RU1838412C - Способ получени рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, способ биосинтеза производного бычьего гормона роста - Google Patents

Abstract

Использование: генетическа  инженери , биосинтез белков, в частности бычьего гормона роста. Сущность изобретени : ре- комбинантные плазмидные ДНК, кодирующие бычий гормон роста получают в результате лигйровани  фрагмента BamHI-Xbal плазмиды pCZ101 размером 10,2 kb или BamHI-EcoRI фрагмента той же, плазмиды с Ipp промотором и репликоном, тер ющим контроль числа копий при 30°С, с BamHI- Xbal .фрагментом плазмиды pCZ101 или pCZ106 размером 0,6 kb, кодирующим аминокислоты с 15 до 191 бычьего гормона роста и ДНК-линкером, содержащим нуклеотиды. кодирующие последовательность активации трансл ции, стартовый ко- дон и кодон дл  N-конца производного бычьего гормона роста. Способ биосинтеза состоит в том, что культивируют штамм Escherlchia coli, трансформированный ре- комбинантной плазмидной ДНК pCZ110, или pCZ153. или pCZ154, культивирование трансформантов, выделение и очистку целевого продукта. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 15 ил. ел с

Description

Изобретение относитс  к новым селективным и автономно реплицирующимс  векторам экспрессии, рекомбинантной ДНК, которые состо т из транскрибируемой и транслируемой, активированной нуклео- тидной последовательности, наход тс  в рамке считывани  гена, который кодирует биоактивное производное бычьего гормона роста (6ГР), и репликона, который в индуцированных услови х утрачивает контроль числа копий.

Изобретение относитс  также к способу биосинтеза бычьего гормона роста с использованием указанных векторов.

Развитие и эксплуатаци  технологии рекомбинантной ДНК дл  получени  6ГР были сильно затруднены проблемами экспрессии

гена. Некоторые из этих проблем, детально описанные в за вке на Европейский патент КЬ 0075444, , включают транскрипцию функционально субоптимальной мРНК . Така  мРНК имеет вторичные конфигурации стержн  и петли, что преп тствует нормальному рибосомному св зыванию и таким образом резко снижает или даже предотвращает 6ГР экспрессию. Изобретение разрешает эту проблему, обеспечива  векторы дл  высокого уровн  экспрессии производных 6ГР.

На фиг. 1-4 изображена схематическа  иллюстраци  протокола конструировани  плазмиды pNM575; на фиг.5-8 - схематическа  иллюстраци  протокола конструировани  плазмиды pNM789B: на фиг.9 - карта сайта рестрикции плазмид pCZ1920 и pJR1;

00

СА) 00

N

So

СА)

на фиг. 10 - карта сайта рестрикции плазмиды pCZ112; на фиг.11 - синтетический тем тимозин альфа 1; на фиг.12 - протокол синтеза нуклеотидного фрагмента Т15; ма фиг.13 - протокол конструировани  плазмиды pHnal; на фиг.14- протокол конструировани  плазмиды рН17Д4Д1. на фиг.15 - протокол конструировани  плазмиды рН 1104.

(1 ) 5 АТС АЛА CGC ЛЛТ ТСТ АТС ССС ТТС 3 ТАС ТТТ ССС ТТЛ АСЛ ТАС CGG AAG

SССА GCC АТС ТСС ТТС ТСС GGC j GOT CGG ТЛС AGO ЛАС AGG CCG

( 2 ) 5 АТС GAT GAT АЛС ПТ CCG GCT АТС

Ю э. ТЛС СТА СТА ТТС ААЛ ССС ССА ТАС

3

13)

тст сто тсс ссс t

АСЛ ёАс Асе 5, АТС ТТТ ССА GCC АТС- GCT СТА ТЛС АЛА GGT ССС ТЛС ССЛ CAT

Селективный автономно реплицирующий рекомбинангную ДНК вектор экспре- сии в соответствии с изобретением состоит из неконтролируемого репликона и транскрибируемой и транслируемой активирующей последовательности, котора  находитс  в рамке считывани  гена, который кодирует биоактивное производное бычьего гормона роста, причем ген  вл етс 

5 АТС CAT ТТТ CCG CCT АТС ТСТ 3 ТАС СТА АЛЛ ССС С(;Л ТАС ЛСЛ

3

СТО ТСС GGC ПАС ЛСК CCG

R-B

(Я.

АТС ТТТ ССА GCT АТС ТСТ СТА ТЛС АЛЛ C.GT ССА ТЛС АСА СЛТ

ТСТ CGT

3 5

(7)

АТС СТГ ТТТ ССО ССТ АТС ТСТ ТАС САЛ АЛЛ СОС СсА ТЛС АСА

тст ест

;-R-R

ЛГ,Л ССЛ

АТС ТТС ССА GCT АТС ТСТ СТА

тле Але ест сел тле Асл CAT тст опт

АСЛ ССЛ

-R-R

где А  вл етс  деоксиаденилом;

G - деоксигуанилом;

С - деоксицитидилом;

Т - тимидилом;

R - последовательностью ДНК, котора  кодирует аминокислоты 9 (лейцин) по 1.91 (фенилаланин) бычьего гормона роста;

Векторы насто щего изобретени  могут быть сконструированы путем независимого

а| 5 CTAGAGGGTATTAATA АТС ААЛ GCG ЛАТ ТСТ АТС ТССсАтАЛТТЛТ ТЛС TtT ССС ТТЛ AGA ТАС

ССС ТТС ССА ССС ATG ТСЙ ТТС ТСС ССС СТС CGC AAG GCT CGG ТАС AGG ЛАС AGO CCG GAC

Ь) 5 СТАСАСССТЛТТАЛТА, ЛТС ТТТ ССА GCC ATG GCT 1 ТСССАТЛЛТтАт тАс АЛЛ GGT CGG ТАС CGA

СТА ТСТ ССТ СТС ТТТ GCC AAC CCT GTGCT 3 CAT АсА ССЛ СЛС ААА CGG TTC CGA С 5

сто тсс сое

РАС AGG CCG

а) 5 АТС црт ттт ссс сет АТС тст

З1 ТАС ССЛ АЛЛ tJGC ССЛ ТАС АСА

сто.-тсс стс

Э 5

30

R1  вл етс  последовательностью ДНК, котора  кодирует транслируемый стоп-сигнал , который представл ет собой

ТАА АТТ

TGA ACT

TAG АТС

ИЛИ

г св зывани  следующих Xbal-H AI линкер- 40 ных последовательностей ДНК:

ттт ссс;ААС ест стсст ААА CGG ттс сс-А с

CTAGAGGCTATTAATA АТС ТТГ ССА ССТ АТС ТСТ

тсссАтААттАт тле ААЛ ест ссА ТАС АСА

СТА ТСТ GGT CTG ТТТ GCC AAC GCT CTGCT 3

CAT АсА сел сАс ААА CGC TTG CGA с 5

во фрагменты примерно 10,2 kb BamHI-Xbal и 0,6 kb BamHI-Hg AI плазмиды pCZ101. Полученные в результате плазмиды обозначают соответственно как плазмиды pCZ1920, pJRI и рАТ2, они содержат транслируемую и транскрибируемую активирующую последовательность липопро- теинового гена Е. coli (Nakamura and Inouye 1979, Cell 18:1109) при считывании каркаса кодирующей последовательности дл  био- активного производного бычьего гормона роста; соответственно размещенный транслируемый стоп-сигнал; и репликон неконтролируемогороста . Клетки, трансформированные плазмидами pCZ1920, pJR1 и рАТ2 соответственно, экс- прессируют MET-LIS-CLY-ASPN-SER-MET- ALA-бГР, MET-PHE-PRO-ALA-MET-ALA-R2 и МЕТ-бГР, где

МЕТ  вл етс  метионином,

LIS - лизином,

л) V V

ССЛСС ЛТС СЛТ СЛТ ЛАС ТТТ CCG GCT АТС ТСТ TCG ТЛС СТЛ СТЛ ТТС ЛЛЛ GCC CGA ТЛС ЛСЛ

CTG ТСС GGC CTG ТТТ ССС АЛС GCT GTGCT СЛС ЛСС CCG СЛС ЛЛЛ CGO TTG ССЛ С

ы

з1

сслсл лтс; ттс сел ест лтс тет стл тст GGT

TGT ТЛС АЛС. GGT ССЛ ТАС ЛСЛ CAT АСЛ ССА

CTG ТТТ ССС ЛАС ССТ GTGCT СЛС АЛЛ CGG TTG ССЛ С

с)

CGACC АТС CAT ТТТ ССС ОСТ АТС ТСТ СТС ТСС

тсс тле стл Алл ссс сел тле лсл слс лсс

GGC CTG ТТТ GCC АЛС GCT GTCCT ССС..САС АЛЛ ССС TTG ССЛ С

ССАТС ЛТС GAT ТТТ ССС ОСТ АТС ТСТ СТС ТСС

тле тле стл Алл GCC сел ТАС лсл слс -лес

ССС СТС ТТТ ССС ААС GCT GTGCT 3 ССС СЛС АЛЛ ССС TTG ССА С 5

где А  вл етс  деоксиаденилом,

G - деоксигуанилом,

С - деоксицитидилом,

Т - тимидилом,

во фрагменты примерно 10 kb EcoRI- BamHI и примерно 0,6 kb BamHI-Hgi AI плазмиды pCZ101 и фрагмент примерно 0,29 kb EcoRI-Clal плазмиды pNM608. Полученные в результате плазмиды. обозначен- ные соответственно как плазмиды pCZ112, рАТ1, pASP1, pASP2, pCZ154, PCZ155 и pCZ156, содержат транскрибируемую и транслируемую активирующую последовательность триптофанового гена Е. coli (Hallewell and Emtage, 1980, Gene 9:27) в рамке считывани  кодирующей последовательности дл  биоактивного производного

GLY - глицином,

A.SPN - аспарагином,

SER - серином,

ALA - аланином,

РНЕ - фенилэланином,

PRO - пролином.

6ГР - природной аминокислотной последовательностью бычьего гормона роста, начинающейс  с N-терминального (первого) фенилаланина.

R  вл етс  природной аминокислотной последовательностью бычьего гормона роста, начинающейс  с шестой аминокислоты (лейцина) от М-терминала.

Карта сайта рестрикции каждой из плаз- мид pCZ1920 и pJR1 представлена на фиг.9.

Дополнительные плазмиды, которые также вход т в область насто щего изобретени , могут быть сконструированы независимо св зыванием следующих линкерных последовательностей ДИК Tagl-Hgi Ai:

5 ССЛСС АТС GTT ТТТ CCG ССТ АТС 3 TCG ТАС САД ЛЛЛ GCC ССЛ ТЛС

ТСТ СТС ТСС ССС СТС ТТТ ССС ЛСЛ GAC ЛСС ССС СЛС ЛЛЛ ССС

ЛАС GCT GTGCT TTG ССЛ С

СС.ЛСС ЛТС ССТ ТГГ ССС ССТ АТС ТСС ТЛС ССЛ ЛЛЛ ОСС ССЛ ТАС

ТСТ CTG ТСС СТС СТС ТТТ ССС ЛСЛ GAC ACG СЛС (-ЛС ЛЛЛ ССС

ЛАС ССТ СТССГ

ттс сел с

5 51

ССЛТА АТС CAT ТТТ ССС С.СТ АТС ТАТ ТАС СТА АЛЛ CGC ССА ТЛС

ТСТ СТС ТСС GGC СТС ТТГ GCC АСА САС ЛСС CCG СЛС АЛЛ ССС

ААС ССТ GTCCT 3 TTG CGA С . 5

бычьего гормона роста; соответственно помещенный транслируемый стоп-сигнал и неконтролируемый репликон. Клетки, трансформированные плазмидами pCZ112, рАТ1, pASP1, pASP2, pCZ154, pCZ155 и pCZ156, соответственно экспрессируют MET-ASP-ASP-LYS-бГР. МЕТ-бГР, МЕТ- ASP-бГР, MET-ASP-бГР, MET-VAL-бГР, MET-ALA-PHE-PRO-ALA-MET-SER-IEU-SER- VAL-бТР и MET-ASP-бГР, где

МЕТ  вл етс  метионином,

ASP - аспарагиновой кислотой,

LED - лейцином,

SER - серином.

PRO - фенилаланином,

LYS -лизином,

VAL - валином,

ALA - аланином,

б ГР  вл етс  природной аминокислотной последовательностью бычьего гормона роста, начинающейс  с аминокислоты 9, лейцина;

6ГР  вл етс  природной аминокислотной последовательностью, начинающейс  с N-терминального,(первого) фенилаланина. Карта сайта рестрикции иллюстративной плазмиды pCZ112 представлена на фиг. 10. Плазмида pCZ101 исходного материала содержит примерно 10,8 kb и сконструирована лигацией фрагмента примерно 0,6 kb Xbal-BamHI плазмиды pNM789B в подобным образом переваренную плазмиду р М-1 -АЗ. Последн   плазмида, котора  содержит транскрибируемую и транслируемую активирующую последовательность липопротеинового гена Е. coli, а также и репликон неконтролируемого роста, может быть получена из Е. coli K12 RV308/plM-V- . A3, штамма, депонированного и составл ющего часть посто нно хран щейс  коллекции культур Северной региональной исследовательской лаборатории, Пеори , Иллинойс. Штамм  вл етс  доступным как предпочтительный источник и хранилище плазмиды под регистрационным номером NRRLN В-15733. Исходный материал плазмида pNM789B происходит из плазмиды pKENUT в соответствии со стади ми, иллюстрированными и описанными на фиг.1- 8 и в примере 1 ниже. Плазмида рКЕШ может быть получена из Е, coli K12 CC620/pKEN111 штамма, депонированного и  вл ющегос  частью посто нно хран щейс  коллекции куль тур Северной региональной исследовательской лаборатории. Пеори , Иллинойс. Штамм  вл етс  доступным как предпочтительный источник и хранилище плазмиды под регистрационным номером NRRL 8-15011. Плазмида pNM789B также содержит транскрибируемую и транслируемую активирующую последовательность липопротеинового гена Е.соЧ и, кроме того, кодирующую последовательность , включающую соответственно расположенный .транслируемый стоп-сигнал , дл  конденсированного протеина, включающего 6ГР и дев тичленный пол- ипептид у 6ГР N-терминала. Лигирование последовательности, кодирующей конденсированный протеин, содержащийс  в фрагменте Xbal-BamHI, к соответственно расщепленной плазмиде р1М-1 -АЗ приводит в результате в вышеупом нутой плазмиде pCZ101 исходного материала.

Исходный материал плазмиды рМ608 содержит примерно 4,6 kb и сконструирована путем лигации фрагмента EcoRI-Clal плазмиды рН17 Д4Д1 в EcoRI-Clal - переваренную плазмиду рВ.322. Плазмида рН17 ДА Л1 может быть сконструирована в соответствии с методикой примера 5 ниже, Из-за множественности сайтов рестрикции

Та 1 в плазмиде рН 17 М Д1 желаемый фрагмент EcoRI-Tagl лучше всего может быть генерирован субклонированием фрагментов рН17 Д4 А1 EcoRI-Hpal и Hpal-Tagl, Плазмида р ММ608 содержит Е. coll триптофан транскрибируемую активирующую последовательность и, следовательно,  вл етс  полезной дл  конструировани  в изобретении.

Специалисты в данной области должны

знать, что различные линкеры ДНК, описанные выше,  вл ютс  важными компонентами изобретени . Эти последовательности могут быть удобно синтезированы с помощью модифицированного фосфор-триэфирного метода, использующего полностью защищенные дидеоксирибонуклеотидные строительные блоки. Такие методы синтеза хорошо известны на данном уровне техники и могут быть осуществлены по существу в

соответствии с методикой Итакуры и др., 1977, Science, 198; 1056; и Криассотр., 1978, Pro, Nat, Acad, USA 75:5765. Кроме того, особенно предпочтительный способ описан в Hslung et al., .1983. Исследование нуклеиновых кислот 11:3227, и Narang eta., 1980. Методы вэнзимологии68:90. Линкеры коди-. руют транслируемую активирующую последовательность и также аминокислоты, составл ющие первый участок (М-терминальную область) вышеупом нутых производных бГР. Остальна  Кодирующа  последовательность бГР (включа  соответ- ственно расположенный транслируемый стоп-сигнал) и также транскрибируема  активирующа  последовательность могут быть обеспечены лигацией соответствующего фрагмента плазмиды pCZ101. Такие лигации привод т в результате к иллюстра,- тивным плазмидам экспрессии производно.

го бычьего гормона роста изобретени . ,-,;

Делени  фрагмента рестрикции при-/ мерно 900 пар оснований BstE l 1 плазмиды pCZ101 с последующей перециркул риза-.

0 цйем приводит в результате в плазмиде pCZ103. BstE11 делени  не оказывает воздействи  на область кодировани  бГР.в плазмиде pCZ101, Использу  плазмиду pCZ103 вместо плазмиды pCZ101 в выше5 упом нутых конструировани х получают в результате подобные плазмиды, но меньше 900 пар оснований. Производные бГР, экс- прессируемые этими происход щими из pCZ103 плазмидами, следовательно,  вл ютс  идентичными производным, экспрессируемым происход щими из pCZ101 их дубликатами.

