수 있다. 본 발명은, 제한이 없으며, 있더라도 거의 없다. 따라서, 본 발명의 방법은 실제적으로 리서치 또는 상업적 가치가 있는 어떤 폴리펩타이드를 코드화하는 발현 벡터에 유용하다.
본 발명을 이용, 또한 서열을 첨가하여 불안정한 RNA를 안정화 시키거나 리보조옴 결합 및 mRNA 해독의 개시를 방해하는 서열을 제거하거나 대체시킬 수 있다.
발현 벡터 및 본 발명의 방법은 광범위한 숙주 미생물, 예를 들어, 에스케리치아 콜라이(예; 이·콜라이 K12, 이·콜라이 K12 RV308, 이·콜라이 K12 HB 101, 이·콜라이 K12 C600, 이·콜라이 K12 C600 Rk-Mk-, 이·콜라이 K12 RR1 및 이·콜라이 K12 MM294), 세라티아(Serratia), 슈도모나스(Pseudomonas)등과 같은 그람-음성원핵생물; 바실루스(예; 비. 서브틸리스, 비. 투링엔시스(B. thuringiensis), 및 비. 투링엔시스 변이주), 이스라엘렌시스(israelensis), 및 스트렙토마이세스(예; 에스. 프라디아제(S. fradiae), 에스. 암보파시엔스(S. ambofaciens), 에스. 리비단스(S. lividans) 및 에스. 그리세오푸스쿠스(S. griseofuscus)와 같은 그람-양성 원핵 생물이 사용될 수 있다. 본 발명의 양태의 모든 것이 유용하지만, 몇가지 벡터 및 형질 전환체가 더 바람직하다. 바람직한 벡터에는 pCZ114, pCZ101.1, pCZ105.1, pCZ105.2, pCZ106.1, pCZ112.1, pCZ112.2 및 pCZ1140이 포함되고 바람직한 형질전환체에는 이·콜라이 K 12RV308/pCZ 114, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 101.1, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 105.1, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 106.1, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 112.1 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1140이 포함된다. 이들 바람직한 그룹중에서, 플라스미드 pCZ 114 및 pCZ 101.1 및 형질전환체 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 114 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 101.1이 특히 바람직하다.
그 분야 전문가들이면 표준 발효 조건하에서 외인성 프로테인 생성물을 발현시킬 수 있는 적절한 숙주 미생물을 발현 벡터 및 본 발명의 방법을 이용하여 형질전환시킬 수 있음을 이해할 것이다. 이어서 외인성 프로테인 생성물을 통상의 방법에 의해 생성된 발효 육즙으로부터 분리한다. 다음 실시예들은 본 발명을 더욱 설명해 준다. 본 발명품을 제조하는 실제 공정 및 설명이 적절히 기술되어 있다.
[실시예 1]
[플라스미드 pNM 789B의 제조 ]
A. 플라스미드 pKEN 021 및 그의 XbaI-BamHI단편의 제조
플라스미드 pKEN 012을 XbaI-BamHI로 분해하여 생긴 약 5.1kb단편(제3도의 106)을 출발물질로서 사용한다. 플라스미드 pKEN 021은 pKEN 111의 파생물이며,(제1도의 101이고 Lee, et al,. 1981, J. Bact. 146; 861-866 및 Zwiebel, et al., 1981, J. Bact. 145; 654-656에 더욱 상술되어 있음)이·콜라이 cc620에 이입되어 기탁되어 있고(NRRL 15011), 이·콜라이의 리포프로테인 유전자를 함유하는 약 2.8kb 단편을 갖는다. 나가무라와 이노우에(1979, Cell 18 : 1109-1117)가 이들 단편을 밝혀냈다. pKEN 021에 있어서, pBR322의 유일한 EcoRI와 SalI 제한부위 사이에 있는 650bp(염기쌍)서열은, 이·콜라이의 리포프로테인 유전자로부터 얻어지는 서열로 대체되었다. 리포프로테인 유전자 서열에는(나가무라와 이노우에, 1979) 프로모터, 5'비전달 부분 및 리보조옴(ribosome) 결합 부위를 함유하는 리포프로테인 유전자의 처음 세개(메티오닌)로부터 위쪽으로, 462bp AluI 단편이 포함된다. 유일한 XbaI 제한 부위는 개시 메티오닌 시그날 전의 리보조옴 결합 부위내에(16bp)편재되어 있다. 구조 유전자의 전달 말단 코돈으로부터 위쪽으로 105bp에 있는 PvuII 제한 부위는 합성 DNA링커(콜라보라티브 리서치로부터 얻어지는 5'CCGGATCCGG3')를 첨가함으로써 BamHI제한 부위로 바뀐다. 리포프로테인의 마지막 35개의 아미노산의 코드화 서열, 해독 말단 시그날, 및 mRNA의 3'비해독 부분에 상응하는 서열은 BamHI부위뒤에 있다. 또한 플라스미드 pKEN 021에는 서로(리포프로테인 유전자와)관련은 없으나 이·콜라이 크로모좀의 리포프로테인 아래에 위치하는 850bp의 외래 서열이 포함되어 있다. 이들 서열이 그 방법의 결과로서 포함되며 제한 효소 부위가 유전자의 기원 분리에 이용된다.
제1, 2, 및 3도를 참고로 하여, 다음 방법으로 pKEN 111로부터 플라스미드 pKEN 021을 유도한다 : 약 50㎍의 pKEN 111(제1도의 101)을 20mM 트리스. HCI(pH 7.4), 10mM MgCl2,및 6mM β-머캅토에탄올을 함유하는 300㎕의 완충액중의 25단위의 HpaII 제한효소로 37℃에서 2시간 동안 분해한다. 그 혼합물을 300㎕의 페놀 및 클로로포름 50 : 50 혼합물로 추출하고, 이어서 회수된 수상을 2.5용적의 에탄올 및 0.1용적의 3M 나트륨 아세테이트로 침전시킨다. DNA펠릿을 100㎕의 전기영동 완충액중에 녹이고 5% 폴리아크릴 겔(아크릴아미이드 : 비스 비는 특별히 밝혀진 곳을 제외하고는 모든 겔에서 29 : 1 이다)상에 분배시킨다. 그 겔을 0.5㎍/ml의 에티듐 브로마이드를 함유하는 용액중에서 착색시키면 강파장 자외선하에서 밴드가 나타난다. 950bp밴드를 분리하고 전기용출에 의해 겔로부터 투석백으로 회수한다. 페놀/CHCl3추출 및 에탄올 침전후에 회수된 DNA(약 2.5㎍)를 25㎕의 TEN(10mM NaCl, 10mM 트리스. HCl, pH 7.4 및 1mM 나트륨 에틸렌디니트릴로 테트라아세테이트(EDTA) pH 8.0)중에 녹인다.
50mM NaCl, 6mM 트리스. HCl(pH 7.6), 6mM MgCl2,및 6mM β-머캅토 에탄올중, 37℃에서 2시간 동안 약 2㎍의 950bp HpaII 단편을 AluI 제한효소로 분해한다. DNA를 6% 폴리아크릴아미드 겔상에 분배시키고 생성되는 462bp AluI단편을 회수하여 상기에 기술된 방법으로 정제한다. 462bp AluI단편(약 1㎍)을 150피코몰의 인산화 EcoRI링커(콜라보라티브 리서치의 5'GGAATTCC3') 및 2단위 T4 DNA리가제(ligase)를 함유하는 10㎕의 T4 DNA리가제 완충액(66mM 트리스. HCl pH 7.6, 10mM 디티오트레이톨, 0.4mM ATP)중에 용해시킨다. 4℃에서 16시간 동안 인큐베이트시킨 후에 그 혼합물을 65℃에서 10분동안 가열하고 EcoRI완충액 (100mM 트리스. HCl pH 7.2, 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올) 및 40단위 EcoRI효소로 100㎕로 희석한다. 37℃에서 2시간 후에, 이 샘플을 통상적으로 페놀/CHCl3로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 이어서 0.1단위 T4 DNA리가제 및 EcoRI로 직선화되고 알카리성 포스파타제로 처리된 0.1㎍ pBR 322(제1도의 102)를 함유하는 20㎕의 T4 DNA리가제중에 DNA를 용해시킨다. 4℃에서 16시간 동안 연결(ligation)시킨 후, 생성되는 DNA를 사용하여 이·콜라이 균주 K12 HB 101을 통상적으로 형질전환시킨다. 12㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 한천 평판 상에서 형질 전환체를 선별하고 비른 보임 및 돌리(Birnboim and Doly, 1979, Nucleic Acids Research 7 : 1513-1523)가 밝힌 신속한 알카리성 추출 공정에 의해 내성 콜로니로부터 플라스미드를 분리시킨다.
466bp XbaI-BamHI단편을 함유하는 플라스미드(제1도의 103)를 선택하여 다음에 기술되는 공정의 출발물질로서 사용한다.
약 2㎍의 이 플라스미드(제2도의 103)을 50㎕의 HindIII 완충액(60mM Nacl, 10mM 트리스. HCl, pH 7.4, 10mM MgCl2및 6mM β-머캅토에탄올)중, 37℃에서 1시간 동안 2단위의 HindIII 효소로 분해시킨다. 페놀/CHCl3로 추출하고 에탄올로 침전시킨 후에, 300mM NaCl, 30mM 나트륨 아세테이트 pH 4.25, lmM ZnCl2및 200단위의 SI 뉴클레아제(마일즈 래보라토리즈)를 함유하는 200㎕의 완충액중에 DNA를 용해시킨다. 15℃에서 1시간후에, 페놀/CHCl3로 추출하고 에탄올로 침전시켜 반응을 정지시킨다. 생성된 DNA를 20피코몰의 인산화 BamHI링커(콜라보라티브 리서치) 및 20단위 T4 DNA리가제를 함유하는 10㎕ T4 DNA리가제 완충액중에 용해시킨다. 4℃에서 16시간 후에, 그 반응 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하여 리가제를 불활성화시키고, 이어서 20단위의 BamHI효소를 함유하는 BamHI완충액(150mM NaCl, 20mM트리스. HCl, pH8. 0,10mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에서 100㎕로 희석한다. 37℃에서 2시간 후에, 그 혼합물을 1% 아가로즈 겔상에서 정제시킨다. 그 겔을 염색하고 동결시킨 후 용출하여 거대 단편(∼4.5kb)을 회수하고 이어서 페놀/CHCl3로 추출하고 에탄올로 침전시켜 정제한다. 회수된 BamHI점성 말단(cohesive ends)을 갖는 단편을 0.1단위의 T4 DNA리가제를 함유하는 20㎕의 T4 DNA리가제 완충액중에 용해시킨다. 4℃에서 16시간 후에, 그 DNA를 사용하여 이·콜라이 HB101을 형질전환시킨다. 100㎍/ml에서 암피실린에 내성인(Apr)형질전환체를 선택하고 10㎍/ml테트라사이클린 감수성(Tcs)에 대해 스크린한다. AprTcs인 콜로니부터 상기의 비른보임 공정에 의해 제조되는 여러 가지 플라스미드를 가지고 HindIII부위의 부제 및 하나의 BamHI부위의 존재에 대해 조사한다. EcoRI, SalI으로 차례로 분해하여 466bp 및 305bp단편을 얻는다. 이들 특징을 갖는 플라스미드(제2도의 104)를 선택하고 이어서 변형시켜 1pp프로모터의 위쪽에 위치하는 EcoRI부위를 HindIII 제한 부위로 전환시킨다.
100㎕의 EcoRI완충액중 37℃에서 10분간 2㎍의 플라스미드(제2도의 104)를 0.2단위의 EcoRI으로 분해시킨다. 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 정지시키고 이어서, 페놀/CHCl3로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 후, 침전된 DNA를 1000단위/ml에서 S1뉴클레아제를 함유하는 200㎕의 S1뉴클레아제 완충액중에 용해시키고 12℃에서 1시간동안 반응시킨다. 페놀/CHCl3추출 및 에탄올 침전에 의해 반응을 정지시킨다. 생성 DNA를 20피코몰의 인산화 HindIII링커(콜라보라티브 리서치의 5'CCAAGCTTGG
3') 및 2단위의 T4 DNA리가제를 함유하는 10㎕의 T4 DNA리가제 환충액중에 재현탁시킨다. 4℃에서 16시간 후에, 그 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하고, 10단위 HindIII 효소를 함유하는 HindIII 완충액에 150㎕로 희석한 다음 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고 이어서 1% 아가로즈 겔상에 분배한다. 가장 큰 밴드(하나의 절단 플라스미드와 동등한)를 통상적으로 회수하여 정제하고, 0.2단위 T4리가제를 함유하는 20㎕ T4리가제 완충액중에 용해시킨 다음, 4℃에서 16시간 인큐베이션시키고, 이어서 이것으로 이·콜라이 HB 101을 형질전환시킨다. 암피실린에 내성인 형질전환체를 선택하여 통상적으로 제한효소로 분석함으로써 플라스미드를 분리한다. 500bp의 EcoRI-HindIII단편을 갖는 플라스미드(제2도의 105) 선택하여 1pp 유전자의 3'부분의 부가용 클로닝 벡터로서 사용한다.
약 2㎍의 플라스미드(제3도의 105)를 50㎕의 SalI제한 완충액(150mM NaCl, 6mM트리스. HCl, pH 7.9, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에서 2단위의 SalI으로 37℃에서 1시간동안 분해시키고 이어서 2단위 BamHI 을 함유하는 BamHI 완충액중에서 150㎕로 희석한다. 37℃에서 1시간 후에, 2.5단위의 알카리성 포스파타제를 가하고 이어서 인큐베이션을 65℃에서 1시간동안 계속한다. 이것을 페놀/CHCl3로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 후, TEN중에 용해시킨 다음, 1pp 3'단편용 클로닝 벡터로서 사용한다.
