PT80051B - Process for preparing recombinant dna expression vectors and method for gene expression - Google Patents

Description

Descrição das Figuras

Figuras 1-4 - Ilustração esquemá tica do protocolo de construção do plasmídeo pNM575.

Figuras 5-8 - Ilustração esquemática do protocolo de construção do plasmídeo pNM789B.

Figura 9 - Mapa dos locais de restrição dos plasmídeos pCZ114 e pCZ105.1.

Figura 10 - Mapa dos locais de restrição do plasmídeo pCZ1140.

Figura 11 - Gene sintético da

timosina alfa 1.

Figura 12 - Protocolo de sintese do fragmento de nucleotídeos T15.

Figura 13 - Protocolo de construção de plasmídeos pTh 1.

-61·:

Gene sintético da

‘fíTbl Δ!

Figura 14

proinsulina.

Figura 15

ção do plasmídeo pHI7A4Al.

Figura 16

ção do plasmídeo pHI104.

Protocolo de construProtocolo de constru0 presente invento proporciona um processo para preparação de um vector de expressão de DNA recombinante que se caracteriza pela ligação de

a) uma sequência activadora da transcrição e

tradução,

b) um DNA adaptador compreendendo uma sequência de nucleotideos que codifica um local de ligação ao ribossoma e um peptideo ou polipeptídeo, a sequência codificadora do referido peptideo ou polipeptideo contendo um sinal de paragem da tradução situado imediatamente adjacente e a jusante do tripleto de nucleotideos que codifica a terminação carbonilo do referido peptideo ou polipeptideo e um sinal de iniciação da tradução que está imediatamente adjacente e a jusante do referido sinal de paragem e

c) uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo funcional, a sequência codificadora do referido polipeptideo funcional contendo um sinal de paragem da tradução situada imediatamente adjacente e a jusante do tripleto de nucleotideos que codifica a terminação carboxilo do referido polipeptideo funcional, sujeito â limitação de o referido vector poder ser seleccionado e de replicação autó noma.

Os vectores podem ser construídos por ligação da sequência de DNA adaptador Xbaal - HgiAI.

5'	CTAGAGGGTATTAATA	ATG	TTC	CCA	TTG	GAG-GAT	GAT	TAA	ATG
	llllllllllil	III	II1	III	111	III III	111	III	III
	TCCCATAATTAT	TAC	AAG	GGT	AAC	CTC CTA	CTA	ATT	TAC
TTC	CCA GCC ATG TCC	TTG	TCC	GGC	CTG	TTT GCC	AAC	GCT
III	III III III III	III	1 11	III	1 1 1	II1 1II	III	1 1 1	<
AAG	GGT CGG TAC AGG	AAC	AGG	CCG	GAC	AAA CGG.	TTG	CGA

GTGCT 3’'

I

C 5’

em que A é desoxiadenilo, G é deoxiguanilo, C é deoxicitosilo e T é timidilo, aos fragmentos BamHI-Xbal10,2 kb e BamHI-HgiAI -v 0,6kb do plasmídeo pCZIOl. 0 plasmídeo resultante, designado por plasmídeo pCZ114, contém sequenciaj_ mente 1) a sequência activadora da transcrição e da tradução do gene da lipoproteina de E. coli (Nakamura and Inouye, 1979) na base de leitura de uma sequência de nucleotídeos que codifica um local de ligação ao ribossoma e um peptídeo com a sequência MET FEN PRO LEU GLU ASP ASP, em que

MET	é metionina,
FEN	é fenilalanina,
PRO	é p r 01 i n a
LEU	é leucina
GLU	é ácido glutânico e
ASP	ê ácido aspártico;

2) um sinal de paragem da tradução adequadamente situado e na fase de leitura da sequência codificadores do peptídeo atrás referido; 3) um sinal de iniciação da tradução que está imediatamente adjacente e a jusante do referido sinal de paragem, e que está na fase de leitura de uma sequência de nuclêotideos codificadora da hormona m-etionil de crescimento bovino ("met-bGH"); e 4) um sinal de paragem de tradu ção adequadamente situado e na fase de leitura da sequência

-8codificadora de met-bGH.

0 material de partida plasmídeo pCZIOl é ~ 10,8 kb e está construido por ligação do fragmento Xbal-BamHI -v 0,6 kb do plasmídeo pNM789B com o plasmídeo pIM-I'-A3 digerido de modo idêntico. 0 último plasmídeo, que contém a sequência activadora da transcrição e tradução do gene da lipoproteina de E\ coli e um replicão "runaway" ("que se escapa") termoinduzível, pode ser obtido a partir de E. coli K12 RV308/pIM-I¹-A3, uma estirpe depositada e que faz parte da colecção permanente de culturas estoque do Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois.

A estirpe pode ser adquirida como fonte preparada e reservatório estoque do plasmídeo com o número de acesso NRRL B-15733. 0 material de partida plasmídeo pNH789B é derivado

do plasmídeo pKENlll de acordo com os passos ilustrados e descritos nas Figuras 1-8 e Exemplo 1 abaixo. 0 plasmídeo pKENlll pode ser obtido a partir de E.. coli K12 Cl 620/ /pKENlll, uma estirpe depositada e que faz parte da colecção permanente de culturas estoque do Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois. A estirpe pode ser adquirida como fonte preferencial e rreservatório estoque do plasmídeo com o número de acesso NRRL B-15011. 0 plasmídeo pNM789B

também contem a sequência activadora da transcrição e tradução do genecda lipoproteina de E.. coli e ainda a sequência codificadora, incluindo um sinal de paragem da tradução adequadamente situado, e de uma proteina de fusão compreendendo bGH e um polipeptídeo de nove elementos da terminação N de bGH. A ligação da sequência acima referida activadora da transcrição e codificadora da proteina de fusão, contida no fragmento Xbal-BamHI, ao plasmídeo pIM-I¹-A3 adequadamente cortado resalto no material de partida plasmídeo pCZIOl acima referido

-9-

Os familiarizados com a matéria verão que o DNA adaptador Xbal - HgiAI descrito atrás é um componente importante do plasmldeo pCZ114. Este adaptador codifica 1) uma sequência activadora da tradução que está na fase de leitura de uma sequência de nucleótideos que codj_ fica simultaneamente um peptídeo e um local de ligação ao r_i_ bossoma 2) um sinal de paragem da tradução adequadamente situado e na fase de leitura da sequência codificadora do peptídeo atrás referido; e 3) um sinal de iniciação da tradução que está imediatamente adjacente e a jusante do referi_ do sinal de paragem e que está na fase de leitura de uma pa£ te da sequência codificadora de met-bGH. Ozrestante da sequência codificadora de met-bGH (incluindo um sinal de paragem da tradução adequadamente situado) e uma sequência activadora da transcrição pode conseguir-se rapidamente por ligação, como descrito atrás, do fragmento apropriado do plasmldeo pCZIOl, Tal ligação resulta no plasmídeo pCZ114 10,8 xb de expressão da hormona de crescimento bovino metionil (met-bGH). Os técnicos da especialidade reconhecerão que o primeiro peptídeo e o polipeptídeo funcional met-bGH não constituem um produto de genes fundidos, mas antes, são traduzidos como proteínas separadas a partir de um único mRNA policistrónico. Na Figura 9 dos desenhos juntos é apresentado um mapa de locais de restrição do plasmídeo ilustrativo pCZl14.

Podem igualmente ser construídos muitos plasmídeos relacionados de expressão de bGH que exemplificam ainda o presente invento. Por exemplo, se bem que uma sequência de DNA adaptador particular deva permitir a expressão de pelo menos dois polipeptídeos separados a partir de um único mRNA, o número de sequência de DNA adaptador que podem ser usados em tais construções virtualmente não tem limites. Estas sequências podem ser convencia^ mente sintetizadas pelo método fosfotriéster modificado usando como blocos de construção dideoxirribonucleotideos completamente protegidos. Tais métodos sintéticos são bem conheciΡβιΊΌ!

Lelfidos na especialidade e podem ser efectuados basicamente de acordo com o processo de Itakura et a 1 . , 1977, Science 198:1056 e Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75:5765. Sequências ilustrativas incluem,mas não estão limitadas aos deoxirribonucleotídeos identificados abaixo como se segue:

1. 5' CTAGAGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT TAA

I I I I I I I I I I I I II! I I I III III III III III III

3' TCCCATAATTAT TAC AAG GGT AAC CTA CTA CTA ATT

ATG TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT

iii iii ι ι ι iii iii iii iii iii ι ι ι ι ι ι -ι ι -1 iii ι ι ι ι ι ι

TAC AA.G GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA

GTGCT 3’

C 5'

2. 5' CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT CAG GAG GAT TAA ATG TTT

I I I I I I I I I I I I III I I I I I I III III III I I I I I r

3' TCCCATAATTAT TAC CTA GTC CTC CTA ATT TAC AAA

CCT GCT	ATG TCC TTG TCC III 1 I I III III TAC AGG AAC AGG	GGC I 1 1 CCG	CTG TTT GCC AAC	GCT f f 1 CGA	GTGCT 3 ι
1 1 1 GGA	I 1 1 CGA	1 1 ! GAC	1 1 1 AAA	1 1 1 CGG	1 1 1 TTG
c	5
3.	5' <	CTAGAGGGTATTAATA 1 1 I 1 I 1 1 1 1 1 I 1 TCCCATAATTAT	ATG	GAT	CAG	TAA	ATG	TTT	CCG	GCT
	3 ’	1 1 1 TAC	1 1 1 CTA	1 1 1 GTC	III ATT	1 1 1 TAC	1 1 1 AAA	III GGC	! 1 1 CGA
? TG	TCC	TTG TCC GGC CTG III III III I 1 I AAC AGG CCG GAC	TTT	GCC	AAC I 1 I TTG	GCT 1 1 1 CGA	GTGCT 3'	r
1 1 ’ T^C	t f I AGG	1 I 1 AAA	1 I 1 CGG	I c	5'	1
4.	5' CTAGAGGGTATTAATA	ATG	GAT	GAT	AAG	TAA	ATG	TTC	CCA
	3 '	ι i j i r ι ι i r r j i TCCCATAATTAT	Ϊ 1 1 TAC	1 1 1 CTA	1 1 I CTA	1 1 1 TTC	1 1 I ATT	f I I m * /-ι	1 1 1 AAG	1 1 1 GGT
GCC	ATG	TCC TTG TCC GGC	CTG	TTT	GCC	AAC	GCT	GTGCT 3'
1 1 I CGG	TAC	t f 1 líl 1 1 1 Ift AGG AAC AGG CCG	1 1 I GAC	I I 1 AAA	III CGG	1 I ! rrirn/-»	III CGA	I	5'
5.	5' CTAGAGGGTAAATTCT	ATG	GAT	GAT	AAG	TAA	ATG	TTT	CCG -III
	3 ’	IfrlTfl IIjfl TCCCATTTAAGA	I 1 1 TAC	I 1 1 CTA	1 1 1 CTA	III TTC	ATT	I 1 1 TAC	IIIAAA
GCT	ATG	TCC TTG TCC GGC	CTG	TTT	GCC	AAC	GCT	GTGCT 3'
I I 1 CGA	1 f 1 TAC	III III III f t 1 AGG AAC AGG CCG	III GAC	1 1 1 AAA	I 1 1 CGG	III TTG	1 I I CGA	l	5'

11-

As sequências designadas acima podem ser ligadas independente mente aos fragmentos BamHI-Xbal 10,2 kb e BamHI-HgiAI 0,6 kb do plasmídeo pCZIOl para construir respectivamente os plasmídeos ilustrativos pCZIOl.1, pCZlOOO.l, pCZ21060 e pCZ1120. Estes plasmídeos, quando da transcrição, originem um único mRNA policistrónico que codifica um primeiro peptídeo e também met-bGH.

0 presente invento não está de

modo algum limitado à utilização de uma sequência activadora da transcrição particular uma vez que a escolha de uma sequência especifica não é critica para a operacionalidade do presente invento. Sequências activadoras da transcrição que possam substituir a sequência exemplificada activadora da lipoproteina incluem mas não estão limitadas âs sequências activadoras da transcrição dos genes tripltofeno (trp) de E. col i, lactose (lac) de E. col i, P_L0|_ do bacteriófago /\ P_R0_R do bacteriófago , vegetativo (veg) de Baci 1 lus e resistência ao tiostrepton (tsr) de Streptomyces azureus. Em adição podem ser usadas em tandem uma ou mais sequências actj_ vadoras da transcrição, como por exemplo as sequências activadoras da transcrição de trp e de lac. Todas as sequências referidas foram previamente caracterizadas e podem ser construídas quer sinteticamente quer a partir de plasmídeos conhecidos .

Mais particularmente, a sequência activadora da transcrição do triptofano (trp) pode ser obtida por digestão do plasmídeo pHI74 4 1. com EcoRI-Clal.

0 plasmídeo pHI7^44l pode ser construído de acordo com os ensinamentos do Exemplo 5 abaixo. Devido à multiplicidade de locais de restrição TagI no plasmídeo pHI74 44 1, o fragmento desejado EcoRI-TagI poderá obter-se e ser amplificado mais facilmente por clonagem prévia dos fragmentos EcoRI-Hpal e Hpal-TagI de pHI74 4⁴ 1 no plasmídeo pBR322 digerido com EcoRI -Ciai. 0 plasmídeo resultante ^v4,6 kb, designado

por plasmídeo pNM608, contem a sequência activadora da

12*

transcrição de trp e é portanto útil na construção de outros exemplos do presente invento.

Plasmídeos ilustrativos compreenden do a referida sequência activadora do trp podem ser constru^ dos por ligação de I) fragmento EcoRI-TagI ^0,29 kb do pias mídeo pNM608; 2) fragmento EcoRI-BamHI 10 kb do plasmídeo

pCZIOl; 3) fragmento BamHI-HgiAI ^0,6 kb do plasmídeo pCZIOI; e 4) qualquer das sequências de deoxirribonucleotídeos identificadas abaixo como segue:

1. 5’ CGACA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG TTC CCA

111 t I I III III III III III III III III III III

3’ TGT TAC AAG GGT AAC CTC CTA CTA ATT TAC AAG GGT

GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTC TTT C-CC AAC GCT GTGCT'3*

III III III III I I I III III III III III III I

CGG TAC’ AGG AAC AGG,CCG GAG AAA CGG TTG CGA C 5’ ,

. 1

2. 5' CGACA ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT TAA ATG TTC CCA

III III III III III III III III III III III III

3' TGT TAC AAG GGT AAC CTA CTA CTA ATT TAC AAG GGT

GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'

III III III III III III III I I I I I I III III I

CGG TAC AGG AAC AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C 5'

3. 5’ CGACC ATG GAT CAG GAG TAA ATG TTC CCG GCT ATG TCC

III III III III III III III III III III III III

3’ TGG TAC CTA GTC CTC ATT TAC AAG GGC CGA TAC AGG

TTG TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’

III III III III III III III III I

AAC AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C 5'

4. 5' CGACC ATG GAT GAT AAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG TCC

III III 111 III III III III l l l I I l l I I I I l III

3' TGG TAC CTA CTA TTC ATT TAC AAA GGC CGA TAC AGG

TTG TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’

III III III III III III III III I

AAC AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C 5'

5. 5' CGACC ATG GAT GAT AAG GAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG

t η iii iii iii iii iil t ι l I ι ι iii Iii iil lll

3' TGG TAC CTA CTA TTC CTC ATT TAC AAA GGC CGA TAC

TCC TTG TCC. GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'

lll lll III lll III lll I l l III III I

AGG AAC AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C 5'

-13As ligações acima descritas resul_ tam respectivamente nos plasmídeos ilustrativos J 10,8 kb pCZ105.2, pCZ106.1, pCZ102.1 e pCZ112.2. Estes plasmídeos quando da transcrição, originam um único mRNA policistrónico que codifica um primeiro peptideo e também met-bGH e portanto exemplifica também o presente invento. Na Figura 9 dos desenhos junto está apresentado um mapa dos locais de restrição do plasmídeo pCZ105.1.

0 presente invento é altamente versátil uma vez que virtualmente qualquer sequência de nucleotídeos que codifique um polipeptídeo, funcional pode substituir a sequência codificadora de mer-bGH exemplificada acima. Tais sequências incluem mas não estão limitadas a sequências que codificam a hormona de crescimento humana ("hGH"), hormona de pré-crescimento humano (pre-hGH), hormona de crescimento avia'ria, factor de libertação da hormona de crescimento, cadeia A da insulina humana, cadeia B da insulina humana, proinsulina humana, pré-proinsulina humana, interferãó humano e não humano, urocinase, activador do plasminogénio de tecido, interleuquina II, qualquer hormona polipeptídica, qualquer enzima polipeptidica e qualquer polipeptideo bioactivo de valor comercial ou para a investigação.

Mais particularmente, um vector ilustrativo exemplificando a expressão de bGH pode ser construído por ligação do fragmento Bam-Hi-Xbal 10,2 kb do plasmídeo pCZIOl e do fragmento BamHi-FnuDII ^0,5 kb do plasmídeo pNM575 com uma sequência adaptadora

14

!5 ’ - CTAG

AGGGTATTAATA

1 I I I I 1 » t I » · ι

TCCCATAATTAT

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I I

GC 5'

em que A é deoxiadenilo, G ê deoxiguanilo, C ê deoxicitosilo e T é timidilo. 0 plasmídeo resultante, designado por plasmídeo pCZ1140, contêm sequencialmente, 1) a sequência activadora da transcrição e tradução do gene da lipoproteina de E. coli na fase de leitura de uma sequência de nucleotídeos que codifica um local de ligação ao ribossoma e um peptídeo com a sequência de MET FEN PRO LEU GLU ASP ASP, em que MET é metionina, FEN é fenilalanina, PRO é prolina,

LEU ê leucina, GLU ê ácido glutâmico e ASP ê ãcido aspártico;

2) um sinal de paragem da tradução adequadamente situado e na fase de leitura da sequência codificadora do peptídeo referido atrás; 3) um sinal de iniciação da tradução que está imediatamente adjacente e a jusante do referido sinal de paragem e que está na fase de leitura de uma sequência de nucleotídeos codificadora da hormona de crescimento humana metionil (met-hGH); e 4) um sinal de paragem da tradução adequadamente situado e na fase de leitura da sequência codificadora de met-HGH. A sequência adaptadora acima descrita pode ser sintetizada segundo moldes convencionais basicamente de acordo com o processo de Itakura et al., 1977 e Crea et al, 1978, atrás citado e o material de partida, o plasmídeo pNM575, pode ser construído de acordo com os passos ilustrados nas Figuras 1-4 e Exemplos 1 abaixo.Na Figura 10 dos desenhos juntos é apresentado um mapa dos

-15-

locais de restrição do plasmídeo ilustrativo pCZ1140.