Итак, использу  фрагменты рестрикции плазмиды pCZ103 примерно 9.3 kb BamHI- Xpal и примерно 0,6 kbBamHI-Ho AI вместо фрагментов рестрикции плазмиды pCZ101 примерно 10,2 kb BamHI-Xbal и примерно kb BamHI-Hgi AI в вышеупом нутых кон- руировани х из плаэмид рЛ и рАТ2 получают в результате конструкцию производных плазмид pJR1.3 и рАТ2.3 соответственно . Использу  фрагменты рестрикции плазмиды pCZ103 примерно 9,3 kb BfemHI-EcoRI и примерно 0,6 kb BamHI-Hgi А1 вместо фрагментов рестрикции плазмиды pCZ101 примерно 10,2 kb BamHI-EcoRI и npHMepHO.O,6kb BamHI-Hgi AI в вышеупом нутых конструировани х из плазмид рАТ1, pASP1, pASP2, pCZ154, pCZ155 и pCZ156 получают в результате конструкции производных плазмид рА И.З, pASP2.3, pCZ154.3, pCZ155.3 и pCZ156.3 соответственно,

Изобретение никоим образом не ограничиваетс  использованием конкретной транскрибируемой активирующей последовательн остью , так как выбор определенной последовательности не  вл етс  критическим дл  работоспособности изобретени .

Транскрибируемые активирующие последовательности , которые могут быть заменены ранее описанными липоиротеиновой и триптофановой активирующими последовательност ми , включают, но не ограничиваютс  Е. coli лактозной (lac), бэктериофаговой АРгОг и бактериофаговой ApROR транскрибируемыми активирующими последовательност ми. В дополнение к этому одна или несколько транскрибируемых активирующих последовательностей, или их частей, могут быть использованы совместно , такие как, например, trp и lac или tac транскрибируемые активирующие последовательности . Все вышеупом нутые последовательности были охарактеризованы ранее и могут быть сконструированы или синтетически или из известных плазмид.

В определенных вариантах, описанных здесь, репликаци  плазмиды определ етс  термоиндуцирующимс  репликоном неконтролируемого роста, описанным как в британской патентной публикации № 1557774, так и в Uhlin et al., 1979, е е 6:91. При температурах ниже 30°С, в частности 25°С, репликон поддерживает относительно низкое число копий, примерно 10-15 копий на клетку . При повышении температуры до 37°С контроль числа копий тер етс  и плазмиды, содержащие репликон, амплифицируютс  до 1000-2000 копий на клетку. Конкретный репликон неконтролируемого роста, приведенный здесь в качестве примера, содержитс  в ранее описанной плазмиде рШ-11- АЗ исходном материале. Специалисты в данной области должны понимать, что изо- 5 бретение нерграничиваетс  использованием какого-либо конкретного репликона неконтролируемого роста или мутанта числа копий. Другие репликоны, вызывающие безудержный рост или большое число ко- 0 пий, могут быть получены путем соответствующей селекции или могут быть сконструированы в соответствии с процедурой , описанной в Международной публикации № W082/02901. Такие репликоны могут 5 быть использованы дл  конструировани  векторов экспрессии, которые также вход т . в область изобретени .

Клонирование генов в векторы, содержащие репликон неконтролируемого роста,

0 приводит в результате, к индуцированию и потере контрол  числа копий, к сильному увеличению скорости синтеза белка и сопутствующему образованию до насто щего времени неизвестных и неописанных видов

5 внутриклеточных белковоподобных гранул. Такие гранулы, которые также вход т в изобретение ,  вл ютс  высоко гомогенными по их белковому составу, и, следовательно, отличимы от известных высокомолекул рных

0 агрегатов и инклюзий, которые иногда встречаютс  в клетках-хоз евах; содержащих рекомбинзнтную ДНК. Последние включени   вл ютс  гетерогенными, обычно содержащими ассортимент клеточных

5 компонентов, таких как нуклеиновые кислоты , углеводы, липиды и пептиды, и содержат только 10-20% конкретного белкового продукта . Гранулы изобретени   вл ютс  высоко однородными по целевому протеиновому

0 продукту, составл ющему по крайней мере 50%, а чаще более 80% гранулы.

Насто щие новые виды гранул могут

с быть легко выделены из лизатов клеток, они

 вл ютс  стабильными к промывке низкими

5 концентраци ми мочевины или детерген - тов. Промывка удал ет белки, которые св заны не специфически в грануле, Выделение, которое генерирует высоко специфический активный материал, представ0 л ет собой полезную первую стадию в очистке чужеродных белков. Все последующие стадии очистки, следовательно, упрощаютс . Особенно полезным  вл етс  тот факт, что компоненты клеточных стенок мо5 гут быть легко отделены от гранул.

Полагаем, что образование гранул изобретени  изолирует такой чужеродный белок , чтобы не происходило нарушени  нормального клеточного метаболизма и

дреждевременной гибели клеток. Некоторые белки, такие как человеческий проинсу- лин, быстро деградируют в E.coli и не накапливаютс . Однако, когда такие белки кодируютс  в векторах, содержащих репли- кон неконтролируемого роста, проинсули- новый белок образует нерастворимые гранулы, которые защищают первоначально нестабильный белок от протеолитическогоо разложени . Следовательно, образование насто щего вида гранул  вл етс  полезным не только дл  накоплени  нестабильных белков, но также дл  упрощени  процедур выделени  и очистки генных продуктов.

Многие модификации и варианты насто-  щих иллюстративных последовательностей ДНК  вл ютс  возможными. Например, вырожденность генетического кода допускает замещение нуклеотидов на всем прот жении областей, кодирующих полипептиды, а также замещени  транслируемых стоп-сигналов TAG или TGA не спеАСТ . ACTциально подтвержденный примером транслируемый стоп-сигнал ТАА. СледоваАТГ .

тельно, как определено здесь выше, может быть одной из любых возможных последовательностей ДНК, которые кодируют аминокислоты 9 (лейцин) до 191 (фенилаланин) 6ГР. Такие последовательности могут быть выведены из.известной аминокислотной последовательности 6ГР и могут быть сконструированы по следующим традиционный синтетическим процедурам. Однако нуклео- тидные триплеты должны быть выбраны в соответствии с известными принципами и экстрапол ци ми, рассмотренными у Цуке- ра и Стейглера, 1981. Исследование нуклеи новых кислот 9(1):133, чтоВы избежать генерировани  дополнительных оснований в мРНК. Водородное св зывание междута-. кими комплиментарными основани ми приводит в результате к конфигураци м стержн  и петли и свертыванию, которое снижает эффективность трансл ции. Специалисты в данной области должны понимать, что все описанные выше модификации и вариации могут быть традиционно синтезированы в полном соответствии с цитированными .ранее синтетическими методиками . Следовательно, изобретение никоим образом не ограничиваетс  специально представленными в примерах последовательност ми ДНК и плазмидами. Векторы экспрессии и способ изобретени  могут быть применены к широкому кругу организмов-хоз ев, например, грамотрицател ьным прокариотным организмам , таким как Escherichia cotl. Е. сой К12 Е. соГсК12 RV308, E. coli K12 НВ101, Е.

coli K12 С600, Е. coli K12 С600 RirMic, E. coll К12 RRI, E. coli K12.MM294 и подобным. Хот  все варианты изобретени   вл ютс  полезными , некоторые векторы и трансформанты

 вл ютс  предпочтительными. Предпочти-, тельные векторы включают pCZ1920, pJR1, рЛ.З, pCZ1T2, pAT1, рАТ1.3, рАТ2, рАТ1.3, pASP1,pASP1,3,pCZ154, pCZ154.3, pCZ156, PCZ156.3. pASP2.3 и pASP2, а предпочтительные трансформанты включают Е. coli К12 RV 308/pJR1, E. coli K12 RV308/pCZ1920, E. coll К12 RV308/plRI, E. coll K12 RV308/pJRI.3, E. coli .К12 RC308/pCZ112, E,-co.ll K12 RV308/pAT1, E.

5 coli K12 RV308/pAT1.3, E, coli K12 RV308/pAT2, E. coli K12 RV3 Q8/pAT2.3, E. coli K12 RV308/pASP1, E. coli K12 RV308/pASP1.3, E.coli 312 RV308/pCZ154, E. COH.K12 RV308/pCZi54.3, E. coli K12

.0 RV308/pCZ156, E. coli K12 RV308/pCZ156.3, E. coli K12 RV308/QASP2.3- и E. coli K12 RV308/pASP2. Из этой предпочтит-ельной группы особенно предпочтительными  вл ютс  плазмиды pCZ112, pCZ154, pCZ154.3,

5 pCZ156,pCZ156.3,pASP2.3npASP2HTpaHC- форманты E. coli K12 RV308/pCZ112, E. col K12 RV3087pCZ154, Eo. coli K12 RV308/pCZ154.3, E. coli K12 RV308/pCZ156 ; E. coli K12 RV308/pCZ156.3,.E. coli K12

0 RV308/pASP2.3 и E.coli K12 RV308/pAP2.

Специалисты в данной области должны знать, что векторы экспрессии изобретени  используютс  дл  трансформации подход щих организмов-хоз ев, таких, чтобы произ5 водное бычьего гормона роста

окспрессировалось при использовании к стандартных условий ферментации. Продукт , экспрессированный в виде высоко гомогенной гранулы и. выделенный

0 рутинными методами из полученного с результате лизата клеток-хоз ев,  вл етс  полезным дл  повышени  молочной продуктивности и обычно дл  стимулировани  роста крупного рогатого скота. Способы

5 использовани , введени  и подход щие дозировки дл  крупного рогатого скота известны иописаны в Публикации Европейского патентного ведомства N 0085036, страницы 7-9, приведенной здесь

0 в качестве уровн  техники.-Следующие при- меры далее иллюстрируют изобретение, описанное здесь.

П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pf JM789B.

5 А. Конструирование плазмиды pKEN021 и ее фрагмента Xbal-BamHI.

В качестве исходного материала используют фрагмент 5,1 kb полученный путем Xbal-BamH расщеплени  плазмиды pKEN021(106 на фиг.З). Плазмида pKEN021

 вл етс  производной pKEN111 (101 на фиг.1) и далее описана у Ли с сотр., 1981, g Bact. 1.46:861-866иуЦвибел исотр,, 1981, J. Вас. 145: 654-656), котора  внесена в Е. coli CC620 (NRRL номер хранени  15011) и котора  имеет фрагмент примерно 2,8 kb, который содержит липопрстеиновый ген Е. coli. Описание этого фрагмента приведено НакамураиИноуе, 1979. Cell 18: 1109-1117. В pKEN021 последовательность из 650 пар оснований между единственными сайтами рестрикции EcoRI и Sail pB 322 была заменена последовательност ми, вз тыми из ли- попротеинового гена Е. coli. Последовательность липопротеинового гена (Накамура и Иноуе, 1979) включает фраг- мент462 пар оснований AI и I, идущий вверх от первого триплета (метионин) липопротеинового гена, который содержит промотор, 5 нётранслируемый участок и участок св зывани  рибосомы. Единственный сайт рестрикции Xbal локализован в сайте св зывани  рибосом 16 пар оснований перед метиониновым сигналом инициации трансл ции. Pvull сайт рестрикции, локализующий 105 пар оснований вверх от концевого кодона трансл ции структурального гева, был заменен нз сайт рестрикции BamHI при добавлении синтетического линкера ДНК (5 ССССАТССССЗ , полученного из-Коллаборатив Рисерч). Кодирующа  последовательность дл  последних тридцати п ти аминокислот липопротеина, сигнал окончани  трансл ций, и последовательность , соответствующа  3 нетранслируемо- му участку информационной РНК, следуют за BamHI сайтом. Плазмида pKEN021 также включает некоторые периферические по- следовательности 850 пар оснований; не относ щиес  к липопротеиновому гену и локализованные вниз от него в хромосоме Е.. coli. Эти последовательности включены как следствие способов и сайтов рестрикции ферментов, использованных при первоначальном выделении гена.

Ссыла сь на фиг.1, 2 и 3, плазмида pKEN021 получена из pKEN11 Т следующим образом: примерно 50 мкг рКЕМШ (101 на фиг.1) переваривают 25 ед. фермента рестрикции Hpall в 300 мкл буфера, содержащего 20 мМ Трис. HCI, рН 7,4, 10 мМ1ИдС 2 и 6 мМ / -меркаптоэтанола, при 37°С в течение 2 ч, Смесь дважды экстрагируют 300 мкл смеси 50:50 фенола и хлороформа и извлеченную водную фазу затем осаждают 2,5 объемами этанола и 0,1 объема ЗМ ацетата натри . Шарик ДНК раствор ют в 100 мкл электрофоретического буфера и фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле (акриламид: бис отношение равно 29:1 дл 

всех гелей, за исключением того, где отмечено ). Гель окрашивают в растворе, содержащем 0,5 мкг/мл этидинийбромида и визуализируют полосы при длинноволно- 5 вом ультрафиолетовом облучении.Изолируют полосу 950 пар оснований и извлекают из гел  электроэлюцией в мешок. После экстракции фенолом/СНС з и осаждени  эта- нолом извлеченную ДНК (приблизительно

0 2,5 мк) раствор ют в 25 мкл TEN (10 мМ NaCI, 10 мМ Трис. HCI, рН 7,4 и 1 мМ этилен- динитрилтетраацетата натри  (ЭДТА) рН 8.0).

Примерно 2 мкг фрагмента Hpall 950

5 пар оснований переваривают ферментом рестрикции Alu l в 200 мкл буфера, содержащего 50 мМ NaCI, 6 мМ Трис. HCI (рН 7,6), 6 мМ MgCl2 и 6 мМ Д-меркаптозтанола, в течение 2 ч при 37°С. ДНК фракционируют

0 на 6%-ном полиакриламидном геле и извлекают и очищают описанными ранее способами фрагмент Alul 462 пэр оснований. Фрагмент 462 пар оснований Alul (приблизительно 1 мкг) раствор ют в 10 мкл Т4 ДНК

5 лигазного буфера (66 мМ Трис. HCI, рН 7,6, 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотрейтола, 0,4 мМ АТР), содержащего 150 пикомолей фосфо- рилированного EcoRI линкера (S GGAATTCCS1 из Коллаборатив Рмсерч)и 2

0 ед. Т4 ДНК лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 4°С смесь нагревают 10 мин при 65°С и разбавл ют до 100 мкл добавлением EcoRI буфера (100 мМ Трис. HCI, рН 7,2, 50 мМ NaCI, TO мМ MgCla, 6 мМ / -мер5 каптоэтанола) и 40 ед. фермента EcoRI. После 2 ч при 37°С образец удобно экстрагируетс  фенолом ( и осаждаетс  этанолом. Затем ДНК раствор ют в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего

0 0,1 ед. Т4 ДНК лигазы и 0,1 мкг pBR322 (102 на фиг.1), которую затем линеаризуют EcoRi, а затем обрабатывают щелочной фос- фатазой. После лигации при 4°С в течение 16 ч полученную в результате ДНК исполь5 зуют., чтобы удобно трансформировать Е. , coli штамм К12 НВ101. Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 12 мкг/мл тетрациклина и изолируют плазмиды из устойчивых колоний путем 5ы0 строй щелочной экстракции, описанной у Бернбойма и Доли, 1979. Исследование нуклеиновых кислот 7: 1513:1523. Отбирают плазмиду (103 на фиг.1), содержащую 466 пар оснований фрагмента Xbal-BamHI, и ис5 пользуют в качестве исходного материала дл  следующей описанной стадии.

Около 2 мкг этой плазмиды (103 на фиг.2) переваривают 2 ед. фермента Hind III в 50 мл Hind HI буфера (60 мМ NaCI. 10 мМ

. HCI, рН 7,4. 10 мИ MgCl2 и 6 мМ

/3-меркаптоэтанола) в течение 1 ч при 37°С. После экстракции фенолом/СНС з и осаждени  этзнолом ДНК раствор ют в 200 мкл буфера, содержащего 300 мМ NaCI, 30 мМ ацетата натри , рН 4,25, 1 мМ ZnCte и 200 ед. SI нуклеазы (Майлс Лебораториз). После 1 ч при 15°С реакцию останавливают экстракцией фенолом/СНС1з и осаждением этанолом . Полученную в результате ДНК раствор ют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера , содержащего 20 пикомолей фосфори- лиров.анныхBamHI линкеров (5 CCGGATCCGG3 из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы. После 16 ч при 4°С реакционную смесь нагревают 10 мин при 65°С дл  инактивации лигазы, а затем разбавл ют до 100 мкл в BamHI буфере(150 мМ NaCI, 20 мМ Трис. HCI, рН 8,0,10 мМ MgCla, 6 мМ /J-меркаптоэтанола), содержащем 20 ед. фермента BamHI. После 2 ч при 37°С смесь очищают на 1%-ном агарозном геле. Гель окрашивают и извлекают элюцией больший фрагмент (примерно 4,5 kb) после охлаждени , а затем очищают экстракцией фенолом/СНС з и осаждением этанолом, Извлеченный фрагмент с BamHI липкими концами раствор ют в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 0,1 ед. Т4 ДНК лигазы. После 16 ч при 4°С используют ДНК дл  трансформации E. coli HB101. Трансформанты отбирают по устойчивости к ам- пициллину (Арг) при 100 мкг/мл и скринируют на чувствительность к 10 мкг/мл тетрациклина (Тс). Несколько плаз- мид, полученных по описанной ранее процедуре Вирнбойма, из колоний, которые  вл ютс  AprTcs, были исследованы на отсутствие Hindlll сайта и присутствие единственного BamHI сайта. Последовательный перевар EcoRI. Sail дает фрагмент 466 пар оснований и фрагмент 305 пар оснований. Отбирают плазмиду (104 на фиг.2) с этими характеристиками и затем модифицируют дл  превращени  EcoRI сайта, локализованного выше Ipp промотора, в Hind 111 сайт рестрикции.