1pp 3'부분을 함유하는 단편을 얻기 위하여, 10㎍의 pKEN 111(제3도의 101)을 200㎕의 HpaI 완충액(200mM kCl, 10mM트리스. HCl, pH 7.4, 10mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중, 37℃에서 2시간 동안 10단위의 HpaI으로 분해한다. 페놀/CHC13의 추출 및 에탄올 침전 공정후에, DNA를 20피코몰 인산화 SalI링커(콜래보라티브 리서치의 5'GGTCGACC 3') 및 2단위 T4 DNA리가제를 함유하는 10㎕ T4 DNA리가제 완충액중에 용해시키고 이어서 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션 시킨다. 65℃에서 10분간 가열하여 리가제를 불활성화시킨다. 생성물질을 10단위의 SalI을 함유하는 SalI완충액 중에서 100㎕로 희석하고, 이어서 10단위 PvuII 제한 효소를 함유하는 PvuII완충액(60mM NaCl, 6mM트리스. HCl, pH 7.5, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에서 300㎕로 희석한다. 37℃에서 1시간 후에, DNA를 5% 폴리아크릴아미드 겔상에 분배시킨다. 약 0.5㎍의 950bp단편을 회수, 정제하고 TEN중에 용해시킨다. 0.2㎍의 단편을 20피코몰의 인산화 BamHI 링커(5'CCGGATCCGG 3' 콜래보라티브 리서치로부터 제조됨) 및 2단위 T4 DNA리가제를 함유하는 20㎕ T4 DNA리가제 완충액으로 희석한 다음 4℃에서 16시간동안 인큐베이션 시킨다. 이어서 생성 DNA를 65℃에서 10분간 가열하고, 20단위 BamHI을 함유하는 BamHI 완충액중에 100㎕로 희석한 다음 37℃에서 2시간동안 인큐베이션시키고, 이어서 5% 폴리아크릴아미드 겔상에 분배하여 과량의 링커분자를 제거한다. BamHI 및 SalI 점성 말단을 갖는 950bp의 생성단편을 통상적으로 정제한 다음 전술된 0.2㎍의 클로닝 벡터 및 0.2단위 T4 DNA 리가제를 함유하는 20㎕의 T4 DNA리가제 완충액중에 용해시킨다. 4℃에서 16시간동안 인큐베이션 시킨후에, 그 DNA를 사용하여 이·콜라이 K12 HB101을 형질전환시킨다. 암피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고 통상적으로 SalI-BamHI단편을 분석한다. 목적하는 플라스미드(∼5.2kb)를 pKEN021(제3도의 106)로 나타낸다. 10㎍의 pKEN021을 200㎕의 XbaI/BamHI 완충액(150mM NaCl, 10mM트리스. HCl, pH 8, 10mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에서 10단위의 BamHI을 사용하여 37℃에서 1시간동안 분해하고 이어서 10단위의 XbaI을 사용하여 37℃에서 1시간 더 분해시킨다. 이어서 목적하는 XbaI-BamHI-분해 DNA를 2.5단위의 알카리성 포스파타제로 65℃에서 1.5시간동안 처리하고, 페놀/CHCl3로 추출한 다음, 에탄올로 침전시켜 모아서, 후에 사용할 수 있도록 50㎕의 TEN중에 용해시켜 둔다(제3도의 107).
B. 플라스미드 pNM 575의 제조
먀샬등의 밝힌(Martial et al., 1979, Science 205 : 602-607)플라스미드 ptrp ED 50ch GH 800을 인체 성장 호르몬 유전자 부분의 코드화 서열을 함유하는 DNA 단편의 공급원으로서 사용한다. 또한 이 단편은 또한 합성적으로 구성될 수 있거나(Itakura et al., 1977 and Crea et al., 1978) 또는 굳만등이 밝힌(Goodman et al., 1979, Methods in Enzymology 68 : 75-90) 인식방법론을 이용하여, 인체 전립선으로 부터 인체 성장 호르몬을 코드화하는 mRNA를 분리함으로써, 얻어질 수 있다. 인체 성장호르몬 유전자부의 플라스미드 ptrp ED 50ch GH 800은 유전자의 전달 말단 코돈으로부터 6bp 아래에 유일한 SamI 제한 부위을 갖는다. 이 부위를 다음 공정을 이용하여 BamHI 부위로 바꾼다 : 6㎍의 플라스미드를 200㎍의 SmaI 제한 완충액(15mM 트리스. HCl, pH 8.0, 6mM MgCl2, 15mM Kcl 및 6mM β-머캅토에탄올)중, 37℃에서 1.5시간 동안 6단위의 SmaI으로 분해시킨다. 분해가 완전히 이루어진 후에, 페놀/CHCl3로 추출하고, 에탄올로 침전시켜서 DNA를 회수한 다음 24㎍의 TEN중에 용해시킨다. 40피코몰의 인산화 BamHI 어댑터 단편(콜래보라티브 리서치로부터 제조된다)를 2단위 T4 DNA 리가제를 함유하는 16㎕의 리가제 완충액중의 0.5㎍(0.5피코몰 말단)의 상기의 분해된 플라스미드에 가한다. 그 혼합물을 22℃에서 2시간, 4℃에서 16시간, 그리고 65℃에서 10분간 인큐베이션 시킨다. BamHI 제한효소로 통상적으로 분해함으로써 BamHI 점성말단을 만든다. 그 효소는 클론화된 인체 성장 호르몬 cDNA 서열의 개시부에 위치한 BamHI 부위뿐만 아니라 링커 서열을 절단한다. 이로써 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리되는 점성의 BamHI 말단을 갖는 691bp 단편을 얻고 이어서 통상적으로 회수한다. 회수된 DNA 단편을(전술된 조건하에서 20㎕ 완충액의 0.2단위 T4 DNA 리가제를 사용하여)0.2㎍의 BamHI으로 분해되고 알카리성 포스파타제로 처리된 pBR322(제4도의 102)와 연결한다. 4℃에서 16시간후에, 그 물질을 사용하여 웬싱크등의 형질전환공정(Wensink et al., 1974, Cell 3 : 315-325)에 따라 이·콜라이 균주 JA 221(NRRL No. B-15014)을 형질전환시킨다. 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 한천 평판상에서 형질전환체를 선택하고 이어서 통상적으로 플라스미드를 분리하여 제한 효소 및 겔 전기영동 분석에 의해 확인한다. pNM575(제4도의 109)로서 표시되는 목적하는 플라스미드는 약 700bp의 BamHI 단편을 함유하며 통상적으로 증폭되어서 그후의 용도에 쓰일 수 있다.
C. 플라스미드 pNM702의 제조
성인 성장 호르몬의 DNA 서열은 첫번째 뉴클레오티드로부터 47bp에 있는 하나의 FunDII 부위를 갖는다. 25㎍의 pNM575를 250㎕의 BamHI 완충액중, 37℃에서 1시간동안에서 25단위의 BamHI으로 분해시킨다. BamHI점성 말단을 갖는 691bp 단편을 6% 폴리아크릴아미드 겔로부터 통상적으로 분리하여 정제한다. 그 단편을 정제시킨 후에 그것의 1/3(8㎍의 플라스미드와 당량의)을 100㎕의 FunDII 완충액(6mM NaCl, 6mM 트리스·HCl, pH 7.4, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중, 37℃에서 1.5시간 동안 2.5단위 FunDII로 분해시킨다. 6% 폴리아크릴아미드 겔상의 전기영동 및 표준 회수 공정을 이용하여 전달 정지 시그날이 뒤따르는 HGH의 마지막 175개 아미노산을 코드화하는 서열을 함유하는 538bp DNA 단편을 분리한다.
1pp 프로모터의 부분을 인체 성장 호르몬 코드화 부분과 연결하는 포스포트리에스테르법에 의해 겹가닥 DNA단편(제5도의 110)을 합성한다. 그 겹가닥 DNA 단편(제5도의 110)은 다음의 서열을갖는다 :
XbaI
그 단편은 다음 서열을 제조하는 인지된 포스포트리에스테르 방법론에 의해 제조된다 :
1) CTAGAGGTAT
2) TAATAATGTTCC
3) CATTGGATGAT
4) GATGATAAGTTCC
5) CAACCATTCCC
6) TTATCCAGGC
7) TTTTTGACAACG
8) CTATGCTCCG
9) CATTATTAATACCCT
10) ATGGGAA
11) CTTATCATCATCCA
12) GGTTGGGAA
13) GGATAAGGGAAT
14) GTCAAAAAGCCT
15) CGGAGCATAGCGTT
상기의 제조단편을 이용하여, T4 리가제로 촉매되는 결합 반응을 아래와 같이 기술하는 바와 같이 단계적으로 수행한다 :
a)5'-인산화 단편 9의 존재하에서 T4 리가제를 사용하여 5'-비인산화 단편 1을 5'-인산화 단편 2에 결합시켜 DNA 듀플렉스(duplex)1을 제조한다(Brown et al., 1979, Methods in Enzymology 68 : 109-151). 15% 폴리아크릴아미드상의 예비 겔 전기 영동법에 의해서 그 듀플렉스를 분리한다.
b) 5'-인산화 단편 11의 존재하에서 T4 리가제를 사용하여 5'-인산화 단편 3을 5'-인산화 단편 4에 결합시켜 DNA 듀플렉스 2를 만들고, 이것을 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 정제한다.
c) 5'-인산화 단편 12 및 13의 존재하에서 T4 리가제를 사용하여 5'-인산화 단편 5를 5'-인산화 단편 6에 결합시켜 DNA 듀플렉스 3을 만들고, 이것을 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 정제한다.
d) 5'-인산화 단편 14 및 5'-비인산화 단편 15의 존재하에서 T4 리가제를 사용하여 5'-인산화 단편 7를 5'-인산화 단편 8에 결합시켜 DNA 듀플렉스 4를 만들고 이것을 15% 폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의해 정제한다.
e) DNA 듀플렉스 2,3 및 4를 T4 리가제를 사용하여 서로 결합시켜서 DNA 듀플렉서 5를 만들고 이것을 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의해 정제한다.
f) T4 리가제의 존재하에서, 5'-인산화 단편 10 및 DNA 듀플렉스 5를 DNA 듀플렉스 1에 가한다. 생성되는 DNA 듀플렉스(제5도의 110)을 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 정제한다. 이어서 이 DNA 듀플렉스를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 [r-P32]ATP를 사용하여 다음의 공정에 따라 효소적으로 인산화시킨다.
24㎕의 연결화 완충액중의 0.1 피콜몰(0.4㎍)의 XbaI-BamHI 단편의 플라스미드 pKEN021(제5도의 107), 0.025 피코몰의 합성 DNA 단편(제5도의 110) 및 0.3피코몰(0.08㎍)의 538bp 단편(제5도의 109로부터 얻어진다)을 1.5 단위의 T4 DNA 리가제를 사용하여 효소적으로 연결시킴으로써 발현 플라스미드 pNM702를 제조한다. 4℃에서 16시간동안 인큐베이트시킨 후에, 그 혼합물을 사용하여 전술한 바와 같이 E.Coli JA 221을 형질전환시킨다. 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 한천 평판상에서 형질전환체를 선택하여 목적하는 발현 플라스미드의 바람직한 공급원으로서 통상적으로 배양시킨다.
인체 성장 호르몬의 발현을 표준 방사면역 공정(Twomey et al., 1974, clin-chem. 20 : 389-391)에 의해 탐지하고 세포당 적어도 2백만 분자가 존재하는 지를 측정한다.
D. 플라스미드 pNM789의 제조
인체 성장 호르몬용 발현 플라스미드인 플라스미드 pNM702(제6도의 111)를 -Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Lys-bGH의 제조용 출발 물질로서 사용한다.
밀러등이(Miller et al., 1980, J. Biol. chem. 255 : 7251-7524), 밝힌 플라스미드 pBP348(제6도의 112)을 소성장 호르몬 유전자부를 코드화하는 서열을 함유하는 두개의 DNA 단편의 공급원으로서 사용한다. 그 플라스미드는 pBR322의 PstI 제한 부위에 클론화되는 831bp 소 성장 호르몬-코드화서열을 함유한다. 소 성장 호르몬용 서열은 밀러 등의(1980) 방법을 이용하여 합성적으로 제조하거나(Itakura et al., 1977 및 Crea et al., 1978)또는 굳만등(1979)에 의해 밝혀진 최신의 공정에 의해서 소의 전립선으로부터 분리된 mRNA로부터 얻을 수 있다.
인체 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬용의 코드화 서열은 아주 유사하고 거의 같게 보여진다. 재한 효소 PvuII로 분해되어 생성되는 단편이 소 성장 호르몬용 발현 플라스미드의 제조에 특히 유용하다. 생성되는 단편의 크기는 인체 성장 호르몬이 497bp이고 소 성장 호르몬이 494bp이며 상응하는 제한 부위는 모든 서열에서 동일한 판독대중(reading frame)에 생긴다.
10㎍의 pNM702(제6도의 111)를 200㎕의 PvuII 제한 완충액(60mM NaCl, 6mM트리스·HCl, pH 7.5, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중, 37℃에서 10분간 1단위의 PvuII로 부분적으로 분해시킨다. 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 정지시킨 후에, DNA를 알카리성 포스파타제로 처리하고, 그 단편을 1% 아가로즈 겔상에서 분리한다. 497bp PvuII 단편이 없는 DNA(1회 절단된 플라스미드보다 약간 빨리 진행한다)에 상응하는 크기의 직선 DNA 단편(제6도의 113)을 통상적으로 잘라내고, 정제하여 중간 플라스미드(제6도의 114)의 제조에 사용한다.