Nas execuções especificas aqui descritas, a replicação do plasmídeo ê determinada por um replicão "que se escapa" termoinduzível divulgado em publicação da Patente GB Número 1.557.774 e Uhlin et al., 1979, Gens 6:91. A temperaturas abaixo de 30°C, especialmente 25°C, o replicão mantém um número de cópias relativamente baixo de cerca de 10-15 cópias por célula. Quando a temperatura sobe para 37°C perde-se o controle das cópias e o DNA do plasmídeo que contém o replicão aumenta para 1000-2000 cópias por célula. 0 replição "que se escapa" particular exemplificado neste caso está contido no material de partida plasmídeo pIM-I¹-A3 já descrito.

Deve-se entender que o presente invento não está limitado â utilização de qualquer replicão "que se escapa" particular ou mutante relativo ao número de cópias. Outros replicões "que se escapam" induzíveis ou de el ϊ vado número de cópias podem ser obtidos por selecção apropriada ou podem ser construídos de acordo cornos processos divulgados na Publicação - Internacional Número W082/02901 e Bittner e Vapnek, 1981, Gene 15:319. Em adição, replicões "que não se escapam" pode também ser usados desde que sejam funcionais em E. coli, Baci1lus, Streptomyces ou outra célula hospedeira microbiana. Exemplos de replicões de pMBl, ColE. NR1, RK2, RK6, pSClOl, RP1, RP4, F e ismilares, incluindo bacteriófagos que se repliquem em £. coli; replicões de pEL7, pEL103, SC103, SCP2, SCP2 * e similares incluindo bacteriófagos que se repliquem em Streptomyces; e replicões de pC194, pBSl, pE194, pUBllO, pT127 e similares, incluindo bacteriófagos se repliquem em Baci1lus. Os familiarizados com a matéria verificarão que estes e também uma variedades de replicões "que se escapam" podem ser substituídos e usados para construção de vectores de expressão os quais estão dentro do âmbito do presente invento.

Muitas outras modificações e variações das presentes sequências de DNA ilustrativas são possíveis. Por exemplo, a degeneração do código genético permite a substituição de nucleotídeos em qualquer região codificadora de aminoácidos assim como a substituição do sinal de paragem de tradução TAA exemplificado específiI 1 !

ATT

camente pelos sinais de paragem da tradução TAG ou TGA.

III lll

ATC ACT

Em adição o número e escolha de nucleotídeos entre a sequência cativadora da transcrição e o segundo codão de iniciação da tradução dos vectores pode variar desde que se providencie os sinais de tradução adequados (local de ligação ao ribossoma e primeiro sinal de iniciação da tradução e de paragem desta). Outras variações dentro do presente âmbito incluem 1) alteração da fase de leitura do primeiro sinal de paragem da tradução em relação ao segundo sinal de iniciação da tradução através da adição de um ou mais nucleotídeos; 2) colocação de um ou mais tripletos de nucleotídeos, mantendo neste caso a fase de leitura, entre o primeiro sinal de paragem da tradução e o segundo sinal de paragem da tradução; e 3) alteração do comprimento do primeiro cistrão (região entre a sequência activadora da transcrição, incluindo-a, e o primeiro sinal de paragem da tradução) atra vês da adição de tripletos de nucleotídeos entre o primeiro sinal de iniciação da tradução e o primeiro sinal de paragem Se bem que o comprimento do cistrão não seja crítico normalmlente prefere-se um primeiro cistrão relativamente pequeno que codifique 2-20 aminoácidos.

Os tripletos de nucleótideos compreendendo o primeiro cistrão devem ser escolhidos segundo os princípios e extrapolações conhecidos revistos em Zuker e Stiegler 1981, Nucleic Acids Reserach 9(1):133, para evitar a produção de bases complementares no mRNA. As ligações de hidrogénio (emparelhamento) entre tais bases complementares resulta em configuração pedunculadps e em ansa

e enrolamento que se crê reduzirem a eficiência da tradução De preferência os tripletos de nucleotídeos que englobam o primeiro cistrão devem também proporcionar, quando da transcrição, um local de ligação ao ribossoma adequadamente istuado a montante do segundo codão de iniciação da tradução. Isto pode conseguir-se por selecção dos tripletos de nucleotídeos que originam pelo menos dois codões que não só especificam aminoácidos como também, quando considerados em conjunto, constituam o local de ligação ao ribossoma deseja do.

Os entendidos na matéria compreenderão que todas as modificações e variações atrás divulga das podem ser convencionalmente sintetizadas basicamente de acordo com os métodos de síntese já citados. Portanto, o presente invento não está de modo algum limitado às sequências de DNA e plasmídeos, especificamente exemplificados.

0 presente

ainda um novo método para produção de cional que se caracteriza por

invento proporciona um polipeptídeo fun1) transformação de uma célula competente com um vector de expressão de DNA recombinante seleccionável e de replicação autónoma o qual inclui.

a) uma sequência activadora de transcrição e tradução que estaja na fase de leitura de uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptideo ou polipeptídeo a sequência codificadora do referido peptideo ou polipeptídeo contendo um sinal de paragem da tradução situado imediatamente adjacente e a jusante do tripleto de nideótideos que codifica a terminação carboxilo do referido peptídeo ou

polipeptídeo

-18-

b) um sinal de iniciação da tradução que está imediatamente adjacente e a jusante do referido sinal de paragem e que está na fase de leitura de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo funcional, a sequêncial codificadora do referido polipeptídeo funcional contendo um sinal de paragem da tradução situado imediatamente adjacente e a jusante do tripleto de nucleotídeos que codifica a terminação earboxilo do referido polipeptídeo funcional, e

2) cultura da célula transformada nas condições de crescimento adequadas â expressão genética.

0 método acima mencionado soluciona o problema de níveis baixos ou de nenhuma expressão genética nos casos em que o mRNA ê instável, não possui uma configura, ção adequada ou não possui as sequências apropriadas para uma ligação altamente eficaz aos ribossomas. 0 presente invento soluciona este problema proporcionando a formação de um único mRNA contendo dois cistrões. A sequência codificadora do primeiro peptídeo ou polipeptídeo do vector, que quando da transcrição, compreende o primeiro cistrão da mensagem é projectada de modo a evitar a formação de estruturas secundárias pedunculadas e em ansa no mRNA. Tais configurações, que se crê impedirem uma ligação adequada ao ribossoma e portanto tradução e expressão, são evitadas por selecção dos nucleotídeos que não originem bases complementares quando da transcrição. Uma vez que isto pode ser feito de acordo com a degeneração do código genético e os prin_ cipios e métodos anteriormente citados (Zuker e Stiegler, 1981), o presente invento está sujeito a poucas, se algumas limitações. Deste modo, o presente método é útil para a expressão de DNA codificador de virtualmente qualquer polipeptídeo de valor comercial ou para investigação. 0 presente invento também pode ser usado para adicionar sequências e portanto estabilizar um RNA de outro modo instável ou re-

tirar sequências que interfiram com o local de ligação ao ribossoma e iniciação da tradução do mRNA.

Os vectores de expressão e métodos deste invento podem ser usados numa larga gama de organismos hospedeiros, por exemplo, organismos procarióticos gram-negativos como sejam Escherichia col i, por exemplo, E_ col i K12, E. coli K12 RV308, E. coli K12, KB1O1, E. coli K12 C600, E.coli K12 C600 R_k-M_k-, E. coli K12 RR1 e E. coli K12 MM294, Serratia, Pseudomonas, e similares; organismos procarióticos gram-positivos como sejam Baci1lus , por exemplo, B. subti1 is, B. thuringiensis e B. thuringiensis var. israelensis, e Streptomyces, por exemplo, S. fradiae S. ambofaciences, lividans e S. griseofuscus. Se bem que todas as execuções do presente invento sejam úteis existem alguns vectores e transformantes preferidos. Os vectores preferidos incluem pCZIOl.l, pCZ105.1, pCZ105.2, pCZ106.1, pCZ112.1, pCZ112.2 e pCZ1140 e os transformantes preferidos incluem E. coli K12 RV308/pCZl 14, E. col i K12 RV 308/pCZl01.1, E. coli K12 RV308/pCZl05.1, E. coli K12 RV308/pCZ106,1 E. coli K12 RV 308/pCZ 112.1, E. coli K12 RV308/pCZ1140. Deste grupo preferido os plasmídeos pCZl14 e pCZIOl.l e os transformantes £. coli K12 RV308/pCZ114 e E. coli K12 RV308/pCZl01.1 são espeeialmente preferidos.

Os entendidos na matéria reconhecerão que os vectores de expressão e métodos deste invento são usados para transformar organismos hospedeiros adequados de modo a que seja expresso um produto proteico exógeno usando condições de fermentação normalizados. 0 produto proteico exógeno, é então isolado por métodos de rotina a partir do caldo de fermentação resultante.Os exemplares que se seguem ilustram o invento aqui divulgado.Sempre que apropriado são descritos os fundamentos e os próprios processos para a construção do invento.

-20'ORTUGAI

Η'*'.*" >

4r"Tf*^fl,Xí.

EXEMPLO I

Construção de Plasmídeo pNM789B

A.

Construção do Plasmídeo pKEN021 Xbal - BamHI

e do seu Fragmento

0 fragmento™ 5,1 kb produzido por corte do plasmídeo pKEN021 com Xbal-BamHI (106 na Figura 3) foi usado como material de partida. 0 plasmídeo pKEN021 é um derivado de pKENlll, (101 na Figura 1 e ainda descrito em Lee, et al, 1981; J. Bact. 146: 861 - 866 e Zwiebel, et al., 1981, J. Bact. 145:654-656), o qual está depositado em IE. col i CC620 (Depósito NRRL N^s. 15011) é que possui um fragmento''·· 2,8 kb contendo o gene da lipoproteina de E^. coli. Uma descrição deste fragmento é dada em Nakamura e Inouye, 1979, Cell 18: 1109-1117. Em pKEN021 , a sequência de 650 pb (pares de bases) entre os únicos locais de restrição EcoRI e Sall do pBR322 foi substituída por sequências retiradas do gene da lipoproteina de JZ. col i. A sequência do gene da lipoproteina inclui um fragmento Alui de 462 pb (Nakamura e Inouye, 1979), o montante do primeiro tripleto (metionina) do gene da lipoproteina que contem o promotor, a região 5' não traduzida e o local de ligação ao ribossoma. Um local de restrição Xbal único está situado dentro do local de ligação ao ribossoma 16pb antes do sinal metionina de iniciação da tradução. Um local de restrição Pvul1 situado 105 pb a montante do codão de terminação da tradução do gene estrutural foi alterado para um local de restrição BamHI através da adição de um DNA adaptador sintético (5¹CCGGATCCGG3¹, adquirido â Col1aborative Research).

A sequência codificadora dos trinta e cinco últimos aminoácidos da lipoproteina, o sinal de terminação da tradução e a sequência correspondente â região 3' não traduzida do RNA mensageiro seguem o local BamHI. 0 plasmídeo pKEN021 também inclui alguns 850 pb de sequências estranhas não

-21........

relacionadas com o gene da lipoproteina e situadas a jusante dele no cromossoma de E. coli. Estas seuqências foram incluídas como sequência dos métodos e locais de enzimas de restrição usados no isolamento original do gene.

Relativamente às Figuras

1,2, e 3 o plasmídeo pKEN021, é derivado do pKENlll do seguinte modo: cerca de 50 jjg de pKENiii (101 na Figura 1) são digeridos com 25 unidades da enzima de restrição HpalI em 300 jjI de um tampão contendo tris-HCl 20 mM, pH 7,4,

MgCl₂ 10 mM e p-mercaptoetanol 6 mM a 37°C durante 2 horas.

A mistura é extraída duas vezes com 300 jil de uma mistura 50:50 de fenol e clorofórmio e a fase aquosa recuperada e precipitada em seguida com 2,5 volumes de etanol e 0,1 volumes de acetato de sódio 3M. 0 sedimento de DNA é dissolvido

em 100 jj 1 de tampão de electroforese e fraccionado num gel de 5 por cento de poliacrilamida (a relação acrilamida:bis é de 29:1 em todos os géis excepto nos casos em que lago em contrário seja observado). 0 gel é corado com uma solução contendo 0,5 ^ug/ml de brometo de etidio e as bandas são visualizadas com luz ultravioleta de grande comprimento de onda. Uma banda de 950 pb é isolada e recuperada do gel por electroeluição num saco de diálise. Após extracção com fenol/CHClg e precipitação com etanol, o DNA recuperado (cerca de 2,5 pg) é dissolvido em 25 jj 1 de TEN (NaCl 10 mM, Tris..HCl 10 mM, pH 7,4 e etilenodinitrilotetracetato de sódio (EDTA), pH 8,0).

Cerca de 2 yug do fragmento

Hpal de 950 pb são digeridos com a enzima de restrição Alui em 200 jul de um tampão contendo NaCl 50mM, Tris.HCl 6 mM (pH7,6), MgCl₂ 6 mM e p-mercaptoetanol 6 mM durante 2 horas a 37°C. 0 DNA é fraccionado num gel de 6 por cento

de poliacrilamida e o fragmento Alui e 462 pb produzido é

recuperado e purificado pelo método anteriormente descrito.

0 fragmento Alui de 462 pb (cerca de 1 jjg) é dissolvido em

10 jj 1 de tampão de ligase do DNA de T4 (Tris.HCl 66 mM,

pH 7,6, MgCl^ 10mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 0,4 mM) contendo 150 picomoles do adaptador EcoRI (5'GGAATCG3' da Collaborative Research) fosforilado e 2 unidade da ligase do DNA de T4. Após incubação a 4°C durante 16 horas, a mistura é aquecida a 65°C durante 10 minutos e diluida para 100 ^il com a adição de tampão EcoRI (Tris.HCl 100 mM, pH 7,2; NaCl 50mM, MgCl₂ 10 mM, B-mercaptoetanol 6 mM) e 40 unidades da enzima EcoRI. Após 2 horas a 37°C a amostra é extraida segundo moldes convencionais com fenol/CHClg e precipitada com etanol. 0 DNA é então dissolvido em 20 pl de tampão ligase do DNA de T4 contendo 0,1 unidade de ligase do DNA de T4 e 0,1 ^ig de pBR322 (102 na Figura 1) o qual foi linearizado com EcoRI e depois tratado com fosfatase alcalina. Após ligação a 4°C durante 16 horas, o DNA resultante é usado para tran_s formar convencionalmente E.coli estirpe K12 HB101. Os transformantes são seleccionados em placas de agar contendo 12 pg/ml de tetraciclina e os plasmídeos isolados a partir de colónias resistentes pelo processo rápido de extracção alcalina descrito em Birnboim e Doly, 1979, Nucleic Acids Research 7: 1513-1523. Um plasmídeo (103 na Figura 1) conter^ do um fragmento Xbal-BamHI de 466 pb é seleccionado e usado como material de partida do passo descrito em seguida.

Cerca de duas yug deste plasmideo (103 na Figura 2) são digeridos com 2 unidades da enzima HindIII em 50 pl de tampão Hindi11 (NaCl 60 mM, Tris.HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl₂ 10 mM e p-mercaptoetanol 6 mM) durante 1 hora a 37°C. Após extracção com fenol/CHClg e precipitação com etanol, o DNA é dissolvido em 300 ^il de um tampão contendo NaCl 300 mM, acetato de sódio 30 mM pH 4,25, ZnCl₂ 1 mM e 200 unidades de nuclease SI (Miles Laboratories). Após 1 hora a 15°C a reacção é parada por extracção com fenol/CHClg e precipitação com etanol. 0 DNA resultante é dissolvido em 10 pil de tampão ligase do DNA de T4 contendo 20 picomoles de adaptadores BamHI (5¹CCGGATCCGG3¹, da Collaborative Research) fosforilados e 2 unidades de ligase do DNA de T4. Após 16 horas a 4°C, a mistura de ligase do

DNA de T4. Após 16 horas a 4°C, a mistura de reacção ê aque cida a 65°C durante 10 minutos, para inactivar a ligase e depois diluida para 100 jul com tampão BamHI(NaCI 150 mM,

Tris.HCl 20 mM, pH 8,0, MgClglO mM, p-mercaptoetanol 6 mM) contendo 20 unidades da enzima BamHI. Após 2 horas a 37°C a mistura é purificada num gel de 1 por cento de agarose.

0 gel é corado e o fragmento maior ( ^4,5 kb)) é recuperado por eluição após congelação e depois purificado por extracção com fenol/CHClg e precipitação com etanol. 0 fragmento recuperado com extremidades coesivas BamHI é dissolvido em 20 jjl de tampão ligase do DNA de T4 contendo 0,1 unidade de ligase do DNA de T4. Após 16 horas a 4°C, o DNA é usado para transformar E. coli HB 101. Os transformantes são seleccionados pela ersistência à ampicilina (Ap^r) a 100 jjg/ml e testados quanto â sensibilidade a 10 jujg/ml de tetraciclina (Tc^s). Vários plasmídeos, preparados pelo processo de Birrloim anteriormente descrito a partir de colónias que são Ap^rTc^s, são examinados quanto â ausência de um local HindIII e quanto â presença de um único local BamHI. Digestão sequenciada com EcoRI e SalI dá um fragmento de 466 pb e um fragmento de 305 pb. Um plasmídeo (104 na Figura 2) com estas caracteristicas é seleccionado e depois modificado para converter o local EcoRI situado a montante do promotor cpp, num local de restrição HindIII .

Dois microgramas de plasmídeo (104 na Figura 2) são digeridos em 100 ^il de tampão EcoRI com 0,2 unidades de EcoRI durante 10 minutos a 37°C. A reacção é parada por aquecimento durante 10 minutos a 65°C é depois, após extracção com fenol/CHClg, o DNA é precipitado com etanol, dissolvido em 200 ^ul de tampão nuclease SI contendo 1000 unidades/ml de nuclease SI e deixado reagir a 12°C durante 1 hora. A reacção é parada por extracção com fenol/CHClg e precipitação com etanol. 0 DNA resultante é ressuspenso em 10 ^1 de tampão ligase do DNA de T4 contendo 20 picomoles do adaptador HindIII

(5 ¹CCAAGCTTGG3¹, da Collaborative Research) fosforilado e

-24í ÍRTUGAÍ

2 unidades de ligase do DNA de T4. Após 16 horas a 4°C, a mistura é aquecida durante 10 minutos a 65°C, diluida para 150 jil em tampão Hindi11 contendo 10 unidades da enzima HindII I, incubada durante 2 horas a 37°C e depois fraccionada num gel de 1 por cento de agarose. A banda maior (equivalente ao plasmídeo cortado num único sitio) ê ercuperada e purificada segundo processos convencionais, dissolvida em 20 yjl de tampão ligase do DNA de T4 contendo 0,2 unidades de ligase de T4, incubada 16 horas a 4°C e depois use da para transformar E coli HB101. Os transformantes são seleccionados relativamente â resistência â ampicilina e os plasmídeos isolados analisados convencionalmente por análise com enzimas de restrição. Um plasmídeo (105 na Figura 2) com um fragmento EcoRI-HindIII de 500 pb seleccionou-se e usou-se como vector de clonagem para adição da região 3' do gene Ipp.