Переваривают 2 мкг плазмиды (104 на фиг.2) в 100 мкл EcoRI буфера с 0,2 ед. EcoRI о течение 10 мин при.37°С. Реакцию останавливают нагреванием в течение 10 мин при 65°С, а затем после экстракции фено- лом/СНС з осаждают ДНК этанолом, раствор ют в 200 мкл SI нуклеазного буфера, содержащего 5 нуклеазу в количестве 1000 ед./мл и провод т реакцию при 12°С в течение 1 ч. Реакцию останавливают экстракцией фенолом/СНС1з и осаждением этзнолом. Полученную в результате ДНК ре- суспендируют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пикомолей фосфорилированного Hind III линкера (S CCAAGCTTGGS1 из Коллаборатив Рисерч) и 2 ед. Т4 ДНК лигазы. После 16 ч при 4°С смесь нагревают 10 мин при 65°С, разбавл ют до 150 мл в Hind III буфере, содержащем 10 ед. фермента Hind III, инкубируют 2 ч при 37°С, а затем фракционируют на 1%-ном агарозном геле. Самую большую полосу (эквивалентную единственному отрезку плазмиды) обычно извлекают и очищают , раствор ют в 20 мкл Т4 лигазного буфера, содержащего 0,2 ед. лигазы, инкубируют при 4°С в течение 16 ч, а затем используют при трансформации в Е. coll

5 НВ101. Отбирают трансформанты по устойчивости к ампициллину, изолированные плазмиды анализируют с помощью рестрмк- ционного ферментного анализа. Отбирают плазмиду (105 на фиг.2) с фрагментом EcoRI0 Hind 111 из 500 пар оснований и используют как вектор клонировани  дл  введени  3 участка Ipp гена.

Переваривают около 2 мкг плазмиды (105 на фиг.З) в 50 мкл буфера Sail рестрик5 Ции (150 мМ NaCI, 6 мМ Трис. HCI, рН 7,9, 6 мМ , 6 мМ / -меркаптоэтанола) с 2 ед. Sail в течение 1 ч при(370С, а затек; разбавл ют в 150 мкл буфера BamHI, содержащего 2 ед. BamHI. После 1ч при 37°С

0 прибавл ют 2,5 ед. щелочной фосфатазы и продолжают инкубирование в течение 1 ч при 65°С. Материал экстрагируют фенолом/ , осаждают этанолом, раствор ют в TEN и используют в качестве

5 клонирующего вектора дл  Ipp З -фрагмента. Дл  получени  фрагмента, содержащего область Ipp 3, переваривают 10 мкг pKEN III (101 на фиг.З) в 200 мкл Нра буфера (20 мМ KCI, 10 мМ Трис. HCI, рН 7,4, 10 мМ

0 MgCl2 и 6 мМ / -меркэптоэтанола) с 10 ед. Нра в-течение 2 ч при 37°С. После экстракции фенолом/СНС1зи осаждени  этанолом. раствор ют ДНК в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пикомолей фосфо5 рилированногоSail линкера (5 GGTCGACC3 из Коллаборатив Рисерч) и 2 единицы Т4 ДНК лигазы, а затем инкубируют 16 н при4°С. Лигазу инактивиру ютпри нагревании при 65°С в течение 10 мин. Пол- 0 ученный в результате мате риал разбавл ют в 100 мл.в Sail буфере, содержащем 10 ед. Sail, и инкубируют 1 ч при 37°С, затем разбавл ют в 300 мл в Pvull буфере (60 мМ NaCI, 6 .мМ Трис. HCI, 7,5, 6 мМ MgCl2, 6 мМ

5 /3-меркаптоэтанола), содержаа1ем 10 ед. ре- стриктивного фермента Pvulll. После 1 ч при 37°С ДНК фракционируют на 5%-ном поли- акриламидном геле. Извлекают примерно 0,5 мкг фрагмента 950 г.-ар оснований, очи- щаюти раствор ют вТЕ. Разбавл ютО,2 мкг

фрагмента в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера , содержащего 20 пикомолей фосфорили- рованногоBam HI линкера (5 CCGGATCCCG3, из Коллаборатив. Ри- серч) и 2 ед. Т 4 ДН К лигазы, а затем инкуби- руют 16 ч при 4°С. Полученную в результате ДНК затем нагревают в течение 10 мин при 65°С, разбавл ют в 100 мкл BamHI буфера, содержащего 20 ед. BamHI, инкубируют при 37°С в течение 2 ч, а затем фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле, чтобы удалить избыток линкерных молекул. Полученный в результате фрагмент 950 пар оснований , имеющий-BamHI и Sail липкие концы, очищают традиционным способом и раствор ют в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера , содержащего как 0,2 мкг клонирующего вектора, описанного ранее, и 0,2 ед. Т4 ДНК лигазы. После инкубировани  в течение 16 ч при 4°С используют ДНК дл транс- формации в Е. coli K12 НВ101. Получают плазмиды из устойчивых к ампициллину трансформантов и традиционно анализируют Sall-BamHI фрагмент. Описанную плаз- ми-ду (примерно 5,2 kb) обозначают PKEN021 (106 на фиг.З).

Переваривают Юмкг pKEN021. при37°С D 200 мкл Xbal/BamHI буфера (150 мМ NaCI, 10 мМ Трис. HCI, рН 8. 10 мМ MgCl2, 6 мМ / -меркаптоэтанола). использу  10 ед. BamHI, в течение 1 ч, затем 10 ед. Xbal в течение еще 1 ч при 37°С. Желаемую переваренную Xbal-BamHI ДНК затем обрабатывают 2.5 ед щелочной фосфатазы в течение 1,5 ч при 65°С экстрагируют фенолом /СИСЬ, собирают при осаждении этанолом и раствор ют в 50 мкл TEN дл  дальнейшего использовани  (107 на фиг.З).

Б. Конструирование плазмиды pNM575.

В качестве источника фрагмента ДНК, содержащего кодирующую последовательность дл  участка гена человеческого гормона ро ста используют плазмиду pt rpED50chGH800 (108 на фиг.4) описанную Мартиалом с сотр. 1979, Science 205:602- 607, Этот фрагмент также может быть сконструирован синтетически (Итакура с сотр. 1988-и Кри с сотр. 1978) или может быть получен с использованием известных методик , описанных Гудманом с сотр. 1979; Me- тоды в Энзимологии 68:75-90, путем выделени  мРНК, кодируюа ей человеческий гормон роста, из гипофиза человека. Участок гена человеческого гормона роста плазмиды ptrpED50chGH800 содержит единственный Smal сайт рестрикции 6 пар оснований ниже от кодона окончани  трансл ции гена. Этот сайт был заменен на сайт BamHI при использовании следующей процедуры: переваривают 6 мкг плазмиды 6 ед.

Smal в 200 мкл буфера Smal рестрикции (15 мМ Трис. HCI, рН 8,0, 6 мМ МдС1з. 16 мМ KCI и 6 мМ Д-меркаптоэтанола) в течение 1,5 ч при 37°С. После окончани  переваривани  провод т экстракции фенолом ( и извлекают ДНК осаждением этанолом, затем раствор ют ее в 24 мкл TEN, Прибавл ют 40 пикомолей фрагмента фосфорилированно- го BamHI адаптера (Коллаборатив Рисерч) к 0,5 мкг (0,2 пикомол  концов) переваренной выше плазмиды к 16 мкл лигазного буфера, содержащего 2 ед. Т4 ДНК лигазы. Смесь инкубируют 2 ч при 22°С, 16 ч при 4°С и затем 10 мин при 65°С. Генерируют BamHI липкие концы путем традиционного переваривани  ВатН рестрикционным ферментом . Фермент расщепл ет линкерную последовательность, а также BamHI сайт, локализованный у начала клонированной последовательности ДНК человеческого гормона роста. Это дает фрагмент 691 пар оснований с липкими BamHI концами, который выдел ют на 6%-ном полиакриламидном геле, а затем извлекают обычным способом. Извлеченный фрагмент ДНК ли- гируют (использу  0,2 ед. Т4 ДНК лигазы в 20 мкл буфера в описанных ранее услови х) с 0,2 мкг переваренной BamHI и обработанной щелочной фосфатазой рВ 322 (102 на фиг.4). После 16ч при4°С материал используют дл  трансформации с E.coli штамм JA221/NRRL NB-15014 по существу в соответствии с процедурой трансформации Вен- синка с сотр. 1974, Cell 3:315-325. Отбирают трансформанты на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, а затем изолируют обычным способом плазмиды и идентифицируют их с помощью анализа ре- стрикционными ферментами и гель-электрофореза . Желаемые плазмиды, обозначенные как pNM575 (109 на фиг.4), содержат BamHI фрагмент приблизительно 700 пар оснований, и амплифицируют их обычным способом дл  дальнейшего использовани .

В. Конструирование плазмиды pNM702.

Последовательность ДНК зрелого человеческого гормона роста содержит сайт РпиД11, который имеет 47 пар оснований от первого нуклеотида. Переваривают 25 мкг pNM-575 в 250 мкл BamHi буфера с 25 ед. BamHI при 37°С в течение 1 ч. Фрагмент591 пара оснований с BamHI липкими концами обычно выдел ют на 6%-ном полилакрила- мидном геле и очищают. После очистки фрагмента одну треть его (эквивалентную 8 кг плазмиды) переваривают в 100 мкл РпиД11 буфера (6 мМ NaCI, 6 мМ Трис. HCI, рН 7,4, 6 мМ MgCla, 6 мМ / -меркаптоэтано- ла)с2,5 ед. РпиД11 в течение 1,5 ч при37°С.

Используют электрофорез на 6%-ном полиакриламидном геле и стандартные процедуры изилочени  дл  выделени  фрагмента 538 пар оснований ДНК, содержащего кодирующую последовательность дл  последних 175 аминокислот гена после транслируемого стоп сигнала.

Фрагмент двуиитевой ДНК (110 на фиг.5) был синтезирован фосфотриэфирным методом дл  соединени  области Ipp промотора с участком, кодирующим человеческий гормон роста. Двунитевый фрагмент ДНК (110 на фиг.5) имеет следующую последовательность:

ZSXbjt 5 3

СТАОАСОСТЛГГАЛТЛЛТСЛТСССАТТССАЮАТСАТПАТЛАСТТСССАА- ТСССАТМТТЛТТАСАЛСССТААсёгАс ГАСТАСТАТГСАЛСССГГ30 ССЛТТСССТТЛТССЛССС7ТТГ1СЛСАЛСССТА1-ОСТССС 3 ССТЛЛГ.СГ.ЛАТАСОТСССАЛАААСТОТТССС-ЛТАССЛаСС S

Фрагмент б ыл получен известным фосфотриэфирным способом, по которому были получены следующие сегменты:

1.)CTACAGGGTAT

S 2)ТААТАЛТСТТСС

3)СЛТТССЛТСЛТ

4)GATGATAAGTTCC

5)САЛССАТТССС

6) TTATCCAGGC

LO 7)TTTTTGACAACG

О)CTATGCTCCG

9)СЛТТЛТТЛАТАСССТ

10)ЛТСССЛА :

11)СТТЛТСАТСЛТСАТССЛ «

15 12)GGTTGGGAA

13)GGATAAGGGAAT

14)GTCAAAAACCCT

15 )CGGAGCATAGCGTT

Использу  приготовленные выше сегменты провод т реакции соединени , катализируемые Т4 лигазой, как описано ниже:

1) Соедин ют 5 -нефосфорилировэнный сегмент 1 с 5 -фрсфорилированным сегментом 2 в присутствии 5 -фосфорилированного сегмента 9, использу  Т4 лигазу, дл  образовани  дуплекса 1 ДНК(Броун с сотр., 1979, Методы в Энзимологии 68:109-151). Дуплекс выдел ют с помощью препаратив- ного гель-электрофореза на 15%-ном поли- акриламидё,

2) Соедин ют 5 -фосфорилированный сегмент 3 с 5 -фосфорилированным сегментом А в присутствии 5 -фосфорилировзннэго

сегмента 11, использу  Т4 лигазу, дл  образовани  дуплекса 2 ДНК, который очищают с помощью электрофореза на 15%-ном полиакриламидном геле.

3) Соедин ют 5 -фосфорилированный сегмент 5 с5 -фосфорилировзнным сегментом 6 в присутствии 5 -фосфорилированных сегментов 12 и 13, использу  Т4 лигазу, дл  образовани  дуплекса 3 ДНК, который очи0 щают электрофорезом на 15%-ном полиак- риламидном геле.

4) Соедин ют 5 -фосфорилироианный сегмент 7 с 5 -фосфорилированным сегментом 8 в присутствии Б -фосфорилированного

5 сегмента 14 и 5 -нефосфорилированного сегмента 15, использу  Т лигазу, дл  образовани  дуплекса 4 ДНК, который очищают электрофорезом на 15%-ном полиакрила- мидном. геле.

0 5) Соедин ют вместе дуплексы ДНК 2, 3 и 4 с помощью Т4 пигазы дл  образовани  дуплекса ДНК 5, который очищают электрофорезом на 15%-ном полиакриламидном геле .

5 6) Прибавл ют 5 -фосфорилированный сегмент 10 и дуплекс 5 ДНК в присутствии Т4 лига зы к дуплексу 1 ДНК. Полученный в результате дуплекс ДНК (110 на фиг.5) очи: щают на 10%-ном полиакриламидном геле с

0 помощью электрофореза. Этот дуплекс ДНК затем зизиматически фосфорилируют, использу  Т4 полинуклеотид киназу и (у- 32Р/ЛТР по следующей установленной процедуре.

5Конструируют плазмиду экспрессии pNM702 с помощью ферментного присоединени  0.1 гшкомол  (0,4 мкг) Xbal-BamHt фрамгента- плазмиды pKEN021 (107 на фиг.5). 0,025 пикомолей. синтетического

0 фрагмента ДНК (110 на фиг.5) и 0,3 пикомолей (0,08 мкг) фрагмента 538 пар оснований (из 109 на фиг.5) в 24 мкл лигационного буфера , использу  1,5 ед. Т4 ДНК лигазы. После инкубировани  в течение 16 ч при 4°С

5 смесь используют дл  трансформации, в E.coli A211, как описано ранее. Отбирают трансформанты на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и культивируют обычным образом как

0 предпочтительный источник желаемой плазмиды экспрессии.

Определ ют экспрессию человеческого гормона роста по стандартной радиоимму- нологической процедуре (Твомей с сотр.,

5 1974 Ciin Chem 20:389-391) и определ ют наличие по крайней мере 2 миллионов молекул на клетку.

Д. Конструирование плазмиды pNM789.

Используют плазмиду PNM702 (111 на

фиг.б). плазмиду экспрессии гормона чело10

веческого роста, в качестве исходного материала дл  конструировани  плазмиды экспрессии Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp- A$p-Lys-6fP.

Используют плазмиду рВР348 (112 на фиг.6), описанную Миллером с сотр., 1980, J. Blol. Chem, 255:7521-7524. в качестве источника двух фрагментов ДНК, содержащих кодирующую последовательность участка гена бычьего гормона роста. Плазмида содержит 831 пар оснований последовательности , кодирующей бычий гормон роста, клонированной в Psjl сайт рестрикции рЕ|5322. В качестве альтернативы методу, описанному Миллером с сотр., 1980, после- 15 до|вательность бычьего гормона роста мо- жфт быть сконструирована синтетически (И|гакура с сотр., 1977, и Кри с сотр., 1978) же может быть также получена из информационной РНК, выделенной из бычьих 20 гипофизов по уже рутинным процедурам, описанным Гудманом с сотр., 1979.

Последовательности; кодирующие человеческий гОрмон роста, и бычий гормон роста,  вл ютс  очень похожими и показы- 25 вают много гомологии. Особенно полезными при конструировании плазмиды . экспрессии бычьего гормона роста  вл ютс  фрагменты, генерированные при переваривании рестрикционным ферментом Pvull. 30 Размер продуцированных фрагментов составл ет 497 пар оснований дл  человеческого гормона роста и 494 пар оснований дл  бычьего гормона роста, а соответствующие сайты рестрикции встречаютс  в одина- 35 ковых рамках считывани  в обеих последовательност х.

Частично переваривают 10 мкг pNM702 (111 на фиг.6) с помощью 1 ед, Pvull в 200 MKjn буфера Pvuf рестрикции (60 мМ NaCI, 6 40 мМ.Трис. НС.. р Н 7,5, 6 мМ М , 6 мМ /3- еркаптоэтанола) в течение 10 мин при 37°С. После этого реакцию останавливают нагреванием при 65°С в течение 10 мин, ДНКобрабатывают щелочной фосфатазой и 45 отдел ют фрагменты на 1%-ном агарозном геле. Линейный фрагмент ДНК (113 на фиг.6), размер которого соответствует ДНК с недостающим фрагментом Pvull 497 пар оснований (сери  опытов несколько быст- 50 рее, чем единственный разрез плазмиды), был вырезан очищен и использован при конструировании промежуточной плазмиды (114 на фиг.6).

Готов т фрагмент 494 пар оснований 55 Pvull плазмиды рВР348 путем переваривани  10 мкг плазмиды в200мкл Pvull буфера, содержащего 10 ед. Pvull в течение 1 ч при 37°С. Выдел ют фрагменты на 6%-ном по- лиакриламидном геле и визуализируют и

0

5

очищают обычным способом целевой фрагмент 494 пар оснований (из 112 на фиг.6).

