JPS6229600A - 融合タンパク質、その生産方法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分子ｍ約１５０００ドルトン以下の比較的小さな真核生
物タンパク質を遺伝子工学的手法によって産生ずる場合
に、細菌によって達成される収率は少ないことが多い。

これは、形成されるタンパク質が宿主に固有のプロテア
ーゼによって急速に分解されるためであると推測される
。このような理由から、このタイプのタンパク質は、宿
主に固有のタンパク質部分を特に有する融合タンパク質
として産生させてから切断することが右利である。

大腸菌ｔｒｐオペロン由来り一タンパク質のほんの約７
０個のアミノ酸からなるセグメントは、特にアミノ酸２
３〜９３番目の配列領域において、融合タンパク質の形
成に特に適していることが見出されたのであるが（Ｃ，
ｖａｎｏｒｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｃｒｃｈ、　９（
１９８１）　６６４７　）。このセグメントは以下にお
いて“Ｄ′　−ペプチドとも称されている。このペプチ
ドのカルボキシル末端と所望の真核生物タンパク質のア
ミノ酸配列との間には、所望のタンパク質を化学的に又
は酵素的に切断させ得る１以上の遺伝的にコード可能な
アミノ酸からなる配列が存在している。本発明の好まし
い態様において、アミノ末端には、ｌｊ／Ｓ−Ａ　ｌ　
ａからなる短鎖アミノ酸配列が続き、場合により、１〜
１０個、特に１〜３個、の他の遺伝的にコード可能なア
ミノ酸配列、このまくは２個のアミノ酸配列、特にＬｙ
ｓ−Ｇｌ”ｙが続いている。

このように、本発明は下記一般式の融合タンパク質に関
する。

Ｍｅ　ｔ−Ｘｎ−Ｄ’　−Ｙ−Ｚ 上記式中、 ｎは、０又は１であり、 Ｘは、１〜１２個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配
列、好ましくはＬｙｓ−Ａｌａ、であり、Ｄ′は、大腸
菌ｔｒｐオペロン中のＤ−ペプチドのアミノ酸２３〜９
３番目の配列領域における約７０個のアミノ酸の配列で
あり、 Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断さｔ！′ＹＩる１以上
の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列を表わし、 ２は、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である。

本発明の他の側面及び好ましい態様は以下に記載され、
特許請求の範囲に規定されている。

勿論、融合タンパク質の（宿主に固有の）不要部分はで
きるだけ小さいことが有利であるが、その理由は細胞が
ほとんどパバラスト（ｂａｌｌａｓｔ　）″を産生せず
、そのため所望のタンパク質の収率が高くなるからであ
る。しかも、不要部分が切断された場合に、副産物がほ
とんど生じなくなり、作業性を簡易化するからである。

これに対立するファクターは、不要部分の（仮説）″保
護機能″が一定サイズ以上のときにのみ期待されるとい
うことである。しかしながら、意外なことに、本発明に
おいて選択されたＤ−タンパク質由来しグメントは、そ
れがわずか約７０１１Ｎのアミノ酸であるにもかかわら
ず、この課題を克服することが明らかにされたのである
。

多くの場合、特にＸが１ｙｓ−Ａｌａを表す、即らＮ末
端にこの配列を有する好ましい態様において、形成され
る融合タンパク質は、不溶性である。後者は可溶性タン
パク質から容易に分離することができ、これにより作業
性が一層簡単になり、収率が増大覆る。不溶性融合タン
パク質が形成されたことは予想外であったが、その理由
は、一方において細菌由来部分がわずか約７０個のアミ
ノ酸であって非常に小さく、しかも他方においてそれが
宿主細胞内の溶液中に存在するタンパク賀成分であった
からである。

“Ｄ−ペプチドのアミノ［２３〜９３番目の配列領域に
おける約７０個のアミノ酸”とは、それに関し自体公知
の方法で変更を加えることが可能であるもの、即ち、本
発明の融合タンパク質の性質を著しく変化させずに個々
のアミノ酸を削除、置換又は交換させることが可能であ
るもの、を意味する。本発明は同様にこの種の変更にも
関する。

望ましい真核生物タンパク質は、好ましくはヒルジンの
ような生物活性タンパク質又はヒトプロインシュリンの
ようなタイプのタンパク質前駆体である。

融合タンパク質は適切な系での発現によって得られ、特
に好ましい態様においては、宿主細胞の破壊後、該タン
パク質がその難溶性の故に濃縮されている沈殿物から単
離される。したがって、それを細胞の可溶成分から分離
することが容易になる。

適切な宿主細胞は発現系が公知のすべてのものであり、
即ち、畦乳類細胞及び微生物、好ましくは細菌、特に大
腸菌であって、したがってこの場合における融合タンパ
ク質の細胞由来部分は宿主大Ｗｊｊ菌に固有のタンパク
質となる。

本発明の融合タンパク質についてコードするＤＮＡ配列
は、選択された発現系において満足すべき発現を確実化
さぼるベクター中に公知の方法で組込まれる。

細菌性宿主の場合は、ファージλ、ｈｓｐ、ｏｍｐのＬ
ａｃ、Ｔａｃ、Ｐ　　又はＰＲからなる群よりプロモー
ター及びオペレーターを選択するか、あるいは例えば西
ドイツ特許公開第３．４３０，６８３号公報（欧州特許
出願第０．１７３，１４９号明細書〉に記載されている
ような合成プロモーターを選択することがｌｔｒ都合で
ある。

特に適切なベクターは、大腸菌ｔｒｐオペロンの次記要
素：即ち、Ｌ−ペプチドのプロモーター、オペレーター
及びリボソーム結合部位、を有するものである。このＬ
−ペプチドの最初の３個のアミノ酸がコード領域に続き
、次いで短鎖アミノ酸配列及びｔｒｐオペロン中のＤ−
タンパク質のアミノＩ！１２３〜９３番目に続いている
ことが特に有利である。

所望のポリペプチドの切断を可能、ならしめる中間配列
Ｙは、この所望のペプチドの構造いかんにかかっている
。例えば、この構造がメチオニンを有していない場合は
、ＹはＭｅｔを表わすことができ、したがって臭化シア
ンによる科学的切断が行なわれる。連結構造物ＹのＣ末
端にシスディンが存在するか、又はＹがＣｙＳを表わす
場合は、システィン特異性の酵素的切断又は化学的切断
が、例えば特異的Ｓ−シアニル化後に行なうことができ
る。連結構成物Ｙのカルボキシル末端にトリプトファン
が存在するか、又はＹ　ｂ＜　Ｔ　ｒ　ｐを表わす場合
は、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる化学的切断を行な
うことができる。ＹがＡｓｐ−Ｐｒ。