10단위의 PvuII를 함유하는 200㎕ PvuII 완충액중, 37℃에서 1시간 동안 10㎍의 플라스미드 pBP348를 분해하여 플라스미드 pBP348의 496bp PvuII 단편을 제조한다. 그 단편을 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하고 통상의 방법으로 목적하는 494bp 단편(제6도의 112로부터 얻어진다)을 확인, 정제 한다.
0.2㎍의 플라스미드 pNM702 PvuII 단편을 2단위 T4 DNA 리가제를 함유하는 20㎕의 T4 DNA 리가제완충액중, 4℃에서 16시간 동안 0.05㎍의 494bp 단편의 반응시켜서 중간 플라스미드(제6도의 114)를 제조한다. 형질전환 후에 암피실린에 내성인 형질전환체를 선택하여, 494bp PvuII 단편의 존재 및 적절한 배위에 의해서 플라스미드를 분석한다. 제조공정을 계속 진행하기 위하여 494bp PvuII 단편 및 440bp XbaI-SmaI 단편을 갖는 플라스미드를 선택한다.
10㎍의 중간 플라스미드(제7도의 114)를 37℃에서 5분간 200㎕ PvuII 완충액중의 1단위 PvuII로 분해한다. 65℃에서 10분간 가열 후에, 그 혼합물을 1% 아가로즈겔상에 퍼뜨리고 분자당 오직 하나의 PvuII 절단이 이루어진 직선 DNA를 회수하여 정제한다. 이 회수 물질(약3㎍)을 5단위의 XbaI으로 완전히 분해한 뒤 알카리성 포스파타제로 처리한다. 그 단편을 1% 아가로즈 겔상에 퍼뜨리고 가장 큰 단편(인체 및 소 성장 호르몬중의 XbaI 및 제1PvuII 부위 사이의 109bp 단편 이 소실된)을 통상적으로 회수한다(제7도의 115).
처음 23개 아미노산(69bp)의 소 성장 호르몬의 DNA 서열은 첫번째 PvuII 부위까지 2개의 HpaII 제한 부위를 함유하며, 그들중의 첫번째 제한 부위는 개시 뉴클레오티드의 코드화 서열로부터 23bp에 있다. 63bp 단편(제7도의 116)은 포스포트리에스테르법에 의해 합성된다. 이 단편은 ATG 해독 개시 시그날과 그 뒤의 Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lsy(24bp)를 코드화하는 서열 및 소 성장 호르몬 코드화 서열의 20뉴클레오티드(phe로부터 첫번째 HpaII 부위까지)를 포함하여 1pp 리보조음 결합 부위 중의 XbaI부위로부터 19bp 서열까지의 상응한다. 그 단편은 다음의 서열을 갖는다.
XbaI
63bp 단편을 제조함에 있어서, 다음의 9개 단편을 준비한다.
1) CTAGAGGGTAT
2) TAATAATGTTCC
2) CATTGGATGAT
4) GATGATAAGTTCC
5) CAGCCATGTCCTTGTC
6) ATGGGAACATTATTAATACCCT
7) TTATCATCATCATCCA
8) ATGGCTGGGAAC
9) CGGACAAGGAC
상기의 제조단편을 이용하여, T4 리가제로 촉매되는 결합 반응을 아래와 같이 단계적으로 수행한다.
a) 5'-인산화 단편 6의 존재하에서 T4 리가제를 사용하여 5'-비인산화 단편 1을 5'-인산화 단편 2에 결합시켜 DNA 듀플렉스 1을 만들고, 이것을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의해 정제한다.
b) 5'-인산화 단편 3,4 및 5를 5'-인산화 단편 7 및 8과 5'-인산화 단편 9의 존재하에서 T4 리가제를 사용하여 DNA 듀플렉스 2를 만들고, 이것을 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 정제한다.
c) 이어서 듀플렉스 1 및 2를 T4 리가제로 결합시켜 DNA 듀플렉스(제7도의 116)를 만들고, 이것을 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 정제한다. 이어서 이 DNA 듀플렉스를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 [r-P32]ATP를 사용하여 효소적으로 인산화시킨다.
상기-기술된 HpaII 부위로부터 PvuII 부위에 이르는 46bp의 DNA 단편은 합성적으로 제조되거나 또는 기원 bBP348 플라스미드로 부터 얻어진다. 따라서 100㎍의 플라스미드 pBP348을 400㎕의 PvuII 완충액중, 37℃에서 2시간동안 50단위의 PvuII로 분해한다. 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨 후에, 그 DNA를 50단위의 PstI을 함유하는 400㎕의 PstI 완충액(50mM NaCl, 6mM트리스·HCl, pH 7.4, 6mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중에, 37℃에서 2시간동안 용해시킨다. 그 DNA 단편을 6% 폴리아크릴 아미드 겔상에 분포시키고, 목적하는 46bp 서열을 함유하는 135bp 단편을 회수하여 표준 공정으로 정제한다. 회수된 DNA의 1/3(33㎍에 해당하는)을 37℃에서 40분간 100㎍ HpaII 완충액(20mM 트리스·HCl, pH 7.4, 7mM MgCl2, 6mM β-머캅토에탄올)중의 1단위의 HpaII 제한 효소로 제한 분해시킨다. 65℃에서 10분간 가열한 후에 DNA 단편을 적절한 크기의 마커와 함께 5% 아크릴 아미드 겔(아크릴 아미드 : 비스의 비 19 : 1)상에 분포시킨다. 135bp 단편(제7도의 112)의 HpaII 부분 분해에 의해서 얻어지는 목적하는 46bp 단편을 표준공정으로 정제한다.
플라스미드 벡터의 0.2㎍ XbaI-PvuII 단편(제7도의 115), 3.2 피코몰의 합성 63bp단편(제7도의 116) 및 0.5피코몰의 46bp단편(제7도의 112로부터 얻어진다)을 2단위의 T4 DNA 리가제와 함께 10ul연결 완출액중, 4℃에서 16시간동안 인큐베이션 시킨다. 그 연결혼합물을 사용하여 이·콜라이 JA221을 형질전환시키고 생성되는 목적 플라스미드 pNM 789를 함유하는 형질전환체를 암피실린 내성에 의해 선택한다. 통상의 스크리닝에 의해 494bp PvuII 및 109bp xbaI -PvuII 단편의 존재를 확인함으로써 플라스미드 pNM 789(제7도의 117)의 동일성이 입증된다.
E. 플라스미드 pNM 789B의 최종 제조
플라스미드 pNM 789(제8도의 117)를 소성장 호르몬으로 완전히 전환시키기 위해서는 하나의 아미노산 코돈이 변화되어야 한다. 이것을 pNM789의 28bp PvuII 내지 BamHI 단편을 제거하고 다음 서열(제8도의 118)의 합성 겹가닥 단편으로 대체함으로써 이루어진다.
10㎍의 pNM 789를 200㎕ PvuII 완충액중, 37℃에서 5분간 1단위의 PvuII로 분해시킨다. 65℃에서 10분 가열한 후에, 그 혼합물을 BamHI 완충액으로 300㎕로 희석하고 10단위의 BamHI으로 37℃에서 1시간동안 분해시킨다. 그 DNA 단편을 1% 아가로즈 겔상에서 분리하고 1회 절단된 플라스미드 pNM 789 크기의 DNA단편(제8도의 119)을 통상적으로 정제한다. 0.2㎍의 이 단편을 20㎕ 리가제 완충액중의 2단위 T4 리가제를 사용하여 5피코몰의 합성 단편과 연결시킨다. 연결 공정은 4℃에서 일야로 수행한다. 형질전환후에 여러가지 플라-스미드를 분리하고 적절한 PvuII(494bp) 및 XbaI-BamHI (628bp)단편을 스크린 한다. 이 단편들을 함유하는 플라스미드들은 목적하는 플라스미드 pNM 789B(제8도의 120)를 구성하고 있다.
[실시예 2]
[플라스미드 pCZ101 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ101의 제조]
A. 플라스미드 pIM-I'-A3의 분리 세균 이·콜라이 K12/pIM-I'-A3(NRRL B-15733)를 통상의 미생물학적 공정에 따라 25℃에서 50㎍/ml의 가나마이신이 든 TY육즙(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, pH 7.4)중에서 배양시킨다. 그 배양물을 신선한 육즙으로 1 : 10으로 희석하고 37℃에서 3시간 인큐베이션시킨 후에, 약 0.5ml의 배양물을 1.5ml의 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)로 옮기고 약 15초 동안 원심분리시킨다. 특별한 지사가 없는한, 모든 공정은 주위온도에서 수행한다. 생성되는 상등액을 조심스럽게 파인-팁 아스피레이터로 제거하고 세포 펠릿을 2㎍/ml 라이소자임, 50mM 글루코즈, 10mM EDTA(디아민테트라아세테이트) 및 25mM 트리스·HCl, pH8을 함유하는 신선하게 제조된 약 100㎕의 라이소자임 용액(2㎍/ml)중에 재현탁시킨다. 약 200㎕의 알칼리성 SDS(나트륨 도데실 설페이트)용액(0.2N)NaOH, 1% SDS)을 가하고 튜브를 가만히 뒤집어서 용해가 완전히 이루어질때까지(약5분)0℃에서 보관한다. 다음에, 약 150㎕의 3M나트륨 아세테이트를 가하고 튜브의 내용물을 수초간 가만히 뒤집어서 혼합한다.
그 튜브를 0℃에서 60분이상 유지하고 이어서 15분간 원심분리하여 거의 맑은 상등액을 얻는다. 상등액을 제2원심분리 튜브로 옮기고 3용적의 차가운 100% 에탄올를 가한다. 튜브를 드라이 아이스 에탄올중에 5분간 넣었다가, 생성된 침전물을 원심분리하여 (5분간)모으고 상등액을 흡인 제거한다. 모아진 펠렛을 100㎕의 TE(100mM 트리스·HCl, pHH 8.0, 1mM EDTA)중에 용해시키고 목적하는 pIM-I'-A3플라스미드 DNA를 수득한다.
B. 플라스미드 pNM 789B의 XbaI-BamHI 분해 및 약 0.6kb XbaI-BamHI단편의 제조
50㎕ Hi염 완충액*중의 약 5㎍의 플라스미드 pNM 789B DNA를 각각 10단위의 BamHI 및 XbaI 제한 효소와 함께 37℃에서 약 1시간동안 인큐베이션 시킨다. 5㎕의 3M 나트륨 아세테이트(pH7.0)를 첨가한 후에, DNA를 3용적의 100% 에탄올로 침전시킨다. 목적하는 DNA 분해물을 100㎕의 TE의 완충액중에 용해시키고 0℃에서 보관하여 후에 이용한다.
* Hi염 완충액은 통상적으로 다음 조성으로 이루어진다.
100mM NaCl
20mM 트리스. HCl, pH 8.0
10mM MgCl2
5mM β-머캅토에탄올
C. 플라스미드 pIM-I'-A3의 XbaI-BamHI 분해
플라스미드 pIM-I'-A3보다는, 플라스미드 pNM 789B를 사용하는 것을 제외하고는 거의 실시예 2B의 공정에 따라 목적하는 분해를 수행한다. 목적하는 DNA를 약 100㎕의 TE완충액에 용해시킨후 0℃에서 보관하여 후에 이용한다.
D. 연결 및 형질전환
약 1㎍의 플라스미드 pIM-I'-A3분해물, 1㎍의 플라스미드 pNM 789B XbaI-BamHI 분해물, 40㎕ 물, 5㎕(5mM)ATP, 5㎕ 연결 혼합물*및 5단위 T4 DNA리가제를 20℃에서 약 2시간동안 인큐베이션 시킨다. 65℃에서 2분간 인큐베이션시킨 후에 얼음상에서 냉각시키고, 생성 연결 혼합물을 사용하여 웬신크의 형질 전환 공정에 따라(Wensink, 1974, Cell 3 : 315), 이·콜라이 K12 RV308을 50㎍/ml의 가나마이신을 함유하는 TY평판상(1%트립톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨, 1.5% 한천, pH 7.4)에서 형질전환시킨다. 세균 이·콜라이 K12RV308은 기탁되어 있으며 기탁번호는 NRRL B-15624이다.
아가로즈 겔 전기영동법(Maniatis et al., 1982) 및 다른 실험에 의해 통상적으로 입증되는 바와 같이 생성형질전환체의 몇 가지는 목적하는 약 10.8kb 플라스미드만을 함유하고 있다. 그와 같은 형질전환체(이·콜라이 K12 RV308/pCZ 101로서 표시됨)를 선택하여 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 놓고 이어서 통상의 미생물학적 기술을 이용하여 배양 시킨다. 생성 세포를 사용하여 실시예 1A의 공정에 따라 플라스미드 pCZ 101을 분리한다.
* 연결 혼합물은 다음의 조성물로 제조할 수 있다.
500mM 트리스. HCl, pH 7.8
200nM 디티오트레이톨
100mM MgCl2
[실시예 3]
[플라스미드 pCZ 114 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 114의 제조]
A. 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편의 제조
플라스미드 pNM 789B 보다는, 플라스미드 pCZ101을 사용하는 것을 제외하고는 거의 실시예 2B의 공정에 따라 수행하여 목적하는 단편을 얻는다. 목적하는 약 10.2kb BamHI-XbaI 제한단편을 통상적으로 분리하고 아가로즈 겔 전기 영동법에 의해 단리한 다음(Maniatis et al., 1982) 약 100㎕의 TE완충액중에 용해시켜 0℃에서 보관하였다가 후에 사용한다.