Конструируют промежуточную плазмиду (1 14 на фиг.6) при взаимодействии 0,2 мкг плазмиды pNM702 Pvull фрагмента с 0,05 мкг фрагмента 494 пары оснований в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 2 ед. Т4 ДНК лигазы, в течение 16 ч при 4°С. После трансформации и отбора трансформантов на устойчивость к ампициллину плазмиды подвергают обычному анализу на наличие и четкую ориентацию Pvull фрагмента 494 пар оснований. Плазмиды с фрагментом Pvull 494 пары оснований и фрагментом Xbal-Smal 440 пар оснований отбирают дл  использовани  при дальнейшем конструировании.

Переваривают 10 мкг промежуточной плазмиды (114 на фиг.7) с помощью 1 ед, Pvull в 200 мкл Pvull буфера в течение 5 мин при 37°С. После нагревани  при 65°С.в течение 10 мин смесь нанос т на 1 %-ный ага- розный гель и извлекают линейную ДНК, имеющую только один Pvull разрез на молекулу , очищают ее. Этот извлеченный материал (приблизительно 3 мкг) полностью переваривают 5 ед. Xbal и обрабатывают щелочной фосфатазой. Фрагменты нанос т на 1 %-ный агарозный гель и извлекают самый большой фрагмент потер вший фрагмент 109 пар оснований между Xbal и первым сайтом Pvull у человеческого и бычьего гормона роста по традицией ной методике (1 15 на фиг.7).

Последовательность ДНК дл  первых 23 аминокислот (69 пар оснований) бычьего гормона роста до первого Pvull сайта содержит два-Hpall сайта рестрикции, первый из которых содержит 23 пары оснований от первого нуклеотида кодирующей последовательности . Фрагмент 63 пары оснований (116 на фиг.7) был синтезирован фосфорот- ризфирным методом. Этот фрагмент соответствует последовательности 19 пар оснований от Xbal сайта в сайте Ipp рибо- сомного св зывани  через АТС транслируемый старт-сигнал, после кодирующей последовательности дл  Phe-Pro-Leu-Asp- . Asp-Asp-Asp-Lys (24 пары оснований) и 20 нуклеотидов кодирующей последовательности бычьего гормона роста (от Ре до первого Hpall сайта). Фрагмент имеет следующую последовательность: Xbal

5 CTAGAGGGTATTAATAATGTTI I t t I -I I I I I I Г I I I I Г

,3 ТСССАТААТТАТТАСААСССATTGGATGATGATGATAAG- i i i i i i i i t i t I i t i i i i 10 GGGTAACCTACTACTACTATTC . TTCCCAGCCATGTCCTTGTC 3 ИИЁ.1 I

I I f 1 I I I I I I I I I t I Г ( t I

AAGGGTCGGTACAGGAACAGGC5

15 5

При получении фрагмента 63 пары осноаний готов т следующие дев ть сегментов:

1) CTAGAGGGTAT

2) TAATAATGTTCC 203) CATTGGATGAT 10

4) GATGATAAGTTCC

5) CAGCCATGTCCTTGTC

6) ATGGGAACATTATTAATACCCT

7) ТТАТСАТСАТСАТССА 258) ATGGCTGGGAAC 15

9) CGGACAAGGAC

Использу  приготовленные выше сегменты , осуществл ют реакции каталитического св зывани  Т4 лигазой, как описано выше:20

а) соедин ют 5 -нефосфорилированный сегмент 1 с 5 -фосфорилированным сегментом 2 в присутствии 5 -фосфорилированно- го сегмента б с использованием Т4 лигазы дл  образовани  дуплекса 1 ДНК, который 25 очищают электрофорезом на 15%-номполи- акриламидном геле;

б) соедин ет 5 -фосфорилированные сегменты 3, 4 и 5 в присутствии 5 -фосфори- лированных сегментов 7 и 8 и 5 -нефосфори- 30. лированного сегмента 9 с использованием Т4 лигазы дл  образовани  дуплекса 2 ДНК, который очищают электрофорезом на 15%- ном полиакриламидном геле;

в) соедин ют затем дуплексы 1 и 2 с 35 помощью Т4 лигазы дл  образовани  дуплекса ДНК (116 на фиг.7), который очищают электрофорезом на 15%-ном полиакрила-: мидном геле. Этот дуплекс ДНК затем фер- ментативно фосфорилируют, использу  Т4 40 полинуклеотид киназу и (у- Р/АТР в сост ветствии с установленной процедурой.

Фрагмент ДНК 46 пар оснований, который простираетс  от вышеуказанного Hpall сайта до Pvull сайта, может быть или скон- 45 струирован синтетически, или получен из первоначальной рВР348 плазмиды. Следовательно , переваривают 0,01 мкг плазмиды рВР348 в 400 мкл Pvull буфера с 50 единицами Pvul в течение 2 ч при 37°С. После 50 экстракции фенолом и осаждени  этанолом раствор ют ДНК в 400 мкл Pst буфера (50 мМ NaCI, 6 мМ Трис. HCif pH 7,4, 6 мМ MgCla, 6 мМ / -меркаптоэтанола) с 50 ед. pstl в течение 2 ч при37°С. Фрагменты ДНК 55 нанос т на 6%-ный полиакрилэмидный гель и извлекают фрагмент 135 пар оснований, содержащий желаемую последовательность 46 пар основамий. очищают его па

стандартным методикам. Одну треть извлеченной ДНК (эквивалентно 33 мкг) подвергают ограниченному перевариванию 1 ед. Hpail рестрикционного фермента в 100 мкл Hpall буфера (20 мМ Трис. HCI, рН 7,4, 7 мМ MgCla, 6 мМ,- /3-меркаптоэтанола) в течение 40 мин при 37°С. После нагревани  при 65°С в течение 10 мин фрагменты ДНК нанос т на 5%-ный акриламидный гель (акри- ламид:бис соотношение 19:1) вместе с маркером соответствующего размера. Желаемый фрагмент 46 пар оснований, полученный при частичном переваривании Hpall фрагмента в 135 пар оснований (из 112 на фиг.7), очищают по стандартным методикам .

Инкубируют 0,2 мкг Xbaj-Pvull фрагмент плазмидного вектора (115 на фиг.7), 3,2 пикомол  синтетического фрагмента 63 пары оснований (116 на фиг.7), и 0,5 пикомол  фрагмента 46 пар оснований (из 112 на фиг.7), в 10 мкл лигационного буфера с 2 ед. Т4 ДНК лигазы в течение 16 ч при 4°С. Ли- гационную смесь используют дл  трансформации E.coli JA221, и отбирают полученные трансформанты, которые содержат, следовательно , желаемую плазмид у pNM789, на устойчивость к ампициллину. Идентичность плазмиды pNM789 (117 на фиг.7) была подтверждена традиционным скринингом в присутствии обоих фрагментов 494 пары оснований Pvuli и 109 пар оснований Xbal- Pvjjll.

Д. Окончательное конструирование плазмиды pNM789B.

Дл  плазмиды pNM789 (117 на фиг.8) требуетс  изменение одного аминокислотного кодона дл  полного превращени  в бычий гормон роста. Это осуществл етс  при удалении фрагмента 28 пар оснований от Pvull до. BamHI в pNM789 и замене синтетическим двунйтевым фрагментом, имеющим следующую последовательность (118 на фиг.8):

5 С ТС- Т& С. С Т Т С Т А Сг

I I I I I | | | , |

э(Ј А С А С О G А А с / г С СТА &s,

Переваривают 10 мкг pl IM789 1 ед. Pvuil в 200 мкл Pvull буфера в течение 5 мин при 37°С, После нагрева при 65°С в течение 10 мин смесь-разбавл ют в 300 мкл добавлением BamHI буфера, переваривают полностью 10 ед. BamHI в течение 1 ч при 37°С, обрабатывают 5 ед. щелочной фосфатазы и инкубируют 1 ч при 65°С. Выдел ют фрагменты ДНК на 1%-ном агарозном геле и традиционным образом очищают фрагмент ДНК(119 на фиг.8), примерно соответствую- щиГ; по размеру плазмиде pNM789 с единстоенным разрезом. Лигируют 0,2 мкг этого фрагмента 5 пикомол ми синтетического фрагмента с использованием 2 ед. Т4 лига- эы в 20 мкл лигазного буфера. Лигацию про- врд т в течение ночи при 4°С. После трансформации выдел ют несколько плаз- мйд и скринируют их на соответствующие фрагменты Pvull (494 пары оснований) и Xtyal-BamHI (628 пар оснований). Плазмиды, содержащие указанные выше фрагменты, составл ют желаемую плазмиду pNM789B (120нафиг.8).

П р им е р 2. Конструирование плазмиды pCZ101 и E.coli K12 RV308/pCZ101. ; А. выделение плазмиды рШ-1 -АЗ.

Культивируют бактерии E.coli K12/p1 M-. Г-АЗ (NRRL № В-15733) в ТД-бульоне (1% трмптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% хлористого натри , рН 7,4) с 50 мкг/мл канамицина при 25°С в соответствии с традиционными микробиологическими процедурами . Затем культуру разбавл ют в соотношении 1:10 свежим бульоном и после 3 4 инкубации при 37°С около 0,5 мл культу- ры перенос т в трубку Эппендорфа 1,5 мл и центрифугируют примерно 15 с. Если нет других указаний, все манипул ции провод тс  при комнатной температуре. Полученный в .результате надосадочный слой осторожно удал ют аспиратором с тонким наконечником, и повторно суспендируют клеточный шарик примерно п 100 мкл свежеприготовленного раствора лизбцима (2 мг/мл), который содержит 2 мг/мл лизоци- ма, 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА (диамино- тетраацетата) и 25 мМ Трис. HCI, рН 8. Прибавл ют примерно 200 мкл щелочного раствора 505(додецилсульфата натри ) (0,2 н. NaOH, 1% SDS), трубку осторожно пере- воЬачивают и затем хран т при 0°С до тех пор, пока не закончитс  лизис (примерно 5 ми-н). Затем прибавл ют примерно 150 мкл З.М ацетата натри  и содержимое трубки осторожно перемешивают переворачиванием в течение нескольких секунд.

Трубку выдерживают при 0°С по крайней мере 60 мин, а затем центрифугируют 15 мин дл  получени  почти прозрачного надосадочного сло . Надосадочный слой. перенос т во вторую трубку дл  центрифугировани , в которую добавл ют 3 обьема холодного 100%-ногоэтанола. Затем трубку на 5 мин помещают на сухой лед-этанол, полученный в результате осадок собирают центрифугированием (5 мин), а надосздоч- ный слой удал ют отсасыванием. Собранный шарик раствор ют в 100 мкл ТЕ (10 мМ Трис HCI, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), он представл ет собой желаемую плазмиду р1М-1 -АЗ ДНК. .

Б. Xbal-BamH переваривание плазмиды pNM789B и генераци  фрагмента примерно 0,6 kb Xbal-BamHI фрагмента.

Инкубируют примерно 5 мкг плазмиды 5 pNM789B ДНК в 50 мкл солевого буфера с 10 ед. каждого из рестрикционных ферментов BamHI и Xbal при 37°С в течение 1 ч. После добавлени  5 мкл ЗМ ацетата натри  при рН 7,0 осаждают ДНК добавлением 2

0 объемов 100%-ного этанола. Целевой перевар ДНК раствор ют в 100 мкл ТЕ буфера и хран т при 0°С дл  дальнейшего использовани .

Солевой буфер обычно следующего со5 става:

100 мМ NaCI, 20 мМ Трис. HD, рН 8,0, 10 мМ MgCla, 5 мМ/3-меркаптоэтанола.

В. Xbal-BamHI переваривание плазмиды рШ-1 -АЗ.

0 Желаемое переваривание осуществл ют по существу в соответствии с методикой примера 2,В, с тем исключением, что ис- . пользуют плазмиду р1М-Г-АЗ вместо плазмиды pNM789B, Раствор ют .целевую ДНК

5 примерно в 100 мкл ТЕ буфера и хран т при 0°С дл  дальнейшего использовани , Г. Лигирование и трансформаци . Инкубируют примерно 1 мкг перевара плазмиды рШ-Г-АЗ, 1 мкг перевара плаз0 миды pl IM789B Xbal-BamHI, 40 мкг воды, 5

мкл (5 мМ) АТР, 5 мкл лигационной смеси и

. 5 ед. Т4 ДНК лигазы при 20°С о течение

примерно 2 ч. . Лигационна  смесь может

быть приготовлена в следующем составе:

5 500 мМ Трис. HCI, рН 7,8,200мМ дитиотрей- тола, 100 мМ MgCl2. После инкубировани  в течение 2 мин при 65°С и последующего охлаждени  на льду полученную лигацион- ную смесь используют дл  трансформации

0 по существу в соответствии, с методикой трансформации Венсинка, 1974, Celi 3:315, E.coli K12 RV308 на ТД пластинах (1 % трип- тона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% хлористого натри , 1,5% агара, рН 7,4),

5 содержащих 50 мкг/мл кзнзмицина. Бакте- - риальный штамм E.coli K12 RV308 был депонирован и  вл етс  частью посто нно хран щейс  коллекции культур Северной региональной исследовательской лаборато0 рии, Пеори , Иллинойс, из которой он  вл етс  доступным дл  публики под регистрационным номером NRRL-B-15624. Некоторые из полученных в результате трансформантов, как показано электрофо5 резом на агарозном геле (Мзнийтис с сотр. 1982) и с помощью других тестов, содержат только целевую плазмиду примерно 10,8kb. Такой трансформант здесь обозначен как E.coli K12 RV308/PVC101, его отбирают, помещают на ТД агаровые пластины, содержащие соответствующие антибиотики, а затем культивируют, использу  традиционные микробиологические методики. Полученные в результате клетки используют дл  выделени  плазмиды pCZ101 по существу в соответствии с процедурой примера 2,А.

П р и м е р 3. Конструирование плазмиды pCZ1920u E.coli K12 RV308/pCZ1920.

А. Конструирование фрагмента BamHI- Xbal около 10,2 kb плазмиды pCZ1920.

Целевой фрагмент был сконструирован по существу в соответствии с мотодикой примера 2,Б, с тем исключением, что использовали плазмиду pCZ101, а не плазми- ду pNM789B, Целевые рестрикцмонные фрагменты BamHI-Xba примерно 10,2 kb традиционным образом отдел ют и выдел ют электрофорезом на агарозном геле (Ма- ниатис с сотр., 1982), а затем раствор ют примерно в 100 мкл ТЕ-буфера и хран т при 0°С дл  дальнейшего использовани .

Б, Конструирование фрагмента BamHI- HgiA примерно 0,6 kb плазмиды pCZ101.

.Целевой фрагмент был сконструирован по существу в соответствии с методикой примера 2,Б, с тем исключением, что были использованы плазмиды pCZ101 и рестрик- ционный фермент HgiAl вместо плазмиды pNM789B и рестрикционного фермента Xbal. Целевые фрагменты рестрикции BamHl-HgiAl примерно 0,6 kb были традиционным образом отделены и выделены электрофорезом на агарозном геле (Маниа- тис с сотр. 1982), а затем растворены в примерно 100 мкл ТЕ-буфера и хранились при 0°С дл  дальнейшего использовани .

В. Конструирование линкерной последовательности ДНК.

51 CTAGAGGGTATTAATA АТС ТТТ ССА ССС ATG ОСТ СТА TCI GGT Э ТСССАТЛЛГТАТ ТЛС АДА GGT CGC TAG COA CAT A JA CCA 20СТП ТТТ GCC ААС GCT GTGCT З1   GAC ААА CGG TTG CGA С. 5

Целева  линкерна  последовательность была синтезирована удобным образомпо модифицированной фосфотриэфирной методике по существу в соответствии с методикой Итакура с сотр. 1977 и Кри с сотр. 1789. Вышеупом нутый способ синтеза также специально иллюстрирован в примере 1,

Г. Лигирование и трансформаци .

Лигируют примерно 20:пикомолей линкера ДНК примера 3В, 1 мкг фрагмента BamHl-HgiAl примерно 0,6 kb плазмиды pCZ101, а полученную в результате плазмиду используют дл  трансформации :E. К12 RV308 по существу в соответствии с методикой примера 2Г.

Некоторые из полученных в результате трансформантов, как удобно показано электрофорезом на агарозном геле (Маниатис с сотр., 1982) и другими тестами, содержат

только целевую плазмиду примерно 10,8 kb. Такие траисформанты, обозначенные здесь как E.coli K12 RV308/pCZ1920, отбирают, нанос т на пластины с ТД-агэром, содержащие соответствующие антибиотики, а затем

культивируют, использу  традиционные микробиологические методики, Полученные в результате клетки показывают при SDS - гель-электрофореза, RIА и других тестах экспрессию вышеупом нутого MET-LYS-CLYASPN-SER-MET-ALA-бГР производного на высоких уровн х. Поскольку плазмида pCZ1920 содержит термоиндуцируемый репликой неконтролируемого роста, максимальна  экспресси  желаемого продукта

производного 6ГР происходит при культивировании при температурах около 37°С.

П р и м е р 4, Конструирование плазмиды pJRI и E.coli K12 RV308/pJRI.