を表わす場合は、タンパク貿分解的切断が自体公知の方
法によって行うことができる（Ｄ。

Ｐｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、　４０（
１９７０）　１１７−１１７３）　。Ａ　ｓ　ｐ　−Ｐ
　ｒ　ｏ結合は、或に明らかであるように、Ｙが（ＡＳ
ｐ）ｍ−Ｐｒｏ又はＧｌｕ−（Ａｓｐ＞　　−Ｐｒｏ　
（ｍは１．２又は３を表わす）である場合に、より一層
酸反応性となることができる。このような場合に得られ
る切断産物は、Ｎ末端のＰｒｏで始まり、Ｃ末端のＡＳ
ｐを終了する。

酵素的切断の例も同様に公知であり、改善された特異性
をもつ修正酵素を用いることも可能である〔例えば、Ｃ
，Ｓ、　Ｃｒａｉｋ　ａｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ
　２２８（１９８５）　２９１−２９７）。所望の真核
生物ペプチドがヒトプロインシュリンである場合は、配
列Ｙとして、１〜リブシンによる切断が可能なアミノ酸
（Δｒｑ１１ｊ／Ｓ）がプロインシュリンのＮ末端アミ
ノ酸（Ｐｈｅ）に結合しているペプチド配列、例えばＡ
ｌａ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−ＡｒＣ＋を選択するこ
とができるが、それはアルギニンの特異的切断がプロテ
アーゼたるトリプシンによって行い得るからである。所
望のタンパク質がアミノ配列１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇを有しない場合は、ファクターＸａによって切断
さＵることもできる（欧州特許出願箱０．１６１，９３
７号明細書）。

配列Ｙのデザインにおいては、合成環境を考慮にいれ、
しかも制限酵素の適切な切断部位を挿入しておくことも
できる。アミノ酸配列Ｙに相当するＤＮＡ配列としては
、このようにリンカ−又はアダプターの機能をも兼ねさ
せることができる。

本発明の融合タンパク質は、大腸菌ｔｒｐオペロンのコ
ントロール下で発現させることが有利である。ｔｒｐオ
ペロンのプロモーター及びオペレーターを有するＤＮＡ
セグメントは、現在市取されている。ｔｒｐオペロンの
コントロール下でのタンパク質発現については、例えば
欧州特許出願箱０．０３６，７７６号明細書のように、
数多く掲載されてきている。ｔｒｐオペロンの誘導は、
培地中において、Ｌ−１−リブトファンの非存在下で、
及び／又はインドリル−３−アクリル酸の存在下で行な
うことができる。

ｔｒｐオペレーターによるコントロール下、Ｌ−ペプチ
ドをコードするＤＮＡ領域の転写が最初に行なわれる。

１４個のアミノ酸からなるこのＬ−ペプチドは、１０位
及び１１位にそれぞれＬ−トリブトフ７ンを有している
。Ｌ−ペプチドのタンパク質合成速度は、下流構造遺伝
子が同様に翻訳されるのか否か、又はタンパク質合成が
終了したのか否かにかかつている。Ｌ−１〜リブトフア
ンが欠失している場合、Ｌ−ｔ−リブトファンについて
のｔＲＮ△が低濃度になるため、Ｌ−ペプチドの合成速
度が遅くなり、次のタンパク質が合成される。反対に、
Ｌ−トリ１１へファンが高１１’Ｊ瓜である場合は、対
応するｒｒｌＮＡセグメントが急速に読込まれてタンパ
ク質生合成が終了するが、その理由は、ｍＲＮＡがター
ミネータ一様構造をしていると考えられるからである（
Ｃ，Ｙａｎｏｆｓｋｙら、同上）。

ｍＲＮＡ翻訳頻度は、開始コドン近傍におけるヌクレオ
チドの性質によって一般に左右される。

このようにｔｒｐオペロンが介入する融合タンパク質の
発現においては、融合タンパク質の構造遺伝子の開始部
分にＬ−ペプチドの最初の数個のアミノ酸に関するヌク
レオチドを挿入することが好ましいようである。ｔｒｐ
系を利用する本発明の好ましい態様においては、Ｌ−ペ
プチドの最初の３個のアミノ酸（以下、Ｌ′　−ペプチ
ドと称される）に関するヌクレオチドが、融合タンパク
質のＮ末端アミノ酸についてのコドンとして選択された
。

したがって、本発明は融合タンパク質の発現のためのベ
クター、好ましくはプラスミド、にム関し、ベクターの
ＤＮＡは５′末端から（適切な順序でかつ段階的に）次
の構造、即ち、プロセーター、オペレーター、リボソー
ム結合部位及び融合タンパク質に関する構造遺伝子、を
右してＪ３つ、後者は所望のタンパク質配列の上流にア
ミノ酸配列■（後記）を右する。構造遺伝子の上流に、
即ら構造遺伝子の最初のトリブレラ１〜としで、ｌｉ！
］　！７（ｊ］コドンＡＴＧ＞と、場合により更に他の
アミノ酸についてのコドンとが位置してＪ３す、更なる
コドンは開始コドンとＤ′　−配列との間、即ら、Ｄ′
　−配列と所望のタンパク質についての遺伝子との間に
配回されている。構Ｗ　ｍ伝了の上流のＤＮＡ配列の選
択は、所望のタンパク質のアミノ酸組成にかかっている
が、これは、融合タンパク質からの所望のタンパク質の
切断を可能ならしめるためである。

ｍＲＮＡレベルでの塩基の対合を阻止するために、ＡＴ
Ｇ開始コドンの下流におする足初の数個のアミノ酸の個
々のトリブレットを修正することが本発明での融合タン
パク質の発現において右利であることは立証可能である
。このタイプの修正と（、Ｌ１正に、当業者が周知のよ
うに、Ｄ′　−タンパク質における個々のアミノ酸の修
正、削除又は伺加であり、本発明は同様にそれらにも関
する。