B. 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편의 제조
플라스미드 pNM 789 및 XbaI 제한 효소보다는, 플라스미드 pCZ 101 및 HgiAI 제한 효소를 각각 사용하는 것을 제외하고는 거의 실시예 2B의 공정에 따라 수행하여 목적하는 단편을 제조한다. 목적하는 약0.6kb BamHI-HgiAI 제한 단편를 통상적으로 분리하고 아가로즈 겔 전기 영동법에 의해 단리한 다음(Maniatis et al., 1982) 약 100㎕의 TE완충액중에 용해시켜 0℃에서 보관하였다가 후에 사용한다.
C. DNA 링커 배열의 구조화
이다꾸라등(Itakura et al., 1977) 및 크레아등(Crea et al., 1978)의 방법에 따라 변형 포스포트리에스테르법에 의해 통상적으로 목적하는 링커 배열을 합성한다. 이 합성법은 또한 실시예 1에 특별히 설명되어 있다.
D. 연결 및 형질전환
실시예 20의 공정에 따라 실시예 3C의 약 20피코몰의 DNA링커, 1㎍의 플라스미드 pCZ101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편 및 0.5㎍의 플라스미드 pCZ101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결하고, 생성 플라스미드를 사용하여 이·콜라이 K12RV308을 형질전환시킨다.
아가로즈 겔 전기영동법(Maniatis et al., 1982) 및 다른 실험에 의해 통상적으로 보여지는 바와 같이, 생성 형질 전환체의 몇 가지는 목적하는 약 10.8kb 플라스미드 만을 함유한다. 그와 같은 형질전환체(이·콜라이 K12 RV308/pCZ114로서 표시됨)를 선택하여, 적절한 항생물질을 함유하는 TY한천상에 도포하고 이어서 통상의 미생물학적 기술을 이용하여 배양시킨다. 생성세포를 SDS 겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험으로 확인하고 높은 비율에서 met-bGH를 발현시킨다. 플라스미드 pCZ 114는 열 유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하기 때문에, met-bGH의 최대 발현은 약 37℃의 배양 온도에서 일어난다.
[실시예 4]
[플라스미드 pCZ 101.1 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 101.1의 제조]
실시예 3c의 링커 배열을 다음 DNA링커서열
로 치환시키는 것을 제외하고는 거의 실시예 3에 따라 수행하여 목적하는 구조를 만든다. 상기의 특정 링커 배열을 이다꾸라등(Itakura et al., 1977 and Crea et al., 1978)의 통상의 공정에 따라 제조될 수 있다. 상기에 언급한 합성법은 또한 특히 실시예 1에 설명되어 있다.
목적하는 형질전환체(이·콜라이 K12 RB 308/pCZ 101.1로서 표시된다)를 적절한 항생물질을 함유하는 TY한천상에 도포하고 이어서 통상적으로 그후의 생성을 위하여 배양시켜 플라스미드 pCZ101.1을 분리한다. 또한 SDS겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험에 의해 그 형질전환체를 확인한 후, 높은 비율에서 met-bGH를 발현시킨다. 플라스미드 pCZ101.1은 열유도성 러너웨이 리클리콘을 함유하기 때문에, met-bGH의 최대 발현은 약 37℃의 배양 온도에서 일어난다.
[실시예 5]
[플라스미드 pHI7△4△1의 제조]
플라스미드 pHI7△4△1의 제조에 대한 부분적 도식을 제15도에 나타낸다.
A. 플라스미드 pBRHtrp의 제조
플라스미드 pGM1은 결 손(deletion)△LE1413(Miozzari, et al., 1978, J, Bacteriology, 1457-1466)를 함유하는 이·콜라이 트립토판 오페론(operon)을 운반하며 따라서 trp 프로모터-오퍼레이터 시스템의 조절하에서 그의 전체중에 trp D 폴리펩타이드 뿐만 아니라, trp 리더(leader)의 처음 6개 아미노산 및 적절하게는 마지막 세번째의 trp E 폴리펩타이드(이후부터는 LE'로서 나타낸다)를 함유하는 융합 프로테인을 발현한다. 이·콜라이 K12 W3110 tna 2trp-△102/pGM1은 ATCC에 기탁되어 있으며(ATCC No. 31622)pGM1은 통상적으로 아래에 기술되는 공정에 이용하기 위해서 균주로 부터 회수할 수도 있다.
약 20㎍의 플라스미드를 다섯 부위에서 플라스미드를 절단하는 제한 효소 PvuII로 분해한다. 다음에 유전자 단편을 EcoRI 분해 부위를 제공하는 EcoRI 링커(배열 pCATGAATTCATG의 자가 상보적 올리고-뉴클레오티드로 이루어진)와 결합시켜 EcoRI부위를 함유하는 플라스미드로 클로닝시킨다. pGM1으로부터 얻어지는 20㎍의 DNA단편을 200피코몰의 5'-인산화 합성 올리고뉴클레오티드 pCATGAATTCAT
G 존재하 및 20㎕ T4 DNA 리가제 완충액(20mM 트리스. pH 7.6, 0.5mM ATP, 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이틀)중 4℃에서 일야로 10단위 T4 DNA 리가제로 처리한다.
이어서 그 용액을 70℃에서 10분 가열하여 연결 공정을 정지시킨다. EcoRI 분해로 그 링커를 절단하고, 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(이후부터 ＂PAGE＂로 표시한다)을 이용하여 EcoRI 말단을 갖는 단편을 분리한다. 에티듐브로마이드로 1차 염색함으로써 겔로부터 3개의 가장 큰 단편을 분리해내고 이어서 그 단편들을 자외선에 쏘여서 문제의 부분을 겔로부터 잘라낸다. 각각의 겔 단편을, 300㎕ 0.1×TBE와 함께 투석백에 넣고 0.1×TBE 완충액(TBE 완충액은 11 H2O중에 10/8gm 트리스 염기, 5.5gm 붕산, 0.09gm Na2EDTA를 함유한다)중에서 1시간동안 100V에서 전기영동시킨다. 수용액을 투석 백으로 부터 모아서 페놀로 추출하고, 클로로포름으로 추출한 다음 염화 나트륨으로 0.2M으로 만든다. 이어서 에탄올로 침전시켜서 DNA를 물중에 회수한다. EcoRI 점성(sticky)말단을 갖는 trp 프로모터/오퍼레이터를 함유하는 단편은 프로모터/오퍼레이터 삽입시에 테트라사이클린 내성을 나타내는 테트라사이클린 감수성 플라스미드에 삽입함으로써 확인된다. 이후 부터 본 실시예에서 기술되는 모든 DNA단편 분리공정은 PAGE와 이어서 상기에 기술된 전기용출법을 히용하여 수행한다.
B. Trp 프로모터/오퍼레이터의 조절하에서 테트라사이클린 내성을 발현하는 플라스미드 pBRH trp의 제조 및 상기의 'A'에서 분리되는 Trp 프로모터/오퍼레이터-함유 DNA 단편의 증폭
플라스미드 pBRH1, (Rodriguez, et, al., 1979, Nucleic Acids Research 6,3267-3287 및 ATCC No. 37070)은 암피실린 내성을 발현하고 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하나 프로모터와 관계가 없기때문에, TC 내성을 나타내지 않는다. 따라서 그 플라스미드가 잠복되어 있는 세포는 테트라사이클린 감수성을 나타낸다.
EcoRI 부위에 프로모터/오퍼레이터 시스템을 도입 함으로써, 그 플라스미드 테트라사이클린 내성을 나타낸다.
플라스미드 pBRH1을 EcoRI로 분해한다. 효소를 페놀 추출물로 제거하고 이어서 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨 다음 DNA를 물중에 재현탁시킨다. 생성 DNA를 반응 혼합물을 분리하는 경우에 있어서, 상기의 실시예 5A에서 얻어지는 각각 3개의 DNA단편과 혼합하고 전술한 바와 같이 T4 DNA 리가제와 연결한다. 반응 혼합물중에 존재하는 DNA를 사용하여 표준기술(Hershfield et al., 1974, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71 : 3455-3459)에 의해 콤피턴트(Competent) 이·콜라이 K12 294(NRRL B-15625)를 형질전환시키고 이어서 세균을 20㎍/ml 암피실린 및 5㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 LB 평판(Maniatis et al., 1982)상에 도포한다.
여러개의 테트라사이클린-내성 콜로니를 선택하여 플라스미드 DNA를 분리하고 pBRH trp라 표시한다. 목적하는 단편의 존재는 제한효소 분석에 의해 확인한다. 플라스미드 pBRH trp은 암피실린 내성과는 별도로, β-락타마제를 발현하며, trp 프로모터/오퍼레이터가 포함된 DNA 단편을 함유한다. 이 DNA 단편은 또한 trp 리더의 첫번째 6개 아미노산 및 마지막 세번째의 trp E 폴리펩타이드의 융합 프로테인을 함유하는 제1프로테인(LE'로 표시한다), trp D 폴리펩타이드의 처음 절반에 상응하는 제2프로테인(D'로 표시한다) 및 테트라사이클린 내성 유전자에 의해서 코드화되는 제3프로테인을 코드화 한다.
C. 플라스미드 pSOM 7△2의 제조
플라스미드 pBRH trp를 EcoRI 제한 효소로 분해하고 PAGE 및 전기용출로 분리한 생성 단편을 EcoRI-분해 플라스미드 pSOM 11과 결합시킨다(Itakura et al., 1977, Sci. 198 : 1056, 미합중국 특허 제4,366,246호, 영국 특허공보 제2,007,676A). 그 혼합물을 T4 DNA 리가제와 연결시켜 생성되는 DNA로 전술한 바와 같이 이·콜라이 K12 294를 형질전환시킨다. 암피실린-함유 평판상에서 형질전환체 세균을 선택하고 생성되는 암피실린 내성 콜로니를 콜로니 하이브리드화(colony hybridization)에 의해 스크린 한다(Gruenstein et al., 1975, Proc. Nat. Acad, Sci. USA 72 : 3951-3965).
pBRH trp로부터 분리되고 이어서 방사능(P32)으로 라벨된 trp 프로모터/오퍼레이터 함유 단편을 상기 공정에서 프로브(probe)로서 사용한다. 여러가지 콜로니가 콜로니 하이브리드화에 의해 양성을 나타냈으며 그러므로 선택된다. 플라스미드 DNA를 분석하고, 효소 Bg1II 및 BamHI으로 이중 분해하여 제한 분석함으로써 삽입 단편의 방향을 알아낸다. 걱절한 방향에 trp 프로모터/오퍼레이터 단편과 함께 목적하는 플라스미드를 함유하는 콜로니를 10㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지중에서 증식시킨다. 목적하는 플라스미드를 pSOM 7△2로 표시하며 아래에 기술되는 그 후의 제조공정에 사용한다.
D. 플라스미드 pTrp 24의 제조
1. 코드화 나선의 5' 및 3'말단에 각각 BglII 및 EcoRI 제한부위를 갖는 말단 부위의 LE'폴리팹타이드를 코드화하는 유전자 단편의 제조
플라스미드 pSOM 7△2를 HindIII 분해하고 이어서 LE'코드화 부분내에서 그리고 BglII 제한부위 바깥에서 분해되도록 선택된 조건하에서 람다 뉴클레아제(5' 내지 3' 엑소뉴클레아제)로 분해한다. 약 20㎍의 HindIII-분해 pSOM 7△2를 완충액(20mM 글리신 완충액, pH9.6, 1mM MgCl2, 1mM β-머캅토 에탄올)중에 용해시킨다. 생성된 혼합물을 5단위의 람다 엑소뉴클레아제로 실온에서 60분간 처리한다. 이어서 얻어지는 반응 혼합물을 페놀, 및 클로로포름으로 차례로 추출하고, 에탄올로 침전시킨다.
LE' 유전자 단편의 말단에 EcoRI 잔기를 만들기 위하여, 개량된 포스포트리에스테르법(Crea et al., 1978)으로 프리머(primer) 32p CCTGTGCATGAT를 합성하고 람다 엑소뉴클레아제 분해로 생기는 LE'유전자 단편의 외가닥 말단에 하이브리드화한다. 20㎕의 H2O 중에서 플라스미드 pSOM 7△2의 20㎍의 람다 엑소뉴클레아제-처리된 HindIII 분해 생성물을 용해시키고, 상기에 기술된 약 80피코몰의 5'-인화산 올리고뉴클레오티드를 함유하는 6㎕의 용액과 혼합함으로써 하이브리드화가 이루어진다. 합성 단편을 LE'코드화 서열의 3'말단에 하이브리드화시키고 남은 LE'단편의 외가닥부분을 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP를 사용하여 클레노우 폴러머라아제 I(Klenow polymerase I)으로 충진시킨다.
클레노우 폴리머라제 I은 DNA 폴리머라제 I의 단백질분해작용에 의해서 얻어진다. 클레노우 폴리머라제 I은 5'→3' 플리머화 활성, 3'→5' 엑소뉴클레아제 분해 활성을 지니나 모 효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제분해 활성은 지니지 않는다(Kornberg, 1974, W.H.Freeman and Co., SFO, 98).