Получают желаемые конструкции по существу в соответствии с методикой примера 3, с тем исключением, что линкерна  последовательность примера 3,В была заменена на линкерную последовательность ДНК:

S CTAGAGGGTAITAATA АТС Р.ААCGG ДАТ ТСТ AtG ССС Т7С ССА GCC

3 ТСССАГААГГАТ ТАС ТТТССС ТТЛ АСА ТЛС CGG GGI CGG

ATG ТСС TTG ТСС GGC СТС. ТТТGCC АЛС GCT CTGCT 3

ТАС АСС-, АЛС ACG CCG GAC АЛАCGG ТТС ССЛ С 5 .

Определенна  выше линкерна  последовательность может быть сконструирована по существу в.соответствии с традиционной методикой Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр. 1978. Вышеупом нутый способ синтеза также специально проиллюстрирован в

примере 1.

Целевые трансформанты, обозначенные здесь как E.coli K12 RV308/pJRI, помещают на ТД агаровые пластины, содержащие соответствующие антибиотики , а затем культивируют обычным образом дл  последующего продуцировани  и выделени  плазмиды pJRI. Трансформанты также были показаны SDS-гель-электро- форезом, R1A и другими тестами, дл 

экспрессии вышеопределеиного производного MET-PHE-PRO-ALA-VET-ALA-R2 бычьего гормона роста. Поскольку плазмида pJRI содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальна 

экспресси  целевого продукта производного 6ГР происходит при культивировании при температуре около 37°С.

П р и м е р 5. Конструирование плазмиды рН17Д4Д1. ;

Частична  схема конструировани  плазмиды РН17 Л4Д1 представлена на фиг.15.

А. Конструирование плазмиды pBRHtrp.

Плазмида pGMl несет E.coli триптофа- 5 новый оперон, содержащий делецию ALE1413 (Миоззари с сотр. 1798, J. Bacteriology, 1457-1466) и, следовательно, экспрессирует плавленный протеин, состо щий из первых 6 аминокислот trp лидера и ю приблизительно последней трети trp E пол- ипептидз (здесь далее упоминаетс  вместе ка|к LE }, а также trp D полипептид целиком, все под контролем системы trp промотор- оператор. E.coli K12 W3110-tna 2trp- 15 A102/pGMI был депонирован в Американской коллекции типов культур (АТСС № 31622), a pGMl может быть удобно удалена из штамма дл  использовани  в описанных ниже процедурах.20

Примерно 20 мкг плазмиды переваривают рестрикционным ферментом Pvull, который расщепл ет плазмиду в п ти сайтах. Фрагменты генов затем объедин ют EcoRI линкерами (состо щими из самокомплемен- 25 тарного олигонуклеотида последовательности: pCATGAATTCATG). обеспечива  EcoRI сайт расщеплени  дл  последующего кло- нировани  в плазмиду, содержащую EcoRI сайт. Обр абатывают 20 мкг фрагментов 30 ДНК, полученных из pGMl, 10 ед. Т4 ДНК лигазы в присутствии 200 пикомолей 5 -фос- фарилированного синтетического нуклеоти- да pCATGAATTCATG и в 20 мкл Т4 ДНК лигазного1 буфера (20 мМ Трис, рН 7,6, 0,5 35 мМ АТР, 10 мМ MgCla, 5 мМ дитиотрейтола) при 4°С в течение ночи. Затем раствор нагревают в течение 10 мин при 70°С дл  остановки лигации. Линкеры расщепл ют перевариванием EcoRI u раздел ют фраг- 40 менты, имеющие теперь EcoRI концы, использу  электрофорез на 5%-ном полиакриламидном геле (ЭПАГ). Выдел ют три самых больших фрагмента из гел , сначала окрашива  этидинийбромидом, а за- 45 тем локализу  фрагменты в ультрафиолетовом свете и выреза  из гел  интересующие участки, Каждый фрагмент гел  с 300 мк.п 0,1хТЕВ помещают в ванну л  диализа и подвергают электрофорезу 50 при 100 в в течение 1 ч в 0,1хТВЕ буфере ТВЕ буфер содержит: 10,8 г Трис основани , 5,5 г борной кислоты, 0,09 г №2 ЭДТА в 1 л воды). Собирают водный раствор из иализной ванны, экстрагируют фенолом, 55 кстрагируют хлороформом, и делают его ,2 М по отношению к хлористому натр ию. атем извлекают ДНК из воды после осажени  этанолом. Фрагменты, содержащие rp промотор/оператор с EcoRi липкими

концами, были дентифицированы путем вставки чувствительной к тетрациклину плазмиды, котора  при вставке промотор/оператор становитс  устойчивой к тетрациклину . Все операции выделени  фрагмента ДНК, описанные здесь и далее в этом примере, осуществл ютс  с использованием ЭПАГ с последующей электроэлю- цией по описанному выше способу.

Б, Конструирование плазмиды pBRH trp, экспрессирующей устойчивость к тетрациклину под контролем trp промотора/оператора , и идентификаци  и амплификаци  фрагмента ДНК содержащего trp промотор/оператор , выделенного в А выше.

Плазмида pBRH1 (Родригес с сотр. 1979, Исследование нуклеиновых кислот 6, 3267-3287 и АТСС № 37070) экспрессирует устойчивость к ампициллину и содержит ген устойчивости к тетрациклину, но не будучи ассоциированной с промотором, не экспрессирует такую устойчивость. Клетки, содержащие плазмиду, следовательно,  вл ютс  чувствительными к тетрациклину. При введении системы промотор/оператор в сайт EcoRI плазмида будет экспрессиро- вать устойчивость к тетрациклину.

Плазмиду pBRHI переваривают EcoRI. Фермент удал ют экстракцией фенолом с последующей экстракцией хлороформом, затем ДНК повторно суспендируют в воде после осаждени  этанолом, Полученную в результате ДНК в отдельных реакционных смес х объедин ют с каждым из трех фрагментов ДНК, полученных в примере 5,А, и лигируют Т4 ДНК лигазой, как описано выше . Имеющуюс  ДНК в реакционной смеси используют дл  трансформации компетентного E.coli K12 293/NRRLB-15G25/ по стандартным методикам (Хершфилд с сотр. 1974, Proc. Nat. Acad. Set. USA 71:3455-3459) .затем бактерии помещают на LB-пластины (Ма- ниатис с сотр.,1982), содержащие 20 мкг/мл ампициллина и 5 мкг/мл тетрациклина.

Отбирают несколько устойчивых к тетрациклину колоний и выдел ют плазмиду ДНК, обозначенную pBRH trp. Наличие желаемого фрагмента подтверждаетс  фер- ментным рестрикционным анализом. Плазмида pBRHIrp экспрессирует Д-лакта- мазу, придающую устойчивость к ампициллину , и содержит фрагмент ДНК, который включает trp-промотор/оператор. Фрагмент ДНК также кодирует первый протеин (обозначенный LE ), состо щий из расплава первых шести аминокислот trp лидера и приблизительно последнюю треть trpE пол- ипептида, второй протеин (обозначенный Д ), соответствующий приблизительно первой половине trp Д полипептида. и третий

протеин, кодируемый, геном устойчивости к тетрациклину.

В. Конструирование плазмиды pSOM7 Д2.

Плазмиду pBRH trp переваривают ре- стрикционным ферментом EcoRI и полученный в результате фрагмент, выделенный ЭПАГ -и электроэлюцией, объедин ют с плазмидой pSOM11, переваренной EcoRI (Итакура с сотр., 1977, 198:1056, патент США № 4 366 246, патент Великобритании № 2 007 676А). Смесь лигируют Т4 ДИК ли- гззойи полученную в результате ДНКтранс- формируют n E.coll E12 294, как описано ранее. Трансформированные бактерии отбирают на пластинах, содержащих ампи- циллим, а полученные в результате устойчивые к ампициллину колонии подвергают скринингу гибридизацией колоний (Грюнштейн с сотр. 1975 Procc. Nat. Acad. Sci. USA 72:3951-3965). Фрагмент, содержащий trp промотор-оператор, выделенный из pBRH trp, а затем радиоактивно меченый 32Р,-используют в качестве зонда в описанной выше процедуре. Было показано, что некоторые колонии  вл ютс  положительными к гибридизации колоний и были отобраны . Изолируют плазмиду ДНК и определ ют ориентацию оставленных фрагментов с помощью рестрикционного анализа , использу  в двойном переваре ферменты Bglll и BamHi. Колонии, содержащие желаемую плазмиду с фрагментом trp промотор/оператор в точной ориентации, были выращены на LB среде, содержащей 10 мкг/мл ампициллина. Желаемую плазмиду обозначали pSOMT Д2 и используют дл  последующих конструировании, описанных выше.. . Г. Конструирование плазмиды ptrp24. 1. Конструирование фрагмента гена,Кодирующего дистальные области LE пол- ипептида с сайтами рестрикции Bglfl и BamHI соответственно на 5 и 3 концах кодирующего т жа.

Плазмиду pSOM7 Д2 переваривают Hind III.после переваривани  л мбда экзо- нуклеазой (5 до 3 экзонуютеаза) в услови х, выбранных таким образом, чтобы переварить выше сайта рестрикции Bglll в LE , кодирующем участке. Раствор ют примерно 20 мкг Hind HI переваренной pSOM7 A2 га буфере(20 мМ глициновогб буфера, рН 9,6, 1 мМ MgCl2, 1 мМ /3-меркаптозтанола), Полученную смесь обрабатывают 5 ед. л мбда экзонуклеазы в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем полученную греак- ционную смесь экстрагируют фенолом, экстрагируют хлороформом и осаждают эта4- нолом.

Дл  создани  EcoRI остатка на дисталь- ном конце фрагмента LE гена синтезируют преймер32рССТСТССАТСАТ по усовершенствованному фосфотриэфирному методу

(Крис сотр., 1978) и гибридизируютнзодно- т жевом конце фрагмента LE гена, полученного при переваре л мбда экзонуклеазой. Гибридизацию осуществл ют при растворении 20 мкг обработанного л мбда экзонуклеазой продукта перевара Hind lit плазмиды pSOM7 Л2 в 20 мкл воды и объединени  с 6 мкл раствора, содержащего приблизительно 80 пикомолей 5 -фосфорилированного олигонуклеотида, описанного выше. Синтетический фрагмент гибридизуют к З -концу LE кодирующей последовательности, а оставшуюс  часть LE1 фрагмента наполн ют полимеразой Клейноу 1, использу  dATP,

dTTP, dGTP и dCTP. Полимераза Клейноу 1

представл ет собой фрагмент, полученный протеолитическим расщеплением ДНК пол- имеразы 1. Он содержит 5 полимеризу- ющуюактивность, 3 экзонуклеотическую активность, но не 5

экзонуклеотическую активность родительского фермента (Корнберг, 1974, W.H. Freeman and Со, 98).

Реакционную смесь нагревают до 50°С и медленно охлаждают, до 10°С, после чего

прибавл ют 4 мкл фермента Клейноу. После 15 мин инкубировани  при комнатной температуре , последующего инкубировани  о течение 30 мин при 37° прекращают реакцию добавлением 5 мкл 0,25 мол рной ЭДТА . Реакционную смесь экстрагируют

фенолом, экстрагируют хлороформом,

.осаждают этанолом. ДНК последовательно

расщепл ют рестрикционным ферментом

Bgl I и раздел ют фрагменты с помощью

ЭПАГ. Ауторадиограмма получена дл  выде- .ленного из гел  Р-меченого фрагмента ожидаемой длины приблизительно 470 пар оснований, его извлекают электроэлюцией, Как отмечалось, это фрагмент LE (d) имеет

терминал Bgl И и тупой конец, совпадающий с началом праймера.

2. Конструирование плазмиды рТ1ш1. Конструируют плазмиду pTh оЛ путем . вставки синтезированного гена дл  тимозина альфа 1 в плазмиду pBR322. Синтез ДНК, кодирующей типозин альфа 1, включает синтез и последующую лигацию 16 нуклео- тидов(Тт доТте), что указано направл ющей стрелкой на фиг.11. Вставл ют met ATG в

5 N-терминал и 5 -концы были сконструированы с однот жевым липким концом дл  облегчени  присоединени  к плазмидам, расщепленным EcoRI и BamHi. Как быть легко оценено, Bglll сайт в центре гена

способствует анализу рекомбинантных плазмид.

Олигодеоксирибонуклеотиды от Ti по Tie были синтезированы по модифицированному фосфотриэфирному методу Итаку- ра с сотр., 1977, и Кри с сотр., 1978. Различные Олигодеоксирибонуклеотиды показаны в табл.1.

Приведенный выше синтез  вл етс  типичным при следовании процедуре дл  фрагмента Tis, как суммировано на фиг.12. Различные нуклеотидные фрагменты, которые использованы при синтезе Tis, обозначены номерами на фиг.12. Использованные сокращени   вл ютс  следующими: ТР Те, 2,4,6-триизопролилбензолсульфонилтетра- зол; BSA, бензолсульфокислота ТСХ, тонкослойна  хроматографи ; HPLC, высокоэффективна  жидкостна  хроматографи ; ДМТ 4,4 -диметокситритил; Се, 2-цианоэ- тил; R, n-хлорфенил; Bz, бензоил; An, анизо- ил; iBu, изобутил; Ру, пиридин; АсОН, уксусна  кислота, EtaN, триэтиламин.

Деблокируют полностью защищенные тридеоксирибонуклеотиды 4 (85 мг, 0,05 мо- п ) и 2 (180 мг, 0,1 ммол ) у 5 -гидроксилов Путем обработки 2% ВАЗ в смеси.хлороформ/метанол 7:3 по объему (10 и 20 мл соответственно) в течение.10 мин при 0°С. Останавливают реакции добавлением насыщенного водного раствора бикарбоната аммони  (2 мл), экстрагируют 25 мл хлороформа и промывают водой 2 раза по 10 мл. Органические слои сушат над сульфатом магни , концентрируют до малого объема (около 5 .мл) и осаждают добавлением петролейного эфира (фракци  35-60°С). Бесцветные осадки собирают центрифугированием и сушат в эксикаторе в вакууме, получают 6 и 8 соответственно, каждый гомогенен при ТСХ на силикагелз (Мерк 60 F2.54, хлороформ/метанол, 9:1).

Превращают тримеры 1 и 3 (270 мг, 0,15 ммол , 145 мг, 0,075 ммол ) в.их фосфодиэ- фиры (5 и 7) путем обработки смесью триэ- тиламин/пиридин/вода/1:3:1, объем/объем, 10 мл/ в течение 25 мин при комнатной температуре. Удал ют реагенты на роторном испарителе и высушивают остатки при повторном испарении безводного пиридина (3x10 мл). Объедин ют трймер 8 (0,05 ммол ) и трймер 7 с ТР Те (50 мг, 0,15 ммол ) в 3 мл безводного пиридина, реакционную смесь оставл ют в вакууме при комнатной температуре на 2 ч. Анализ ТСХ показывает, что 95% тримера 8 превращаетс  в гексамерный продукт (визуализиро- вано при детекции ДМТ группы при обрызгивании 10%-ной водной серной кислотой и нагревании при 60°С). Реакцию закаливают при добавлении 1 мл воды, растворитель выпаривают в вакууме. После удалени  пиридина, испар ющегос  совместно с толуолом, деблокируют гексамер в 5 поло- 5 жении с помощью 8 мл 2%-ной BSA, как описано выше дл  тримеров 4 и 2. Продукт 10 очищают на колонке с силикагелем (Мерк 60 Н, 3,5 х 5 см) при элюировании хлороформом/метанолом с градиентом от 98:2 до 95:5

10 по объему. Фракции, содержащие продукт 10.выпаривают досуха. Подобным образом трймер 5 сочетают с б и очищают полностью защищенный продукт непосредственно на силикагеле. Это последнее соединение бы15 ло деблокировано с З -конца смесью триэти- ламин/пиридин/вода, как описано ранее, дл  получени  фрагмента 9.

Наконец, сочетают гексамеры 9 и 10 в 2 мл безводного пиридина с ТР Те (75 мг,

0 0,225 ммол ) в качестве конденсирующего агента. По окончании реакции (4 ч при комнатной температуре) смесь выпаривают на роторном испарителе, остаток хроматогра- фируют на силикагеле. Получают 160 мг про5 дукта 11 при осаждении петролейным эфиром, который оказалс  гомогенным по дачным ТСХ. Полностью деблокируют часть (20 мг) соединени  11 в 0,5 мл пиридина при обработке 7 мл концентрированной гидро0 окиси аммони  (8 ч при 60°С) и последующей обработке в течение 15 мин 80%-ной уксусной кислотой при комнатной температуре . После выпаривани  уксусной кислоты твердый остаток растрор ют в 4 мл 4%-ной

5 гидроокиси аммони  и экстрагируют 3 х 2 мл этилового эфира. Водную фазу концентрируют до 1-2 мл и часть нанос т на HPLC дл  очистки 12. Объедин ют фракции, соответствующие основному пику (примерно 2 А25-5

0 единицы)и концентрируют до примерно 5 мл. Обессоливают конечный продукт 12 на Вио-геле Р-2 (1,5 х 100 см) при злюции 20%-ным водным этанолом, отгон ют растворитель при пониженном давлении

5 досуха и снова суспендируют в 20 мкл воды, получают раствор А254 10. Подтверждают последовательность 12 двумерным анализом последовательности. Полный типозин альфа 1 ген был собран

0 из 16 синтетических олигонуклеотидов по описанным ранее методам, детализированным дл  соматостатина (Итакурэ с сотр., 1977), инсулина (Гоеддел с сотр., 1979) и гормона роста (Гоеддел с сотр., 1979,

5 281:544). Олигонуклеотиды Т2 по Tis в количеств по 10 мкгбыли количественно фосфо- рилированы (-р32/-АТР/Нью Ингленд Нюклеар) в присутствии Т4 полинуклеотид киказы (Гоеддел с сотр., 1979), чтобы пол- учить определенные активности прмблизитед1|ьно 1 кюри/ммоль. Радиомеченные фрагменты были очищены электрофорезом Интеле 20%, полиакриламида/7М мочеви- (ны, последовательности элюированных фрагментов были подтверждены двумер- ным электрофорезом/гомохроматографией (Джей с сотр., 1974 Nucleic Acids Res,1:331) частичных переваров змеиным  дом. Фрагментов Т.1 и Tie были оставлены нефосфори- лированными дл  сведени  к минимуму нежелательной полимеризации во врем  последующих реакций лигировани . По 2 мкг каждого из этих нуклеотидов объедин ют в четыре группы из четырех фрагментов (см, фиг. 13)с помощью Т4 ДНК лигазы, ис- пользованной в опубликованных процедурах (Гоеддел с сотр., 1979). Продукты реакции очищают гель-электрофорезом на 15%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевины (Мэксам и Джилберт, 1977, Proc. Nat, Acad. Sci. USA 71:3455). Четыре выделенных продукта были лигирова- ны вместе и реакционную смесь раздел ют электрофорезом на 10%-ном полиакрила- мидком геле. При таком интервале разме- ров электроэлюируетс  ДНК гена тимозина альфа 1 (90-105 пар оснований).