比較的小さなプラスミドはいくつかの利点をしたらりこ
とから、本発明の好ましい態様ｅは、ｐＢＲ３２２由来
プラスミドからテトラサイクリン耐性に関する構造遺伝
子のＤ　Ｎ　Ａ　Ｌ−グメン１〜を取除く。即ち、２９
位のＨｉ　ｎｄｐｉ制限部位から２０６６位のＰｖｕＩ
Ｉ制限部位までのセグメントを削除することが有利であ
る。（非本質的部分に位置する）ｔｒｐオペロンの（読
取り方向の）開始部分におけるＰｖｕＩＩ制限部位を利
用することによって、本発明のプラスミドからやや大き
なりＮＡ上セグメント取除くことは特に有利である。

このようにして得られるフラグメン１−を二つのＰｖＵ
■制限部位で心接結合さＶることは可能である。約２ｋ
ｂｐ短縮されて得られたプラスミドは発−現を増大させ
、これによって宿主細胞内における複製数の増大に寄与
することができる。

本発明は下記の踏倒において詳細に説明されている。

例　　１ ａ）　大腸菌染色体ＤＮＡをＨｉｎｆＩＩで切断し、ｔ
ｒｐオペロンからプロモーター、オペレーター、Ｌ−ペ
プチドの構造遺伝子、アテニュエーター及びｔｒｐ−Ｅ
構造遺伝子の最初の６個のアミノ酸についてのコドンか
らなる４９２ｂＣ１対フラグメンｈを単離する。このフ
ラグメントをクレノウボリメラーゼによってデオキシヌ
クレオチド三リン酸で埋填し、その両末端でｌ−１ｉ　
ｎ　ｄ　ｎＩｌ識部位含有Δリゴヌクレオヂドに結合し
、次いでＨｉｎｄ■で切断する。このようにして得られ
たＨｉｎｄ■フラグメントをｐＢＲ３２２の１−（ｉｎ
ｄ［Ｉ［制限部位に結合させる。これによって、プラス
ミドｐｔｒｐＥ２−１が得られる（Ｊ、　Ｃ，Ｅｄｍａ
ｎｎ　Ｃｔａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２９１　（１９８
１）　５０３−５０６）　。これを説明どおりにプラス
ミドｐｔｒｐＬｉに変換する。

合成オリゴヌクレオチド（Ｎ１）及び（Ｎ２）：５’　
　　ＣＧＡ　　　ＣΔ八　　ＴＧ八　　へへＧ　　　Ｃ
Ａ八　　八ＧＧ　　　３°　　　（Ｎ１）５’　　　Ｃ
ＣＴ　　　ＴＴＧ　　　ＣＴＴ　　　ＴＣ八　　ＴＴＧ
　　　Ｔ　　　　　３’　　　　（８２）を用い、二重
鎖オリゴヌクレオチド（Ｎ３）：５°　　ＣＧＡ　　　
Ｃへへ　　ＴＧΔ　　へへＧＣへＡ　　　ＡＧＧ　　　
３’３’　　　　　Ｔ　　　ＧＴＴ　　　ＡＣＴ　　　
ＴＴＣＧ丁ＴＴＣＣ，５゜ハイブリッド形成させること
によって、Ｌ−ペプチドの最初の３個のアミノ酸につい
てのＤＮＡ配列を組込み、プラスミドｐｔｒｐＬ１　（
第１図）ＣＩａＩ部位に他のＤＮＡ挿入のための制限部
位（ＳｔｕＩ）を形成させる（第１図）プラスミドｐｔ
ｒｐＬｌを製造者の指示に従って酵素Ｃ１ａＩと反応さ
せ、混合物をフェノールで抽出し、ＤＮＡをエタノール
で沈殿させる。開環したプラスミドを大腸菌由来アルカ
リホスファターゼと反応させ、５′末端でホスフェート
丼を除去する。

合成ヌクレオチドを５′末端でホスホリル化し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて、ホスファターゼで処理された開
環プラスミドに挿入する。リガーゼとの反応後、大腸菌
２９４への形質転換、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性形質
転換株の選別及び、Ｓｔｕ■制限部位の形成を行なう。

得られたクローンの約８０％は期待どおりの制限部位を
有していた。第１図に示されたヌクレオチド配列は、配
列分析によって決定された。Ｌ−ペプチドのリボソーム
結合部位の下流に１−〜ペプチドの最初の３ｇのアミノ
Ｆｌｉｔ（Ｌ’　　−ペプチド）についてのヌクレオチ
ドトリプレットを有し、続いて他のＤＮＡを順次挿入す
ることによりＬ−ペプチドの最初の３個のアミノ酸をａ
む融合タンパク買の形成を可能ならしめる５ｔｕＩ部位
を右するプラスミドｐＨ１２０／１４が得られる。

ｂ）　上記で使用されたオリゴヌクレオチド（Ｎ１）の
例は、このオリゴヌクレオチドの化学的合成について説
明するために、以下で用いられている。

Ｈ，Ｊ、　Ｇａ１ｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ８　（１９８０）　１
０８１−１０９６の方法は、３′末端でヌクレオシド、
即ちこの場合はグアノシンを、３′　−ヒドロキシル基
を介してグラスビーズ支持体〔ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ
）市販のＣＰＧ　（’：ｌｌｌントロールされた多孔質
ガラス）ＬＣＡＡ　（長鎖アルキルアミン））に共有結
合させるために利用される。この方法では、Ｎ、Ｎ’　
　−ジシクロへキシルカルボジイミド及び４−ジメチル
アミノピリジンの存在下、改変支持体にＮ−２−イソブ
チリル−３’　　−０−スクシニル−５′　−ジメトキ
シトリチルエーテルとして反応Ｖしめられるグアノシン
を必要とし、スクシニル基のＭ離カルボキシル基にＪ、
っ−（支持体上の長鎖アミンのアミノ基がアシル化され
る。

合成の次の段階にＪ３いて、塩基成分は５′−〇−ジメ
トキシトリチルヌクレオシド−３′　−亜リン酸モノメ
チルエステルのジアルキルアミド又はクロリドとして使
用されるが、この場合において、アデニンはＮ６−ベン
ゾイル化合物の形、シ１−シンはＮ４−ベンゾイル化合
物の形、グアニンはＮ２−イソブチル化合物の形、アミ
ノ基のないヂミンは保護基なしの形である。