Para obter o fragmento contendo a região 3' de lpp, 10 ug de pKENHI (101 na Figura 3) são digeridos em 200 yjl de tampão Hpal (KC1 20 mM, Tris.HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl₂ 10 mM e ^-mercaptoetanol 6 mM) com 10 unidades de Hpal durante 2 horas a 37°C. Após extracção com fenol/CHClg e precipitação com etanol, o DNA é dissolvido em 10 pl de tampão ligase do DNA de T4 contendo 20 picomoles do adaptador Sall (5¹GGTCGACC3 ¹ , da Col1aborative Research) fosforilado e 2 unidades de ligase do DNA de T4 e depois incubado durante 16 horas a 4°C. A ligase é inactivada por aquecimento a 65°C durante 10 minutos. 0 material resultante é diluido para 100 jjl em tampão Sal I contendo 10 unidades de Sall e incubado 1 hora a 37°C e depois diluido para 300 ul em tampão PvulI (Na Cl 60 mM, Tris.HCl 6mM, pH 7,5, MgCl₂ 6 mM, ^B-mercaptoetanol 6 mM) contendo 10 unidades de enzima de restrição Pvul I. Apôs 1 hora a 37°C, o DNA é fraccionado num gel de 5 por cento de poliacrilamida. Recupera-se cerca de 0,5 yjg de um fragmento de 950 pb que se purificou e dissolveu em TEN.

-25Dois décimos do micrograma do fragmento ê diluido para 20 pl de tampão ligase do DNA de T4 contendo 20 picomoles de adapta_ dor BamHI (5¹000Α^τ0Γθ63¹, da Collaborative Research) fosforilado e 2 unidades de ligase do DNA de T4 e depois incubado durante 16 horas a 4°C. 0 DNA resultante é então aquecido durante 10 minutos a 65°C, diluido para loo pl em tampão BamHI contendo 20 unidades de BamHI, incubado a 37°C durante 2 horas e depois fraccionado num gel de 5 por cento de poliacrilamida para remover as moléculas de adaptador em excesso. 0 fragmento de 950 pb resultante tendo extremidades coesivas BamHI e Sall foi purificado convencionalmente e dissolvido em 20 pl de tampão ligase do DNA de T4 contendo 0,2 jjg do vector de clonagem descrito atrás e 0,2 unidades de ligase do DNA de T4. Após incubação durante 16 horas a 4°C, o DNA usou-se para transformar L· coli K12 HB101. Os plasmídeos são preparados a partir de transformantes resistentes à ampicilina e convencionalmente analisados relativamente à presença do fragmento SalI-BamHI. 0 plasmídeo desejado

(^5,2 kb) designou-se por pKEN021 ( 106 na Figura 3).

Dez microgramas de pKEN021 foram digeridos a 37°C em 200 ul de tampão Xbal/BamHI (NaC1150mM, Tris.HCl 10 mM, pH8, MgCl₂ 10mM, p-mercaptoetanol 6mM) usando 10 unidades de BamHI durante 1 hora seguido de 10 unidades de Xbal durante mais uma hora a 37°C. 0 DNA desejado

digerido com Xbal-BamHI foi então tratado com 2,5 unidades de fosfatase alcalina durante 1,5 horas a 65°C, extraido com fenol/CHClg, colhido por precipitação com etanol e dissolvido em 50 pl de TEN para utilização futura (107 na figura 3).

-26Μ^^ΟηΒβ· |j.^ j.íc ΜΜΟΗΜΗββΒι

B. Construção do Plasmídeo pNM575

0 plasmídeo ptrpED50chGH800 (108 na Figura 4), descrito em Martial et al., 1979, Science 205: 602-607 foi usado como fonte de um fragmento de DNA contendo a sequência codificadora de uma parte do gene da hormona de crescimento humano. Este fragmento pode também ser construído sinteticamente (Itakura et al., 1977 e Crea et al.,

1978) ou pode ser obtido usando metodologia bem conhecida descrita por Goodman et al., 1979, "Methodos in Enzymology 68:

f 75-90, através do isolamento do mRNA codificador da hcmona

de crescimento humana a partir de pituitárias humanas.

A parte do gene da hormona de crescimento humana do plasmideo ptrpED50chGH800 contem um único local de restrição Smal 6pb a jusante do codão de terminação da tradução do gene.

Este local foi alterado para um local BamHI usando o processo que se segue: 6 jjg do plasmídeo foram digeridos com 6 unidades de Smal em 200 ul de tampão de restrição Smal (Tris.HCl 15 mM, pH 8,0, MgCl₂ 6mM, KC1 15 mM e p-mercaptoetanol 6mM) durante 1,5 horas a 37°C. Após completa a digestão, fez-se extracção com fenol/CHClg e o DNA foi recuperado por precipitação com etanol e depois dissolvido em 24 ul de TEN. Quarenta picomoles do fragmento adaptador BamHI (Collaborative Research) fosforilado foram adicionados a 0,5 jg (0,2 picomoles final) do plasmídeo acima digerido em 16 yul de tampão ligase contendo 2 unidades de ligase do DNA de T4.

A mistura foi incubada 2 horas a

1 22°C, 16 horas a 4°C e depois 10 minutos a 65°C. Extremidades coesivas BamHI foram criadas por digestão convencional com a enzima de restrição BamHI. A enzima cortou a sequência do adaptador assim como o local BamHIsituado no inicio da sequência de cDNA clonado da hormona de crescimento humana.

Isto originou um fragmento de 691 pb com extremidades coesivas BamHI o qual foi separado num gel de 6 por cento de poliacrilamida e depois recuperado como é habitual. 0 fragmento

de DNA recuperado foi ligado (usando 0,2 unidades de ligase

do DNA de T4 em 20/ul de tampão nas condições descritas atrás) com 0,2 /ug de pBR322 digerido com BamHI e tratado com fosfata se alcalina (102 na Figura 4).Após 16 horas a 4°C, o material foi usado para transformar E. coli estirpe JA221 (NRRL N.⁹ B-15014) basicamente de acordo com o processo de transformação de Wensink et al. 1974, Cell 3:315-325. Os transformantes foram seleccionados em placas de agar contendo 100/jg/ml de ampicilina e em seguida os plasmídeos foram isolados pelos métodos tradicionais e identificados por análise com enzimas de restrição e electroforese em gel. Os plasmídeos desejados,

I designados por pNM575 (109 na Figura 4), contém um fragmento

BamHI com cerca de 700 pb e foram amplificados convencionalmente para uso futuro.

C. Construção do Plasmídeo pNM702

A sequência do DNA da hormona de crescimento humana madura contem um local FnuDII que dista 47 pb do primeiro nucleótideo. Vinte e cinco microgramas de pNM575 foram digeridos em 250 ul de tampão BamHI com 25 unidades de BamHI a 37°C durante 1 hora. 0 fragmento de 691 pb com extremidades coesivas BamHI foi isolado conencionalmente a partir de um gel de 06 por cento de poliacrilamida e purificado. Após purificação do fragmento, um terço dele(equivalente a 8 /jg de plasmídeo) foi digerido em 100/j1 de tampão FnuDII (NaCl 6mM, Tris.HCl 6 mM, pH 7,4, MgCl^ 6 mM, JB-mercaptoetanol 6mM) com 2,5 unidades de FnuDII durante 1,5 horas a 37°C.Usou-se electroforese em gel de 6 por cento de poliacrilamida e processos recuperação normalizados para isolar um fragmento de DNA de 538 pb contendo a sequência codificadora, dos últimos 175 aminoácidos de HGH seguido de um sinal de paragem da tradução.

-28.......

Sintetizou-se um fragmento de

DNA de cadeia dupla (110 na Figura 5) pelo método fosfotriés ter para ligar a região do promotor de Lpp â região codificadora da hormona de crescimento humano. 0 fragmento de DNA de cadeia dupla (110 na Figura 5) tem a seguinte sequência: Xbal

5' CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAAI I ί ι I » , I 1 I Í ι » ι Í » i Í ι » f ι r > » ί I I I > > » I I ' ' ¹ 1¹ ' ' '1111

3' TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTTCCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG f | ! 1 I » » J t t t « « t I I f f f I » I t » » I » I » ’ > ’ ι ι I » t ι 1 I GGTAAGGGAATAGGTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC

3'

5’

FnuDII

0 fragmento foi preparado pela medologia fosfotriéster bem conhecida pela qual se prepara

rem os segmentos que

D

2)

3)

4)

5)

6)

7)

8)

9)

10)

11)

12)

13)

14)

15)

se seguem:

CTAGAGGGTAT

TAATAATGTTCC

CATTGGATGAT

GATGATAAGTTCC

CAACCATTCCC

TTATCCAGGC

TTTTTGACAACG

CTATGCTCCG

CATTATTAATACCCT

ATGGGAA

CTTATCATCATCCA

GGTTGGGAA

GGATAAGGGAAT

GTCAAAAAGCCT

CGGAGCATAGCGTT

Usando os segmentos acima preparados as reacções de ligação catalizadas pela ligase de T4 foram efectuadas passo por passo como se descreve abaixo:

a) 0 segmento 1 não fosforilado em 5' foi ligado ao segmento 2 fosforilado em 5' na presença do segmento 9 fosforilado em 5' usando a ligase de T4 para formar o duplex

de DNA 1 (Brown et al., 1979, Methods in Enzymology 68: 109-151). 0 duplex foi isolado por electroforese preparativa em gel de 15% de poliacrilamida.

b) 0 segmento 3 fosforilado em 5' foi ligado ao segmeii to 4 fosforilado em 5' na presença do segmento 11 fosforilado em 8' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA 2

o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.

c) 0 segmento 5 fosforilado em 5' foi ligado ao segmeii to 6 fosforilado em 5' na presença dos segmentos 12 e 13 fosforilados em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA3 o qual foi purificado por electroforese em gel de 15%

de poliacrilamida.

d) 0 segmento 7 fosforilado em 5' foi ligado ao segmento 8 fosforilado em 5' na presença do segmento 14 fosfo rilado em 5' e do segmento 15 não fosforilado em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA 4 o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.

e) Os duplexes de DNA 2,3 e 4 foram então ligados uns aos outros pela ligase de T4 para formar o duplex de DNA 5 o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.

f) 0 segmento 10 fosforilado em 5' e duplex de DNA 5 foram adicionados, na presença de ligase de T4, ao duplex de DNA1. 0 duplex de DNA resultante (110 na figura 5 foi puri[Ρ

ι

ficado por electroforese em gel de poliacrilamida. Este

duplex de DNA foi então enzimaticamente fosforilado usando 32

a cinase de polinucleotídeos de T4 e /~^ -P J ATP seguindo o processo estabelecido.

0 plasmídeo de expressão pNM702 foi construído por ligação enzimática de 0,1 picomole (0,4^< do fragmento Xbal-BamHI do plasmídeo pKEN021 (107 na Figura 5), 0,025 picomoles do fragmento de DNA sintético (110 na Figura 5) e 0,3 picomoles (0,08 ug) do fragmento de 538 pb (do 109 na Figura 5) em 24 pl de tampão de ligação usando 1,5 unidades de ligase do DNA de T4. Após incubação durante 16 horas a 4°C, a mistura foi usada para transformar

coli JA221 como descrito atrás. Os transformantes foram seleccionados em placas de agar contendo 100 ug/ml de ampicilina e foram cultivados convencionalmente como fonte prefereido do plasmídeo de expressão desejado.

A expressão da hormona de crescimento humana foi detectada por um processo de ensaio radioimune normalizado (Twomey et al, 1974, Clin. Chem, 20: 389-391) e determinou-se ser de pelo menos 2 milhões de moléculas por célula.

D. Construção do Plasmídeo pNM789

0 plasmídeo pNM702 (lll na Figura

6) o plasmídeo de expressão para a hormona de crescimento humana, foi usado como material de partida para a construção de um plasmídeo expressando Met-Fen-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Lis-bGH.

0 plasmídeo pBP348 (112 na Figura

6), descrito em Miller et al., 1980 J. Biol. Chem. 255:

7521-7524, foi usado como fonte dos dois fragmentos de

DNA contendo a sequêflcia codificadora de uma parte do gene

-31-

da hormona de crescimento bovino. 0 plasmideo contem uma sequência codificadora da hormona de crescimento bovino de 831pb clonada no local de restrição PstI do pBR322. Como alternativa ao método descrito em Miller et al., 1980, a sequência da hormona de crescimento bovino pode ser construída sinteticamente (Itakura et al., 1978) ou pode também ser obtida a partir do RNA mensageiro isolado de pituitárias bovinas pelos processos de rotina descritos por Goodman et al. 1979.

As sequências codificadoras da hormona de crescimento humano e da hormona de crescimento bovina são muito semelhantes e possuem muita homologia. Foram partieularmente úteis na construção do plasmídeo de expressão da hormona de crescimento bovino os fragmentos produzidos por digestão com a enzima de restrição Pvul1. 0 tamanho dos

fragmentos produzidos são 497pb na hormona de crescimento humana e 494pb na hormona de crescimento bovina e os correspondentes locais de restrição surgem na mesma fase de leitura em ambas as sequências.

Dez microgramas de pNM702 (111 na Figura 6) foram parcialmente digeridas com uma unidade de PvulI em 200 jul de tampão de restrição PvulI (NaC160mM, Tris.MCm 6mM, pH7,5, MgClg 6mM, ^-mercaptoetanol 6mM) duraii te 10 minutos a 37°C. Após paragem da reacção por aquecimein to a 65°C durante 10 minutos, o DNA foi tratado com fosfatase alcalina e os fragmentos separados num gem de um por cento de agarose. 0 fragmento de DNA linear (113 na Figura 6) com o tamanho que correspondia a um DNA sem o fragmento PvulI de 497pb (migra ligeiramente mais depressa do que um plasmideo cortado num só local) foi excisado convencionalmente, purificado e usado na construção de um plasmídeo intermédio (114 na Figura 6).

Preparou-se um fragmento PvulI

com 494pb do plasmídeo pBP348 por digestão de 10 ug do piasmideo em 200 pl de tampão PvuII contendo 10 unidades de PvulI durante 1 hora a 37°C. Os fragmentos foram separados num gel de 6 por cento de poliacrilamida e o fragmento desejado de 494 pb (de 112 na Figura 6) foi visualizado e purificado como habitualmente.

0 plasmídeo intermédia (114 na Figura 6) foi construído por reacção de 0,2 pg do fragmento PvuII do plasmídeo pNM702 com 0,05 pg do fragmento de 494 pb em 20 pl de tampão de ligase do DNA de T4 contendo 2 unidades de ligase do DNA de T4 durante 16 horas a 4°C. Após transformação e seleccção dos transformantes quanto â resistência à ampicilina, os plasmídeos foram convencionalmente analisados quanto à presença e orientação correcta do fragmento PvuII de 494pb. Os plasmídeos com um fragmento PvuII de 494pb e um fragmento Xbal - Smal de 440 pb foram seleccionados para serem usados em construções ulteriores.

Dez microgramas do plasmídeo

intermédio (114 na Figura 7) foram digeridos com i unidade de Pvu11 em 200 jjl de tampão PvuIIdurante 5 minutos a 37°C. Após aquecimento a 65°C, durante 10 minutos, a mistura foi aplicada a um gel de 1 por cento de agarose e um DNA linear tendo apenas um único corte com PvuII por molécula foi recuperado e purificado. Este material recuperado (cerca de 3 pg) foi completamente digerido com 5 unidades de Xbal e tratado com fosfatase alcalina. Os fragmentos aplicados num gel de 1 por cento de agarose e o fragmento maior (sem o fragmento de 109pb entre Xbal e o primeiro local PvuII na hormona de crescimento humana e bovina) foi recuperado convencionalmente (115 na Figura 7).

A sequência de DNA dos 23

primeiros aminoácidos(69pb) da hormona de crescimento bovina até ao primeiro local PvuII contem 2 locais de restrição HpalI o primeiro dos quais tem 23pb a partir do primeiro nucleótideo da sequência codificadora. Um fragmento de 63 pb (116 na

-33-

Figura 7) foi sintetizado pelo método fosfotriéster. Este fragmento corresponde à sequência de 19pb a partir do local Xbal na zona de ligação ao ribossoma de lpp até ao sinal de iniciação da tradução ATG seguido da sequênciacodificadora de Fen-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lis (24 pb) e 20 nucelotídeos da sequência codificadora da hormona de crescimento bovina ( a partir da Fen até ao primeior local Hpal I). 0 fragmento

tem a seguinte sequência:

Xbal

5 ’ CTAGA.GGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGI , ₍ I I » I l l » I I I » I I I I I I I I I I » I I I » I ’ 1» ¹ ' ; L

3’ TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTC„, HpalI

TTCCCAGCCATGTCCTTGTC 3'

ι ι l t » ι ι ι ι ι ι ί ι ι ι ι ι ι · ' AAGGGTCGGTACAGGAACAGGC 5

Para produção do fragmento de 63pb prepararam-se os nove segmentos seguintes:

1) CTAGAGC-GTAT

2) TAATAATGTTCC

3) CATTGGATGAT

4) GATGATAAGTTCC

5) CAGCCATGTCCTTGTC

6) ATGGGAACATTATTAATACCCT

7) TTATCATCATCATCCA 3) ATGGCTGGGAAC

9) CGGACAAGGAC

Usando os segmentos preparados atrás, as reacções de ligação catalizadas pela ligase de T4 foram efectuadas passo por passo como se descreve abaixo:

a) 0 segmento 1 não fosforilado em 5' foi ligado ao segmento 2 fosforilado em 5' na presença do segmento 6 fosforilado em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA 1 que foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.

b) Os segmentos 3, 4 e 5 fosforilados em 5' foram ligados na presença dos segmentos 7 e 8 fosforilados em 5'

e do segmento 9 não fosforilado em 5' usando ligase de T4 para formar o duplex de DNA e o qual foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida.

c) Os duplexes 1 e 2 foram então ligados com ligase de T4 para formar o duplex de DNA (116 na Figura 7) que foi purificado por electroforese em gel de 15% de poliacrilamida. Este duplex de DNA foi então fosforilado enzimaticamente usando a cinase de polinucleotídeos de T4 e /"j" _7ATP segundo o processo estabelecido.