Обрабатывают плазмиду рВ 322 (0,5 мкг) BamHI и EcoRI рестрикциоиными эндо- нуклеазами и раздел ют фрагменты элект- рофорезом на полиакриламидном геле. Извлекают большой фрагмент из гел  элек- троэлюцией и последовательно лигируют дл  получени  объединенной синтетической ДНК(Гоеделл и др.. Nature 281:544, 1979). Эту смесь используют дл  трансформации E.coli К12 294. Помещают 5% трансформи- рованной смеси на LB пластины. Содержа- щие 20 мкг/мл ампициллйна. Четыре полученные устойчивые к ампициллину ко- лонии  вл ютс  чувствительными к тетрациклину , предполага  вставку в ген устойчивости к тетрациклину. Анализ плаз- мид из этих четырех колоний показал, что в каждом случае плазмида, обозначенна  pTha Т, содержит сайт Bglll. не найденный в самой pBR322, следовательно, указывает на наличие гена тимозин а ьфа 1, как показано на фиг.11, и фрагмент приблизительно 105 пар оснований, генерированный при расщеплении BamHI/EcoRI. Рутиноэ конструирование плазмиды pTh «1 (Не выт нута в масштабе) представлено на фиг. 13, где толстые точки указывают 5 -фосфатные группы.

3. Реакци  обработанной pTh «1 и LE (d) фрагмента.

Плазмида pTh a содержит ген, определ ющий устойчивость к ампициллину. и структуральный ген, определ ющий тимо- зин альфа«1, клонированный в его 5 кодирующий т жевый конец в сайте EcoRI и в его З -конец в BamHI .сайте. Тимозиновый ген содержит также Bgl II сайт. Дл  создани  плазмиды, способной прин ть LE (cl) фрагмент , полученный выше, pThAi переваривают EcoRI,r затем провод т реакцию прлимеразы Клейноу 1 с dTTP и dATP дл  тупых остатков EcoRI. Bg II переваривание полученного в результате продукта создает линейный фрагмент ДНК, содержащий ген устойчивости к ампициллину, а на его противоположных концах липкий Bgl II остаток и тупой конец. Полученный о результате продукт может, быть рециркулирован при взаимодействии с LE (d) фрагментом, содержащим Bgl II липкий конец и тупой конец, в присутствии Т4 лигазы дл  .образовани  плазмиды ptrp24. Действу  таким образом, повторно создаетс  сайт EcoRI в положении , где имеетс  тупой конец лигации.

Д, Конструирование плазмиды рЗОМ7А2Д4.

Последовательное переваривание ptrp24 Bgl И и EcoRI и проведение затем ЭПАП и злектроэлюции дает фрагмент, имеющий кодоны дл  LE (d) полипептида с Bgl II липким концом и EcoRI липким концом вблизи его 3 кодирующего терминала.(й) фрагмент может быть клонирован в Bgl II сайт плазмиды pSOM7 A2 дл  образовани  плавленного протеина полипептид/сомато- статин, экспрессированного под контролем триптофанового промотора/операторе. Дл  этого требуетс  частичное переваривание EcoRI pSOM7 Д2 дл  того, чтобы расщепить дистальный сайт EcoRI от трифтофанового промотора/оператора, и точно выбрать последовательность праймера, чтобы точно сохранить рамку считывани  кодона, и снова создать EcoRI сайт расщеплени ,

Итак, 16 мкг pSOM7 Д2 разбавл ют в 200 мкл буфера, содержащего 20 мМ Трис, рН 7,5, 5 мМ MgCte, 0,02 % NP40 детергента и 100 мМ NaCI, и обрабатывают 0,5 ед. EcoRI. После 15 мин при 37°С реакционную смесь экстрагируют фенолом, экстрагируют хлороформом, осаждают этанолом, и потом переваривают Bgl П. Изолируют больший полученный в результате фрагмент с помощью ЭПАГ с последующей электроэлюцией. Этот фрагмент содержит кодоны..Е (р) дл  проксимального конца LE полипептида, а именно вверх от сайта Bgl.11, Этот фрагмент затем лигируют к указанному выше LE (p) фрагменту в присутствии Т4 ДНК лигазы дл  образовани  плазмиды pSOM7 A2 М.котора  при трансформации в E.coii K12 294 эффективно продуцирует плавленный протеин, состо щий из полностью восстановленного LE поли ептида и соматостатина под контролем триптофанового промотора/оператора.

Е. Конструирование линейной ДНК, имеющей Pstl остаток на З -конце и Bgl II остаток на его 5 -конце, св зывающем ген, определ ющий устойчивость к тетрациклину .

Плазмиду рВ322 Hind III переваривают и выступающие Hind III концы переваривают SI нуклеазой. Переваривание SI нуклеа- зой включает обработку 10 мкг Hind III переваренной рВ322 в 30 мкл SI буфера (0,3 М NsCI, 1 мМ ZnCl2, 25 мМ ацетата натри , рН 4,5) 300 ед. SI нуклеазы в течение 30 мин при 15°С. Прекращают реакцию добавлени- ем 1 мкл 30 х 51 нуклеазного стоп-раствора (0,8 М трис основани . 50 мМ ЭДТА), Смесь экстрагируют фенолом, экстрагируют хлороформом , осаждают этанолом, а затем переваривают EcoRI, как описано выше, Полученный в результате фрагмент выдел ют с помощью ЭПАГ с последующей электроэлюцией , он имеет EcoRI липкий конец и тупой конец, у которого кодирующий т ж начинаетс  с тимидинового нуклеотида, SI- переваренный Hind III остаток, начинающийс  с тимидина, может быть присоединен к переваренному Полимера- зой Клейноу 1 Bgl II остатку, чтобы восстановить ВдГИ сайт рестрикции при лигации.

Следовательно, плазмиду pSOM7 Д2, полученную в примере 5В, Bgl И переваривают и полученные Bglll липкие концы делают двут жевыми обработкой полимеразой Клейноу 1, использу  все четыре деоксинук- леотидных трифосфата. EcoRI расщепление полученного продукта с последующим ЭПАГ и электроэлюцией маленького фрагмента дает линейную часть ДНК, содержащую триптофановый промотор/оператор и кодоны LE проксимальной последовательности выше Bgl II сайта (LE (p))- Продукт имеет EcoRI конец и тупой конец, полученный в результате заполнени  в Bgl II сайте. Однако Bgl II сайт восстанавлива- етс  лигацией тупого конца к тупому концу указанного выше SI переваренного Hind III фрагмента. Итак, оба фрагмента лигируют в присутствии Ъ) ДНК лигазы дл  образовани  рециркул рированной плазмиды рНКУ10, котора  размножаетс  при транс- , формации в компетентные клетки E.coll K12 294. Отбирают клетки, устойчивые к тетрациклину , несущие рекомбинантную плазмиду рНКУЮ и экстрагируют ДНК плазмиды. Переваривание Bgl II и Pst I с последующим выделением с помощью ЭПАГ и электро- элюции большого фрагмента приводит к целевому линейному участку ДНК, имеющему Pst I и Bgl II липкие концы. Этот фрагмент

ДНК, полученный таким образом из рНКУЮ, содержит источник репликации, и, следовательно,  вл етс  полезным в качестве компонента дл  конструировани  плаэ- миды рН17 Д4 А1, у которой оба гена, кодирующих .плавленный протеин trpLE . полипептида и устойчивость к тетрациклину , контролируютс  trp промотором/оператором .

Ж. Конструирование линейной ДНК. имеющей trp промотор-оператор.

Плазмиду pSOM7 Д2 Д4, полученную в примере 5,Д, подвергают частичному EcoRI перевариванию с последующим Pst I перевариванием . Полученный в результате фрагмент , содержащий trp промотор/оператор, выдел ют с помощью ЭПАГ с последующей электроэлюцией. Частичное EcoRI переваривание необходимо дл  получени  фрагмента , который расщепл етс  вблизи 5 -конца соматостатинового гена, но не расщепл етс  у сайта EcoRI, имеющегос  между геном устойчивости к ампициллину и trp промотором/оператором. Устойчивость к ампициллину тер етс  при Fst I разрез в гене устойчивости к ампициллину. она может быть восстановлена при лигации с готовым производным линейной ДНК рНКУЮ, полученным в примере 5,Е.

Синтетические олигонуклеотиды дд  человеческого проинсулина

Соединение Последовательность Н1AATTCATGTT Н2 CGTCAATCAGCA НЗ CCTTTGTGGTTC Н4 TCACCTCGTTGA Н5 TTGACGAACATG Нб CAAAGGTGCTGA Н7 AGGTGAGAACCA Н8 AGCTTCAACG

81AGCTTTGTAC

82CTTGTTTGCGGT

83GAACGTGGTTTC

84ТТСТАСАСТССТ В51 AAGACTCGCC

86AACAAGGTACAA

87ACGTTCACCGCA

88GTAGAAGAAACC

89AGTCTTAGGAGT В10 GATCCGGCG

П р и м е р 6. Конструирование плазмиды рМ608 и E.coll K12 RV308/PNM608.

А. Конструирование EcoRI-Hpal фрагмента примерно 253 пары оснований плазмиды рН17 А4 Д1.

Инкубируют при 37°С в течение примерно 1 ч около 5 мкг ДНК плэзмиды рН17 М А1,10 мкл (1 Ох)реакционного буфера , 80 мкл воды и 5 мкл (5 ед.) фермента рестрикции Hpal. Реакционный буфер (ЮХ)

дл  Hpal рестрикционнго фермента готов т следующего состава: 100 мМ Трис. HCI, рН 7.100 мМ MgCla, 60 мМ -меркаптоэтанола, 200 мМ KCI. Реакцию прекращают инкуби- рованием при 70°С в течение 5 мин. После охлаждени  смеси на льду прибавл ют примерно 12 мкл 1 fvl Трис. HCI, рН 7,2, 7 мкл воды и 1 мкл (10 ёд.) рестрищионного фермента . EcoRI. Полученную в результате смесь инкубируют сначала при 37°С в течение 1 ч, а затем 5 мин при 70°С. После охлаждени  на льду экстрагируют полученную в результате ДНК каждым из фенолом и хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), а затем осаждают этанолом. Целевой фрагмент EcoRI-Hpal примерно 253 пары оснований отдел ют электрофорезом на полиакрила- мидном геле, извлекают электроэлюцией, осаждают этанолом, затем раствор ют примерно в 10 мкл ТЕ буфера и хран т при 0°С дл  дальнейшего использовани .

Б. Конструирование Hpal-Tagl фрагмента примерно 34 пары оснований плазмиды РН17Д4Д1.

Инкубируют при 37°С в течение 1 ч примерно 20 мкг ДНК плазмиды рН17 М Д1 в 32 мкл (5Х) EcoRI реакционного буфера, 124 мкл воды и 4 мкл рестрикционного фермента EcoRI (20 ед.). Реакционный буфер (5Х) дл  EcoRI рестрикционного фермента готов т следующего состава: 250 мМ NaCI, 500 мМ Трис. HCI, рН 7,2. 25 мМ MgCl2, 30 мМ / -меркаптоэтанола. Реакцию заканчивают инкубированием при 70°С в течение 5 ммн.. Полученный в результате EcoRI фрагмент 862 пары оснований выдел ют электрофорезом на 6%-ном полиакриламидном геле с последующей электроэлюцией и осаждением этанолом. Затем фрагмент расувор ют примерно в 100 мкл Hpal буфера, содержащего 16ед. Нра рестрикционного фермента. После 1,5 ч при 37°С прибавл ют 7,5 ед. Tag I рестрикционного фермента, продолжают инкубирование еще 1,5 ч и полученные в результате фрагменты отдел ют на 7,5%- ном полиакриламидном геле. Извлекают целевой Hpal-Tagl фрагмент примерно 34 пары оснований электроэлюированием и осаждением этанолом, затем раствор ют его в 5 мкл ТЕ буфера.

В, EcoRI-Clal переваривание плазмиды рВ322.

Инкубируют при 37°С в течение 1 ч примерно 5 мкг ДНК плазмиды рН322, 10 мкл Clal реакционной смеси, 77,5 мкл воды и 7,5 мкл (15 ед.) Clal рестрикционного фермента. Реакционную смесь (10Х) дл  Clal рестрикционного фермента готов т следующего состава: 100 мМ Трис. HCI. рН 7,4, 100 мМ MgCl2, 60 мМ /J-меркаптоэтанола. Реакцию

заканчивают инкубированием при 70°С в течение 5 мин. После охлаждени  смеси на льду прибавл ют примерно 12,5 мкл Трис. HCI, рН 7.2. 6,25 мкл 1 М NaCI, 2,5 мкл 0,1 М

MgCla и 1 мкл (10 ед.) EcoRI рестрикционного фермента. Полученную в результате смесь инкубируют 1 ч при 37°С, а затем 5 мин при 70°С. После охлаждени  на льду полученную в результате ДНК подвергают

электрофорезу на 1%-ном агарозном геле. Большой фрагмент извлекают электрозлю- цией и осаждением этанолом, затем раствор ют примерно в 20 мкл ТЕ буфера и хран т при 0°С дл  дальнейшего использовани ,

Г. Лигирование и трансформаци .

Лигируют примерно 0,2 мкг EcoRI-Hpal фрагмента примера 6,А, 0,5 мкг Hpal-Tagl фрагмента примера 6,В и 0,1 мкг EcoRI-Clal перевара примера 6,В и используют дл 

трансформации E.coli К12 RV308 по существу по методике, описанной в примере 2Г.

Некоторые из полученных в результате трансформамтов, как показано электрофорезом на агарозном геле (Мэниатис с сотр.,

1982) и другими тестами, содержат только желаемую плазмиду примерно 4,6 kb. Отбирают такие трансформанты, обозначенные как E.coli K12 RV308/pNM608, помещают на пластины с ТД агаром, содержащим соответствующие антибиотики, и затем культивируют , использу  традиционные микробиологические методики. Плазмида pNM508 представл ет собой и  вл етс  предпочтительным источником EcoRI-Clal

(TagI) фрагмента примерно 287 kb плазмиды РН17Д4Д1.

Пример. Конструирование плазмиды pCZ112 и E.coli K12 RV308/pCZ112.

A. EcoRI-Clat переваривание плазмиды

pNM608 и генераци  EcoRI-Tagl фрагмента примерно 0,288 kb (такого же как EcoRI-Tagl фрагмент 0,288 kb плазмиды рН17Д4 Д1).

Инкубируют примерно 5 мкг ДНК плазмиды pNM608 в 50 мкл солевого буфера с 10

ед. каждого из EcoRI и Clal рестрикционных ферментов при 37°С в течение примерно 1 ч. Солевой буфер следующего состава: 50 мМ NaCI, 100 мМ Трис. HCI, рН 7,5, 6 мМ MgCl2, 2 мМ / -меркаптозт.анола. После до0 бав ени  5 мкл 3 М ацетата натри , рН 7,0, осаждают ДНК 3 объемами 100%-ного эта- нола. Целевой перевар ДНК раствор ют в 100 мкл ТЕ буфера и хран т при 0°С дл  дальнейшего использовани .

5 Б. Конструирование линкерной последовательности ДНК.

CGACC ATG GAT GAT AAG TIT CCG GCT АТС ТСТ СТО TGG TAG СТА СТА ТТС ААА GGC CGA ТЛС AGA GAC

20.

ТСС GG.C СТО ТТТ GCC ААС ССТ GTGCT AGO CCG GAC ДАЛ CGG TTG ССА С

Синтезируют желаемую линкерную последовательность модифицированным фос- фотриэфирным способом по существу в соответствии с Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978. Вышеупом нутый способ синтеза также был специально проиллюстрирован в примере 1.

В. Лигирование и трансформаци .