結合グアノシン１μモル含有支持体４０ｍｇを下式試薬
で逐次処理する。

ａ）　塩化メチレン ｂ）　塩化メチレン中の１０％１−リクロロ酢酸Ｃ）　
メタノール ｄ）　テトラヒドロフラン ｅ）　アセトニトリル ｆ）　無水アセトニトリル中の適切なヌクレオシドホス
ファイト１５μモル及びテトラゾール７０μモル（５分
間） ｑ）　　４０％ルヂジン及び１０％ジメヂルアミノビリ
ジン含有テトラヒドロフラン中の２０％無水酢酸（２分
間） ｈ）　テトラヒドロフラン ｉ）　２０％水及び４０％ルチジン含有テトラヒドロフ
ラン ｊ）　容積比５：４：１のコリジン／水／テトラヒドロ
フラン中の３％ヨウ素 ｋ）　テトラヒドロフラン及び １）　メタノール 本文において゛ホスファフィト″という語は、デ第４−
シリボース−３′　−亜リン酸のモノメチルエステルと
定義されるが、３番目の原子価は、塩基又は三級アミノ
基、例えばジイソプロピルアミンＩＢで飽和されている
。各合成段階にＪ３　Ｌノる収率は、それぞれ脱１ヘリ
デル化反応語、分光光度６１による波長４９６ｎｍでの
ツメ１〜キシトリデル陽イオンの吸光度測定によって調
べることができる。

オリゴヌクレオチドの合成が終了したら、Ａリボマー上
のメチルホスフェ−１・保ＩＪをｐ−ブΔクレゾール及
びトリエチルアミンの使用によって切断する。

オリゴヌクレオチドを、次いでアンモニアで３時間処理
することにより固体支持体から分離さぼる。濃アンモニ
アで２〜３日間オリゴマーを処理して、塩基上のアミノ
保護基を定損的に切断させる。このようにして得られた
粗生成物を高５１液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
又、はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製づ
゛る。

他のオリゴヌクレオチド類も全く同様にして合成される
。

Ｃ）　プラスミド１）ｔｒｐＥ５−１（Ｒ，＾。

Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｇｅｎｅ
　　９　　（１９８０）　　２７−４７　　）　　を装
ｙｒｉ者の指示どおりに制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ及び３
ａ　ｌ　Ｉと反応させて、約６２０塩！ｊ対のＤＮＡフ
ラグメントを切断する。合成オリゴヌクレオチド（Ｎ４
）及び（Ｎ５）： ５’　　ＡＧＣＴＴＣＣＡＴ　　ＧＡＣＧＣＧ　　Ｔ　
　３°　（Ｎ４）５°　ＡＣＧ　　ＣＧＴ　　ＣＡＴ　
　ＧＧＡ　　３°　　　　　（Ｎ５）をホスホリル化し
、３７℃で一緒にインキュベートし、ＤＮＡリガーゼの
使用によってプロインシュリンについてのプラント末’
４　Ｄ　Ｎ　Ａに挿入する（Ｗ、　Ｗｅｔｅｃａｍ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　１９（１９８２Ｈ７９−１８
３）。

＋１ｉｎｄＩ［Ｉ及び５ａｌＩと反応させた後、伸長さ
れたプロインシュリンＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ酵
素を用いて開環プラスミドに組込んで共有結合させ、こ
れによってプラスミドｐＨ１０６／４（第２図）を得る
。

プラスミドｐＨ１０６／　４を最初に再度Ｓａｔ王と反
応させ、重複末端をクレノウボリメラーぜで埋填してプ
ラント末端とし、生成物を次いでＭ　Ｓ　ｉ　Ｉ　Ｆ？
ｒ素と一緒にインキュベート覆る。プロインシュリンに
ついてすべてコードする部分を含む約５００ＪＷ基対の
ＤＮＡフラグメント及び大腸菌ｔｒｐオペロン由来り一
タンパク質の約２１０塩基対のセグメントを単１ｉｉ１
１−Ｊる。ＤＮＡフラグメントをプラント末端化し、プ
ラスミドｐＨ１２０／１４の５ｔｕＩ部位に挿入し、か
くしてプラスミドｐＨ１５４／２５（第３図）を得る。

これはｔｒｐオペロンのコントロール下における融合タ
ンパク質の発現に適しており、そのタンパク質において
は、アミノ酸配列Ａｌａ−８ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａ
ｒｇがＬ′　−及びＤ′　−ペプチドの後に位置し、そ
の後にプロインシュリンのアミノ酸配列が連結している
。

例　　２ プラスミドｐＨ１５４／２５　（第３図）を制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ及びｘｍａｍと反応させる。突出末端をクレノ
ウボ・リメラーゼで埋填し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて結
合させる。これによってプラスミドｐＨ２５４（第４図
）が得られ、これはｔｒｐプロモーターのコントロール
下におけるＬ−、Ｄ’　　−プロインシュリンアミノ酸
配列含有融合タンパク質の発現に適している。プラスミ
ドはｐＨ１５４／２５よりもやや小ざく、右利であるか
もしれない。

例　　３ 制限酵素ＭｌｕＩ及び３ａｌ■と一緒にプラスミドｐＨ
２５４（例２゜第４図）をインキュベートして、２８０
塩基対のＤＮＡセグメントに切断し、これを除去する。

残りのプラスミドをタレノウポリメラーゼによってプラ
ント末端型に変換し、ＤＮＡリガーゼによって再度環化
させる。これによりプラスミドｐＨ２５５（第４図）が
得られるが、これは制限部位ＭｌｕＩ、５ａｌＩ及びＥ
Ｃ０ＲＩの一つに構造遺伝子を挿入するのに適している
。Ｌ’　、Ｄ’　　−タンパク質含有融合タンパク質の
形成は、誘導条件下で行われる。当然のことながら、適
切なリンカ−によって、更にプラスミドｐｌ−１２５５
に制限部位を挿入することも可能である。

例　　４ プラスミドｐｌ−４１５４／２５（第３図）を酵素１ｙ
ｊｌｕ工及びＥＣ０ＲＩと一緒にインキュベートし、切
断されたＤＮＡフラグメン１〜（約３００塩基対）を除
去する。残りのプラスミドをタレノウポリメラーゼによ
り埋填する。閉環をＤＮＡリガーゼの作用にＪ：って行
なう。ｉｒＪられるプラスミドｐｉ−１２５６（第５図
）は、ＥＣｏＲＩ部位に構造遺伝子を挿入り°るために
使用することができる。