0 fragmento de DNA de 46pb que vai desde o local HpalI acima descrito até ao localPvulI pode ser construído por sintese química ou obtida do plasmídeo original pBP348. Assim, com microgramas do plasmídeo pBP348 foram digeridos em 400 jul de tampão Pvul I com 50 unidades de PvuIHurante 2 horas a 37°C. Após extracção com fenol e precipitação com etanol, o DNA foi dissolvido em 400jj1 de tampão PstI (NaCl 50 mM, Tris.HCl 6mM, pH 7,4, MgCl₂ 6mM, p-mercaptoetanol 6mM) com 50 unidades de PstI durante 2 horas a 37°C. Os fragmentos de DNA foram aplicados num gel de 6 por cento de poliacrilamida e o fragmento del35 pb contendo a sequência desejada de 46pb foi recuperado e purificado por processos normalizados. Um terço do DNA recuperado (equivalente a 33 pg) foi submetido a digestão limitada com

-35-

1 unidade da enzima de restrição Hpall em 100 ul de tampão HpalI (Tris.HCl 20 mM, pH 7,4, MgCl^ 7 mM, B-mercaptoetanol 6mM) durante 40 minutos a 37°C. Após aquecimento a 65°C durante 10 minutos, os fragmentos de DNA migraran num gel de 5 por cento de acrilamida (proporção de acrilamida:bis 19:1) juntamente com um marcador de tamanho adequado. 0 fragmento desejado de 46pb obtido por digestão parcial do fragmento de 135 pb (de 112 na Figura 5) com Hpall foi purificado por processos bem conhecidos.

Dois décimos do micrograma do fragmento Xbal-PvulI do plasmídeo vector (115 na Figira ),

3,2 picomoles do fragmento sintético de 63 pb (116 na Figura 7) e 0,5 picomoles do fragmento de 46 pb (de 112 na Figura 7) foram em 10 jil de tampão de ligaçãocom 2 unidades de ligase do DNA de T4 durante 16 horas a 4°C. A mistura de ligação foi usada para transformar E. coli JA221 e os transformantes resultantes, os quais continham portanto o plasmídeo desejado pNM789, foram seleccionados por resistência à ampicilina. A identidade do plasmídeo pNM789 (112 na Figura

7) foi confirmada por pesquisa convencional sobre a presença de ambos os fragmentos PvuII de 494 pb e Xbal-PvulI de 109 pb.

1· Construção Final do Plasmídeo pNM789B

0 plasmídeo pNM789 (117 na Figu ra 8) necessita de uma alteração no codão de um aminoácido para conversão total em hormona de crescimento bovino. Isto conseguido através da remoção do fragmento PvuII a BamHI de 28 pb do pNM789 e substituição com um fragmento sintético de cadeia dupla tendo a sequência seguinte (118 na Figura

8):

⁵'ctgtgccttctag³'

₃iGACACGGAAGATCCTAG₅.

-36ííjíTjj

SI-.'

Dez microgramas de pNM789

foram digeridos com 1 unidade de PvulI em 200 ^il de tampão PvuII durante 5 minutos a 37°C. Após aquecimento durante 10 minutos a 65°C, a mistura foi diluida para 300 ^il com a adição de tampão BamHI, digerida completamente com 10 unidades de BamHI durante 1 hora a 37°C, tratada com 5 unidades de fosfatase alcalina é incubada durante 1 hora a 65°C. Os fragmentos de DNA foram separados num gel de 1 por cento de agarose e um fragmento de DNA (119 na Figura 8) com o tamanho do plasmídeo pNM784 com um único corte foi purificado por métodos convencionais. Dois décimos do microgra^ ma deste fragmento foi ligado com 5 picomoles de fragmento sintético usando 2 unidades de ligase de T4 em 20 pi de tampão ligase. A ligação foi feita durante a noite a 4°C. Apóq transformação, isolaram-se e testaram-se vãrios plasmídeos no respeitante â presença dos fragmentos PvuII (494 pb)e Xbal BamHI (628 pb) adequados. Os plasmídeos contendo os referidos fragmentos constituíram o plasmídeos desejado pNM789B (120 na Figura 8).

EXEMPLO 2

Construção do Plasmídeo pCZIOl e de E. coli K12 RV308/p CZ101

A. Isolamento do Plasmídeo pIM-I'-A3

A bactéria E. coli Κ12/ΡΙΜ-Γ-A3(NRRLB-15733) foi cultivada em caldo TY (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,5% de cloreto de sódio, pH 7,4) com 50 ^ig/ml de canamicina a 25°C segundo os processos microbiologicos normais. Após diluição da cultura a 1:10 para meio fresco e após 3 horas de incubação a 37°C, transferiu-se cerca de 0,5 ml da cultura para um tubo

-37-

. -..r^ítelg

Eppendorf de 1,5 ml e centrifugou-se durante cerca de 15 segundos. Salvo nos casos indicados todas as manipulações foram feitas à temperatura ambiente. 0 sobrenadante resultante foi cuidadosamente removido com um aspirador de ponta fina e o sedimento de cálulas foi ressuspenso em cerca de 100

I de solução de lisozima a 2 pg/ml) recentemente preparado a

qual contém 2 yig/ml de lisozima, glucose 50 mM, EDTA (diaminatetracetato) 10 mM e Tris.HCl 25 mM, pH8. Adicionou-se cerca de 200 ul de solução alcalina de SDS (dodecil sulfa_ to de sódio) (NaOH 0,2N, 1% de SDS) e o tubo foi invertido suavemente e depois mantido a 0°C até lise completa (5 minitos). Em seguida adicionou-se 150 jj 1 de acetato de sódio 3M e o conteúdo do tubo foi misturado suavemente por inversão durante alguns segundos.

0 tubo foi mantido a 0°C durante pelo menos 60 minutos e depois centrifugado durante 15 minutos para dar um sobrenadante quase limpo. 0 sobrenadante foi transferido para um segundo tubo de centrífuga ao qual se adicionou 3 volumes de etanol a 100% frio. Após o tubo ter estado em neve carbónica com etanol durante 5 minutos, o pre cipitado resultante foi removido por aspiração. 0 sedimento colhido foi dissolvido em 100 ul de TE (Tris.HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA mM) e constitui o DNA do plasmídeo pIM-I'-A3 pretendido.

B. Digestãi do plasmídeo pNM789B com Xbal-BamHI e obtenção do fragmento XbaΙ-BamHI HI v/0,6kb

-38-

Cerca de 5 yg de DNA do plasmídeo pNM789B em 50 yjl de tampão Hi Salt* foram incubados com 10 unidades de cada uma das enzimas de restrição BamHI e Xbal a 37°C durante cerca de 1 hora. Após a adição de 5yu 1 de acetato de sódio 3M pH 7,0, o DNA foi precipitado com 3 vojlumes de etanol a 100%. 0 produto da digestão de

DNA desejado foi dissolvida em 100 yjl de tampão TE e guardado a 0° até utilização futura.

* 0 tampão Hi Salt foi preparado segundo moldes convencionais com a seguinte composição:

NaCl 100 mM

MgCl₂ 10 mM

p-mercaptoetanol 5 mM

C. Digestão do Plasmídeo p!M-I'-A3 com Xbal - BamHI

A digestão pretendida foi efectuada basicamente segundo o processo do Exemplo 2B exceptuando o facto de se usar o plasmídeo pIM-I’-A3 em lugar do plasmídeo pNM789B. 0 DNA desejado foi dissolvido em cerca de 100 ul de tampão TE e guardado a 0°C até uso futuro.

D. Ligação e Transformação

Cerca de 1 yjg do plasmídeo

pIM-1¹ -A3 digerido,1 yg do plasmídeo pNM789B digerido com Xbal - BamHI , 40 yu 1 de água, 5 pl de ATP (5 mM), 5yj 1 de mistura de ligação * e 5 unidades de ligase do DNA de T4 foram incubados a 20°C durante cerca de 2 horas.

Após incubação a 65°C durante 2 minutos seguido de arrefecimento em gelo , a mistura de ligação resultante foi usada para transformar, basicamente segundo o processo de transformação de Wensink, 1974, Cell 3 : 315, E, coli K12 KV308 em placas com TY (1% de trptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,5% de cloreto de sódio, 1,5% de agar, pH 7,4) contendo 50 ug/ml de canamicina. A estirpe bacteriana E_. col i K12 RV308 foi depositada e incluida na colecção permanente de culturas estoque do Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois onde está disponível ao público com o número de acesso NRRLB - 15624.

Alguns dos transformantes

resultantes, conforme demonstrado por electroforese em gel de agarose (Maniatis et al, 1982) e outros testes, continham apenas o plasmídeo pretendido -\x 10,8 kb. Um desses transformantes, aqui designados por £. coli K12 RV308/pCZ101, foi seleccionado, semeado em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivado segundo técnicas de micrologia convencionais. As células resultantes foram usados para isolamento do plasmídeo pCZIOl basicamente de acordo com o processo do Exemplo IA

* A mistura de ligação pode ser preparada com a seguinte composição:

Tris.HCI 500 mM, pH 7,8 Ditiotreitol 200 mM MgC^ 100 mM

EXEMPLO 3

Construção do Plasmídeo pCZl14 e de E. col i K12 RV308/pCZl14

A. Construção do fragmento BamHI - Xbal 10,2 kb do plasmídeo p CZ101

0 fragmento pretendido foi construído básicamente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 2B exceptuando a utilização do plasmídeo pCZIOl em vez do plasmídeo pNM789B. Os fragmentos de restrição pretendidos BamHI Xbal ^>10,2 kb foram separados por métodos convencionais isolados por electroforese em gel de agarose (Maniatis et al, 1982) e em seguida dissolvidos em cerca de 100 /j 1 de tampão TE e guardados a 0°C para uso futuro.

B. Construção do fragmentos BamHI - HgiAbvQ,6 kb do plasmídeo pCZIOl

0 fragmento desejado foi construído segundo os ensinamentos do Exemplo 2B exceptuando a utilização do plasmídeo pCZIOl e da enzima de restrição HgiAI em vez do plasmídeo pNM789B e da enzima de restrição Xbal respectivamente. Os fragmentos de restrição pretendidos

BamHI - HgiAI A⁷ 0,6 kb foram separados como habitual e isolados por electroforese em gel de agarose (Maniatis et al, 1982) e depois dissolvidos em cerca de 100 /ul de tampão TE e guardados a 0°C atê serem utilizados.

C. Construção da Sequência de DNA Adaptador

5'	CTAGAGGGTATTAATA	ATG	TTC	CCA	TTG	GAG	•GAT	GAT	TAA	ATG
	111111111111	III	III	III	III	II r	III	III	III	III
	TCCCATAATTAT	TAC	AAG	GGT	AAC	CTC	CTA	CTA	ATT	TAC
TTC	CCA GCC ATG TCC	TTG	TCC	GGC	CTG	TTT	GCC	AAC	GCT
III	III III III III	III	III	1 1 1	III	III	III	III	III
AAG	GGT CGG TAC AGG	AAC	AGG	CCG	GAC	AAA	CGG	TTG	CGA

GTGCT 3'

5'

-41-

A sequência adaptadora desejada foi sintetizada pelas vias convencionais através do método fosfo triéster modificado basicamente de acordo com os ensinamentos de Itakura et al., 1977 e Crea et al., 1978. 0 método de síntese referido está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.

D. Ligação e Transformação

Cerca de 20 picomoles do DNA adaptador do Exemplo 3C, 1 pg do fragmento BamHI - Xbal10,2 kb do plasmídeo pCZIOl e 0,5 pg do fragmento BamHI - HgiAI^ 0,6 kb do plasmídeo pCZIOl foram ligados e o plasmídeo resultante usado para transformar E_ coli K12 RV308 basicamente segundo os ensinamentos do Exemplo 2D.

Alguns dos transformantes resultantes como verificado pela electroforese em gel de agarose (Maniatis et al., 1982) e outros testes, continham apenas o plasmídeo rv 10,8 kb pretendido. Um desses transformantes aqui designado por E coli K12 RV308/ pCZ114, foi seleccionado, semeado em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivado segundo as técnicas de microbiologia convencionais. Demonstrou-se por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes que as células resultantes expressam met-bGH em níveis elevados. Devido ao facto de o plasmídeo pCZ114 conter um replicão termoinduzível obtém-se expressão máxima de met-bGH a temperaturas de cultura de cerca de 37°C.

EXEMPLO 4

Construção do Plasmídeo pCZIOl.1 e de E.Coli K12 RV308/pCZ101.1

As construções pretendidas são feitas basicamente segundo os ensinamentos do Exemplo 3 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 3C pela sequência de DNA adaptador

5' CTAGAGGGTATTAATA ATG TTC

I I I I I I I I I I I I III lll

3 * TCCCATAATTAT TAC AAG CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC

lll lll lll lll lll lll lll

GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG

CCA TTG GAT GAT

lll lll lll lll

GGT AAC CTA CTA CTG TTT GCC AAC

lll lll lll lll

GAC AAA CGG TTG

GAT TAA ATG TTC

lll lll lll lll

CTA ATT TAC AAG GCT GTGCT 3’III I I I I I

CGA C 5'

A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída essencialmente de acordo com os processos convencional de Itakura et al. 1977 e Crea et al., 1978. 0 método de sintese acima referido também está especificamente ilustrado no Exemplo 1.

Os transformantes pretendidos, aqui designados por E. coli K12 RV 308/pCZ101.1 são semeados em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivados convencionalmente para subsequente produção e isolamento do plasmídeo pCZIOl.1 Verificou-se por electroforese em gel de SDS, RIA e outros testes que os transformantes expressam níveis elevados de met-bGH. Porque o plasmídeo pCZIOl.1 contêm um replicão fugitivo ("runaway") termoinduzível consegue-se expressão máxima de met-bGH a temperaturas.de sultura de cerca de 37°C.

EXEMPLO 5

Construção do Plasmídeo pHI74 4Δ1

Na figura 15 dos desenhos juntos é apresentado um esquema parcial da construção do plasmídeo pH 17 /14 Δ1.

A. Construção do plasmídeo pBRHtrp

0 plasmídeo pGMl possui o operão do tritofano de L· coli tendo a delecção Λ LE1413 (Miozzari et al 1978, J.. Bacteriology, 1457 - 1466) e portanto expressa uma pre teina de fusão compreendendo os 6 primeiros aminoácidos do contador ("leader") do trp e cerca do último terço do polipeptídeo \E do trp (aqui referido em conjunto como LE'), assim como o polipeptídeo D do trp na sua totalidade, tudo sob o controle do sistema promotor-operador do trp. E.coli K12 W3110 tna 2 trp -Λ 102/pGMl foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC Ν^δ. 31622) e pGMl pode ser convencionalmente removido da estirpe para ser usado nor processos descritos abaixo.

Cerca de 20 pg do plasmídeo foram digeridos com a enizma de restrição PvulI que corta o plasmídeo em cinco locais. Os fragmentos de gene foram em seguida combinados com adaptadores EcoRI (consistindo numa sequência de nucleotídeos auto-complementar: pCATGAATTCATG) proporcionando um local de corte com EcoRI para posterior clonagem num plasmídeo contendo um local EcoRI. Os 20ug de fragmentos de DNA obtidos a partir do pGMl foram tratados com 10 unidades de ligase do DNA de T4 na presença de 200 picomoles do oligonucleotídeo sintético pCATGAATTCATG fosforilado em 5' e em 20 jul de tampão ligase do DNA de T4 (Tris 20 mM, pH7,6, ATP 0,5 mM, MgCl₂ 10 mM, ditiotritol 5mM) a 4°C durante a noite. A solução foi então aquecida 10 minutos a 70°C para parar a ligação. Os adaptadores foram cortados por di-

gestão com EcoRI e os fragmentos, agora com extremidade EcoRI foram separados usando electroforese em gel de 5 por cento de poliacrilamida (daqui em diante "PAGE"). Os três fragmentos maiores foram isolados a partir do gel corando primeiro com brometo de etídio e depois situandos os fragmentos com ultravioletas e cortando do gel as partes com interesse. Cada fragmento de gel, com 300 ^1 de TBE 0,1 x , foi colocado numa manga de diálise e submetido a electroforese a 100 V durante 1 hora em tampão TBE0,1 x (tampão TBE contém: 10,8 g da base Tris, 5,5 g de ácido bórico, 0,09 mg de Na^EDTA num litro de H2O). A solução aquosa foi colhida do tubo de diálise extraí_ da com fenol, extraída com clorofórmio e feita 0,2 M respeitan. te a cloreto de sódio. 0 DNA foi então recuperado em água após precipitação com etanol. Os fragmentos contendo 0 promo tor/operador do trp com extremidades EcoRI foram identificados por inserção num plasmídeo sensivel â tetraciclina que, quando da inserção do promotor/operador, se torna resistente à tetraciclina. Todos os isolamentos de fragmentos de DNA descritos neste exemplo são feitos usando PAGE seguido do método de electroeluição desrito atrás.

B. Construção do Plasmídeo pBRH trp Expressnado a Resistência à Tetraciclina Sob 0 Controlo do Promotor/Operador do trp e Identificação e Amplificação do Fragmento de DNA Contendo 0 Promotor/Operador do Trp Isolado em "A" acima

0 plasmídeo pBRHl (Rodriguez, et al, 1979, Nuclear Acids Research 6, 3267-3287 e ATCC N^s.37070) expressa resistência à ampicilina e contem 0 gene da resistência à tetraciclina mas, não havendo um promotor associado, não expressa aquela resistência. As células possuidoras do plasmídeo são portanto sensíveis â tetraciclina. Através da introdução de um sistema promotor/operador no local EcoRI 0 plasmídeo expressará a resistência à tetraciclina.

>.·-ίΐιΑ»

Ο plasmídeo pBRHl foi digerido com EcoRI. A enzima foi removida por extracçãó com fenol seguida de extracçãó com clorofórmio e depois o DNA foi resuspenso em água após precipitação com etanol. 0 DNA resultante foi em misturas de reacção separadas, combinado com cada um dos três fragmentos de DNA obtidos no Exemplo 5A atrás e ligado com ligase do DNA de T4 com descrito anteriormente. 0 DNA presente no mistura de reacção foi usado para transformar

E. coli K12 294 (NRRL B15625) competente por técnicas normalizadas (Hershfield et al, 1974, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71 :3455 - 3459) e as bactérias foram semeadas em placas LB (Maniatis et al., 1982) contendo 20 ^ug/ml de ampicilina e 5 ug/ml de tetraciclina.