Примерно 20 пикомолей линкерной ДНК примера 7,Б, 1 мкг перевара pNM608 примера 7,А, 0,5 мкг BamHI-EcoRI фрагмента примерно 10,2 kb плазмиды pCZ101 (полученного в соответствии с методикой примера 2,Б, с тем исключением, что ис- пользуют EcoRI рестрикционный фермент и соответствующий буфер, а ке Xbal рестрикционный фермент и буфер) и 1 мкг Ba mHI- HgiAl фрагмент примерно 0,6 kb плазмиды pCZ101 примерз 3,Б подвергают лигации, а полученную в результате плазмиду используют дл  трансформации E.coli K12 RV308 по --существу в соответствии с методикой примера 2,Г,

Не которые из полученных в результате трансформантов, как показано электрофорезом на агарозном пзле (Маниатис с сотр., 1982) и другими тестами, содержат только желаемую плэзмиду примерно 10,8 kb. Такие траисформанты, обозначенные здесь как E.coli K12 RV308/pCZ112, отбирают, по- мещают на ТД агаровые пластины, содержащие соответствующие антибиотики, и затем культивируют, использу  традиционные микробиологические методики. Как показано электрофорезом на SDS-геле, RIA и другими тестами, полученные в результате клетки экспрессируют вышеупом нутое производное MET-ASP-ASP-LYS-бГР с высокими уровн ми. Поскольку плазмида pCZ112 содержит репликон неконтролируемого роста, термоиндуцируемый, максимальна  экспресси  желаемого продукта производного 6ГР происходит при культивировании при температуре около 37°С.

П р и м е р 8, Конструирование pATI плазмиды и E.coli K12 RV308/pATI.

Желаемое конструирование осуществл ют по существу в соответствии с методикой примера 7 с тем исключением, что линкерную последовательность прим.ера.7 замен ют линкерной последовательность ) ДНК:

5 ССАСА АТС ТТС ССЛ GCT АТС ТСТ СТА ТСТ СОТ j. ЈДЈ Дс Ј Ј ,j,Ј . Јj Д ЈЈ

CTG ТТТ CCU ЛАС С,СТ CTCCT 3 ОЛС ААА CGG ТТС ССА С 5

Определенна  выше линкерна  последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с традиционной методикой Итакур с сотр.,

1977 и Кри с сотр., 1978. Вышеупом нутый метод синтеза также специально иллюстрирован в примере 1.

Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как E.coli K12 RV308/pATI, помещают на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиотики , а затем культивируют дл  последующего продуцировани  и выделени  плазмиды

pASTI. Как показано SDS-гель-электрофоре- зом, RIA и другими тестами, трансформанты экспрессируют вышеупом нутое производное МЕТ 6ГР с высокими уровн ми. Поскольку плазмида pATI содержит

термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальна  экспресси  желаемого продукта производного 6ГР происходит при культивировании при температурах около 37°С.

П р и м е р 9. Конструирование плазмиды pASP1 и E.coli K12 RV308/pASP1.

Желаемые конструкции получают по существу по методике примера 7 с тем исключением , что линкерную последовательность

примера 7замен ют на последовательность ДНК: ,

10 5 -CGACC АТС GAT ТГТ ССС ССТ АТС ТСТ С ГС ТСС СОС СТО 3г ТСга ТАС СТА АЛЛ ССС CGA ТАС AGC GAC ЛСС cci GAC

ТТТ GCC ЛЛС fiCT СТ(Х1 3 15 АЛА CGC ТТС CGA С 5

Вышеуказа нна  линкерна  последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с традиционной

методикой. Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978, Вышеуказанный способ синтеза также.специально иллюстрирован в примере 1.

Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как E.coit K12 RV308/pASP1, помещают на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиоти- ки, и затем культивируют дл  последующего

продуцировани  и выделени  плазмиды

pASP1. Как показано SDS-гель-электрофо- резом, RIA и другими тестами, трансформанты экспрессируют вышеопределенное производное MET-ASP-бГР с высокими уровн ми. Поскольку плазмида ,pASP2 coдержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальна  экспресси  желаемого производного 6ГР происходит при культивировании при температурах около 37°С.

ПримерЮ. Конструирование плазмиды pASP2 и E.coli K12 RV308/pASP2.

Желаемые конструкции получают по существу по методике примера 7, с тем исключением , что линкерную последовательность

примера 7 замер ют на последовательность ДНК:

ССАТС АТС CAT ГГТ ССС GCT ATG ТСТ СТО ТСС ССС СТО ТЛО ТАС СТА ЛАА ССС CGA ТАС АСА САС AGG CCG GAC

IS

ТТТ ССС ААС ОСТ СТССТ ААА CGG ТГС SCA С

Вышеуказанна  линкерна  последовательность может быть сконструирована по сущестоу о соответствии с традиционной методикой Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978. Вышеуказанный способ синтеза также специально иллюстрирован в примере 1.

Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как E.coli K12 RV308/pAP2, помещают на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиотики , и затем культивируют дл  последующего продуцировани  и выделени  плазмиды pASP1. Как показано SDS-гель-электрофорезом , RIA и другими тестами, трансформанты зкспрессируют вышеопределенное производное MET-ASP-бГР с высокими уровн ми. Поскольку плазмида pASP2 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальна  экспресси  желаемого производного 6ГР происходит при культивировании при температурах около 37°С.

Л р и м е р 11. Конструирование плазмиды рАТ2 и E.coli K12 RV308/pAT2.

Осуществл ют желаемые конструировани  по существу по методике примера23, с тем исключением, что линкерна  последо-, вательность примера З.В заменена линкер- ной последовательностью ДНК:

10 5 CTAGAGGGTATTAATA ATG ,ТТТ CCA GCT АТС ТСГ З1 ТСССАТААТТАТ ТАС ААА GGT CGA ТАС AGA CAT АСА

15

GCT СТО ТТТ GCC ААС GCT GTGCT CCA CAC AAA CGG TTG, CCA С

Определенна  выше линкерна  последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с традиционными, методиками Итакура с сотр.. 1977, и Кри с сотр., 1978. Вышеуказанный способ синтеза специально иллюстрирован в примере 1.

Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как E.coli K12 RV308/pAT2, помещают на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиотики , а затем культивируют дл  последующего получени  и выделени  плазмиды рАТ2. Как было показано SDS-гель-электрофорезом, RIA и другими тестами, трансформанты зкспрессируют определенное выше производное МЕТ-бГР с высокими уровн ми.

Поскольку плазмида рАТ2 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальна экспресси  желаемого производного происходит при

культивировании при температуре около 37°С.

П р и м е р 12, Конструирование плазмиды pCZ154 и E.coli K12 RV303/pCZ154.

Осуществл ют желаемые конструировани  по существу в соответствии с методикой примера 7, с тем исключением, что линкерную последовательность примера 7 замен ют на линкерную последовательность ДНК:

10 5 CGACC АТС СТГ ТТТ ССС ОСТ АТС ТСТ CTG ТСС GGC СТО 3 TGG TAG САД АЛА CGC CGA ТЛС АСА CAC AGG ССО СЛС

ТТГ ССС ААС GCT СТССТ /АА CGG TTG CCA С

Определенна  выше линкерна  последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с традиционной методикой. Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978. Вышеуказанный способ синтеза

был специально иллюстрирован о примере

Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как E.coli K12 RV308/pCZ154, помещают на пластины с ТД агаром,

содержащим соответствующие антибиотики , и культивируют дл  последующего получени  и выделени  плазмиды pCZ150. Так же показано SDS-гель-электрофорезом, RIA и другими тестами, что трансформанты экспрессируют вышеупом нутое производное МЕТЛ/АЫэ Р с высоким уровнем. Поскольку плазмида pCZ154 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальна  экспресси  желаемого

производного 6ГР происходит при культивировании при температуре около 37°С.

П р и м е р 13. Конструирование плазмиды pCZ155 и E.coli K12 RV308/pCZ155.

Желаемые .конструировани  осуществл  ют по существу в соответствии с методикой примера 7, с тем исключением, доо замен ют линкерную последовательность примера 7 линкерной последовательностью ДНК:

.-.

10 5 CGACC АТС ССТ ТТГ ССС GCT АТС ТСС СТО ТСС GTC СТО 3 ТСС ТАС СС-А ААА GCC CGA ТАС АСА GAC AGG CAG GAC

ТТТ ССС ААС GCT СГССТ 3 15 ААА CGG TTG CGA С $

Ыг

ty

ч/;

Определенна  выше линкерн л последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с традиционной методикой Итакура с сотр., 1977 и Кри с сотр., 1978. Указанный выше

способ был также иллюстрирован специально в примере 1.

Желаемые трансформанты, обозначенные здесь как E.coli K12 RV308/pCZ155, no- . мещают на пластины с ТД-агаром, 5 содержащим соответствующие антибиотики , а затем культивируют дл  последующего получени  и выделени  плазмиды pCZ155. Также было показано, SDS-гель-электрофо- резом, RIA и другими тестами, что трансфер- 10 манты экспрессируют указанное выше производное MET-ALA-PHE-PRO-ALA-MET- SER-LEU-SER-VAL-бТР с высокими уровн ми . Поскольку плазмида pCZ155 содержит

термоиндуцируемый неконтроли- 15 руемого роста, максимальна  экспресси  желаемого производного 6ГР происходит при культивировании при температуре око- ло 37°С.

П ри м е р 14. Конструирование плазми- 20

ды pCZ156 и E.coli K12 RV308/pCZ156.

Провод т желаемые конструировани  по существу по методике примера 7 с тем исключением, что линкерную последовательность примера 7 замен ют на линкер- 26 ную последовательность ДНК:

S1 CGATA ЛТС CAT ITT CCG ССГ ЛТО ТСТ CTG ТСС GCC CTG 3 ТЛТ.ТАС СТА ЛАЛ GGC Срл ТАС ЛСЛ СЛС ACG CCG СЛС

ТТТ GCC АЛС GCT GTGCT 3 АЛЛ CGG TTG ССЛ С 5

Определенна  выше линкерна  последовательность может быть сконструирована по существу в соответствии с 35 традиционной методикой Итакура с сотр. 1977 и Кри с сотр., 1978. Указанный выше способ синтеза также был специально иллюстрирован в примере 1. - Желаемые трансформанты, обозначен- 40. .ные здесь как E.coli K12 RV308 /pCZ156, бы- ли. помещены на пластины с ТД-агаром, содержащим соответствующие антибиотики , затем провод т традиционное культивирование дл  последующего получени  и 45 выделени  плазмиды pCZ156. Также показано SDS-гель-электрофорезом, R1A и другими тестами, что трансформанты экспрессируют вышеупом нутое производное MET-ALP-бГР с высокими уровн ми. По- 50 скольку плазмида pCZ156 содержит термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальна  экспресси  желаемого производного 6ГР происходит при культивирова нии при температуре око- 55 ло 37°С.

П р и м е р 15. Конструирование плазмиды pCZ103 и E.coli K12 RV308/-pCZ103.

Раствор ют 10 мкг плазмиды pCZ101 в Юмкл 10Х BstE11 реакционного буфера (1,5

. 5 10

15

0

6

0

5 0. 5 0 5

М NaCI, 60 мМ Трис. HCI, рН 7,9, 60 мМ MgCla, 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл BSA). и 88 мкл воды и 2 мкл ( 20 ед.) ре- стрикционного фермента BstEII, полученную в результате реакционную смесь инкубируют при 60°С в течение 2 ч. После экстракций фенолом и хлороформом и нескольких осаждений этанолом ДНК обрабатывают 0,25 М раствором ацетата натри .

Суспендируют около 0,1 мкг ДНК переваренной BstE11 плазмиды pCZ101 в 100 мкл лигазного буфера. После добавлени  ЮОед. Т4 ДНК лигазы и инкубировани  при 16°С в течение 2 .ч лигированную ДНК используют дл  традиционного трансформировани  E.col K12 RV308, Отбирают трансформанты E.coli K12 RV308/pCZ103 на канамицине и идентифицируют рестрикци- онным ферментным анализом ДНК их плазмиды . Выдел ют плазмиду pCZ103 из трансформантов по существу в соответствии с методикой примера 2,А.

Пример 16. Конструирование векторов , происход щих из плазмиды pCZ103 дл  экспрессии производных бычьего гормона роста.

Так как BstE11 делеци , сделанна  при конструировании плазмиды pCZ103, не воздействует-на последовательность, кодирующую протеин 6П1, плазмиды, происход щие из плазмиды pCZ103 изобретени , зкспрес- сируюг то же самое произЕюдное 6ГР, что и их дубликаты, происход щие из плазмиды PCZ101.

Так как плазмиды изобретени , происход щие из pCZ1Q3. 6bmM сконструированы по существу в соответствии с методикой примеров, и которых были сконструированы их дубликаты, происход щие из pCZIOI, о табл.2 представлено кратко суммированное конструирование илазмид, происход щих из pCZ103. В габл.2 перечислены плазмиды, .происход щие из pCZ103, соответствующий пример, описывающий конструирование дубликата, происход щего из pCZI.01, и размер только отличающегос  фрагмента ДНК, включенного и конструирование.

Плазмиды, происход щие из pCZ103, были использованы дл .традиционной трансформации E.coli K12 RV308. Полученные в результате трансформанты экспрессируют вышеупом нутые производные 6ГР. Поскольку плазмиды, происход щие из pCZ103, содержат термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальна  экспресси  происходит при культивировании при температурах около 37°С.

Claims (2)

1. Формула изобретени  1. Способ получени  рекомбинэнтной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, заключающийс  в том, что осу: ществл ют лигирование фрагмента BamHI-Xbaf пла.змиды pCZ101 размером 10,2 kb или BamHI EcoRI фрагмента той же плазмиды с Ipp промотором и репликоном, тер ющим контроль числа копий при 37°С, с BamHI-Xbal-фрагментом плазмиды pCZ101 или pCZ103 размером 0,6 kb, кодирующим аминокислоты с 15 до 191 бычьего гормона роста и ДНК-линкером, содержащим нуклеотиды, кодирующие последовательность активации трансл ции, стартовый кодон и кодон дл  N-конца производного бычьего гормона роста, при этом в случае, когда дл  лигировани  берут BamHI-Xbaf-фрагмент плазмиды pCZ101 используют линкер с последовательностью нуклеотидов

   Г1 - CTAGA аебтлттмтл

   . . I IIIIII11 . ..

   « - ТСССАТААТГАТ ГАС ТТТ ССС

   ЛТО. АДА C6G ЛАТ -ТСТ ATU Off ТТС ССА 0((

   шишшшуш

   Атб тсс TTS тсс &&с ста ттт GCC ЛАС ист стаст-з

   III Ml III HUM III III III ИМИ I тле лев АЛ f MS tct VAC MA ess We ш c-s1

   и получают плазмиду pCZ1920, кодирующую MeT-Lys-Gly-Asp-1N-SER-MET-A a- bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов

   амш

   ССА ССГ лтв.ссТ СТА тггеет

   HI ill ill nun

   ТАС С6А &ATAUC

   66 ТАС С6А 6АТЛСЛ ССА

   СТС ТТТ СГС ААС ОСТ OTGCT-J III III III III III I CAC AAA C66 ГГО CdA

   и получают плазмиду plR1, кодирующую MET-PHe-PRO-ALa-MET-Ala-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов

   Г-СШЛОССТАТТАЛТ АТС ТТТ ССЛ; ССТ АТС ТСТ СТА ТСТ ССТ

   НМШШН HI 111 III- l III Ml HI III, 3-- сСс11АЛТТЛТ ТЛС AAA GOT CCA ТАС ЛОЛ 5ЛТ АСА ССЛ

   сто ттт ccc ЛАС ест CTCCT-J

   Ill III III 111 III I

   CAC AAA CCS ПО CCA C-S

   и получают плазмиду рАТ2, кодирующую Met bGH, в случае, когда дл  лигировани  берут BamHI-Xbal-фрагмент плазмиды pCZ103, линкер имеет последовательность нуклеотидов

   -ciACAGUGTATWTA АТС fri сел GCC АТС ест стл тст ест

   minium iii iii ill ч) in 111 111 111 ill

   Г-ТСССАТЛЛтТ TAC AM CST CCC TAG CGA CAT АСА ССА

   Ct6 ТТТ «С ЛАС ССТ GTGCT-Г

   ill III 111 III HI I CAC AAA CCC TTC CCA C-S1

   5

   0

   и получают плазмиду р1Я1„3 кодирующего Met-PHE-PRO-Ala-BGH или линкер с последовательностью нуклеотидов

   S -CTACAGGGTATTAATA АТС ТТТ ССА ПС Г АТС ТСТ СТА ТСТ ССТ

   МИШИН Ill III III III III Ml Ml III III

   З -ТСССАТААТТАТ ТЛС ЛЛА GGT CGA ТАС АСА CAT АСЛ CCA СТС ТТТ ССС ЛЛС GCT CTCCT-31

   III III III IM Ml I

   CAC AAA CCG TTG CCA C-5 -..

   и получают плазмиду рАТ2,3, кодирующую MET-bGH, при этом в случае, когда дл  ли-, гировани  берут BamHI-EcoRI-фрагмент плазмиды pCZIOI илирСгЮЗ, его дополнительно лигируют с ЕсоЯ1-С1а1-фрагментом плазмиды pNM 608 с ДНК-линкером, кодирующим последовательность активации трансл ции, стартовый кодон и кодон дл  N-конца производного бычьего, гормона, причем в случае лигировани  фрагмента плазмиды pCZ101 используют линкере нук- леотидной последовательностью

   5 -ССАСС,ЛТО GAT GAT ЛЛО Г{Т ССС ССТ АТС ТСТ СТО

   МММ III III III III III ill II Ill III

   З -ТСС.ТАС СТЛ СТЛ TTC ЛА) GCC CGA ТАС ЛПА СЛС ТСС ССС СТС И Т ССС ЛЛС ССТ СТССТ-31

   III II МИ 11 III I I.I III I

   ACC CCG СЛС ЛЛЛ CGG ПГ. ССЛ C-S

   о

   5

   при этом получают плазмиду pCZ112, кодирующую MET-Asp-Asp-Lys-bGH или линкер с последовательностью нуклеотидов

   S -CGACA ЛТО ТТС ССЛ ССТ АТС.ТСТ СТЛ ТСТ GGT

   Ml Ml Ml Ml III III, Ml IM Ml III тот тле ллс CGT спл тлс лсл слт лсл ссл

   стстттссс ллс сст стсст-э .