따라서 반응 혼합물을 50℃로 가열하고 10℃로 서서히 냉각시킨 다음, 4㎕의 클레노우 효소를 가해준다. 실온에서 15분 인큐베이션시킨 다음, 37℃에서 30분간 인큐베이션시키고, 5㎕의 0.25몰 EDTA를 가하여 반응을 중지시킨다. 그 반응 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 차례로 추출하고, 에탄올 침전시킨다. 그 후에 그 DNA를 제한 효소 BglII로 분해하고 PAGE에 의해 단편을 분리한다. 겔로부터 얻어지는 오오토라디오그램은 약 470bp의 기대한 길이를 갖는 P32-라벨 단편을 나타내며, 이 단편을 전기용출법으로 회수한다. 개략으로서, 이 단편 LE'(d)는 Bg1II 말단 및 프라머의 시작과 일치하는 블런트 엔드(blunt end)를 갖는다.
2. 플라스미드 pThα1의 제조
타이모신(Thymosin)α1용의 합성 유전자를 플라스미드 pBR322에 삽입하여 플라스미드 pThα1을 제조한다. 타이모신 α1코드화 DNA의 합성에는 제11도의 이중 화살표에 의해 표시되는 16개의 올리고뉴클레오티드(T1내지 T16)의 합성 및 그후의 연결이 포함된다. 메트(met) ATG를 N-말단에 삽입하고 5'말단은 외가닥 점성 말단으로 설계하여 EcoRI 및 BamHI으로 분해되는 플라스미드에의 결합을 촉진한다. 유전자의 중심에 있는 Bg1II부위는 재조합체 플라스미드의 분석을 쉽게해준다.
울리고데옥시리보뉴클레오티드 T1내지 T16은 문헌참조 : Itakura et al., 1977 and Crea et al, 1978의 변형 포스포트리에스테르 법에 의해서 합성된다. 여러가지의 울리고데옥시리보 뉴클레오티드를 아래의 표 1에 나타낸다.
[표 1]
타이오신 α1 유전자용 합성 올리고 뉴클레오티드
* 주위 온도에서 실시
상기 합성공정을 제12도에 요약된 바와 같이 단편 T15에 대한 다음 공정에 의해서 추정할 수 있다. T15의 합성에 사용되는 여러가지 뉴클레오티드 단편을 숫자적으로 도면에 표시되어 있다. 사용된 약자는 다음과 같다 :
TPSTe, 2,4,6-트리이소프로필벤젤설포닐테트라졸; BSA, 벤젠 설폰산; TLC, 박층크로마토그라피; HPLC, 고성능 액체 크로마토그라피; DMT, 4,4'-디메톡시트리틸; CE, 2-시아노에틸; R, p-클로로페닐; BZ, 벤조일; An, 아니소일; iBu, 이소부트릴; Py, 피리딘; AcOH, 아세트산; Et3N, 트리에틸아민
완전히 보호된 트리데옥시리보 뉴클레오티드 4(85mg, 0.05mmol) 및 2(180mg, 0.1mmol)를 7 : 3(V/V)클로로포름/메탄올(각각 10 및 20ml)중의 2% BSA로 0℃에서 10분간 처리함으로써 5'수산기에서 비블록화 시킨다. 포화 수성 중탄산암모늄을 첨가하여 반응을 정지시키고, 클로로포름(25ml)으로 추출하고 물로(2×10ml)로 세척한다. 유기층을 탈수시키고(황산 마그네슘), 소용적(약 5ml) 으로 농축시킨 다음 석유 에테르(35°내지 60°분획)을 첨가하여 침전시킨다. 원심분리로 무색 침전물을 모으고 진공하 데시케이터중에서 건조시켜 각각 6 및 8을 수득하며, 이들 각각은 실리카겔 tlc(Merck 60F 254, 클로로포름/메탄올, 9 : 1)로 균질화한다.
삼중합체 1 및 3(270mg, 0.15mmol : 145mg, 0.075mmol)를 트리에틸아민/피리딘/물(1 : 3 : 1, V/V, 10ml)로 주위온도에서 25분간 처리하여 그들의 포스포디 에스테르(5 및 7)로 전환시킨다. 회전식 증발기로 시약을 제거하고 무수 피리딘으로 반복 증발시켜(3×10ml) 잔사를 건조시킨다. 삼중합체 8(0.05미리몰) 및 삼중합체 7을 무수 피리딘(3ml)중의 TPSTe(50mg, 0.15미리몰)와 혼합하고 그 반응 혼합물을 진공하, 주위 온도에서 2시간동안 방치한다. TLC분석은 삼중합체 8의 95%가 육중합체 생성물(10% 수성황산으로 분무하고 60℃에서 가열함으로써 DMT그룹의 검출에 의해 확인된다)로 전환되었음을 보여준다. 물(1ml)을 가하여 반응을 급냉시키고 감압하에서 용매를 증발시킨다.
톨루엔과 함께 공증발(coevaporaton)시킴으로써 피리딘을 제거한 후 삼중합체 4 및 2의 경우에서 상기에 기술한 바와 같이 2% BSA(8ml)로 처리하여 5'위치에서 분해한다. 생성물(10)은 클로로포름/메탄올(98 : 2 내지 95 : 5 V/V)을 이용한 스텝 구배 용출에 의해 실리카겔 컬럼(머크 60H, 3.5×5cm) 상에서 정제한다. 생성물 10을 함유하는 분획을 증발로 건조시킨다. 마찬가지로, 삼중합체 5를 6에 커플링시키고 완전히 보호된 생성물을 실리카겔상에서 직접 정제시킨다. 이 후자의 생성물을 상기와 같이 트리에틸아민/피리딘/물을 사용하여 3' 말단에서 분해시킨다.
마지막으로, 육중합체 9 및 10을 축합제로서 TPSTe(75mg, 0.225미리몰)를 사용하여 무수 피리딘(2ml)중에서 커플링시킨다. 완전히 이루어짐에 따라 (주위온도에서 4시간) 그 혼합물을 회전증발시키고 잔사를 실리카겔상에서 크로마토그라피시킨다. 석유 에테르로 침전시켜 생성물 11(160mg)을 수득하고 TLC상에서 균일하게 한다. 피리딘(0.5ml)중의 화합물 11(20mg)의 일부를 농수산화암모늄으로 처리하고(7ml, 8시간, 60℃) 그 후에 80% 아세트산으로 처리하여(15분, 주위온도) 완전히 분해시킨다. 아세트산을 증발시킨 후 고형 잔사를 4% 수성 수산화 암모늄(V/V, 4ml)중에 용해시킨다. 에틸에테르(3×2ml)로 추출한다. 수상을 1 내지 2ml로 농축시키고 일부를 HPLC에 적용하여 12를 정제한다. 주 피크(peak)에 상응하는 분획을 모아서(약 2A254단위) 약 5ml로 농축시킨다. 최종 생성물 12를 바이오-겔 P-2(1.5×100cm)상에서 20% 수성에탄올로 용출시켜 날염시키고, 환원 건조시켜서 물(200㎕)중에 재현탁시켜 A254=10의 용액을 얻는다. 12의 서열을 이차원적 서열 분석에 의해 확인한다.
소마토스타틴(Itakura et al., 1977), 인슐린(Goeddel et al., 1979), 및 성장 호르몬(Goeddel et al., 1979, Nature 281 : 544)에 대해 상세히 전술된 방법에 의해서 16 합성 올리고-뉴클레오티드로부터 완전한 타이모신 α1 유전자를 모은다. 10㎍의 올리고뉴클레오티드 T2내지 T15를 T4폴리뉴클레오티드 키나제(Goeddel et al., 1979)의 존재하에 [γ-P32]-ATP(New England Nuclear)로 정량적으로 인산화시켜 약 1ci/mmol의 특정 활성을 생성시킨다. 방사성표지된 단편을 20% 폴리아크릴아미드/7M 우레아겔 전기영동법에 의해서 정제하고 용출된 단편의 서열을 2차원 전기영동법/부분적 스넥 베넘(snake venom) 분해의 호모크로마토그라피(Jay et al., 1974, Nucleic Acids Res. 1 : 331)에 의해 입증한다. 단편 T1및 T16을 인산화하지 않고 그대로 남겨두어서 그후의 연결 반응동안 목적하지 않는 폴리머화를 최소화한다. 이들 올리고뉴클레오티드(각각2㎍)를 보고된 공정(Goeddel et al., 1979)을 이용하여 T4 DNA 리가제에 의해서 4그룹의 4개의 단편(제13도 참조)을 조립한다. 7M 우레아 (Maxam and Gilbert, 1977, Proc, Nat, Acad, Sci, USA 71 : 3455)를 함유하는 15% 폴리아크릴아미드 겔상의 겔 전기영동에 의해 그 반응 생성물을 정제한다. 4개의 분리 생성물을 함께 연결하여 그 반응 혼합물을 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 용해시킨다. 타이모신 α1 유전자 크기 범위에 있는 DNA(90 내지 105 염기쌍)을 전기용출로 얻는다.
플라스미드 pBR 322(0.5㎍)를 BamHI 및 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 처리하고 그 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 분리한다. 전기용출로 겔로부터 거대 단편을 회수하고 그 후에 조립된 합성 DNA(Goeddel et al., Nature 281 : 544 1979)에 연결한다. 이 혼합물을 사용하여 이·콜라이 K12 294를 형질전환시킨다. 5%의 형질전환 혼합물을 20㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 평판상에 도포한다. 얻어지는 4개의 암피실린 내성콜로니는 테트라사이클린에 민감하여, 테트라사이클린 내성 유전자로 삽입되도록 되어 있다. 이들 4개의 콜로니로부터 얻어지는 플라스미드를 분석하면 각각의 경우에 플라스미드(pThα1로 표시됨)는 (a) pBR 322 그 자체에서는 나타나지 않고, 따라서 제11도에 나타낸 바와 같이 타이모신 α1 유전자의 존재를 표시해 주는 BglII 부위, 및 (b) BamHI/EcoRI 분해에 의해 생성되는 약 105 염기쌍의 단편을 함유하는 것을 알 수 있다. 플라스미드 pThα1의 제조루트(규모는 밝히지 않음)는 굵은 점이 5'-인산염 그룹을 나타내는 제13도에 나타나 있다.
3. 처리된 pThα1 및 LE'(d) 단편의 반응
플라스미드 pThα1은 암피실린 내성을 나타내는 유전자 및 그의 5' 코드화 나선 말단에서 EcoRI 부위로 그리고 3' 말단에서 BamHI 부위에 클론화된 타이모시 α1을 나타내는 구조 유조전를 함유한다. 또한 타이모시 유전자는 BglII 부위를 함유한다. 상기에서 예비된 LE'(d) 단편을 받아들일 수 있는 플라스미드를 제조하기 위해서는, pThα1을 EcoRI 분해하고 이어서 클레노우 폴리머라제1을 dTTP 및 dATP와 반응시켜 EcoRI 잔기를 무디게(blunt) 절단한다. 그 생성물을 BalII로 분해하여 암피실린 내성 유전자 및, 그의 양 말단에, 스틱키(Sticky) BalII 잔기 및 블런트(blunt) 엔드를 함유하는 직선의 DNA 단편을 만든다. 그 생성물을 T4리가제 존재하에서 BglII 스틱키 엔드 및 블런트 엔드를 함유하는 LE'(d) 단편과 반응시켜 재폐환시킴으로써 플라스미드 pTrp 24를 제조할 수 있다. 그렇게 수행하는 경우에는, 블런트 엔드 연결이 일어나는 부위에서 EcoRI 부위가 다시 만들어진다.
E. 플라스미드 pSOM7△2△4의 제조
pTrp24를 Bg1II 및 EcoRI로 잇달아 분해하고, 이어서 PAGE 및 전기용출시킴으로써, 그의 3' 코드화 말단에 인접한 BglII 스틱키 엔드 및 EcoRI 스틱키 엔드를 갖는 LE'(d) 폴리펩타이드를 코드화하는 단편을 얻는다. LE'(d)단편을 플라스미드 pSOM7△2의 BglII 부위로 클론화시켜 트립토판 프리모터/오퍼레이터의 조절하에서 발현되는 LE'폴리펩타이드/소마토스타틴 융합 프로테인을 제조한다. 그와 같이 하기 위해서는 (1) 트립토판 프로모터/오퍼레이터 말단의 EcoRI 부위를 절단하기 위한 pSOM7△2의 EcoRI로의 부분 분해, 및 (2) 코돈의 판독대(reading frame)를 적절히 유지해주고 EcoRI 절단 부위를 다시 만들어 내기 위한 프리머 서열의 적절한 선택이 필요하다.
따라서, 16㎍의 플라스미드 pSOM7△2를 20mM 트리스, pH 7.5, 5mM MgCl2, 0.02% NP40 세정제, 및 100㎎ NaCl을 함유하는 200㎕의 완충액중에 넣어 희석시키고, 0.5단위 EcoRI로 처리한다. 37℃에서 15분 후에, 반응 혼합물을 페놀로 추출하고, 클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시키고, 그 후에 BglII로 분해한다. 생성된 보다 큰 단편을 PAGE 공정 및 이어서 전기용출로 분리한다. 이 단편은 LE'폴리펩타이드의 가장 가까운 말단에 대한 코돈 ＂LE'(P)＂, 즉, BglII 부위로부터 위쪽에 있는 코돈을 함유한다. 이들 단편을 T4DNA 리가제의 존재하에서 상기의 LE'(d) 단편에 연결하여 플라스미드 pSOM7△2△4를 만들고, 이것은 이·콜라이 K12 294로 형질전환됨에 따라, 트립토판 프로모터/오퍼레이터의 조절하에서 완전히 재구성된 LE 폴리펩타이드 및 소마토스타틴으로 이루어진 융합 프로테인을 효과적으로 생성한다.