Foram seleccionadas várias colónias resistentes â tetraciclina e o DNA dos plasmídeos foi isolado e designado por pBRHtrp. A presença do fragmento pretendido foi confirmado por análise com enzima de restrição. 0 plasmideo pBRHtrp expressa ^-lactamase, confere resistência à ampicilina e contem um fragmento de DNA que inclui o promotor/operador do trp. 0 fragmento de DNA também codifica uma primeira

proteína, (designada LE¹), compreendendo uma fusão dos seis primeiros aminoácidos do condutor do trp e aproximadamente o último terço do polipeptideo E do trp, uma segunda proteína (designada D¹), correspondendo aproximadamente à primeira metade do polipeptideo D do trp e uma terceira proteína, codificada pelo gene de resistência à tetraciclina.

C. Construção do Plasmídeo pS0M7/) 2

0 plasmídeo pBRHtrp foi digerido com a enzima de restrição EcoRI e o fragmento resultante, isolado por PAGE e electroeluição, foi combinado com o plasmídeo pSOMl digerido com EcoRI (Itakura et al, 1977, Sei. 198:1056, Patente US N^e. 4 366 246, Publicação de Patente G.B. Ns. 2 007 676A)

A mistura foi ligada com ligase do DNA resultante usado para transformar E.. coli K12 294 como anteriormente descrito. As bactérias transformantes foram seleccionadas em placas conten_ do ampicilina e as colónias resultantes ersistentes à ampiciH na foram testadas por hibridação de colónias (Gruenstein et al 1979, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72:3965). 0 fragmento conten

do o promotor/operador do trp, isolado a partir do pBRHtrp e depois marcado radioactivamente com P³³, foi usado como sonda no processo acima. Encontrou-se várias colónias positi_ vas por hibridação de colónias as quais foram portanto seleccionadas. 0 DNA dos plasmídeos foi isolado e a orientação fos fragmentos inseridos foi determinada por análise de restrição usando as enzimas Bgl 11 e BamHI em digestão dupla.

As colónias contendo o plasmídeo desejado com o fragmento do promotor/operador do trp na orientação correcta foram cultivadas em meio LB contendo 10 jug/ml de ampicilina.

0 plasmídeo pretendido foi designado pS0M7 2 e foi usado para construção subsequentes descritos abaixo.

D. Construção do Plasmídeo ptrp24

1 Construção de um Fragmento de Gene Codificador das Regiões Distais do Polipeptídeo LE’ com os Locais de Restrição BglII e EcoRI Respectivamente nas Extremidades 5’ e 3' da Cadeia Codificadora

0 plasmídeo pS0M7À2 foi digerido com Hind seguido de digestão com a exonuclease lambda (uma exonuclease de 5' para 3‘) em condições escolhidas de modo a digerir para lá do local de restrição Bgl 11 dentro da região codificadora de LE¹. Cerca de 20 yug do pS0M7Zl 2 digerido com HindIII foi dissolvido em tampão glicina 20 mM, pH 9,6, MgCl£ ImM, ^-mercaptoetanol 1 mM). A mistura resultante foi tratada com 5 unidades da exonuclease lambda durante 60 minutos à temperatura ambiente. A mistura de reacção obtida foi então extraida com fenol, extraída com clorofórmio e precipitado com etanol.

•47?OBTUGAI

Ι”Υί<Χ

7

Para criar um residuo EcoRI na extremidade distai do fragmento do gene LE¹, sintetizou-se um iniciador ³²pCCTGTGCATGAT pelo método fosfotriéster melhorado (Crea et al., 1978) e hibridou-se com a extremidade de cadeia simples do fragmento do gene LE' resultante da digestão com a exonuclease lambda. A hibridação foi efectuada por dissolução de 20 pg do produto da digestão do plasmídeo pS0M7A com HinlII tratado com a exonuclease lambda em 20 pl de 1^0 e combinação com 6 pl de uma solução contendo cerca de 80 picomoles do oligonucleotideo descrito atrás e fosforilado em 5'. 0 fragmento sintético foi hibridado com a extremidade 3' da sequência codificadora de LE' e a restante porção de cadeia simples do fragmento de LE¹ foi preenchida pela Polimerase I Klenon usando dATP, dGTP, dTTP e dCTP. A polimerase I klenon é o fragmento obtido por corte proteolitico da Polimerase I do DNA. Ela possui actividade polimerizadora 5'3', actividade exonucleol itica 3'->5', mas não a actj_ vidade exonucleolitica 5'-r3¹ da enzima parental (Kornberg, 1974, W.H. Freeman and Co. SFO, 98).

A mistura de reacção foi assim aquecida até 50°C e deixada arrefecer lentamente até 10°C, adicionou-se então 4 pl da enzima Klenow. Após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente, seguido de 30 minutos de incubação a 37°C a reacção foi parada pela adição de 5 pl de EDTA 0,25 molar. A mistura de reacção foi extraída com fenol extraída com clorofórmio e precipitada com etanol. 0 DNA foi subsequentemente cortado com a enzima de restrição BglII

e os fragmentos foram separados por PAGE. Um autoradiograma

32

obtido a partir do gel revelou um fragmento marcado com P com o comprimento esperado de cerca de 470 pb, o qual foi recuperado por electroeluição. Como esboçado, este fragmento LE' (d) tem uma extremidade Bgl11 e uma extremidade cerse coin cidente com o principio do iniciador.

ís

- H-O foi construído timosina alfa 1

2. Construção do Plasmídeo pTh < 1

0 plasmídeo pTh o( 1 por inserção de um gene sintetizado para a

no plasmídeo pBR322. A sintese do DNA codificador da timosina alfa 1 envolve a sintese e subsequente ligação dos 16 oligonucleotídeos (Tj a T₁₅) que estão pelas setas de dois sentidos na Figura 11 dos desenhos juntos. Uma met ATG foi inserida na terminação N e as extremidades 5' foram projectadas com extremidades coesivas de cadeia simples para facilitar a ligação dos plasmídeos cortados com EcoRI e BamHI. Como se pode facilmente constatar o local BglII no centro do gene ajuda a análise dos plasmídeos recombinantes.

Os oligodeoxirribonucleotídeos T^ a Tjg foram sintetizados pelo método fosfotriéster modificado de Itakura et al., 1977 e Crea êt al., 1978. Os vários oligodeoxinucleotideos estão apresentados na Tabela 1 abaixo.

ι

-49-

Tabela 1

OLIGONUCLEOTIDEOS SINTÉTICOS PARA O GENE DA TIMOSINA 1

Composto	Sequãicia Comprimento	Análise por HPLC tempo de retenção (min)
T1	a-a-t-t-c-a-t-g-t-c	10	17.4
T2	T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A	15	24.3
T3	T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A	12	20.3
h	G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A	13	22.0.
' T5	G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G	15	24.8
"6	g-a-a-g-t-a-t-c-a-a-c-a	12	20.1
T7	A-g-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A	1.3	22.6
T 8	A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T	12	20.2
T 9	G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G	12	20.4
• T10	a-a-g-a-a-g-g-a-a-g-t-t	12	21.1
Tn	g-t-c-g-a-a-g-a-g-g-c-t	12	20.5
T12	g-a-g-a-a-c-t-a-a-t-a-g	12	20.4
T “13	C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T	12	19.9
T* *14	T-T-C-G-A-G-A.-A.-C-T-T-C	12	20.5
T15	G ™ C “ "* C A “ G—C—C T “ C	12	20.2
T16	g-a-t-c-c-t-a-t-t-a	10	17.2

l·

à temperatura ambiente

-50-

A sintese acima está exemplificada pelo processo que se segue para o fragmento ^T15 conforme resumido na Figura 12 dos desenhos juntos. Os vários fragmentos de nucleotídeos que são usados na sintese de ^T15 estão designados numericamente na Figura. As abreviaturas empregues são as seguintes: TPSTe, 2,4,6-triisopropilbenzenossulfoniltetrazolo; BSA, ácido benzeno sulfónico; TLC, cromatografia em camada fina; HPLC, cromatografia liquida de alta resolução; DMT, 4,4¹-dimetoxitriti lo; CE, 2-cianometilo; R, p-clorofenilo; Bz, benzoilo; An, anisoilo; iBu, isobutrilo; Py, piridina; AcOH, ácido acético; Et^N, trietilamina.

Os trideoxirribonucleotídeos 4 (85 mg, 0,05 mmole) e 2^ (180 mg, 0,1 mmole) totalmente protegidos foram desbloqueados nos hidroxilos 5' por tratamento com 2% de BSA em 7:3 (v/v) de clorofórmio/metanol (10 e 20 ml, respectivamente) durante 10 minutos a 0°C. As reacções foram paradas pela adição de bicarbonato de amónio aquoso saturado (2 ml), extraídas com clorofórmio (25 ml) e lavadas com água (2 x 10 ml). As fases orgânicas foram secas (sulfato de magnésio) concentradas para pequenos volumes (cerca de 5 ml) e precipitadas pela adição de éter de petróleo (fracção 35° - 36°). Os precipitados incolores foram colhidos por centrifugação e secos num dessecador in vacuo para dar 6 e 8 respectivamente, cada um homogéneo por tlc em silica gel (Merck 60 F254, clorofórmio/metanol, 9:1).

Os trimeros e 3 (270 mg 0,15 mmole

145 mg, 0,075 mmol) foram convertidos nos seus fosfodiésteres (5 e 7.) por tratamento com trieti lamina/piridina/água (1:3:1, v/v, 10 ml) durante 25 minutos â temperatura ambiente. Os reagentes foram removidos por evaporação rotativa e os resíduos secos por evaporação repetidas com piridina anidra (3 ml) e a mistura de reacção deixada in vacuo à temperatura ambiente durante duas horas. Análise por TLC mostrou que 95% do trímero 8 tinha sido convertido no produto

ORTDCAII

M - H i.i¹ >«

-51

Ί

^’ΤΡ’ΐϊΐ"hexâmero (visualizado por detecção do grupo DMT por vaporização com ácido sulfúrico aquoso a 10% e aquecimento a 60°C).

A reacção foi parada através da adição de água (1 ml) e o soj. vente evaporado a pressão reduzida. Após remoção da piridina por coevaporações com tolueno, o hexâmero foi desbloqueado na posição 5' com BSA a 2% (8 ml) como descrito atrás para os trimeros 4 e 2. 0 produto (10) foi purificado numa coluna de silica gel (Merck 60H, 3,5x5 cm) por eluição com gradiente descontínuo de clorofórmio/metanol (98:2 a 95:5, v/v). As fracções contendo o produto 10 foram evaporadas até secagem. De modo idêntico o trimero 5^ foi acoplado ao 6 e o pro duto totalmente protegido purificado directamente em silica gel. Este último composto foi desbloqueado na extremidade 3' por trietilamina/piridina/água como descrito atrás para dar o fragmento 9.

Finalmente, os hexâmeros 9 e 10 foram acoplados em piridina anidra (2 ml) com TPSTe (75 mg, 0,225 mole) como agente de condensação. Quando completada a reacção (4 horas, temperatura ambiente) a mistura foi sujeita a evaporação rotativa e o residuo cromatografado em silica gel. 0 produto 11 (160 mg) foi obtido por precipitação com éter de petróleo e verificou-se ser homogéneo por TLC.

Uma parte do composto I1 (20 mg) em piridina (0,5 ml) foi

totalmente desbloqueada por tratamento com hidróxido de amónio concentrado (7 ml, 8 horas, 60°C) e tratamento subsequeii te em ácido acético a 80% (15 minutos, temperatura ambiente). Após evaporação do ácido acético, o residuo sólido foi disso]_ vido hidróxido de amónio aquoso a 4% (v/v, 4 ml) e extraído com éter etilico (3x2 ml). A fase aquosa foi concentrada para 1-2 ml e uma parte foi aplicada em HPLC para purificação de 12. As fracções correspondentes ao pico principal foram reunidos (ca. 2 unidades A254) e concentradas para cerca de 5 ml. Ao produto final 12 foi retirado 0 sal em Bio-Gel P-2 (1,5x100 cm) por eluição com etanol aquoso a 20%, reduzido até secagem e resuspenso em água (200 ul) para uma solução de A254 = lo. A sequência de 12 foi confirmada por

-52—........

análise da sequência em duas dimensões.

A totalidade do gene da timosina alfa 1 foi obtida a partir dos 16 oligonucleótideos sintéticos sintéticos pelos métodos já descritos detalhadamente para a somatostat ina (Itakura et al. 1977) insulina (Goeddel et al., 1979) e hormona de crescimento (Goeddel et al., 1979, Nature 281:544). Quantidades de dez microgramas deoligonucleotídeos Tg a Τ1₃ foram quantativamente fosforilados com /V - _7-ATP (new England Nuclear) na presença da cinase de polinucleotídeos de T4-(Goeddel et al., 1979), para dar actividades especificas de cerca de 1 Ci/mmole. Os fragmentos marcados radioactivamente foram purificados por electroforese em gel de 20% poliacrilamida/ureia 7Me as sequências dos fragmentos eluídos foram verificadas por electroforese em duas dimensões/homocromatografia (Jay et al., 1974, Nucleic Acids Res. 1:331) dos produtos de digestão parcial com veneno de

cobra. Os fragmentos T^ e Τ^θ foram deixados por fosforilar para minimizar polimerização indesejável durante subsequentes reacções de ligação. Estes ol igonucleótideos (2 ug de C£ da) foram reunidos em quatro grupos de quatro fragmentos (ver Figura 13 dos desenhos juntos) pela ligase do DNA de T^ usando processos já publicados (Goedel et al., 1979).

Os produtos da reacção foram purificados por electroforese em gel num gel de 15% de poliacri1amida contendo 7M(maxam e Gilbert, 1977, Proc. Nat Acad. Sei USA 71:3455). Os quatro produtos isolados foram isolados uns aos outros e a mistura de eracção resolvida por electroforese em gel de 10% de po1iacrilamida. 0 DNA dentro da gama de tamanhos do gene da timosina alfa 1 (90-105 pares de bases) foi electroeluido.

0 plasmídeo pBR322 (o,5 yig) foi tratado com as endonucleases de restrição BamHI e EcoRI e os fragmentos separados por electroforese em gel de poliacrilamida.

0 fragmento maior foi recuperado do gel por electroeluição e

subsequentemente ligado ao DNA sintético formado (Goeddel

el at., Nature 281:544 1979). Esta mistura foi usada para

Ώ

-53-

transformar Ε. coH Κ12 294. Cinco por cento da mistura de transformação foi semeada em placas LB contendo 20 ug/ml de ampicilina. As quatro colónias resistentes à ampicilina obtidas eram sensíveis à tetraciclina, sugerindo inserção no gene de resistência â tetraciclina. Análise dos plasmídeos destas quatro colónias mostrou que em cada caso o plasmídeo, designado pTh<l, continha (a) um local Bgl 11 que não se encontra no próprio pBR322, indicando assim a presença do gene da timosina alfa 1 como se mostra na Figura 11 e (b) em fragmentos de cerca de 105 pares de bases originado por corte com BamHI/EcoRI . A via de construção para o plasmídeo pTh1 (não desenhada â escala) está apresentada na Figura 13 dos desenhos juntos em que as virgulas carregado indicam grupos fosfato 5'.

3. Reacção do ρΤΙτχ! Trattado e do Fragmento LE’ (d)

0 plasmídeo pTh < 1 contém um gene que especifica resistência à ampicilina e um gene estrutural que especifica a timosina elfa 1 clonada com extremidade 5' dc: cadeia codificadora num local EcoRI e a sua extremidade 3' num local BamHI. 0 gene da timosina contém igualmente um

local BglII. ^Para criar um plasmídeo capaz de aceitar o fragmento LE' (d) preparado atrás, pTh1 foi digerido com EcoRI seguido de reacção com a Polimerase I Klenow na presença de dTTP e dATP para tornar cerse a extremidade EcoRI . Digestão com Bgl11 dó produto resultante originou um fragmento de DNA linear contendo o gene da resistência à ampicilina e nas extremidades opostas um residuo BglIIcoesivo e uma extremidade cerse. 0 produto resultante pode ser recircularizado por reacção com o fragmento LE'(d) contendo uma extremidade coesiva Bgl II e uma extremidade cerse na presença de ligase de T₄ para formar o plasmídeo pTrp24.

Ao fazer se isto ê recriado um local EcoRI na posição em

que se deu a ligação de extremidades cerses.

-54-

Βίχ_μ '.JIC-. ιjLftití.ia

E. Construção do Plasmídeo pS0M7/\24^4

Digestão sucessiva do pTrp24 com Bgl 11 e EcoRI, seguido de PAGE e electroeluição deu um frag mento tendo os codões do polipeptideo LE¹ (d) com uma extre midade coesiva BglII e uma extremidade coesiva EcoRI adjacen te à sua extremidade codificadora 3'. 0 fragmento LE¹ (d)

pode ser clonado no local BglII pS0M7 2 para formar uma pro teina de fusão polipeptideo LE¹/somatostatina expressa sob o controle do promotor/operador do trp. Para isto é necessá rio(l) digestão parcial de pS0M7 2 com EcoRI de modo a cortar o local EcoRI distai em relação ao promotor/operador do triptofano e (2) escolha adequada da sequência iniciadora de modo a manter correctamente a fase de leitura dos codões e a recriar o local de corte EcoRI.

Assim, 16 ug do plasmídeo pS0M7Á2 foi diluido em 200 ^il de tampão contendo Tris 20 mM, pH 7,5, MgCl₂ 5mM,0,02% do detergente NP40 e NaCl 100 mM e tratado com 0,5 unidades de EcoRI. Após 15 minutos a 37°C, a mist£ ra de reacção foi extraída com fenol, extraida com clorofórmio, precipitado com etanol e subsequentemente digerida com BglII. 0 fragmento maior resultante foi isolado pelo proces^ so de PAGE seguido de electroeluição. Este fragmento contém os codões "LE ¹ (p)¹¹ para a extremidade proximal do polipeptídeo LE¹, i.e., as que estão a montante do local BglII.

Este fragmento foi em seguida ligado ao fragmento LE¹ (d) referido atrás, na presença de ligase do DNA de T4 para formar o plasmídeo pS0M7A2A4,o qual quando da transformação de £. coli K12 294, produziu eficazmente uma proteína de fusão consistindo no polipeptideo LE completamente reconstituído e somatostatina sob o controle do promotor/operador do triptofano.