例　　５ 制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｒｕＩを用いたプラスミドｐ
Ｈ２５６（例４゜第５図）からの６００塩基対プラスミ
ドの削除により、プラスミドｐＨ２５７（第５図）が得
られる。このためには、ｐｔ−１２５６を最初にＢａｍ
ＨＩと一緒にインキュベートし、プラント末端をタレノ
ウボリメラーＵにより形成させる。ＮｒｕＩとのインキ
ュベート及び６００塩基対フラグメントの除去の後、Ｄ
ＮＡリガーゼと一緒にインキュベートすると、ｐＨ２５
７が形成される。

例　　６ ｈａｃリプレッサー（Ｐ、Ｊ、　Ｆａｒａｂａｕｇｈ、
　Ｎａｔｕｒｅ２７４　（１９７８）　７６５−７６９
）をプラスミドｐＫＫ１７７−３　〔八ｍａｎｎ　　ｅ
ｔ　　ａｌ、、　　Ｇｅｎｅ　　２５　　（１９８３）
　　１６７）　　に挿入すると、プラスミドｐＪＦ１１
８が１！１られる。

これをＥｃｏＲＩ及び５ａｌＩと反応させ、残留プラス
ミドを単離する。

大きさが約４９５塩基対のフラグメントを、５ａｌＩの
作用とＭｓｔＩとのインキュベ−１・とによって、プラ
スミドｐＨ１０６／４（第２図）から得る。

合成されたオリゴヌクレオチド（Ｎ６）及び（Ｎ７）： ５゛　　＾ＣＧ　　ＡＡＴ　　ＴＣＡ　　ＴＧＡ　　Ａ
ＡＧ　　ＣＡＡ　　ＡＧＧ　　３°　　　（Ｎ６）５“
　　ＣＣＴ　　丁ＴＧ　　ＣＴＴ　　ＴＣＡ　　ＴＧＡ
　　ＡＴＴ　　ＣＧＴ　　３’　　　　　（Ｎ７）をホ
スホリル化し、ＤＮＡリガーゼによってプラント末端Ｄ
ＮＡフラグメントに付加させる。

ＥＣ０ＲＩ及び５ａｌＩとの反応により、開環プラスミ
ドｐＪＦ１８８と結合させるための重複末端を形成する
。

このようにして得られたハイブリッドプラスミドによる
大腸菌２９４への形質転換後、適切なりローンを制限フ
ラグメン１〜の大きさに基づいて選別する。このプラス
ミドはｐＪ１２０（第６図）と称される。

融合タンパク質の発現は、下記のように振煮フラスコ内
で行なう。

アンピシリン５０μ「／−含有ＬＢ培地（Ｊ、ｌｌ。

Ｈｉｌｌｅｒ、　［ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｈｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　１９７２　）中におけるプラスミドｐＪ
１２０含有大腸菌２９４形質転換株の一夜培養物を約１
＝１００の比率の新鮮培養物を調製するために使用し、
増殖は吸光度測定によって追跡する。吸光度が０．５の
場合は、イソプロピルβ−Ｄ−ガラク１〜ピラノシド（
ＬＰＴＧ）をその濃度が１ｍＭとなるような母で培養物
中に加え、細菌を１５０〜１８０分間後遠心分離により
除去する。細胞を緩衝液混合物（７Ｍ尿素、０．１％Ｓ
ＤＳ、Ｏ，ＩＭリン酸少トリウム、ｐＨ７，０）中で５
分間沸騰させ、試料をＳＤＳゲル電気泳動プレートに供
する。電気泳動後、プラスミドｐＪ１２０含有細菌は、
予想される融合タンパク質の大きさに相当し、しかもイ
ソシュリンに対する抗体と反応Ｊるタンパク買バンドを
与える。融合タンパク質を単離した後、予想されるプロ
インシュリン誘導体を臭化シアンで切断させて得ること
ができる。細菌破壊（Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ　ｒダ
イノミルＪ　（Ｄｙｎｏ−ｍｉｌｌ　）　）と遠心分離
との後、Ｌ’　、Ｄ’　　−プロインシュリン融合タン
パク質は沈殿物中に存在しているため、著しい分の他の
タンパク質を上澄と一緒に除去することができる。

誘導開始条件を培養物を振盪する際に課づ。人規横発酵
の場合は、それに応じて吸光度を修正し、できとにＩ　
ＰＴＧＩ１１度を若干変更することが有利である。

例　　７ ５０μｇ／ｍｅアンピシリン含有Ｌ　Ｂ　１ｓ地中にお
ける一夜培養物をプラスミドＤＨ１５４／２５（第３図
）含有大腸菌２９４形質転換株から調製し、翌朝カザミ
ノＭ２Ｏ００μ７／ｄ及びチアミン１μ含有 中で約１：１００の比率に希釈する。吸光度が０、５の
場合は、最適濃度が１５μｇ／ＩｄとなるＪ：うにイン
ドリル−３−アクリル酸を加える。２〜３時間インキュ
ベート後、細菌を遠心分離によって除去する。ＳＤＳゲ
ル電気泳動では、融合タンパク質として予想される位置
に、インシュリンに対する抗体と反応する極めて顕著な
タンパク質バンドがみられる。細菌破壊と遠心分離との
後に、Ｌ’　、Ｄ’　　−プロインシュリン融合タンパ
ク質は沈殿物中に存在しているため、再度著しいａの他
のタンパク質を上澄と一緒に次いで除去する。

本例の場合にＪ３いても、誘導開始条件が培信物を振盪
する際に課される。大容岱発酵の場合は、カザミノｖｉ
濃度を変更するか又はＬ−トリプトファンを添加するこ
とを要する。

例　　８ プラスミドＤＨＩ　５４／２５　（第３図）をＥＣ０Ｒ
Ｉで開環し、突出ＤＮＡ−重鎖をクレノウボリメラーゼ
で埋填する。このようにして得られたＤＮＡをＭＩｕＩ
１５１素と一緒にインキュベートし、インシュリンをコ
ードするＤＮＡをプラスミドから切除する。ゲル電気泳
動による分離を行ない、このフラグメントを残りのプラ
スミドから分離し、残留プラスミドを単離する。