   . IIIIflIII III III I :

   СЛСЛЛЛCCC TTO ССЛ С-5

   при этом получают, плазмиду pAST.1, кодирующую MET-Asp-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов

   5 -ССЛСС ЛТС СЛТ ТТТ ССС ССТ ЛТС ТСТ СТС ТСС CGC СТС

   III III Ml-1II III III-Ml III III I If Ml III

   З -TGG 1ЛС СТЛ ЛЛЛ ССС ССЛ ТЛС ЛСС СЛС ЛСС ССО СЛС

   Т1Т ССС ЛЛС ССТ GTGCT-3 . 111 11МII 11II

   ЛЛЛ CCG TTG ССЛ С-5 :

   при этом получают плазмиду pASTPI, кодирующую MET-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов

   55

   S -CCAIC ЛТО ЫТ ТТГ СИ ССТ ЛТО ТСТ ПС ТСС ССС СЮ ПТ ССС ЛЛС ССТ Г1ССТ-Э

   I I I III III |П III ill III III ill ill ill III I

   TM ТЛС СТА.АЛД ССС СОЛ ТЛС.ЛГЛ СЛС. ЛГ.С ССС СДС : IM CC5 ItC CCA C-5

   при этом получают плазмиду pASP2, кодирующую MET-ASP-bGH, или линкере последовательностью нуклеотидов

   ДСС АТС UT TIT ССЙ ОСТ АТС ТСТ СТО Т« СВС СТС

   HI III III III III II ill iii ill ill ill HI Э -TCG TAC СЛЛ AAA ССС СОЛ ТАС АСЛ GAC AGG CCG CAC

   TITссс втост-з1

   . IllIII ИМИ I V

   АЛЛCCG ПС ССЛ C-5

   при этом получают плазмиду pCZ154, кодирующую MET-VAL-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов .-э

   V-ССЛСС АТС ОСТ ТТТ CCG GCT.ATG ТСТ СТО ТСС GTC СТО

   111 IIPIII III III III III III III III III III

   З -TGC ТЛС ССЛ ЛАЛ CGC ССЛ GAG-ЛСС CrtG GAC ТТТ ССС АЛС ССГ GTCCT-3

   Ill IN III III I . . .

   АЛЛ CGO TTG ССЛ C-S )

   при этом получают плазмиду pCZ155, кодирующую MET-ALA-PHE-PRO-A.LA-MET-SER- LEU-SER-VAL-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов

   5 -СПЛТЛ АТС СЛТ ТТТ ССО С.СТ ДТП ТСТ СТО ТСС Г,«С СТС

   III III III III III III III III 111. III Ml III

   Э -ТЛТ ТЛС СТА АЛА GGC ССЛ ТЛС ЛОЛ СЛС AGO IXG КЛС

   ТТТ ССС ЛЛС ОСТ GTCCT-31 III ИМИ ИМ

   . ЛЛА CGC TTG ССЛ С-5 ,

   при этом получают плазмиду pCZ156, кодирующую MET-ASP-CH, в случае, когда дл  легировани  берут BamHI-EcoRI-фрагмент плазмиды pCZ103 используют линкер с последовательностью нуклеотидов

   5 -СОЛСА ATG ТТС ССЛ- ОСТ ЛТО ТСТ СТЛ ТОТ CGT

   Ml ill ill III III III III III IN Hi

   TGT TAC AAG GGT ССЛ 1ЛС АСЛ GAT ЛОА CCA СТО ТТТ ССС ЛЛС OCT. CTCCT -3

   III III МММ Ml I

   СЛС АЛЛ CGG-ПО-СОЛ C-5

   при этом получают плэзмиду рАЛ.З, кодирующую MET-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов

   5 -ССАСС ЛТО СЛТ TiT CCG GCT ATG ТСТ СТО ТСС GCC СТО III III III III III 111 III III III III ||| Ills -TEG TAC СТА ЛЛА CGC ССЛ ТЛС ЛСС СЛС AGG CCG .СЛС

   ТТТ ССС АЛС ССТ GTCCT-31

   III III ИМИ I

   ЛАЛ CGG TTG СОЛ С-5 ,

   при этом получают плазмиду рА5Рг.З,кодй рующую MET-ASP-bGH, или линкере последовательностью нуклеотидов

   ГДТС ATG СЛТ TIT CCU GCT ЛТС ТСТ CTG ТСС GUC СТС II 111 111 III III 111 111 III III III HI HI AC ТЛС СТА ЛЛЛ GGC ССЛ ТАС ЛСА СЛС ЛСО CCG.GAC

   ТТТ ССС ЛАС .UCT СТССТ-3

   III III III 111 I

   ЛЛЛ CCG.ТТС CGA C-51 .

   при этом получают плазмиду pAZP2.3, кодирующую МЕТ-а a-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов

   5 -ССЛСС ЛТО СТТ ТТТ CCG fiCT АТС ГСТ СТО ТСС ССС СГС

   , III III III III III III III III III III III Ml

   3 -TCG ТЛС СЛЛ АЛЛ CGC CGA TAC АСЛ СЛС ЛСС ССС СЛС ТТТ ССС ЛЛС ССТ GTCCT-3

   III III III III I

   АЛЛ CCG TTG ССЛ С-51

   при этом получают плазмиду pCZ154.3, кодирующую MET-VAL-bGH, или линкер с последовательностью нуклеотидов

   0

   IK S -CGACO АТС ССТ ТТТ CCG ССТ ЛТО ТСТ СТО ТСС GTC СТС

   111 ИМИ III III III III III III III III III

   З -TGG ТЛС ССЛ ЛАА Г,ОС ССЛ ТЛС ЛСА СЛС AGO СЛС СЛС

   ТТТ ССС АЛС ССТGTGCT-3

   III ИМИ IIII

   АЛЛ CGG TTG ССЛС-5

   при этом получают плазмиду pCZ 155.3, кодирующую MET-ALA-PHE-PRO- ALA-MET- SE R-LEU-SER-VAL-bGH, или линкер с последовательностью нуклеождов

   -5. -седт мо .ет пт кс ест лтс ict стс ice cc: Cfi . m ссс (.-с не OTCCT-J

   И Л HI III HI III III III HI HI III III in III III MM

   3 -T.M:IJC СТА M. CCC M ТЛС ДСЧ СГ.С AM CCO CAC ii., CCC ПС С Л C-S

   5

   0

   5

   0

   при этом получают плозмиду pCZ156.3, кодирующую MET-ASP-bGH.
2. 2. Способ биосинтеза производного бычьего гормона роста, предусматривающий конструирозвнме рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, трансформацию полученной ДНК штамма EschericWa coll, выращивание трансформантоа в питательной среде и выделение целевого продукта, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода целевогоо продукта, конструируют рекомбмнантиую плазмидную ДНК pCZ110 или pCZ153, или pCZ154, трансформируют штамм E.coli K12 RV38, а выращивание провод т при 25°С до достижени  логарифмического роста, затем клетки пересевают на свежую питательную среду того же состава и выращивают при 37°С.

   Приоритет по признакам: 06.03.84 поп.1; 26.07.84 по п.2.

   Синтетические олигонуклеотиды дл  гена тимоэин I

   at ambient temperature при комнатной температуре.

   J а б л и ц а 1

   PKEN111

   EcoRl

   -

   Hpall Xbal PvuII Hpall

   Hpal

   EcoRl

   PvuII

   /

   | Hpall 950bp Hpa II Fragment

   jAful 462bp Alu I Fragment

   iJEco RI Linkers/ T4 Ligase

   EcoRl

   4e6bp Eco Rf Fragment

   Aii.l

   pBR322 EcoRl

   PstI

   PvuII

   E

   Eco RI Alkaline

   ,-.c

   Pnosphatas

   Bam HI

   Sail

   Plasmid 103 (Figure 1)

   Hindi It

   S1 Nuclease

   Bam HI Linkers T4DNALIgase

   Bam HI

   ind HI

   У Есо RI PartialDigestion Xsi Nuclease«

   XHindlH Linkers ./ T4ONALigase

   A Hind III

   / :.-. ..,-.

   У T DNALigase

   4

   Xbal co RI Bam Hi

   Sail

   ttoi.2

   Bam HI

   .T DNALigase VEcoRl

   Plasmid 105 (Figure 2)

   Sail 1 BamHT

   Alkaline Phosphatase

   Hind ill

   #KEN021

   Bam;HI Sail Xbal

   Alkaline Phosphatase

   Plasmid pKEN111 (101 in Figure 1)

   Hpal

   Sal I Linkers T4DNALigase

   Sail Pvull

   Bam HI tinkers T4 DNA Ligase

   Bam HI

   lppp

   « 950bp Fragment Sal I, Bam HI Ends

   Xbal EcoRI

   Bam HI

   IppP

   Xbal

   Bam HI

   Фиг-3

   Sail

   Sma I

   Hind III Bam HI

   8тл I

   Bam HI Linkers T4 ONA Ligase

   Bam HI

   691 bp Bam Hi Fragment

   pNM575

   Plasmid pNM575 (109 in Figure 4)

   I Bam HI

   691 bp Bam HI Fragment

   I Fnu Dll

   538 bp Bam HI, Fnu 01Г Fragment

   pNM702

   OU5

   Pvu II

   I Bam HI

   I Alkaline

   Phosphafase

   Coding Region for Human Growth Hormone

   Bam HI

   Via. Ll

   . Synflielic Fragment

   Placmid pKEN021 Xba I-Bam Hi digested (107 in Figure 3)

   Pvu il BamUl

   Sa 1

   Plasmid pNI/fo2 (111 in Figures)

   Pvu II Partial Digestion

   Pvu 11

   Pvu II

   Pst

   pBP348

   EcoRI

   Pvu II Bam HI

   3 lpp

   VlHJ

   114 (in Figure 6)

   j Pvu II Partial f Digestion

   JXbal

   ЧAlkaline

   tPhosphatase

   Xbal

   Bovine

   Growth Hormone

   Pvu II

   Bam HI

   Salt

   pNM789

   Pvu II

   Фиг. 7

   116

   Xbal:

   IHpall

   Synthetic Fragment

   Hormone

   pPB348 (112 in Figure 6)

   I Pvu ft j PstI 135bp Fragment

   IHpall

   IPartial

   Digestion

   Pvu II Bam HI

   3 ipp ;

   Sail

   PJasmid pNM789 (117 in Figure 7)

   l Pvu II Partial Digestion

   | Bam HI

   I Alkaline

   т Phosphatase

   Hind III

   pNM789B

   118

   n ., Bam HI Pvu 11N..

   Synthetic Frngmenl

   Тд DNA Ligase

   Pvu II

   Coding Sequence lor Bovine Growth Hormone

   Pvu II UamHI

   Фм.«

   EcoRI

   Xbal

   HgiAl

   BstEII

   BstEII

   pCZ 1920

   EcoRt

   Hpa I

   Фиг. 9

   Bam HI

   EcoRI Hpcfl

   HgiAl

   -- - i

   BamHI

   BstEII

   Фиг fO

   EcoRI

   AATTCATGTCTGATGCTGCTGTTGATACTTCrTCTGAGATTACTACTAAAiGATCTTAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAACTAATAG

   SriCAGACTACGACGACA CTATGAAGAAGACTCTAATGATOATTTCTAGlAATTCCTCTTCTTCCTTCAAGAGCTTCTCCGACTCTTGATTATCCTAG

   «iOu

   I 00 I

   IIII OM7O ЦОРО h-OPO (-

   5Я OR

   OPO ь-о

   OMTO Ь-ОРО

   L

   0 II PO

   OR

   G Bu i о

   TO bOPO OR4

   Т Т Г8 Т Га Д8 r 8u rSz PQz т

   DJoToYoToYoto(o(

   nii и M il и и и м ii

   PO kopo h-opo t-opo ЬОРО ЬОРО kopo V-OPO UOPO l-op J 4 J I J J J 4j I M I SI I I

   то4 rvo no4 no no4 nn лс. Лг, Ar.N л

   OR Ой

   OR ОН ОЯ OR 11

   OR OR

   OPO

   6a

   step stop

   BSIH CpLll.l1

   Bam HI

   0 I

   II OPO (-

   OR

   OPO ь-оросе

   OR

   CBl Т

   Too

   OMTO hOPO l-OPO

   N O

   О | О

   itit OPO ЬОР I I

   он с

   e

   о

   OPQCE

   СЯ ,Ql

   iBu ,Bz

   ПМТО f-OPO I

   1 on

   О I О I О IIII II ЦОР

   iv i i

   on J о  о

   о

   -OPOCE OR

   -BI

   Т о С

   az

   OMTO

   O | О I II I II I OPO НЭРО kOAn

   OH I Ofl

   Et3N/Py/H20

   J&

   2% BSA

   J

   Et3N/Py/H20

   2% BSA

   u

   РО

   000 II I II I II PO h-OPO OPOOR OR4 OR

   .81

   Bi

   HO

   с т с

   j О0 i О ) ЦОРО ГОРО -ОРОСЕ N ncN ORN OF

   ОН4 ORN

   Ј

   ) TPSTe

   2) Silica gel chrom.

   3) Et3N/Py. H20

   ОЯ

   nSz

   -IBu

   Bl

   OMTO t-OPO

   N он4

   U I О I О IIII II PO f-OPO HOPO

   ORN ОПМ

   OR

   „at T rei I -S i ,9

   HO h OPO - OPO (-О An

   M A«M

   I

   PO h-OAl

   v .

   OH OR

   1) TPSTe

   2) 2% BSA

   3) Silica gei chrom.

   со со

   CO

   -t

   КЗ

   Gia .T

   sBz

   -8r

   |O|0|0|O|0|O I n и и OMTO j-OPO kQPO HOPO h-OPO -OPO

   OR4 OR4 OR Ofl OR

   .81

   iBu

   .Bz

   Bz

   -3l

   I ° I ° I ° I ° I ° I

   nii и n и HO f-OPO hOPO Ь-ОРО Ц-ОРО KOPO f-OAn

   ОН бн4 OH4 OR4

   OH4 10

   Т Га Д8 r 8u rSz PQz т

   oToYoto(o(

   M il и и и м ii

   po ЬОРО ЬОРО kopo V-OPO UOPO l-op I J J J 4j I M I SI I I

   no no4 nn лс. Лг, Ar.N л

   OR ОН ОЯ OR 11

   OR OR

   OPO

   6a

   -Bz

   OPOl-OAn OH

   1) Silica gel chrom.

   2) Cone. NH4OH

   -----------------------г ----------„---

   3) AcOH

   4) HPLC

   5 HO-G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C-OH 3

   (fut. (2

   12

   T5 T6 T7 T8 T13T14 T15T16 I-I I |T4DNALigase

   EcoRI I

   Mpell BamHI

   --Ц

   t г

   phi mil Ы

   29 30 31 32

   I V rg rg

   TIC ia тгс otc АЛО ст сое сдо rcc лес ccciccc оде err Ало тле «a ттс тол осе Sec ТХйо ттс TOO cco5cc;cro

   Р50М7Д4Л1

   EcaRI.Hpall EcoRI

   Ecqfll partial, Psll

   iI

   Pill

   Јсой

   irppo LE lmlon §S°R

   -..- ма-ч

   ESK ЕЯ;

   II Qlf1 u P

   x GCA CAQ О

   COT QIC CtT AA

   фи.М

   EcoRI

   EcoRI | Bam HI Eco RI

   Bam HI

   EcoRI

   ME thymosin Bam HI

   Tcs

   ил. К

   PSII

   --- - сссоаа----r .CCCCCрИНО-4

   Hp«ll fill

   т rn

   B«mHI Psll

   -.«..-LceeccccL- t I f 1 1 --luGOGaa -- - 29 30 31 32 33

   tyft Ihr rg мф glw

   A CCUC ICCOCftCCC ITtTOGCCIiG GCCQCOC

   BamHl, Hpall

   Hpall

   T4 EcoRI. BamHI

   EcoRi

   BamHI

   Bg.ll

   T4 llga Tcinjlotmjllon

   .WiiЈ« .

   Reverse Iransciipiase + сШТрч + Gam HI linker S CCGGATCCGG(l)n3

   tAln3- (T)n GGCCTAGGCC 5

   j Denature RNA/DNA hybrid I Klenow Pol

   QamHI

   (A)nCCGGATCCGG 3 (T)nGGCCTAGGCC 5

   I SI Nucleate

   | Terminal Iransferase + dCTP

   ссссс

   IAlnCCGGATCCGGCCCCC fO.GGCCTAGGCC

   E-SJI Hpall Human Insulinр8ц cOfM

   BamHl Psll

   Aps

   ЈT

   Фиг К

   Ecofll

   BamHl

   Psll

   Pi I

   Terminal Irsnslflr. + dGTP

   ( Anneal

   j Trnnsform Ј. coli

   } Select Tr.R

   } Screen

   EcoRI

   BamHl

   ЈT