-55frsr^.. I»

F. Construção de DNA Linear Tendo um Residuo PstI na Extremidade 3' e um Residuo BgllI na sua Extremidade 5' Limitando em Gene Especificador da Resistência à Tetraciclina

0 plasmídeo pBR 322 foi digerido com HindlII e as extremidades HindIII proeminentes foram digeridos com a nuclease Sl. A digestão com nuclease Sl envolveu tratamento de 10 pg de pBR322 cortado com HindIII em 30 ul de tampão Sl(NaCl 0,3M,ZnCl₂ 1 mM, acetato de sódio 25 mM, pH 4,5) com 300 unidades de nuclease Sl durante 30 minutos a 15°C. A reacção foi parada por adição de 1 yj 1 de solução de paragem da nuclease Sl (base tris 0,8M, EDTA 50 mM) 30x .

A mistura foi extraída com fenol, extraída com clorofórmio, precipitada com etanol e depois digerida com EcoRI como descrito atrás. 0 fragmento resultante, obtido pelo processo de PAGE seguido de electroeluição, tem uma extremidade coesiva EcoRI e uma extremidade cerse cuja cadeia codificadora começa com o nucleotídeo timidina. 0 residuo Hindi11 digerido com Sl começando com itmidina pode ser ligado a um residuo Bgl 11 tratado com polimerase I Klenow de modo a reconstituir o local de restrição BglII quando da ligação.

Portanto o plasmídeo pS0M7â 2, preparado no Exemplo 5C, foi digerido com BglII e as extremidades coesivas BglII resultantes foram transformadas em cadeia dupla por tratamento com polimerase I Klenow usando os quatro trifosfato de deoxinucleotídeos. Corte do produto resultante com EcoRI, seguido de PAGE e electroeluição do pequeno fragmento deu um pedaço de DNA linear contendo o promotor/operador do triptofano e codões da sequência proximal de LE¹ a montante do local BglII ("LE'(p)". 0 produto

tem uma extremidade EcoRI e uma extremidade cerse resultante do preenchimento do local BglII No entanto o local BglII ê reconstituído por ligação da extremidade cerse à extremidade cerse do fragmento HindIII digerido com Sl referido atrás. Assim, os dois fragmentos foram ligados na presença

de ligase do DNA de T4 para formar o plasmídeo pHKYlO recircularizado o qual foi propagado por transformação de células competentes E_. coli K12 294. As células resistentes à tetraciclina possuindo o plasmídeo recombinante pHKYlO foram sele£ cionadas e o DNA do plasmídeo extraido. Digestão com BglII e PstI seguido de isolamento pelo processo de PAGE e electroeluição do fragmento maior deu o pedaço de DNA linear pretendido tendo extremidades coesivas PstI e BglI. Este fragmento de DNA, assim produzido a partir de pHKYlO, contem a origem da replicação e portanto é útil como componente na construção do plasmídeo ρΗΙ7Λ4Δ1 em que ambos os genes codificadores da proteína de fusão polipeptideo LE¹ do triptofano e resistência à tetraciclina são controlados pelo promotor/operador do trp .

G. Construção de DNA Linear Tendo o Promotor/Operador do trp

0 plasmídeo pS0M7A2/A4, preparado no Exemplo 5E-foi submetido a digestão parcial com EcoRI seguido de digestão com PstI. 0 fragmento resultante continha

o promotor/operador do trp e foi isolado pelo processo de PAGE seguido de electroeluição. Digestão parcial com EcoRI foi necessário para a obtenção de um fragmento o qual foi cortado adjacente à extremidade 5' do gene da somatostina mas não cortado no local EcoRIpresente entre o gene de resistência à ampicilina e o promotor/operador do trp. A resistência à ampicilina perdida atrvês de corte com PstI no gene de resistência â ampicilina pode ser restaurada quando da ligação do DNA linear do derivado final de pHKYlO produzido no Exemplo 5F acima.

Η.

Preparação do Gene Sintético Codificador dos 32 Aminoá eidos da Terminação N da Proinsulina

Uma série de 18 oligonucleotídeos, apresen tados na Tabela 2, foram preparados num primeiro passo da construção de um gene codificador dos 32 primeiros aminoácidos da proinsulina. A sequência de nucleotideos da totalidade do gene construído está apresentada na Figura 14.

Tabela 2

01igonucleotídeos sintéticos para a proinsulina humana

posto	Sequência
Hl	AATTCATGTT
H2	CGTCAATCAGCA
H3	CCTTTGTGGTTC
H4	TCACCTCGTTGA
H5	TTGACGAACATG
H6	CAAAGGTGCTGA
H7	AGGTGAGAACCA
H8	AGCTTCAACG
Hl	AGCTTTGTAC
B2	CTTGTTTGCGGT
B3	GAACGTGGTTTC
B4	TTCTACACTCCT
B5'	AAGACTCGCC
B6	AACAAGGTACAA
B7	ACGTTCACCGCA
B8	GTAGAAGAAACC
B9	AGTCTTAGGAGT
BIO1	GATCCGGCG

Os nucleotídeos sintéticos são mostrados entre parêntesis e sublinhados na Figura 14. Estes oligonucleotídeos foram sintetizados pelo método convencional de Crea, et al., 1978, Itakura, et al., 1975, J. Biol.Chem. 250:4592 e Itakura, et al., 197S, J. Am.Chem.Soc.97:7327. Alguns dos oligonucleotídeos foram usados para construir um gene da cadeia B da insulina humana anteriormente descrita por Crea, et al., 1978 e Goeddel, et al., 1979. Dois oligonucleotídeos(B5¹ e B10') possuem locais de restrição Hpa II e BamHI e EcoRI terminais. Os locais terminais são particularmente úteis para fins de clonagem.

Os oito oligonucleotídeos H1-H8, usados anteriormente na construção da metade esquerda do gene da cadeia B da insulina humana (Goeddel, et al.,1979), contem a sequência codificadora dos aminoácidos 1-13 do gene da cadeia B e uma metionina, adicional na terminação Ν. A metade direita do gene da cadeia B foi construída a partir dos oligonucleotídeos Bj, B₂, Bg, B^, B_g, B_g, By, Βθ, Βθ e Bjg por ligação usando a ligase do DNA de T4 essencialmente segundo os ensinamentos de Goeddel et al., 1979. 0 fragmento do gene resultante codifica as unidades de aminoácidos 14-30 da cadeia B da insulina humana e a primeira arginina da cadeia de ligação. Um local de restrição Hpall está incluído na sequência do gene na fase de leitura e posição do local HpalI do gene da insulina humana. Após purificação do fragmento de gene ligado por electroforese em gel de poliacrilamida e após eluição da banda do maior DNA, o fragmento foi inserido no plasmídeo pBR322 cortado com HindIII-BamHI. 0 plasmídeo resultante, designado pB3, foi

inserido por transformação em E.coli K12 294. 0 plasmídeo

conferiu resistência aos antibióticos ampicilina e tetraciclina e verificou-se conter a sequência de nucleotídeos desej ada.

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Dois fragmentos, um fragmento HindIII-BamHI de 58 pares de bases de pB3 e um fragmento EcoRI-HindIII de 46 pares de bases de pBHI (divulgado em Goeddel, et al., 1979), foram ligados para produzir um fragmento tendo terminação EcoRI e BamHI. Este fragmento foi ligado convencionalmente ao plasmídeo pBR322 cortado com EcoRI e BamHI e o plasmídeo resultante, designado pIB3, foi então clonado em E. Coli K12 294. Após amplificação convencional e isolamento, o plasmídeo pIB3 foi digerido com EcoRI e HpalI para produzir um fragmento de gene sintético (Fragmento 1, Figura 15) que codifica os aminoácidos da terminação N da proinsulina precedidos de uma metionina. 0 gene sintético foi isolado convencionalmente por electroforese em gel de poliacrilamida.

I. Isolamento de cDNA Codificador dos 50 Aminoácidos da Terminação C da Proinsulina Humana

0 esquema para obtenção do cDNA pretendido está apresentado na Figura 16 dos desenhos juntos. De acordo com o aí descrito, o decanucleotídeo pCCGGATCCGGTTT 18^T|’ que contem uma sequência de reconhecimento BamHI e um segmento 3' de ácido politimidi1ico de aproximadamente 20 resíduos foi sintetizado e usado como iniciador da transcriptase rever sa do AMV na síntese do cDN. 0 iniciador foi preparado usando transferase de deoxinucleotídilos (Enzo Biochem,

200 unidades) com 1 umole do decanucleotídeo BamHI num volune de reacção de 0,6 ml contendo 1,5xl0“⁴ zimole de TTP . A reacção foi conduzida a 37°C durante 1 hora no sistema tampão de Chang, et al. ,1978, Nature 275:617.

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0 tecido de insulinoma humano foi fornecido pelo Institute fiir Diabetesforschung, Muenchen, West Germany Os fami1iarizados com a matéria sabem que tecido de insulinoma humano é de fácil obtenção podendo ser adquirido numa série de outras fontes da comunidade médica. Isolou-se mRNA poli A(2,5 /ig) do tecido de insulinoma humano essencia^ mente segundo o prooasso de Ullrich, et al. ,1977, Science 196:1313 e em seguida foi convertido em cDNA de cadeia dupla básicamente de acordo com os ensinamentos de Wickens, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:2483. Assim, um volume de reacção de 80/til contendo Tris.HCl 15mM (pH 8,3 a 42°C), KC1 21mM, MgCl₂ 8 mM, J3-mercaptoetanol 30 mM, 2 mM do iniciador dCCGGATCCGGTTjgT e dNTPs 1 mM foi pré-incubado a 0°C. Após adição de transcriptase reversa do AMV, a mistura foi incubada durante 15 minutos a 42°C. 0 RNA/DNA resultante

foi então desnaturado usando processos convencionais.

Uma cadeia de cDNA complementar foi sintetizada num volume de reacção de 150 /jl contendo Tris.HCl 25 mM, pH 8,3, KC1 35 mM, MgCl₂ 4 mM, J3-mercaptoetanol 15 mM dNTPs 1 mM e 9 unidades de polimerase I Klenow. A mistura foi incubada a 15°C durante 90 minutos seguido de 15 horas a 4°C. A digestão com nuclease SI foi então efectuada durante 2 horas a 37°C usando 1000 unidades de nuclease SI (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) básicamente segundo os ensinamentos de Wickens, et al., 1978. 0 cDNA de cadeia

dupla (0,37 jug) foi sujeito a electroforese num gel de 8% de poliacrilamida e os fragmentos de DNA superiores a 500 pares de bases foram eluídos. Adicionaram-se resíduos de ácido oligodeoxicitidi1ico às extremidades 3' dos fragmentos usando transferase terminal de deoxinucleotidilo de acordo com o processo de Maizel, 1971, Meth.Virol.5:180. Os fragmentos de cDNA com caudas DC foram então ligados ao pBR322 que tinha primeiro sido digerido com a enzima de restrição Pst I e depois provido de caudas com ácido deoxiguamidí1ico usando a transferase terminal de deoxinucleotidilo. Os

plasmídeos resultantes foram usados para transformar E.col i K12 294 e as células resultantes semeadas em meio LB e TET. As colónias resistentes à tetraciclina mas sensíveis à ampicilina foram isoladas e testadas para plasmídeos que tivessem três locais de restrição PstI. Tal padrão de restrição é indicativo do gene da proinsulina., Sures, et al.,1980 Science 208:57. Um plasmídeo designado por pHI104, continha uma inserção de 600 pares de bases, deu o padrão de restrição PstI esperado e possuía um local BamHI entre o poliA 3' e o poliGC introduzido durante a preparação do cDNA. Parte da sequência de nucleotídeos da inserção está apresentada na Figura 14.

J. Montagem de um Gene Codificador da Proinsulina Humana

0 esquema usado para montar um gene codificador da proinsulina humana está apresentado na Figura 15 dos desenhos juntos.

0 segmento do gene sintético codificando os primeiro 31 aminoácidos da proinsulina,fragmento 1 na Figura 15, foi recuperado a partir de 50 /jg do plasmídeo pIB3 usando as endonucleases de restrição EcoRI e HpalI como descrito atrás. Este fragmento também contém a sequência ATG da metionina em vez da "presequência" da preproinsulina"

0 segmento do gene de cDNA codificador dos aminoácidos 32-86, assim como o sinal de paragem da tradução e a região 3' não traduzida do mRNA, foi recuperado a partir de 40 /jg do plasmídeo pHI 104 por tratamento primeiro com a enzima de restrição BamHI e depois com a HpalI. Os dois fragmentos foram isolados por electroforese em gel de poliacrilamida seguido de electroeluição. Os fragmentos de gene foram ligados por tratamento com ligase do DNA de T4 em 20/j! de tampão ligase a 4°C durante 24

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horas. Α mistura foi diluida com 50/il de F^O, extraída como habitualmente com fenol e com clorofórmio e depois precipitada com etanoí.

ι 0 DNA resultante foi tratado com as enzimas de restrição BamHI e EcoRI para regenerar estes locais e remover os polímeros de gene. 0 gene da proinsulinaa montado foi isolado por electroforese em gel de poliacrilam_i_ da e ligado (usaido ligase do DNA de T4) ao plasmídeo pBR322 digerido com EcoRI e BamHI. 0 DNA resultante foi usado

¹ para transformar E.coii K12 294 e as colónias resultantes

foram testadas quanto à sensibilidade à tetraciclina e resistência à ampicilina. 0 plasmídeo pHI3, isolado de uma dessas colónias, continha o gene pretendido da proinsulina o qual foi subsequentemente caracterizado por análise da sequência de nucleotídeos.

K. Construção de um Plasmídeo para Expressão de uma Proteína

Quimérica Contendo a Proinsulina Humana

0 gene completo da proinsulina humana, incluindo o codão da terminação N que codifica metionina, foi recuperado a partir do plasmídeo pHI3 por tratamento com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI. 0 fragmento dese jado foi purificado por electroforese em gel e depois ligado (usando a ligase do DNA de T4) ao plasmídeo pS0M7 2 4 parcialmente digerido com PstI-EcoRI (preparado

I no Exemplo 5G) e o maior dos fragmentos PstI-Bgl 11 do plasmídeo pH<Y10 (preparado no Exemplo 5F). Assim, cerca de 1 /jg do gene total da proinsulina humana com extremidades EcoRI e BamHI, 4 /ug do fragmento Pst Ι-EcoRI (parcial) do pS0M7 2 4 e cerca de 1 /jg do fragmento PstI-Bgl II de pHKYlO foram ligados a 4°C durante 24 horas usando ligase do DNA de T4 em tampão de ligação. A mistura de DNA ligado foi usado para transformar E.coli. K12 294. Seleccionou-se

as colónias que cresceram tanto em ampicilina como em tetraciclina e verificou-se possuirem o plasmídeo pretendido ΡΗΙ7Δ4Δ1 e expressarem uma proteína com o peso molecular esperado para o produto de fusão LE¹ trp-proinsulina. 0 plasmídeo ρΗΙ7Δ4Δ1, que expressava a referida proteína, foi completamente caracterizado relativamente ã sequência do DNA e locais de restrição tanto do gene incorporado como também do vector. 0 plasmídeo pHI7ô46l está descrito na Figura 15 dos desenhos juntos e pode ser fácilmente seleccionado devido à aquisição de novo da resistência â ampicilina e tetraciclina.

Exemplo 6

Construção do Plasmídeo pNM608 e de E.coli K12

RV308/pNM608

A. Construção do Fragmento EcoRI-Hpal ~ 253pb do Plasmídeo ΡΗΙ7Δ4Δ1

Cerca de 5 ug de DNA do plasmídeo pHI7 4 1, 10 yul de tanpão de reacção * (10X), 80/ul de âgua e 5 ai 1 (5 unidades) da enzima de restrição Hpal foram incubados a 37°C durante cerca de 1 hora. A reacção termina por incubação a 70°C durante 5 minutos. Após a mistura ter arre fecido em gelo, adicionou-se cerca de 12/ul de Tris-HCl IM, pH 7,2, 7 /U1 de água e 1/j1 (10 unidades)da enzima de restrição EcoRI. A mistura resultante foi incubada primeiro a 37 C durante 1 hora e depois a 70 C durante 5 minutos. Após arrefecimento em gelo, o DNA resultante foi extraído primeiro com fenol depois com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e depois precipitado com etanol. 0 fragemnto pretendido EcoRI-Hpal ^253 pb foi convencionalmente separado por electroforese em gel de poliacrilamida, recuperado por elecEssa

troeluição e precipitado com EtOH e depois dissolvido em cerca de 10/ul de tampão TE e guardado a 0°C até utilização.

* 0 tampão de reacção (10X) para a enzima de restrição Hpal foi preparado com a seguinte composição: Tris.HCl 100 mM, pH 7

MgCl₂ 100 mM β-mercaptoetanol 60 mM KC1 200 mM

B. Construção do Fragmento Hpal-Taql ^34 pb do Plasmídeo ΡΗΙ7Δ4Δ1.

Cerca de 20 /jg de DNA do plasmídeo ρΗΙ7Δ4 Al em 32 /u 1 de tampão de reacção EcoRI (5X)*, 198/ul de água e 4/il da enzima de restrição EcoRI (20 unidades)foram incubados a 27°C durante cerca de 1 hora. A reacção terminou por incubação a 70°C durante 5 minutos. 0 fragmento resultante EcoRI de 862 pb foi isolado por electroforese num gel de 6% de poliacrilamida seguido de electroeluição e precipitação com etanol. 0 fragmento foi então dissolvido em cerca de 100 ^1 de tampão Hpal contendo 16 unidades da enzima de restrição Hpal. Após 1,5 horas a 37°C, adicionou-se 7,5 unidades da enzima de restrição Taql, a incubação continuou durante mais 1,5 horas e os fragmentos resultantes foram separados como habitualmente num gel de 7 ’/2%de poliacrilamida. 0 fragmento desejado Hpal-Taql ^34 pb foi recuperado por electroeluição e precipitação com etanol tendo sido em seguida dissolvido em 5/ul de tampão TE.

ii!