西ドイツ特許公開用３．４２９，４３０号公報（欧州特
許出願第Ａ１０，１７０．０２４号明細書）の第３図に
示されたプラスミドを制限Ｖｆ素ＡＣＣＩ及び３ａｌと
反応させ、ヒルジン配列含有ＤＮＡフラグメントを除去
する。５ａｌＩ制限部位の突出部位をフレノウポリメラ
ーゼで埋填した後、ＤＮＡヒゲメン１−を次式＜Ｎ８）
：Ｈｅｔ　　Ｔｈｒ ５’　　　ＣＣＣＡＣＧ　　　ＣＧＴ　　　Ａ１ＧＡＣ
ＧＴ３゜５’　　　ＧＧＧ　　　ＴＧＣＧＣ八　　■へ
ＣＴＧＣＡＴＡ　　　５°　　　（Ｎ８）の合成りＮＡ
と結合させる。結合生成物をＭｌｕ工と一緒にインキュ
ベートリ−る。酵素を６５℃で不活化した後、ＤＮＡ混
合物を３７℃（・１時間ウシアルカリホスファターゼに
より処理する。次いで、フェノール抽出によって混合物
からホスファターゼ及び制限酵素を除去し、ＤＮＡをエ
タノール沈殿により精製する。このように処理されたＤ
ＮＡを、Ｔ４リガーゼによって、残留した開環プラスミ
ドｐ　ｆ−１１５／１．　／　２５に挿入することによ
り、プラスミドｐＫ１５０が得られるが、これはマキ４
Ｊム−ギルバート（Ｈａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂｅｒｔ　）
法による制限分析とＤＮＡ配列決定とによって特徴づけ
られた。

例　　９ プラスミドｐＫ１５０（第７図）含有大腸菌２９４をア
ンピシリン３０〜５０μｇ／−含有ＬＢ培地中３７℃で
一夜ｉａ養する。培養物を力１アミノ酸２０００μｇ／
ｄ及びヂアミン１μり／彪含有Ｍ９培地で１：１００の
比率に希釈し、混合物を連続的に撹拌しながら３７℃で
インキュベートする。６００ｎｍにおける吸光度が０．
５又は１の場合は、インドリル−３−アクリル酸を最終
濃度１５μｇ／ｌ１ｔｉとなるまで加え、混合物を２〜
３時間又は１６時間それぞれインキュベートする。

細菌を次いで遠心分離により除去し、加圧下０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）中で破壊する。難
溶性タンパク質を遠心分離により除去し、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分析する。それによれば、
誘導されたｔｒｐオペロンの細胞は、１４，０００〜２
０．０００ドルトンの領域に、非誘導細胞中には存在し
ない新しいタンパク質を含有していることを示している
。融合タンパク質を単離し、臭化シアンと反応させた後
、ヒルジンを分離させる。

例１０ 下記手順により、ｔｒｐ−［）配列をできるだけ多くの
絶間の原核生物発現系に組込むために、各種制限酵素の
認識部位をできるだけ多く含むＤＮＡ配列を、ｔｒｐ−
Ｑ配列の５′末端の上流に導入させることができる。

プラスミドＤＵＣ１２及びｐＵＣ１３ （（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　ＢｉｏｃｈｃＩＩｌ
ｉｃａｌｓ）ゼントゴール（Ｓｔ、　Ｇｏａｒ）　５４
０１　：分子生物学カタログ（Ｔｈｅ　Ｈｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　）　１９
８３年、ト１録第８９頁〕はポリリンカー配列を右する
が、これは、プラスミドｐｕｃｉ３において、ＸｍａＩ
及びＳａＣ工の制限切断部位間に、プラスミドｐＫ１５
０　（第７図）由来１−１ｉｎｄｌｌ−Ｌニルジン−８
ａＣ■フラグメン１−を結合けしめられるプラスミドｐ
１０６／４（第２図）由来Ｍｓｔ■−Ｆ（ｉｎｄｌｌｌ
ｔｒｐフラグメン１へを沖入するためである。

このためには、プラスミドｐＵＣ１３のＤＮＡを最初に
制限酵素ＸｍａＩで処理する。直鎖プラスミドの末端を
タレノウボリメラーげ反応によって埋填する。エタノー
ル沈殿後、ＤＮＡを酵素８８０丁で処理し、再度エタノ
ールにより反応況合物から沈殿させる。Ｄ　Ｎ　、Ａを
次いで、プラスミド１）Ｈ１０６／４から単離された１
ｙｌｓｔニー１−１ｉｎｄＩ［［ｔｒｐ−Ｄフラグメン
ト、プラスミドｐＫＩ　５０から単離されたＨｉｎｄＩ
ＩＩ−８ａｃＩヒルジンフラグメント及びＴ４　ＤＮＡ
リガービと結合混合物水溶液中で反応させる。

このようにして得られたプラスミドｐＫ１６０は、酵素
ＸｍａＩ、ＳｍａＩ、Ｂ　ａ　ｍ　）−（Ｉ、ＸｂａＩ
、Ｈｉ　ｎｃＩＩ、Ｓａ　ｌ　Ｉ、ＡＣＣＩ、ＰｓｔＩ
及びＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を含有した多数制限ＩＳ
５素認識配列を、ｔｒｐ−［）配列のザぐ上流に有して
いる。更に、ＥＣ０ＲＩ制限部位が本構造〈第８図）に
おけるヒルジン配列の３′末端の下流に存在している。

例１１ プラスミドｐＨ１３１１５は、（未公開の西ドィツ特；
１出願第Ｐ３５　１４　１１３．１号明細書、例１、図
１に示されているように）下記の通りに製造される。

プラスミドｐｔ　ｒ　ｐＬ　１　（，１，Ｃ，Ｅｄｍｏ
ｈら、同ｊニ〕をＣｌａ■で開環し、合成されｌ、二自
己相補的オリゴヌクレオチド（Ｎ９）： ５’　　ｐＣＧＡＣＣ△丁ＧＧＴ　　３’　　　（Ｎ９
）と結合させる。このようにして得られたプラスミドＤ
Ｈ１３１１５（第９図）を、この方法（・導入された制
限酵素ＮＣＯ■の制限部位で開環し、得られた突出−重
鎖末端をクレノウボリメラーぜ反応によって埋填する。