F. 테트라사이클린 내성을 나타내는 유전자에 인접한 3' 말단에 PstI 잔기 및 5'말단에 BglII잔기를 갖는 직선상 DNA의 제조
플라스미드 pBR322를 HindIII분해하고 삐어져 나온 HindIII 말단을 S1 뉴클레아제로 분해한다. S1 뉴클레아제 분해 공정에는 30㎕ S1 완충액(0.3M NaCl, 1mM ZnCl2, 25mM 나트륨 아세테이트, pH 4.5)중의 10㎍의 HingIII-분해된 pBR322를 300단위의 S1 뉴클레아제로 15℃에서 30분간 처리하는 공정이 포함된다. 1㎕의 30×S1 뉴클레아제 정지용액(0.8M 트리스 염기, 50mM EDTA)을 가하여 반응을 정지시킨다. 그 혼합물을 페놀로 추출하고, 클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시키고, 이어서 전술한 바와 같이 EcoRI로 분해한다.
PAGE 공정 및 이어서 전기용출에 의해 얻어지는, 생성된 단편은 그의 코드화 나선이 뉴클레오티드 티미딘으로 시작되는 EcoRI 스틱키 엔드 및 블런트 엔드를 갖는다. 티미딘으로 시작하는 S1-분해된 HindIII 잔기를 연결에 따라 BglII 제한 부위를 다시 만들기 위하여 클레노우 폴리머라제 I-처리된 BglII 잔기에 결합시킬 수 있다.
그러므로 실시예 5C에서 제조돈 플라스미드 pSOM7△2를 BglII 분해하고 생성되는 BglII 스틱키 엔드를 4개의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용하여 클레노우 폴리머라제 I으로 처리함으로써 이중 나선으로 만든다. 생성되는 물질을 EcoRI로 절단하고, 이어서 PAGE 및 소단편의 전기용출에 의해, 트립토판 프로모터/오퍼레이터 및 BglII 부위 위쪽에 있는 LE' ＂프록시말(proximal)＂ 서열(＂LE'(P)＂)의 코돈을 함유하는 직선 조각의 DNA를 생성한다. 그 생성물은 EcoRI 말단 및 BglII 부위를 충진하여 만들어지는 블런트 엔드를 갖는다. 그러나 BglII 부위는 상기의 S1-분해된 HindIII 단편의 블런트 엔드 대 블런트 엔드의 연결에 의해 재구성된다. 따라서, T4DNA 리가제 존재하에서 두개의 단편을 연결하여, 콤퍼턴트(competent) 이·콜라이 K12 294 세포로 형질전환됨으로써 전파되는 재폐환된 플라스미드 pHKY10을 재조한다. 재조합체 플라스미드 pHKY10를 지닌 테트라사이클린 내성 세포를 선택하여 플라스미드 DNA를 추출한다. BglII 및 PstI으로 분해하고, 이어서 PAGE 공정 및 거대 단편의 전기용출 공정을 이용하여 분리한 다음, PstI 및 BglII 스틱키 엔드를 갖는 목적하는 직선의 DNA를 얻는다. 따라서, pHKY10으로부터 생성되는, 이 DNA 단편은 복제의 기원을 함유하며, 따라서 trp LE' 폴리펩타이드 융합 프로테인 및 테트라사이클린 내성 유전자를 코드화하는 유전자 모두가 trp 프로모터/오퍼레이터에 의해 조절되는 플라스미드 pHI7△4△1의 구조중의 구성원으로 유용하다.
G. Trp 프로모터/오퍼레이터를 갖는 직선 DNA의 제조
실시예 5E에서 제조되는 플라스미드 pSOM7△2△4를 EcoRI로 부분 분해시키고 이어서 Pst I 분해한다. 생성되는 단편은 trp 프로모터/오퍼레이터를 함유하고 PAGE 공정, 그 후의 전기 용출에 의해 분리된다. EcoRI 부분 분해는 소마토스타틴의 5'말단에 인접하여 절단되고 암피실린 내성 유전자와 trp 프로머터/오퍼레이터사이에 존재하는 EcoRI 부위에서는 절단되지 않는 단편을 얻기 위해 필요하다. 암피실린 내성 유전자를 PstI 절단함으로써 나타나는 암피실린 내성 손실은 상기의 실시예 5F에서 제조되는 최종의 pHKY10 직선 DNA유도체와 연결함에 따라 회복될 수 있다.
H. 프로인슐린의 32개N-말단 아미노산을 코드화하는 합성유전자의 제조
표 2에 나타낸, 18개의 올리고뉴클레오티드를 프로인슐린의 처음 32개 아미노산을 코드화하는 유전자를 제조하는 제1단계로서 제조한다. 궁극적으로 제조된 완전한 유전자의 뉴클레오티드 서열은 제14도에 나타나 있다.
[표 2]
인체 프로인슐린용 합성 올리고뉴클레오티드
제14도에서 합성 뉴클레오티드는 괄호 사이에 나타내었으며 밑줄을 그었다. 이들 올리고뉴클레오티드는 문헌(참조, Crea et al., 1978, Itakura, et al., 1975 J,Biol.Chem.250 : 4592, 및 Itakura, et al., 1975, J.Am. Chem. Soc. 97 : 7327)의 통상적인 방법에 의해 합성된다. 올리고뉴클레오티드의 몇가지는 크레아등(Crea, et al., 1978) 및 괴텔등(Goeddel, et, al., 1979)에 의해 이미 기술된 인체 인슐린 B 사슬용 유전자를 제조하는데 사용된다. 두개의 올리고뉴클레오티드를(B5' 및 B10') HpaII 및 말단의 BamHI 및 EcoRI 제한 부위에 삽입시킨다. 말단 부위는 특히 클로닝(cloning)용으로 유용하다.
이미, 인체 인슐린 B사슬 유전자의 좌측 절반을 제조하는데 사용된 8개의 올리고뉴클레오티드 H1 내지 H8(Goeddel. et al., 1979)은 B사슬 유전자의 1 내지 13개 아미노 및 부가의 N-말단 메티오닌을 코드화하는 서열을 함유한다. B 사슬 유전자의 오른쪽 절반은 올리고뉴클레오티드 B1, B2, B3, B4, B5', B6, B7, B8, B9및 B10'을 거의 궤들등(Goeddel, et al., 1979)의 기술에 따라 T4DNA 리가제를 사용하여 연결함으로써 제조된다. 생성되는 유전자 단편은 14 내지 30 아미노산 단위 의인체 인슐린 B사슬 및 브리징(bridging)사슬의 첫번째 아르기닌을 코드화한다. HpaII 제한 부위를 인체 인슐린 유전자중의 HpaII부위와 같은 판독대(reading frame) 및 편재를 갖는 유전자 서열로 병합시킨다. 연결된 유전자 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 정제한 후에, 가장 큰 DNA 밴드의 용출후, 그 단편을 HindIII-BamHI-절단된 플라스미드 pBR322로 삽입시킨다. 생성된 플라스미드(pB3로 표시한다)를 형질전환에 의해, 이·콜라이 K12 294로 삽입시킨다. 그 플라스미드는 항생물질 암피실린 및 테트라사이클린에 대해 내성을 나타내며 목격하는 뉴클레이오티드 서열을 함유하는 것으로 나타난다.
두개의 단편 pB3의 58 염기쌍 HindIII-BamHI 단편 및 pBH1의 46 염기쌍 EcoRI-HindIII 단편(Goeddel 등에 의해 발견됨, 1979)을 연결하여 EcoRI 및 BamHI 말단을 갖는 단편을 제조한다. 이 단편을 통상적으로는 EcoRI 및 BamHI로 제한된 플라스미드 pBR 322에 연결하고, 이어서 생성된 플라스미드(IB 3으로 표시한다)를 이·콜라이 K12 294에 클론화시킨다. 통상의 증폭 및 분리를 공정후에. 플라스미드 pIB 3을 EcoRI 및 HpaII로 분해하여 메티오닌이 붙어 있는 N-말단의 프로인슐린 아미노산을 코드화하는 합성 유전자 단편(단편1, 제15도)을 제조한다. 합성 유전자를 통상적으로는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 통상적으로 분리한다.
I. 인체 프로인슐린의 50C-말단 아미노산을 코드화하는 cDNA의 분리
목적하는 cDNA를 얻기 위한 도식을 제16도에 나타낸다. 이 도식에 따라, BamHI 인식서열 및 약 20잔기의 3'폴리티미딜 산부분 모두를 함유하는, 데카뉴클레오티드 DNA서열 pCCGGATCCGGTTT18T를 합성하고 이것을 사용하여 cDNA합성을 위한 AMV 리버스 트랜스크립타제(reverse transcriptose)를 준비한다. 1.5×10+4마이크로몰 TTP를 함유하는 0.6ml 반응용적중의 1마이크로몰 BamHI 데카뉴클레오티드와 함께 말단의 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 프리머(primer) 제조한다. 이 반응은 창(Chang, et al., 1978, Nature 275 : 617)등의 완충액 시스템중에서 1시간 동안 37℃에서 수행한다.
인체 인슐리노마(insulinoma) 조직은 서독의 뮌헨에 있는 당뇨병 연구 기관으로부터 제공된다. 그 분야 전문가들이면 인체 인슐리노마 조직을 다수의 다른 의학 단체를 통해 구입, 쉽게 이용할 수 있음을 이해할 것이다. 울리히등(Ullrich, et al., 1977, Science 196 : 1313)의 공정에 따라 인체 인슐리노마 조직의 폴리 AmRNA(2.5㎍)을 분리하고 이어서 위켄즈 등(Wickens, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253 : 2483)의 방법에 따라 겹가닥의 cDNA로 전환시킨다. 따라서, 15mM 트리스. HCl(42℃에서 pH 8.3), 21mM KCl, 8mM MgCl2, 30mM β-머캅토에탄올, 2mM의 프리머 dCCGGAT
CCGGTT18T 및 1mM dNTPs를 함유하는 80㎕ 반응 용적을 0℃에서 예비인큐베이션시킨다. AMV 리버스 트랜스크립타제를 첨가한 후에, 그 혼합물을 42℃에서 15분간 인큐베이션시킨다. 이어서 생성된 RNA/DNA를 통상의 방법을 이용하여 변성시킨다.
25mM 트리스. HCl, pH 8.3, 35mM KCl, 4mM MgCl2, 15mM β-머캅토에탄올, 1mM dNTPs및 9단위의 클레노우 폴리머라아제 I을 함유하는 150㎕의 반응용적중에서 상보적 cDNA나선을 합성한다. 그 혼합물을 15℃에서 90분간 인큐베이션시키고 이어서 4℃에서 15시간 인큐베이션시킨다. 이어서 윅켄즈등(Wickens, et al., 1978)의 공정에 따라 1000단위의 S1 뉴클레아제(마일즈 라보라토리즈, 엘크 하르트, 인디아나)를 사용하여 37℃에서 2시간동안 S1 뉴클레아제 분해공정을 수행한다. 겹가닥의 cDNA(0.37㎍)를 8% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시키고 500 염기 쌍보다 큰 DNA 단편을 용출시킨다. 마이젤의 공정에 따라(Maizel, 1971, Meth. Virol. 5 : 180)터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 사용하여 울리고데옥시사이티딜산 잔기를 단편의 3' 말단에 붙인다. 이어서 dc 꼬리가 달린 cDNA 단편을 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 사용하여, 먼저 PstI 제한 효소로 분해되고 이어서 데옥시-구아니딜산에 부착된 pBR 322에 아닐링(annealing)시킨다. 생성된 플라스미드를 사용하여 이·콜라이 K12 294를 형질전환시키고 그 생성세포를 LB 및 TET 배지상에 피복한다. 테트라사이클린에 내성을 나타내나 암피실린에는 감수성인 콜로니를 분리하고 세개의 PstI 제한 부위를 갖는 플라스미드를 구별하기 위해 스크린한다. 그와 같은 제한 패턴은 프로인슐린 유전자의 특징이다(참조 : Suves, et al., 1980, Science 208 : 57). 600 염기 쌍이 삽입된 하나의 플라스미드(pHI104로 표시한다)는 기대하는 PstI 제한 패턴을 나타내고 및 3' 폴리 A 및 cDNA 제조 동안에 도입된 폴리 GC 사이에 BamHI 부위를 갖는다. 삽입 유전자 몇가지 뉴클레오티드 서열을 제14도에 나타낸다.
J. 인체의 프로인슐린을 코드화 유전자의 집합
인체 프로인슐린을 코드화하는 유전자를 모으기 위하여 사용된 도식을 제15도에 나타낸다.
프로인슐린의 처음 31개 아미노산을 코드화하는 합성 유전자 단편, 제15도의 단편 1을, 상기와 같이 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 HpaII를 사용하여 50㎍의 플라스미드 pIB3으로부터 회수한다. 이 단편은 또한 프리프로인슐린(preproinsulin)의 ＂예비서열(presequence)＂ 대신에 메티오닌을 위한 ATG서열을 함유하고 있다.
1차로 BamHI으로 처리하고 이어서 HpaII 제한 효소로 처리함으로써 40㎍의 플라스미드 pHI 104로부터 mRNA의 해독 정지 시그널 및 3' 비해독 부분뿐만 아니라, 아미노산 32 내지 86을 코드화하는 cDNA유전자 단편을 회수한다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 및 이어서 전기용출에 의해 두개의 단편을 분리한다. 20㎕ 리가제 완충액중의 T4DNA 리가제로 4℃에서 24시간동안 처리하여 그 유전자 단편들을 결합시킨다. 그 혼합물을 50㎕의 H2O로 희석하고, 통상적으로 페놀 및 클로로포름 각각으로 추출하고 이어서 에탄올로 침전시킨다.