·65·

* 0 tampão de reacção (5X) para a enzima de restrição EcoRI foi preparado com a seguinte composição:

NaCl 250 mM

Tris.HCl 500 mM, pH 7,2 MgCl₂ 25 mM

J3-mercaptoetanol 30 mM

C. Digestão do Plasmídeo pBR322 com EcoRI-Clal

Cerca de 5 /jg de DNA do plasmídeo pBR322, 10 /ul de mistura de reacção Ciai*, 77,5 ul de água e 7,5 /ul (15 unidades) da enzima de restrição Ciai foram incubados a 37°C durante cerca de 1 hora. A reacção terminou por incubação a 70°C durante 5 minutos. Após a mistura ter arrefecido em gelo, adicionou-se cerca de 12,5 /j1 de Tris-HCl 1M, pH 7,2, 6,25 yul de NaCl 1M, 2,5 >ul de MgCl₂ 0,lh e 1 λι 1 (10 unidades) da enzima de restrição EcoRI. A mistura resultante foi incubada primeiro a 37°C durante 1 hora e depois a 70°C durante 5 minutos. Após arrefecimento em gelo, o DNA resultante foi submetido a electroforese em gel de 1% de agarose. 0 fragmento maior foi recuperado por eluição e precipitado com etanol e depois dissolvido em cerca de 20 /j 1 de tampão TE e guardado a 0°C até ser usado.

-65-A^

A mistura de reacção (10X) para a enzima de restrição Ciai foi preparada com a seguinte composição Tris.HCl lOOmM, pH 7,4

MgCl₂ 100 mM

β-mercaptoetanol 60 mM

D. Ligação e Transformação

Cerca de 0,2 >ug do fragmento

EcoRI-Hpal ^253 pb do Exemplo 6A, 0,5 jug do fragmento Hpl-Taql do Exemplo 6B e 0,1 /jg do produto de digestão com EcoRI-Clal do Exemplo 6C foram ligados e usados para transformar E.coli K12 RV 308 básicamente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 2D.

Alguns dos transformantes resultantes, como convencionalmente se mostrou por electroforese em gel de agarose (Maniatis et al, 1982) e outros testes, continham apenas o plasmídeo pretendido 4,6 Kb. Tal transformante aqui designado por E.coli K12 RV308/pNM608 foi seleccionado, semeado em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivado pelas técnicas de microbiologia habituais. 0 plasmídeo pNM608 possui o fragmento EcoRI-C1 aI (Taql) λ/ 287 pb do plasmídeo pHI7&4àl sendo uma fonte preferida deste fragmento.

ímtilk

— Exemplo 7

Construção do Plasmídeo pCZ105.1 e de E.coli K12 RV308/ /pCZT015'.l~·

ί A. Digestão do Plasmídeo pNM608 com EcoRI-Clal e Obtenção

do Fragmento EcoRI-Taql 0,288 kb

(0 mesmo que para o fragmento EcoRI-Taql de 0,288 kb

do plasmídeo ρΗΙ7Δ4Δ1)

k

Cerca de 5 ug de DNA do plasmídeo pNM608 em 50yul de tampão "Médium Salt" foram incubados com 10 unidades de cada uma das enzimas de restrição EcoRI e Ciai a 37°C durante cerca cfe 1 hora. Após adição de 5/ul de acetato de sódio 3M,pH 7,0, o DNA foi precipitado com 3 volumes de etanol a 100%. 0 produto pretendido

da digestão do DNA foi dissolvido em 100 /u1 de tampão TE e guardado a 0°C até ser usado.

0 tampão "Médium Salt" foi preparado com a seguinte composição:

NaCl 50 mM

Tris.HCl lOOmM, pH 7,5 MgCl₂ 6 mM

β-mercaptoetanol 2 mM

B. Construção da Sequência de DNA adaptador

5' CGACA ATG TTC CCA TTG GAG

III III III III III III

TGT TAC AAG GGT AAC CTC

GAT I 1 1	GAT I I 1	TAA I 1 I	ATG 1 1 1	TTC 1 I I	CCA I I 1	GCC I I 1	ATG 1 I I
CTA	CTA	ATT	TAC	AAG	GGT	CGG	TAC

TCC TTG TCC GGC

III III III III

AGG AAC AGG CCG

CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT

III III III III III I I I I I

GAC AAA CGG TTG CGA C

3 ' 5'

A sequência adaptadora desejada é sintetizada convencionalmente pelo método fosfotriêster modificado essencialmente segundo os ensinamentos de Itakura et a 1 .,1977 e Crea et a 1 ., 1978. 0 método de síntese

acima referido está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.

C. Ligação e Transformação

Cerca de 20 picomoles do DNA adaptador do Exemplo 7B, 1 /ug do produto de digestão do pNM608 do Exemplo 7A, 0,5/ug do fragmento BamHI-EcoRI fd io,2 kb do pCZIOl (preparado segundo os ensinamentos do Exemplo 2B exceptuando a utilização da enzima de restrição EcoRI e o tampão adequado em lugar da enzima de restrição Xbal e do respectivo tampão) e 1/jg do fragmento BamHI-HgiAI A/Ojôkb do plasmídeo pCZIOl do Exemplo 3B são ligados e o plasmídeo resultante usado pera transformar E.coli K12 RV308 essenciaj_ mente segundo os ensinamentos do Exemplo 2D.

68- ,

Alguns dos transformantes resultantes, como convencionalmente se mostrou por electroforese em gel de agarose (Maniatis et a 1 ., 1982) e outros testes, contêm apenas o plasmídeo pretendidoM0,8 kb. Tal transformante aqui designado por E.coli K12 RV308/pCZ105.1 é seleccionado semeado em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivado usando técnicas de microbiologia convencionais. As células resultantes expressam níveis elevados de met-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Uma vez que o plasmídeo pCZIOõ.l contem um replicão "que se escapa" termoinduzível, a expressão máxima de met-bGH ocorre em temperaturas de cultura de cerca de 37°C.

Exemplo 8

Construção do Plasmídeo pCZ105.2 e de E.coli K12 RV308/

/pCZl05.2

As construções pretendidas são feitas essencialmente segundo os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptador do Exemplo 7 pela sequência de DNA adaptador.

5' CGACA ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT TAA ATG TTC CCA GCC ATC

III III III III III I l > ' > > ' ¹ ' ¹ ' ' > > > > > > ' ' ¹ ' '

3' TGT TAC AAG GGT AAC CTA CTA CTA ATT TAC AAG GGT CGG TAC

TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'

III III III III III III III III III I

AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C

5'

A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída básicamente de acordo com o processo convencional de Itakura et a 1 ., 1977 e Crea et a 1., 1978. 0 referido método de síntese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.

Os transformantes pretendidos, aqui designados por E.coli K12 RV308/pCZ105.2 são semeados em agar TY eontendo os antibióticos adequados e então cultivados como habitualmente para produção e isolamento subsequentes do plasmídeo pCZ105.2. Os transformantes expressam níveis elevados de met-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Uma vez que o plasmídeo pCZ105.2 contem um replicão "que se escapa" termoinduzível, consegue-se expressão máxima de met-bGH a temperaturas de cultura de cerca de 37°C.

Exemplo 9

Construção do Plasmídeo pCZIOô.l e de E.coli K12

RV308/pCZl06.1

As construções pretendidas são feitas essencialmente segundo os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 7 pela sequência de DNA .

CGACC 1 1 I

ATG I I 1

GAT 1 1 1

CAG I 1 1

GAG 1 I 1

TAA 1 1 I

ATG l I I

TTC I f 1

CCG 1 I 1

GCT f I I

ATG I 1 1

TCC t 1 I

TTG 1 1 I

TGG

TAC

CTA

GTC

CTC

ATT

TAC

AAG

GGC

CGA

TAC

AGG

AAC

TCC I I 1

GCC ( t I 1

CTC lll

TTT I I 1

GCC l I l

AAC I 1 I

GCT 1 1 1

GTGCT 3 1

-

AGG

CGG

GAG

AAA

CGG

TTG

CGA

c

5

I

A sequência adaptador acima especificada pode ser construída básicamente segundo o processo convencional de Itakura et al., 1977 e Crea et al., 1978. 0 referido método de síntese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.

Os transformantes pretendidos,aqui designados por E.coli K12 RV308/pCZ106.1, são semeados em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivados convencionalmente para subsequente produção e isolamento do plasmídeo pCZ106.1. Os transformantes expressam níveis elevados de met-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pCZ106.1 contem um replicão runaway termoinduzível, a expressão máxima de met-bGH ocorre a temperatuas de cultura de cerca de 37°C.

-71Exemplo 10

ra

Construção do Plasmídeo pCZ112.1 e de E.coii K12 RV3Q8/pCZl12.I

As construções pretendidas são feitas substaneialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 7 pela sequência de DNA

5' CGACC ATG GAT GAT AAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG TCC TTG

III III III III III III I I l l l l III III III III III

3' TGG TAC CTA CTA TTC ATT TAC AAA GGC CGA TAC AGG AAC

TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'

III III III III III III III I

AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C 5'

A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída básicamente segundo o processo convencional de Itakura et al., 1977 e Crea et al.,1978.

0 referido método de síntese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.

Os transformantes pretendidos, aqui designados por E.coli K12 RV308/pCZl12.1 são semeados em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivados convencionalmente para produção e isolamento subsequentes do plasmídeo pCZ112.1. Os transformantes expressam níveis elevados de met-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pCZ112.1 contem um replicão "que se escapa" termoinduzível, a expressão máxima de met-bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 37°C.

Exemplo 11

Construção do Plasmídeo pCZl12.2 e de E.coli K12 RV308’/pCZ'll'2~.'2

As construções pretendidas são feitas substancialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 7 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 7 pela sequência de DNA

5' CGACC ATG GAT GAT AAG GAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG TCC

III I I I III lll lll lll III lll lll I I I lll lll lll

3' TGG TAC CTA CTA TTC CTC ACC TAC AAA GGC CGA TAC AGG

TTG TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'

lll lll lll lll lll lll lll lll 1

AAC AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA C 5'

A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída de acordo com o processo convencional de Itakura et al.., 1977 e Crea et al., 1978. 0 método de síntese acima referido está também especificamente lustrado no Exemplo 1.

Os transformantes pretendidos, aqui designados por E.coli K12 RV308/pCZl12.2 são semeados em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivados convencionalmente para produção e isolamento subsequentes do plasmídeo pCZ112.2. Os transformantes expressam níveis elevados de met-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS.R1A e outros testes. Uma vez que o plasmídeo pCZl12.2 contem um replicão "que se escapa" termoinduzível a expressão máxima de met-bGH ocorre a tem peraturas de cultura de cerca de 37°C.

Exemplo 12

Construção do Plasmídeo pCZlOOO e de E.coli K2 RV 308/pCzrW~

As construções pretendidas são feitas substancialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 3 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 3C pela sequência de DNA adaptador

5'	CTAGAGGGTATTAATA I I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1	ATG 1 1 1	GAT I 1 1	CAG I I 1	GAG 1 I 1	GAT I 1 I	TAA I 1 1	ATG 1 I 1	TTT I 1 I	CCT 1 I 1	GCT 1 I 1
3'	TCCCATAATTAT	TAC	CTA	GTC	CTC	CTA	ATT	TAC	AAA	GGA	CGA
ATG 1 1 I	TCC TTG TCC GGC 111 1 1 I III III	CTG 1 I 1	TTT I 1 1	GCC I 1 I	AAC 1 1 1	GCT 1 1 1	GTGCT 3'
TAC	AGG AAC AGG CCG	GAC	AAA	CGG	TTG	CGA	C	5'	1

A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída básicamente segundo o processo convencional de Itakura et al., 1977 e Crea et al., 1978.

0 referido método de síntese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.

Os transformantes pretendidos,aqui designados por E.coli. K12 RV308/pCZl000, são semeados em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivados convencionamente para produção e isolamento subsequeii tes do plasmídeo pCZlOOO. Os transformantes expressam níveis elevados de met-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pCZlOOO contem um replicão runaway termoinduzível, a expressão máxima de met-bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 37°C.

74-

fftar-n

Exemplo 13

Construção do Plasmídeo pCZlOOO.l e de E.colí K12 RV308/pCZl000.1

As construções pretendidas são feitas básicamente segundo os ensinamentos do Exemplo 3 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 3C pela sequência de DNA adaptador

5'	CTAGAGGGTATTAATA	ATG	GAT	CAG	TAA	ATG	TTT	CCG	GCT	ATG	TCC
3'	I I 1 1 1 1 1 I 1 1 1 i TCCCATAATTAT	TAC	I 1 1 CTA	GTC	I 1 1 ATT	1 I I TAC	AAA	GGC	C GA	TAC	AGG

TTG	TCC	GGC	CTG	TTT	GCC	AAC	GCT	GTGCT	3
f I 1 AAC	AGG	CCG	1 1 f GAC	ÁÁÁ	I I 1 CGG	I 1 I TTG	CGA	1 c	5

A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída substancialmente de acordo com o processo convencional delTakura et al. , 1977 e Crea et al., 1978. 0 referido método de síntese está também específicamente ilustrado no Exemplo 1.

Os transformantes pretendidos, a qui designados por E.coli K12 RV308/pCZ1000.1 são semeados em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois convencionalmente cultivados para produção e subsequente isolamento do plasmídeo pCZlOOO.l. Os transformantes expressam níveis elevados de met-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel ctm SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pCZ 1000.1 contem um replicão"que se escape" termoinduzível, a expressão máxima de met-bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 37°C.

Exemplo 14

aí;¹:·.";!·--"

Construção do Plasmídeo pCZ1060 e de E.coli K12 RV308/ZpCZl060

As construções pretendidas são feitas substan cialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 3 exceptuando a substituição da sequência adaptadora do Exemplo 3C pela sequência de DNA adaptadores.

5'	CTAGAGGGTATTAATA	ATG	GAT	GAT	AAG	TAA	ATG	TTC	CCA	GCC	ATG
3'	tcccÁÍÂÁttÀt	1 I 1 TAC	CTA	1 I 1 CTA	1 1 1 TTC	ATT	I 1 1 TAC	1 I I AAG	1 1 1 GGT	1 1 I CGG	1 1 1 TAC
TCC	TTG TCC GGC CTG	TTT	GCC	AAC	GCT	GTGCT 3'	1
1 1 1 AGG	lll III 111 li) AAC AGG CCG GAC	1 I 1 AAA	1 1 I CGG	1 1 I TTG	1 I J CGA	1 c	5'

A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída essencialmente segundo o processo convencional de Itakura et a 1.,1977 e Crea et al., 1978 . 0 referido método de síntese está também especificamente ilustrado no Exemplo 1.

Os transformantes pretendidos, aqui designados por E.coli K12 RV308/pCZl060, são semeados em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivados convencionalmente para produção e isolamento subsequentes do plasmídeo pCZ1060. Os transformantes expressam níveis elevados de met-bGH conforme demonstrado por electroforese em gel com SDS, RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pCZlOOO contem um replicão runaway termoinduzível, a expressão máxima de met-bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 37°C.

Exemplo 15

Construção do Plasmídeo pCZ1120 e de E.coli K12 RV308/pCZl120

As construções pretendidas são feitas essencialmente segundo os ensinamentos do Exemplo 3 exceptuando a utilização da sequência de DNA adaptador

5' CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT GAT AAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG

llllllllllil III III III I I I III III III III III III

3' TCCCATAATTAT TAC CTA CTA TTC ATT TAC AAA GGC CGA TAC

TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'

III III III I 1 I III III III III lil I

AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C 5'

em lugar da sequência adaptadora do Exemplo 3C. A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída essencialmente de acordo com o processo convencional de Itakura et aj_.,1977 e Crea et al. , 1978. 0 referido método

de síntese estâ também especificamente ilustrado no Exemplo 1.

Os transformantes pretendidos, aqui designados por E.coli K12 RV308/pCZl120 são semeados em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois convencionalmente cultivados para produção e isolamento subsequentes do plasmídeo pCZ1120. Os transformantes expressan níveis elevados de met-bGH conforme demonstrado por RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pCZl120 contem um replicão "que se escapa" termoinduzível, a expressão máxima de met-bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 37°C.

Exemplo 16

Caistrução do Plasmídeo pCZl 140 e de E.col i K12

RV308/pCZl140

A. Digestão do Plasmídeo pNM575 com BamHI-FnuDII e Obtenção do Fragmento BamHI-FnuDII ^0,5 Kb

Cerca de 5 yug do plasmídeo pNM575 (preparado no Exemplo 1B) em 50 yul de tampão "Médium Salt" são incubados com 10 unidades de cada uma das enzimas de restrição BamHI e FnuDII a 37°C durante cerca de 1 hora. Após adição de 5 xjI de acetato de sódio 3M, pH 7,0, o DNA é precipitado com 2 volumes de etanol a 100% e recuperado. 0 DNA digerido pretendido é dissolvido em 100 χιΐ de tampão TE e guardado a 0°C atê ser usado.

#

0 tampão "Médium Salt" ê preparado com a seguinte composição:

NaCl 50 mM Tris.HCl, pH 8 MgCl₂ 10 mM J3-mercaptoetanol 6 mM

B. Construção da Sequência de DNA Adaptador

5'	CTAGAGGGTATTAATA 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 1 I	ATG 1 I 1	TTC 1 I 1	CCA 1 1 I	TTG 1 1 1	GAG 1 1 1	GAT 1 I 1	GAT 1 1 I	TAA 1 1 1	ATG 1 1 1	TTC 1 1 I
3'	TCCCATAATTAT	TAC	AAG	GGT	AAC	CTC	CTA	CTA	ATT	TAC	AAG
CCA I I 1	ACC ATT CCC TTA III lll lll lll	TCC 1 1 1	AGG I ι 1	CTT ι ι ι	TTT 1 1 1	GAC 1 1 I	AAC 1 1 1	GCT i r ι	ATG 1 I 1	CTC 1 1 1	CG 3 1 1
GGT	TGG TAA GGG AAT	AGG	TCC	GAA	AAA	CTG	TTG	CGA	TAC	GAG	GC 5

A sequência adaptadora acima especificada pode ser construída essencialmente segundo o processo convencional de Itakura et al., 1977 e Crea et al. ,1978. 0 referido método de síntese está também especificamente ilustrado go Exemplo 1.

C. Ligação e Transformação

Cerca de 20 picomoles do DNA adaptador do Exasplo 16B, 1 >ug do produto de digestão com BamHI-FnuDII do Exemplo 16A e 0,5 yug do fragmento BamHI-Xbal <^10,2 Kb do Exemplo 3A são ligados e o plasmídeo resultante é usado para transformar E.coli K12 RV308 essencialmente de acordo com os ensinamentos do Exemplo 2D.