直鎖ブラン１〜末端ＤＮＡを次いＣ酵素ＥＣ０ＲＩで切
断し、得られた二つのＤＮＡ配列のう）う大きい法を、
エタノール沈殿にＪ、っ−Ｃ小さい配列から分離さ已る
。このＪ：うにして得られたプラスミドＤ　ｉ（１３１
／　５の残りのプラスミドＤＮＡを、１４リガービとの
反応によって、ｔｒｐ−４）’　　−ヒルジンを一コー
ドするｐＫ１６０山来フラグメン１−と結合させる。こ
のフラグメン１〜を、Ｈｉ　ｎ　ｃ　■及びＥＣ０ＲＩ
でプラスミドを開環することにより、プラスミドｐＫ１
６０から切断させる。こフラグメントをゲル電気泳動に
よって残留プラスミドから分離し１次いでゲル物質から
溶出させる。結合生成物を大腸菌に１２に形質転換する
。プラスミドＤＮＡ含有クローンを単離し、制限分析及
びＤＮＡ配列決定分析によって１？Ｉ徴を把握する。こ
のようにして得られたプラスミドｐＫ１７０は、Ｍ　ｅ
　’ｔ　−Ａ　Ｓ　ｐ−３ｅｒ−ΔｒＱ−Ｇｌｙ−８ｅ
ｒ−Ｐｒｏ−ＧＩｙ−ｔｒＤ−Ｄ’　　−（ヒルジン）
をコードするＤＮＡ配列をｔｒｐオペレーター上に融合
して有している（第９図）。

例１−２ プラスミドｐＪＦ１１８（例６）をＥＣ０ＲＩで開環し
、突出ＤＮＡ末端をクレノウボリメラーゼ反応によって
プラン１〜末端に変換する。このようにして処理された
ＤＮＡを次いＣ酵素Ｓａｌ工で切断し、知＊ＥｃｏＲＩ
−８ａ　ｌ　ＩＩ７ラグメントをゲル電気泳動により除
去する。

プラスミドｐＫ１７０　（例１１）をＮｃｏＩで切断し
、突出末端をタレノウポリメラーゼの使用によりプラン
１〜末端に変換する。プラスミドＯＮ△をエタノール沈
殿によって反応混合物から除去し、酵素１−ｔ　ｉ　ｎ
　ｄ　Ｉｌｌ及びＢａｍＨＩで処理する。得ら４１だ二
つのフラグメント、即＃１５ＮＣＯＩ（末端が埋填され
ている）−ｔｒｐ−［）’　　−ｌ」１ｎｄＩ［！フラ
グメント及びｌ−１ｉ　ｎｄｌｌ！−ヒルジン−Ｂ　ａ
　ｍ　ＨＩフラグメント（西ドイツ特許公開筒３　、４
２９　、４３０　’ｉ’ｙ明細書）が単離される。

二つの７ラグメン１−をゲル電気泳動による分＋ｍ後に
甲１ｌｌ１１する。

更に、西ドイツ特許公開筒３．４２９，４３０号明細占
の図２に示された３ａｍｌ−ＩＩ〜Ｓａ１■−ヒルジン
■フラグメントを単離する。結合反応では、四つのフラ
グメント、即ち残りのプラスミドｐＪ　Ｆ　１１８、Ｎ
Ｃ０Ｉ−ｔｒｌ）−Ｄ’　　−Ｈｉ　ＩＩ　ｃｊ　ＩＩ
Ｉフラグメン１へ、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　−ヒルジン
−Ｂ　ａ　ｎＩ　Ｈｉフラグメン１−及びヒルジン１■
フラグメント、を次いて・−緒に反応させ、（！ネられ
たフラグメンｔ−ｐＫ１８０（第１０図）を大腸菌に１
２−Ｗ３１１０に形質転換させる。適切なプラスミドか
否かは、プラスミドＤ　Ｎ　Ａ中にＥＣ０ＲＩ−ｔｒｐ
−１）’　　−ヒルジン−３ａ　！　ｉ７ラグメントを
検出することができるかどうかによって決定される。ｔ
ｒｐ−Ｄ’　　−ヒルジン配列を次いでｔａｃプロモー
ターに結合させる。融合タンパク質は例６のようにして
発現せしめられる。

漣ユニ ｐＨ１２０／１４　（例１、第１図）、ｐｔ−１１５４
／２５　（例１、第３図）、ｐＨ２５６（例４、第５図
）、ｐＫ１５０（例８、第７図）及びｐＫ１７０（例１
１、第９図）のようなｐＢＲ３２２由来のプラスミドは
、図中で時計回り方向に、ｔｒｐプロモーター及びオペ
レーター含有フラグメントの領域内であるが、プロモー
ター領域外において、融合タンパク質の開始コドン（ｐ
ＢＲ３２２の２９位（７）ＨｉｎｄＩ［Ｉｌ、：相当ス
ル）隣の）ｌｉｎｄ１１部位との間に史にＰＶｕＩＩ部
位を有している。

上記ＰＶｕＵ部位に結合するＤＮＡセグメントとＤＢＲ
３２２の２０６６位に位置するＰｖｕＭ部位との切断に
よるクローンタンパク質（即ち、融合タンパク質）の収
率は著しく増大することが判明した。

ｐＨ１５４／２５☆を得るためプラスミドｐＨ１５４／
２５の短縮化については下記に例示されており、このた
めには上記された他のプラスミドに応じて行なうことが
可能である（短縮化されたプラスミドは、星印宜によっ
て同様に区別されている）。

ｐＨ１５４／２５を（Ｉｆ造者の指示に従い）ＰｖｕＩ
［と反応させて、三つのフラグメントとする。

フラグメント１：　プロインシュリン遺伝子のｐｖｕｌ
ＩＪＩ限部位からｐＢＲ３２２の２０６６位に位置する
ｐｖ、ｕｌ［制限部位までの断片フラグメント２：　　
ｔｒｐプロモーター近傍のｐＶｕｌｌ！＋１限部位から
プロインシュリン遺伝子のｐ　Ｖ　Ｌｊ　ｒ［部位まで
の断片 フラグメント３：ｔｒｐブ０モーターフラグメント近傍
のＰｖｕｌＩ部位からｐＢＲ３２２の２０６６位に位置
するＰｖｕＩＩ部位までの断片フラグメントは、アガロ
ース上での電気泳動により分離することができ、しかる
侵単離される（Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｉ、、　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ　ｔ！ａｒｂｏｒ、　１９８２　）。