생성된 DNA를 BamHI 및 EcoRI 제한 효소로 처리하여, 이들 부위를 재생시키고 유전자 폴리머를 제거한다. 모아진 프로인슐린 유전자를 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 분리하고 EcoRI 및 BamHI로 분해된 플라스미드 pBR 322에 연결한다(이때, T4 DNA 리가제를 사용한다). 생성된 DNA를 사용하여 이·콜라이 K12 294를 형질전환시키고 이어서 생성 콜로니의 테트라사이클린 감수성 및 암피실린 내성을 알아보기 위하여 스크리닝한다. 그와 같은 콜로니의 하나로부터 분리된, 플라스미드 pH13은 그후의 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 특징지어지는 목적하는 프로인슐린 유전자를 함유한다.
K. 인체 프로인슐린을 함유하는 키메릭 프로테인의 발현용 플라스미드의 제조
플리스미드 pHI3을 EcoRI 및 BamHI 제한효소로 처리함으로써 메티오닌을 코드화하는 N-말단의 코돈을 포함하는, 완전한 인체 프로인슐린 유전자는 회수한다. 목적하는 단편을 겔 전기영동법에 의해 정제하고 이어서 플라스미드 pSOM7△2△4 Pst I-EcoRI 부분 분해물(실시예 5G에서 제조된다) 및 플라스미드 pHKY10(실시예 5F에서 제조된다)의 PstI-BglII 단편의 보다 큰 부분에 연결시킨다(이때, T4 DNA 리가제를 사용한다). 따라서, EcoRI 및 BamHI 말단을 갖는 약 1㎍의 완전한 인체 프로인슐린 유전자, 4㎍의 PstI-EcoRI(부분적) pSOM7△2△4 단편, 및 pHKY10의 약 1㎍의 PstI-BglII 단편을 연결화 완충액중의 T4 DNA 리가제를 사용하여 4℃에서 24시간동안 연결시킨다. 그 연결된 DNA 혼합물을 사용하여 이·콜라이 K12 294 를 형질전환시킨다. 암피실린 및 테트라사이클린상의 모두에서 증식하는 콜로니를 선택하여, 목적하는 플라스미드 pHI7△4△1을 함유하는지와 trp LE'-프로인슐린 융합이 기대되는 분자량의 프로테인을 발현하는지를 확인한다. 상기 언급한 프로테인을 발현하는 플라스미드 pHI7△4△1은 도입된 유전자 및 또한 벡터 모두의 DNA 서열 및 제한 부위에 관한한 완전히 특징지어졌다. 플라스미드 pHI7△4△1을 제15도로 나타내며 이들은 암피실린 및 테트라사이클린 내성이 복원되기 때문에 쉽게 선택할 수 있다.
[실시예 6]
[플라스미드 pNM 608 및 이·콜라이 K12 RV308/pNM608의 제조]
A. 플라스미드 pHI7△4△1의 약 253bp EcoRI-HpAI 단편의 제조
약 5㎍의 플라스미드 pHI7△4△1 DNA, 10㎕(10×)의 반응 완충액*, 80㎕ 물 및 5㎕(5단위)의 HpaI 제한 효소를 37℃에서 약 1시간동안 인큐베이션시킨다. 70℃에서 5분간 인큐베이션시킴으로써 반응을 끝난다. 그 혼합물을 얼음상에서 냉각시키고, 약 12㎕의 1M 트리스. HCl, pH 7.2㎕ 물 및 1㎕(10단위)의 EcoRI 제한 효소를 가한다. 이 반응 혼합물을 먼저 37℃에서 1시간, 이어서 70℃에서 5분간 인큐베이션시킨다. 얼음상에서 냉각시킨 다음, 생성 DNA를 페놀 및 클로로포름; 이소아밀 알코올(24 : 1) 각각으로 추출하고 이어서 에탄올로 침전시킨다. 목적하는 약 253bp EcoRI-HpaI 단편을 통상적으로 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동법에 의해 분리하고, 전기용출 및 ETOH 침전법으로 회수한 다음 약 10㎕의 TE 완충액중에 용해시켜 0℃에 저장하였다가 후에 사용한다.
* HpaI 제한 효소의 반응 완충액(10×)은 다음 조성으로 제조된다 :
100mM 트리스. HCl, pH 7
100mM MgCl2
60mM β-머캅토에탄올
200mM KCl
B. 플라스미드 pHI7△4△1의 약 34bp HpaI -TagI 단편의 제조
32㎕(5×) EcoRI 반응 완충액*, 198㎕ 물 및 4㎕의 EcoRI 제한 효소(20단위)중의 약 20㎍의 플라스미드 pHI7△4△1 DNA를 37℃에서 약 1시간동안 인큐베이션시킨다. 70℃에서 5분간 인큐베이션시킴으로써 반응을 종결시킨다. 생성된 826bp EcoRI 단편을 6% 폴리아크릴아미드 겔상의 전기영동법 및 이어서 전기용출법으로 분리하고 에탄올로 침전시킨다. 이어서 그 단편을 16단위로 HpaI 제한 효소를 함유하는 약 100㎕의 HpaI 완충액중에 용해시킨다. 37℃에서 1.5시간후에, 7.5단위의 TagI 제한 효소를 가하고, 인큐베이션을 1.5시간 더 계속한 다음 생성된 단편을 통상적으로는 71/2% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리한다. 목적하는 약 34bp HpaI -TagI 단편을 전기용출로 회수하고 에탄올로 침전시킨후 이어서 5㎕의 TE 완충액중에 용해시킨다.
* EcoRI 제한 효소용 반응 완충액(5×)은 다음 조성으로 제조된다 :
250mM NaCl
500mM 트리스. HCl, pH 7.2
25mM MgCl2
30mM β-머캅토에탄올
C. 플라스미드 pBR 322의 EcoRI-ClaI의 분해
약 5㎕의 플라스미드 pBR 322 DNA, 10㎕의 ClaI 반응 혼합물*, 77.5㎕ 물 및 7.5㎕(15단위)의 ClaI 제한 효소를 37℃에서 약 1시간동안 인큐베이션시킨다. 70℃에서 5분간 인큐베이션시킴으로써 반응을 종결시킨다. 그 혼합물을 얼음상에서 냉각시킨 후에, 약 12.5㎕의 1M 트리스. HCl, pH 7.2, 6.25㎕의 1M NaCl, 2.5㎕의 0.1M MgCl2및 1㎕(10단위)의 EcoRI 제한 효소를 가한다. 그 반응 혼합물을 먼저 37℃에서 1시간그리고 70℃에서 5분간 인큐베이션시킨다. 얼음상에서 냉각시킨 후, 그 생성 DNA를 1% 아가로즈 겔상에서 전기영동시킨다. 용출에 의해 거대 단편을 회수하고 이어서 약 20㎕의 TE 완충액에 용해시킨 다음 0℃에 보관하였다가 후에 사용한다.
* ClaI 제한 효소용 반응 혼합물(10×)은 다음 조성으로 제조된다 :
100mM 트리스. HCl, pH 7.4
100mM MgCl2
60mM β-머캅토에탄올
D. 연결(Ligation) 및 형질전환
약 0.2㎍의 실시예 6A의 약 253bp-EcoRI-HpaI 단편, 0.5㎍의 실시예 6B의 HpaI-TagI 단편 및 0.1㎍의 실시예 6C의 EcoRI-ClaI 분해물을 연결하고 이것을 사용하여 실시예 2D의 공정에 따라 이.콜라이 K12 RV308을 형질전환시킨다.
생성된 형질전환체의 몇가지는, 통상적으로 아가로즈겔 전기영동법(Maniatis et al., 1982) 및 다른 실험방법에 의해서 나타는 바와 같이, 오직 목적하는 약 4.6kb 플라스미드만을 함유한다. 그와 같은 형질전환체(본 명세서에서는 이.콜라이 K12 RV308/pNM608로서 표시한다)를 선택하여 적절한 항생물질을 함유하는 TV 한천상에 도포하고 통상의 미생물학적 기술을 이용하여 배양시킨다. 플라스미드 pNM608은 플라스미드 pHI7△4△1의 약 287bp EcoRI-ClaI(TagI)단편의 바람직한 공급원이다.
[실시예 7]
[플라스미드 pCZ105.1 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 105.1의 제조]
A. 플라스미드 pNM608의 EcoRI-ClaI 분해 및 약 0.288kb EcoRI-TagI 단편의 제조(플라스미드 pHI7△4△1의 0.288kb EcoRI-TagI 단편과 동일하다)
50㎕의 메디움 솔트 완충액*중의 약 5㎍의 플라스미드 pNM608 DNA를 10단위씩의 EcoRI 및 ClaI 제한 효소와 함께 37℃에서 약 1시간동안 인큐베이션시킨다. 5㎕의 3M 아세테이트(pH 7.0)를 첨가한 후에, 3용적의 100% 에탄올로 그 DNA를 침전시킨다. 목적하는 DNA 분해물을 100㎕의 TE 완충액중에 용해시키고 0℃에 보관하였다가 필요할때에 사용한다.
**메디움 솔트 완충액은 다음 조성으로 제조된다 :
50mM NaCl
100mM 트리스. HCl, pH 7.5
6mM MgCl2
2mM β-머캅토에탄올
B. DNA 링커(Linker) 서열의 제조
이다꾸라등(1977)및 크레아등(1978)의 방법에 따라 변형된 포스포트리에스테르 법에 의해 목적하는 링커 서열을 통상적으로 합성한다. 상기 언급된 합성 방법은 또한 특히 실시예 1에서 설명된다.
C. 연결화 및 형질전환
약 20피코몰의 실시예 7B의 DNA 링커, 1㎍의 실시예 7A의 pNM608 분해물,0.5㎍, 플라스미드 pCZ101 약10.2kb BamHII-EcoRI 단편(XbaI제한 효소 및 완충액 보다는, EcoRI 제한 효소 및 적절한 완충액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2B의 방법에 따라 제조되는), 및 1㎍의 실시예 3B의 플라스미드 pCZ101 약0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시키고 생성된 플라스미드를 사용하여 실시예 2D의 방법에 따라 이·콜라이 K12 RV308을 형질전환시킨다.
생성된 형질전환체의 몇가지는, 아가로즈 겔 전기영동법(Maniatis et al., 1982) 및 다른 실험방법에 의해 통상적으로 나타내는 바와 같이, 오직 목적하는 약 10.8kb 플라스미드만을 함유한다. 그와 같은 형질전환체(본 명세서에서 이·콜라이 K12 BV308/pCZ105.1로서 나타낸다)를 선택하여, 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 도포하고 이어서 통상의 미생물학적 기술을 이용하여 배양한다. SDS겔 전지영동법, RIA 및 다른 실험시에 생성된 세포는 met-bGH를 고율로 발현시키다. 플라스미드 pCZ105.1은 열유도성(thermoinducibe) 러너웨이 리플리콘(runaway replicon
)을 함유하며, met-bGH의 최대 발현은 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
[실시예 8]
[플라스미드 pCZ 105.2 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 105.2의 제조]
다음과 같은 DNA 링커 서열이 실시예 7의 링커 서열대신인 것을 제외하고는 실시예 7의 방법으로 수행하여 목적하는 구조를 얻는다.
이다꾸라(Itakura et al., 1977) 및 크레아(Crea et al., 1978)의 통상의 방법에 따라 상기의 특정 링커 서열의 제조할 수 있다. 상기의 합성법은 또한 실시예 1에서 설명된다.
목적하는 형질전환체(본명세서에서는 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 105.2로 표시한다)를 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 도포하고 이어서 통상적으로 그후의 공정을 위해 배양하고 플라스미드 pCZ 105.2를 분리한다. 그 형질전환체는 SDS겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험시에, met-bGH를 고율로 발현시킨다. 플라스미드 pCZ 105.2는 열유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하기 때문에 met-bGH의 최대 발현이 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
[실시예 9]
[플라스미드 pCZ106.1 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ106.1의 제조]
다음과 같은 DNA 링커 서열이 실시예 7의 링커 서열 대신인 것을 제외하고는 실시예 7의 방법으로 수행하여 목적하는 구조를 얻는다 :
이다꾸라(Itakura et al., 1977) 및 크레아(Crea et al., 1978)의 통상의 방법에 따라 상기의 특정 링커 서열의 제조할 수 있다. 상기의 합성법은 또한 실시예 1에서 설명된다.
목적하는 형질전환체(본 명세서에서는 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 106.1로 표시한다)를 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 도포하고 이어서 통상적으로 그후의 공정을 위해 배양하고 플라스미드 pCZ106.1을 분리한다. 그 형질전환체는 SDS겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험시에, met-bGH를 고율로 발현시킨다. 플라스미드 pCZ106.1는 열유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하기 때문에 met-bGH의 최대 발현이 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
[실시예 10]
[플라스미드 pCZ 112.1 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 112.1의 제조]
다음과 같은 DNA 서열이 실시예 7의 링커 서열대신인 것을 제외하고는 실시예 7의 방법으로 수행하여 목적하는 구조를 얻는다 :
이다꾸라(Itakura et al., 1977) 및 크레아(Crea et al., 1978)의 통상의 방법에 따라 상기의 특정 링커 서열의 제조할 수 있다. 상기의 합성법은 또한 특별히 실시예 1에서 설명된다.