Alguns dos transformantes resultantes, conforme demonstrado por electroforese em gel de agarose (Maniatis et al.,1982) contêm apenas o plasmídeo pretendido a>10,8 Kb.Tal transformante, aqui designado por E.coli K12 RV308/pCZl140, é seleccionado, semeado em agar TY contendo os antibióticos adequados e depois cultivado segundo técnicas de microbiologia convencionais.As células resultantes expressam níveis elevados de met-hGH conforme demonstrado por electroforese em gel oom SDS,RIA e outros testes. Porque o plasmídeo pCZl140 contem um replicão"que se escapa" termoinduzível, a expressão máxima de met-bGH ocorre a temperaturas de cultura de cerca de 37°c.

-79-

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   I^a. - Processo para a preparação de um vector de expressão de DNA reeombinante, caracterizado por se fazer a ligação de

   a) uma sequência activadora da transcrição e tradução,

   b) um DNA adaptador compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um local de ligação ao ribossoma e um peptideo, a sequência do referido peptídeo ou polipeptídeo contendo um sinal de paragem da tradução localizado imediatamente adjacente e a jusante de tripleto de nucleotídeos que codifica a terminação carboxilo do referido peptideo ou polipeptídeo, e um sinal de iniciação da tradução que está imediatamente adjacente e a jusante do referido sinal de paragem, e

   c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo funcional, a sequência codificadora do referido polipeptídeo funcional contendo de paragem da tradução situado imediatamente adjacente e a jusante do tripleto de nucleotídeos que codifica a terminação carboxilo do referido polipeptídeo funcional, sujeito à limitação de o referido vector ser seleccionável e de replicação autónoma.

   23. - Processo de acordo com a

   reivindicação 1, caracterizado por o vector ser um plasmídeo.

   3^a. - Processo de acordo com a rei, vindicação 1 ou 2, caracterizado por a sequência codificadora do polipeptídeo ou peptídeo codificador 2-20 amino-ácidos.

   4^a. - Processo de acordo com a

   reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por a sequência codifj,

   cadora do peptídeo ou polipeptídeo ser uma sequência que

   codifica MET-FEN--PRO-LEU-GLU-ASP-ASP, MET-GLU-ASP-ASP,

   MET-ASP-GLN-GLU-ASP, MET-ASP-ASP-LIS, MET-ASP-G.LN-GLU ou

   MET-ASP-GLN em que

   MET é metionina, FEN é fenilalanina, PRO é prolina LEU é leucina GLU é ácido glutâmico ASP ê ácido aspártico GLN é glutamina

   5^S. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a sequência activadora da transcrição ser a sequência activadora da transcrição de triptofano de IE. coli., lactose de E. coli, Pj_O|_ do bacteriófago , P_r0_f do bacteriófago vegetativa de Bacillus subtilis ou resistência ao tiosterpton de Streptomyces azureus. ^{6 7 8}

   6^S. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a sequência activadora da transcrição compreender uma ou mais sequências activadora da transcrição de E. coli em tandem.

   7^â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a sequêji cia activadora da transcrição do triptofano de IE. coli ou a sequência activadora da transcrição da lipoproteina de E_. coli

   8^ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por um ou dois pares de nucleotídeos estarem situados entre o sinal de paragem da tradução da sequência codificadora do peptideo ou polipeptideo e o sinal de inciação da tradução da sequência codificadora do polipeptideo funcional.

   ......^ϊ^ιϋίΚΛΜβΙ »

   9^S. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por pelo menos um tripleto de nucleotfdeos estar situado entre o sinal de paragem da tradução da sequência codificadora do peptídeo ou polipeptídeo e o sinal de iniciação da tradução da sequência codificadora do polipeptídeo funcional.

   10^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a sequên_ cia de nucleotídeosque codifica um peptídeo ou polipeptídeo conter uma sequência activadora da tradução funcional.

   II^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o vector de expressão de DNA recombínante compreender uma sequência de nucleótideos que origina, quando da transcrição, um mRNA policistrónico susceptível de ser traduzido contendo codões de um polipeptídeo funcional e mais um peptídeo ou polipeptídeo não condensado.

   12^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 caracterizado por os codões do polipeptídeo funcional e do peptídeo ou polipeptídeo adicional não condensado não estarem na mesma fase de leitura.

   13^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 caracterizado por a sequência codificadora do polipeptídeo funcional ser uma sequência que codifica hormona de crescimento bovina; hormona de crescimento humana, hormona de pré-crescimento humana, hormona de crescimento porcina, hormona de crescimento mamífera, hormona de crescimento aviária, cadeia A da insulina humana, cadeia B da insulina humana, pro insulina humana preproinsulina humana, interferão, urocinase, activador do plasminogénio de tecido humano, factor de libertação da hormona de crescimento ou interleuquina II.

   -8214^a. - Processo de acordo com.a reivindicação 1, 2 ou 3, para a preparação do plasmídeo pCZ114, caracterizado por se fazer ligação do fragmento Bamx - Xbal

   10,2 kb do plasmídeo pCZIOl, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos

   GCC

   I I I

   CGS

   5’ CTAGAÔ6GTATTAATA

   • I ’ I I « I I « I I |

   TCCCATAATTAT

   ATG < 1 1 TTG » 1 1 GAG | 1 | GAT GAT TAC AAC CTC 1 1 f CTA 1 1 t CTA

   ATO TCC TTG TCC GGC

   ¹ ’ ' · ' » «»»111 lit

   TAC AGG AAC AGG CCC

   CTG TTT GCC AAC GCT

   ' ’ ' ' ' ' »11 lit ||,

   GAC AAA CGG TTG CGA

   TAA ATG TTC

   » » » « · I , ι ,

   ATT TAC AAG GTGCT 3’; .

   <iii,

   C 5‘

   CCA

   I I I

   GGT

   e o fragmento BamHI - HgiAI ^0,6 kb do plasmídeo pCZIOl.

   15^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZIOl, caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI - Xbal 10,2 kb do plasmídeo pCZIOl, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos.

   5‘ CTA6A6GGTATTAATA ATS TTC CCA TTG GAT GAT SAT TAA ATS TTC I 1 1 1 I 1 1 I 1 I 1 I TCCCATAATTAT 1 1 1 TAC 1 1 1 AAG 1 1 1 GGT 1 1 1 AAC 1 1 1 CTA 1 t 1 CTA III III CTA ATT 1 1 1 TAC 1 t < AAG CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’ 1 , I 1 1 1 1 ♦ 1 <11 III 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ( 1 1 I 1 1 1 1 1 iii ι ι t ι ι GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C 5'

   e o fragmento BamHI-HglAI 0,6 kb do plasmídeo pCZIOl.

   16³. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZlOOO, caracterizado por se fazer ligação do fragmento BamHI-XbaI 10,2kb do plasmídeo pCZIOl um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos

   5 CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT CAG GAS GAF TAA ATG TTT CCT

   TCCCATAATTAT TAC CTA «TC CTC CTA ATT TAC AAA «GA

   GCT ATS TCC TTG TCC GGC CTG TTT SCO AAC SCT GTGCT 3'

   CGA TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA C3G TT3 CGA C 5'.

   e o fragmento BamHI-HgiAI 0,6 kb do plasmídeo pCZIOl.

   17³. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZlOOO.1 caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI -Xbal /v/10,2 kb do plasmídeo pCZIOl um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos

   5‘ CTAGAGGGTATTAATA ATG GAT CAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG

   ι · ι I » I I « I I I I lll .111 lll lll lll lll lll III lll

   TCCCATAATTAT TAC CTA GTC ATT TAC AAA 6GC CGA TAC

   TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT ST6CT 3’

   • · · · · · < « » «II lll lll lll lll lll I

   AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGS TTG CGA C 5‘

   e o fragmento BamHI-Hgi ^0,6 kb do plasmídeo pCZIOl.

   Ρίι nuGfti • ’ IV £ . < ’ - ‘Μ

   18^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZ1060, caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-Xbal fu 10,2 kb do plasmídeo pCZIOl,um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos o fragmento BamHI-HgiAI<v. 0,6 kb do plasmídeo pCZIOl e

   5‘ CTAG ΑβββΤΑΤΤΑΑΤΑ ATS 6AT GAT AAG TAA ATS TTC CCA SCC I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 i I 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 TCCCATAATTAT TAC CTA CTA TTC ATT TAC AAS S6T C6S ATS TCC TTG TCC sec CTG TTT GGC AAC ÔCT 6TSCT 3‘ 1 1 I 1 1 1 lll 111 lll 1 I I 1 1 1 1 1 « 1 1 1 1 1 1 1 TAC AGQ AAC ASS CCS SAC AAA CGS TTG CGA C 5’

   19^â. -Processo de acordo com a reivin dicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZ1120, ca racaterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-Xbal

   10,2 kb do plasmídeo pCZIOl, um DNA adaptador tendo a sequên cia de nucleotídeos

   5* CTA6A6GSTATTAATA ATG GAT GAT AAG TAA ATS TTT CCS GCT

   ι ι ι » · t ι « ι ι ι i iii iii iii ι ι ι iii ι ι ι ι t ι ι ι ι ι ι ι

   TCCCATAATTAT TAC CTA CTA TTC ATT TAC AAA GGC CGA

   ATS TCC TTS TCC 66C CTG TTT C₃CC AAC GCT 8TSCT 3‘

   lll lll lll t I I lll Ilf lll lll I I I - I I I I

   TAC AfiG AAC ASO CCS SAC AAA CGS TTS CQA C 5'

   e o fragmento BamHI-HgiAI ^0,6 kb do plasmídeo pCZIOl.

   20⁵. - Processo de acordo com a reividnicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZ105,l caracterizado por se fazer a ligação do produto da digestão do plasmídeo pNM608 com EcoRI-C1 aI, o fragmento BamHI-Xbal

   10,2 kb do plasmídeo pCZ, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos.

   TTC CCA GCC

   III llt III

   AA6 GGT CGG 3’

   5' CGACA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG

   ’ * ’ * ¹ ’ · ^{1 1} · · ' t I ι » · » III lil (II |||

   TGT TAC AAG GGT AAC CTC CTA CTA ATT TAC

   ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT

   ‘ ‘ ' ’ " ’ ' * » " ‘ » · · ' I III III III 111,1111

   TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA .C

   e o fragmento BamHI-HgiAI 0,6 kb do plasmídeo pCZIOl.

   21^a. - Processo de acordo com a reividnicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZlo5.2, caracterizado por se fazer a ligação do produto da digestão do plasmídeo pNM608 com EcoRI-Clal o fragmento BamHI-Xbal 10,2 kb do plasmídeo pCZIOl, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos.

   5' CGACA ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT TAA ATG TTC CCA GCC

   III 1(1 III III III III III III III III III III III

   TGT TAC AAG GGT AAC CTA CTA CTA ATT TAC AAG 8ST CGG

   ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3‘

   III III III III III t I l l I , l l l l I I III I

   TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C 5’

   e o fragmento BamHI-HgiAI 0,6 kb do plasmídeo pCZIOl.

   22^a. - Processo de acordo com a reivin dicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZ106,l, caracterizado por se fazer a liagção do produto da digestão do plasmídeo pNH608 com EcoRI-Clal, o -fragmento BamHI-Xbal <v 10,2 kb do plasmídeo pCZIOl um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos.

   «ιΒΜιγΛ;

   5’ CGACC ATG GAT CAG GAG TAA ATS TTC CCS GCT ATS TCC

   lll lll lll | I I lll I t I lll I « I 11(111 » t » II·

   TGG TAC CTA 8TC CTC ATT TAC AAG GGC C6A TAC AGG

   TTG TCC GCC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3* 1 1 1 ι ι ι 1 1 I 1 1 1 1 1 · 1 1 1 lll • 1 1 1 1 AAC AGG CGG GAG AAA CGG TTG CGA C 5'

   e o fragmento BamHI-HgiAI·^ν 0,6 kb do plasmidep pCZIOl.

   23³. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZ112.1, caracterizado por se fazer a ligação do produto da digestão do plasmídeo pNM608 com EcoRI-ClaI, o fragmento BamHI-Xbal ^10,2 kb do plasmídeo pCZIOl, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos.

   5' CGACC ATG GAT GAT AAS TAA ATS TTT 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 i 1 1 1 1 TGG TAC CTA CTA TTC ATT TAC AAA TTG TCC GGC -CTC TTT GCC AAC GCT lll 1 (lll 1 1 1 1 1 1 1 1 t • < 1 I 1 1 1 i 1 AAC AGG CCG GAG AAA CGG TTG CGA

   BamHI-HgiAI ^0,6 kb do

   CCG SCT ATG TCC

   » * » lll lll lll

   GGC CGA TAC AGG GTGCT 3’

   lil

   C 5‘

   e o fragmento

   plasmídeo

   pCZIOl.

   24^s. - Processo de acordo com a rei, vindicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo

   pCZll.2,2 caracterizado por se fazer a ligação do produto da digestão do plasmídeo pNM608 com EcoRI-Clal , o fragmento BamHI-EcoRI 10,2 kb do plasmídeo pCZIOl, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleotídeos

   5‘ CGACC ATS GAT GAT AAG GAG TAA ATG TTT CCS GCT ATG

   , , I III III III III ι I : I · I ' > ' » ' ' ’ ' ‘ * * * · ' ¹

   T.G.S TAC CTA CTA TTC CTC ACC TAC AAA GGC CGA TAC

   TCC TTG TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3'

   III <11 III lli 111 1*1 I I I I I I > III '

   A55 AAC AGG CCG SAS AAA CGG TTS CGA C 5

   e o fragmento BamHI-HgiAI 0,6 kb do plasmídeo pCZIOl.

   25^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 para a preparação do plasmídeo pCZ1140, caracterizado por se fazer a ligação do fragmento BamHI-Xbal a? 10,2 kb do plasmideo pCZIOl, um DNA adaptador tendo a sequência de nucleótideos

   5‘ CTAGAG6G TATTAATA ATG TTC CCA TTG GAG GAT GAT TAA ATG 1 I I t 1 I 1 I 1 1 1 1 I 1 1 » I 1 1 1 1 t 1 1 1 1 t III 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ícec ATAATTAT TAC AAG GGT AAC CTC CTA CTA ATT T ΑΓ t TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG 1 » t • II 1 » 1 1 1 1 1 I 1 1 1 > 1 < 1 1 t 1 t 1 1 ( r < > 1 1 1 1 1 1 ι ι ι 1 1 1 AAG GGT TGG TAA GGG AAT AGG TCC GAA AAA CTG TTG CGA TAC

   CTC CS 3'

   SAC GC 5*

   e o produto da digestão do plasmídeo pNM575 com BamHI-FnuDII.

   26^a. - Processo para a preparação do plasmídeo pCZIOl, caracterizado por se fazer a ligação do produto da digestão do plasmídeo pIM-I'-Ag com Xbal-BamHI e o produto da digestão do plasmideo pNM7898

   com XbmI-BamHI.

   27³. - Célula hospedeira, caracterizada por ser transformada com um vector de expressão de DNA recombinante susceptível de ser seleccionado e de replicação autónoma o qual compreende

   a) uma sequência activadora da transcrição e tradução a qual está na mesma fase de leitura de uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo ou polipeptídeo a sequência codificadora do referido peptídeo ou polipeptideo contendo um sinal de paragem da tradução situado imedia_ tamente adjacente e a jusante do tripleto de nucleotídeos que codifica a terminação carboxilo do referido peptídeo ou polipeptídeo e

   b) um sinal de iniciação da tradução que estã imediatamente adjacente e a jusante do referido sinal de paragem e que estã na mesma fase de leitura de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo funcional contendo um sinal de paragem da tradução situado imediatamente adjacente e a jusante do tripleto de nucleotídeos que cc difica a terminação do referido polipeptídeo funcional.

   28^â. - Célula de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o vector ser um plasmídeo.

   29³. - Célula de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado por a sequência codificadora peptídeo ou polipeptídeo do vector codificar MET-FEN-PRO-LEU-GLU-ASP-ASP-MET-GLU-ASP-ASP-LIS, MET-ASP-ASP-LIS, MET-GLU-ASP-GLN ou MET-ASP-GLN, em que

   -JS

   MET ê metionina,

   FEN ê fenilalanina,

   PRO é prolina,

   LEU é leucina,

   GLU é ácido glutâmico,

   ASP é ácido aspártico e GLN ê glutamina

   308. _ célula de acordo com a reivindicação 27, 28 ou 29, caracterizado por a sequência codificadora do polipeptídeo funcional do vector codificar hormona de crescimento bovina, hormona de crescimento humana, hormona de pré-crescimento humana, hormona de crescimen to porcina, hormona de crescimento de mamíferos, hormona de crescimento aviária, cadeia A da insulina humana, cadeia B de insulina humana, pro-insulina humana, pré-pro-insulina humana, interferão, urocinase, activador do plasminogênio de tecido humano, factor de libertação da hormona de crescimento ou interleuquina II.

   318. _ célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizado por a sequência codificadora do polipeptídeo funcional do vector codificar um polipeptídeo bioactivo.

   328. _ célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizada por o vector ser o plasmídeo pCZ114, pCZIOl.1, pCZlOOO, pCZlOOO.l PCZ1060, pCZ1120, pCZ105.1, pCZ105.2, pCZ106.1, pCZI12.I, PCZ112.2 ou pCZ1140.

   33^a. - Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizada por ser uma célula procariotica.

   34^a. _ célula de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por ser JM coli Bacillus ou Streptomyces.

   35^a. - Célula de acordo com a reivindicação 34, caracterizada por ser EH co1i K12 RV308.

   36^a. _ Método para a produção de um polipeptídeo funcional, caracterizado por compreender:

   1) a transformação de uma célula com um expressão de DNA reeombinante obtido de acordo uma das reivindicações 1 a 25 e

   vector de com qualquer

   2) a cultura da célula quadas à expressão genética.

   transformada

   sob condições ade37^a. - Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por a célula hospedeira transformada ser uma célula procariótica.

   383. _ Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a célula procariótica tran£ formada ser E.coli Bacillus ou Streptomyces.

   393. - Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por a célula transformada ser E.coli.

   -9140^a. - Método de acordo com a rei vindicação 39, caracterizado por a célula transfromada ser E.coli K12 RV308/pCZl 14. E.coli K12 RV308/pCZ101.1, E.coli KI2 RV208/pCZ1000, E.coli K12 RV308/pCZ1000.1, E.coli K12 RV308/pCZ1060, E.coliK12 RV308/pCZl120 , E.coli K12 RV308/pCZ105.1, E.coli K12 RV308/pCZl05.2, E.coli K12 RV308/pCZ106.1, E.coli K12 RV308/pCZl12,1, E.coli K12 RV308/pCZl12.2 ou E.coli K12 RV308/pCZl140.