목적하는 형질전환체(본 명세서에서는 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 112.1로 표시한다)를 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 도포하고 이어서 통상적으로 그후의 공정을 위해 배양하고 플라스미드 pCZ 112.1를 분리한다. 그 형질전환체는 SDS겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험시에, met-bGH를 고율로 발현시킨다. 플라스미드 pCZ 112.1은 열유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하기 때문에 met-bGH의 최대 발현이 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
[실시예 11]
[플라스미드 pCZ 112.2 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 112.2의 제조]
다음과 같은 DNA 서열이 실시예 7의 링커 서열을 대신인 것을 제외하고는 실시예 7의 방법으로 수행하여 목적하는 구조를 얻는다 :
이다꾸라(Itakura et al., 1977) 및 크레아(Crea et al., 1978)의 통상의 방법에 따라 상기의 특정 링커 서열의 제조할 수 있다. 상기의 합성법은 또한 실시예 1에서 설명된다.
목적하는 형질전환체(본 명세서에서는 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 112.2로 표시한다)를 적절한 항생제물질을 함유하는 TY 한천상에 도포하고 이어서 통상적으로 그후의 공정을 위해 배양하고 플라스미드 pCZ 112.2를 분리한다. 그 형질전환체는 SDS겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험시에, met-bGH를 고율로 발현시킨다. 플라스미드 pCZ 112.2는 열유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하고 있기 때문에 met-bGH의 최대 발현이 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
[실시예 12]
[플라스미드 pCZ 1000 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1000의 제조]
다음과 같은 DNA 서열이 실시예 3C의 링커서열을 대신하는 것을 제외하고는 실시예 3의 방법으로 수행하여 목적하는 구조를 얻는다.
이다꾸라(Itakura et al., 1977) 및 크레아(Crea et al., 1978)의 통상의 방법에 따라 상기의 특정 링커 서열의 제조할 수 있다. 상기의 합성법은 또한 실시예 1에서 설명된다.
목적하는 형질전환체(본 명세서에서는 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1000로 표시한다)를 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 도포하고 이어서 통상적으로 그후의 공정을 위해 배양하고 플라스미드 pCZ 1000을 분리한다. 그 형질전환체는 SDS겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험시에, met-bGH를 고율로 발현시킨다. 플라스미드 pCZ 1000은 열유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하고 있기 때문에 met-bGH의 최대 발현이 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
[실시예 13]
[플라스미드 pCZ 1000.1 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1000.1의 제조]
다음과 같은 DNA 링커 서열이 실시예 3C의 링커서열을 대신하는 것을 제외하고는 실시예 7의 방법으로 수행하여 목적하는 구조를 얻는다 :
이다꾸라(Itakura et al., 1977) 및 크레아(Crea et al., 1978)의 통상의 방법에 따라 상기의 특정 링커 서열을 제조할 수 있다. 상기의 합성법은 또한 특별히 실시예 1에서 설명된다.
목적하는 형질전환체(본 명세서에서는 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1000.1로 표시한다)를 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 도포하고 이어서 통상적으로 그후의 공정을 위해 배양하고 플라스미드 pCZ 1000.1을 분리한다. 그 형질전환체는 SDS겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험시에, met-bGH를 고율로 발현시킨다. 플라스미드 pCZ 1000.1은 열유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하고 있기 때문에, met-bGH의 최대 발현이 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
[실시예 14]
[플라스미드 pCZ 1060 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1060의 제조]
다음과 같은 DNA 링커 서열이 실시예 3C의 링커 서열을 대신하는 것을 제외하고는 실시예 3의 방법으로 수행하여 목적하는 구조를 얻는다 :
이다꾸라(Itakura et al., 1977) 및 크레아(Crea et al., 1978)의 통상의 방법에 따라 상기의 특정 링커 서열의 제조할 수 있다. 상기의 합성법은 또한 특별히 실시예 1에서 설명된다.
목적하는 형질전환체(본 명세서에서는 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1060로 표시한다)를 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 도포하고 이어서 통상적으로 그후의 공정을 위해 배양하고 플라스미드 pCZ 1060을 분리한다. 그 형질전환체는 SDS겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험시에, met-bGH를 고율로 발현시킨다. 플라스미드 pCZ 1060는 열유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하기 때문에, met-bGH의 최대 발현이 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
[실시예 15]
[플라스미드 pCZ 1120 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1120의 제조]
다음과 같은 DNA 링커 서열이 실시예 3C의 링커 서열을 대신하는 것을 제외하고는 실시예 3의 방법으로 수행하여 목적하는 구조를 얻는다.
이다꾸라(Itakura et al., 1977) 및 크레아(Crea et al., 1978)의 통상의 방법에 따라 상기의 특정 링커 서열을 제조할 수 있다. 상기의 합성법은 또한 특별히 실시예 1에서 설명된다.
목적하는 형질전환체(본 명세서에서는 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1120로 표시한다)를 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 도포하고 이어서 통상적으로 그후의 공정을 위해 배양하고 플라스미드 pCZ 1120을 분리한다. 그 형질전환체는 SDS겔 전기영동법, RIA 및 다른 실험시에, met-bGH를 고율로 발현시킨다. 플라스미드 pCZ 1120는 열유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하기 때문에 met-bGH의 최대 발현이 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
[실시예 16]
[플라스미드 pCZ 1140 및 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1140의 제조]
50㎕ 메디움 솔트 완충액*중의 약 5㎍의 플라스미드 pNM 575(실시예 1B에서 제조된)를 각각 10단위씩의 BamHI 및 FunDII제한 효소와 함께 37℃에서 약 1시간동안 인큐베이션시킨다. 5㎕의 3M 나트륨 아세테이트(pH 7.0)를 첨가한 후에, 그 DNA를 2용적의 100% 에탄올로 침전시켜 회수한다. 목적하는 DNA 분해물을 100㎕의 TE완충액중에 용해시키고 0℃에 보관하였다가 필요할 때 사용한다.
* 메디움 솔트 완충액은 다음 조성으로 제조된다 :
50mM NaCl
50mM 트리스. HCl, pH8
10mM MgCl2
6mM β-메캅토 에탄올
B. DNA 링커 서열의 제조
이다꾸라(Itakura et al., 1977) 및 크레아(Crea et al., 1978)의 통상의 방법에 따라 상기의 특정 링커 서열을 제조할 수 있다. 상기의 합성방법은 또한 특별히 실시예 1에서 설명된다.
C. 연결화 및 형질전환
약 20피코물의 실시예 16B의 DNA 링커, 1㎍의 실시예 16A의 BamHI-FunDII 분해물 및 0.5㎍의 실시예 3A의 약 10.2kb BamHI-XbaI단편을 연결하고 생성된 플라스미드를 사용하여 이·콜라이 K12 RV308을 실시예 2D의 방법에 따라 형질전환시킨다.
통상적으로 아가로즈 겔 전기영동법(Maniatis et al., (1982)에 의해 확인되는 바와 같이, 생성된 형질전환체의 몇개는 오직 목적하는 약 10.8kb 플라스미드만을 함유한다. 그와 같은 형질전환체(본 명세서에서는 이·클라이 K12 RV308/pCZ 1140으로 표시한다)를 선택하여, 적절한 항생물질을 함유하는 TY 한천상에 피복하고 이어서 통상의 미생물학적 기술을 이용하여 배양시킨다. 그 생성 세포는 SDS겔 전기영동, RIA 및 다른 실험시에 met-bGH를 고율로 발현한다. 플라스미드 pCZ 1140은 열유도성 러너웨이 리플리콘을 함유하고 있기 때문에, met-bGH 최대 발현이 약 37℃의 배양온도에서 일어난다.
Claims (31)
- a) 전사 및 해독 활성화 서열, b) 리보조옴 결합 부위 및 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA링커(이때, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코드화하는 서열은 이 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 카복시 말단을 코드화하는 뉴클레오티드 트리플렛의 아래쪽에 바로 인접하여 위치하는 해독 정지 시그날, 및 이 정지 시그날의 아래쪽에 바로 인접하여 위치하는 해독 개시 시그날을 함유한다), 및 c) 작용성 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열(이때, 작용성 폴리펩타이드의 코드화 서열은 이 작용성 폴리펩타이드의 카복시 말단을 코드화하는 뉴클레오티드 트리플렛의 아래쪽에 바로 인접하여 위치하는 해독 정지 시그날을 함유한다)을 연결시킴을 특징으로 하여, 선택성이 있고 자발적으로 복제하는 재조합체 DNA 발현 벡터를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 방법.
- 제1 또는 2항에 있어서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 코드화 서열이 2 내지 20개의 아미노산을 코드화 하는 방법.
- 제1, 2 또는 제3항에 있어서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 코드화 서열이 MET-PHE-PRO-LEU-GLU-ASP-ASP, MET-GLU-ASP-ASP, MET-ASP-GLN-GLU-ASP, MET-ASP-ASP-LYS, MET-ASP-GLN-GLU 또는 MET-ASP-GLN(이때, MET는 메티오닌, PHE는 페닐알라닌, PRO는 프롤린, LEU는 로이신, GLU는 글루탐산, ASP는 아스파르트산이고 GLN은 글루타민이다)을 코드화하는 서열인 방법.
- 제1 내지 4항중의 어느 하나에 있어서, 전사 활성화 서열이 이·콜라이 트립토판, 이·콜라이 리포프로테인, 이·콜라이 락토즈, 박테리오파지 λPL OL 박테리오파지 λPr Or, 바실루스 서브틸리스 배지터티브(Bacillus subtilis vegetative) 또는 스트렙토마이세스 아주레우스 티오스트렙톤(Streptomyces azureus thiostrepton) 내성 전사 활성화 서열인 방법.
- 제5항에 있어서, 전사 활성화 서열이 직렬로 하나 이상의 이·콜라이 전사 활성화 서열을 함유하는 방법.
- 제1 내지 6항중의 어느 하나에 있어서 전사 활성화 서열이 이·콜라이 트립토판 전사 활성화 서열 또는 이·콜라이 리포프로테인 전사 활성화 서열인 방법.
- 제1 내지 7항중의 어느 하나에 있어서, 하나 또는 두개의 뉴클레오티드 쌍이 펩타이드 또는 폴리펩타이드 코드화 서열의 해독 정지 시그날과 작용성 폴리펩타이드 코드화 서열의 해독 개시 시그날 사이에 위치하는 방법.
- 제1 내지 7항중의 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 뉴클레오티드 트리플렛이 펩타이드 또는 폴리펩타이드 코드화 서열의 해독 정지 시그날과 작용성 폴리펩타이드 코드화 서열의 해독 개시 시그날 사이에 위치하는 방법.
- 제1 내지 9항중의 어느 하나에 있어서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 작용성 해독 활성화 서열을 함유하는 방법.
- 제1 내지 10항중의 어느 하나에 있어서, 재조합체 DNA 발현 벡터가, 전사후, 작용성 폴리펩타이드 및 융합되지 않은 부가 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 코돈을 함유하는 해독 가능한 폴리시스트로닉 mRNA를 생성하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 방법.
- 제1 내지 11항중의 어느 하나에 있어서, 작용성 폴리펩타이드 및 융합되지 않은 부가 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 코돈이 동일한 판도대(reading frame)에 있지 않는 방법.
- 제1 내지 12항중의 어느 하나에 있어서, 작용성 폴리펩타이드 코드화 서열이 소의 성장 호르몬, 인체의 성장 호르몬, 인체의 전-성장 호르몬, 돼지의 성장 호르몬, 포유동물의 성장 호르몬, 조류의 성장 호르몬, 인체의 인슐린 A 사슬, 인체의 인슐린 B 사슬, 인체의 프로인슐린, 인체의 프리프로인슐린, 인터페론, 유로키나제, 인체의 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장 호르몬 방출 인자 또는 인터로인킨 II를 코드화하는 서열인 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 114를 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 101.1을 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 1000을 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 1000.1을 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 1060을 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 1120을 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pNM 608의 EcoRI-ClaI 분해물, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 105.1을 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pNM 608의 EcoRI-ClaI 분해물, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 105.2를 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pNM 608의 EcoRI-ClaI 분해물, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 106.1을 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pNM 608의 EcoRI-ClaI 분해물, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 112.1을 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pNM 608의 EcoRI-ClaI 분해물, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-EcoRI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pCZ 101의 약 0.6kb BamHI-HgiAI 단편을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 112.2를 제조하는 방법.
- 제1, 2 또는 3항에 있어서, 플라스미드 pCZ 101의 약 10.2kb BamHI-XbaI 단편, 다음 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 링커 및 플라스미드 pNM 575의 BamHI-FnuDII 분해물을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 1140을 제조하는 방법.
- 플라스미드 pIM-I'-A3의 XbaI-BamHI 분해물 및 플라스미드 pNM 789B의 XbaI-BamHI 분해물을 연결시킴을 특징으로 하여, 플라스미드 pCZ 101을 제조하는 방법.
- 1) 제1 내지 25항중의 어느 하나의 재조합체 DNA 발현벡터로 세포를 형질전환시키고 2) 이 형질전환된 세포를 유전자 발현에 적합한 조건하에서 배양시킴을 특징으로 하여, 작용성 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
- 제27항에 있어서, 형질전환된 숙주 세포가 원핵 생물인 방법.
- 제28항에 있어서, 형질 전환된 원핵 생물이 이·콜라이, 바실루스(Bacillus) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)인 방법.
- 제29항에 있어서, 형질전환된 세포가 이·콜라이인 방법
- 제30항에 있어서, 형질 전환된 세포가 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 114, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 101.1, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1000, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1000.1, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1060, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 1120, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 105.1, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 105.2, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 106.1, 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 112.1 이·콜라이 K12 RV308/pCZ 112.2, 또는 이·콜라이 K 2 RV308/pCZ 1140인 방법.
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