フラグメント１及び２を、プラント末端条件下、酵素Ｔ
４ＤＮＡリガーゼによって結合させる。大腸菌２９４へ
の形質転換後、完全なプロインシュリン配列をもつプラ
スミドを含有していて、したがって望ましい順序でフラ
グメントを有するコロニーか否かについて試験する。プ
ラスミドｐＨ１５４／２５☆は第１１図に示されている
。

融合タンパク質の量に関し著しい増加が発現に際して観
察されるが、発現は前記諸侯に記載されたように行なわ
れる。

例１４ プラスミドｐＨ１５４／２５☆（例１３、第１１図）を
ｌ−１ｉｎｄｌｆｌ及びＳａ　ｌ　Ｉテ切断し、（プロ
インシュリン配列をもつ）小フラグメントをゲル電気泳
動によりて分離する。大フラグメントを単離し、合成り
ＮＡ　（Ｎ１０）：（Ａｌａ）Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｏ
　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　ＩＩｓ　Ｇｌｕ（Ｇｌｙ）（Ａｒｇ
）＾ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＡＴＧ
　ＡＴＣＧＡＧ　ＧＧ　　　（ＮＩＯ）ＡＣＣＣＴＣＣ
ＴＡ　ＧＧＡ　ＴＡＣＴＡＧ　ＣＴＣＣＣＡ　　ＧＣＴ
と結合させる。プラスミドｐｉｎｔ／３（第１３図）が
形成される。

ＤＮＡ（Ｎ１０）は、化学的切断用のいくつかの下記切
断部位を含有したアミノ酸配列をコードしている。

ａ）　臭化シアン用のＭｅ　ｔ。

ｂ）　　Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ又は８８１
）用のＴｒｐ。

Ｃ）　タンパク質分解的切断用のＡＳＦ）−Ｐｒｏ　（
上流のＧ＋ｕは酸の作用によってＡｓｐ−Ｐｒｏ結合を
更に弱める）。

このコード化ポリペプチドの読取り枠内へのこのＨｉｎ
ｄＩ［ｌ−８ａｌＩ−リンカ−（ＮＩＯ＞の導入に際し
、化学的切断用として上記の何を選択するかは、所望の
タンパク質のアミノ酸配列及び切断剤に対するその感受
性によって決まる。

図面は、大きさに比例させて描かれてはいない。

ＬｌＬ員亙月ユ ３ｅｒ　Ａｓｎ　Ｑｔｙ　ｌ−１ｉｓ　Ａｓｎ　Ｖａｔ
　　Ｖａｌ　　ｌｌｅＴｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ
　　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＧｉｎＴｈｒ　Ｌｅｕ　
　Ｉｔｅ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＬｅｕ　Ａｌａ　ＴｈｒＧｌ
ｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ
　ＬｅｕＬｅＬｊ　Ｔｈｒ　ＡｒｇＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＰｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　ａ
ｌｙ　　ｌｉｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙト１ｉｓ　　
　Ｇｌｎ　　　Ａｌａ　　　Ｉｌｅ　　　Ｖａｔ　　　
Ｇｌｕ　　　ＡｌａＤＮＡ配列工

【図面の簡単な説明】

第１〜１２図は、いずれも本発明によるプラスミドを説
明する説明図である。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 （７）−（８）９７”ｔ−（９）　　５ａｉｌ／Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ　　（１（１）ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、４ ６６ＡＴ　ｃｊ６Ｇｃｃｅ− ＣＣＴＡ６ｉＣＣＧＧＣ ｐＨ２５４（ＴｃＳ）　　（１４） Ｍｌｕ　ｌ　（簀） ｐＨ２５５（１５） ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、７ （２日） （３日） ＦＩＧ、１２ ！１− 菅一一 Φ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式の融合タンパク質。 Ｍｅｔ−Ｘ＿ｎ−Ｄ′−Ｙ−Ｚ 〔上記式中、 ｎは、０又は１である。 Ｘは、１〜１２個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配
   列である。 Ｄ′は、大腸菌ｔｒｐオペロン中のＤ−ペプチドのアミ
   ノ酸２３〜９３番目の配列領域における約７０個のアミ
   ノ酸の配列である。 Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断させ得る１以上の遺伝
   的にコード可能なアミノ酸の配列を表わす。 Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である〕 ２、ｎが１で、Ｘが１〜５個のアミノ酸からなる、特許
   請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。 ３、ｎが１で、Ｌｙｓ−ＡｌａがＸのＮ末端に存在する
   、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の融合タンパク
   質。 ４、Ｙが、Ｃ末端においてＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ａ
   ｒｇ又はＬｙｓ、あるいは （ＡＳＰ）＿ｍ−Ｐｒｏ又はＧｌｕ−（Ａｓｐ）＿ｍ−
   Ｐｒｏ又はＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ｍは１、
   ２又は３を表わす）の基のうち一つを有するかあるいは
   これらのアミノ酸又は基からなる、特許請求の範囲第１
   項〜第３項のいずれか１項に記載の融合タンパク質。 ５、Ｚがヒトプロインシュリン又はヒルジンのアミノ酸
   配列を表わす、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれ
   か１項に記載の融合タンパク質。 ６、下式の融合タンパク質をコードする遺伝子構造体を
   宿主細胞内で発現させ、融合タンパク質を分離すること
   を特徴とする、下式の融合タンパク質の生産方法。 Ｍｅｔ−Ｘ＿ｎ−Ｄ′−Ｙ−Ｚ 〔上記式中、 ｎは、０又は１である。 Ｘは、１〜１２個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配
   列である。 Ｄ′は、大腸菌ｔｒｐオペロン中のＤ−ペプチドのアミ
   ノ酸２３〜９３番目の配列領域における約７０個のアミ
   ノ酸の配列である。 Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断させ得る１以上の遺伝
   的にコード可能なアミノ酸の配列を表わす。 Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である〕 ７、明細書中に示したＤＮＡ配列 I がＤ′の遺伝子構
   造をコードする、特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、ＤＮＡ配列（コード鎖）： ５′　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＧＧＣ　３′がＸの遺
   伝子構造をコードする、特許請求の範囲第６項又は第７
   項記載の方法。 ９、遺伝子構造を、融合タンパク質が不溶性となるよう
   に選択する、特許請求の範囲第６項〜第８項のいずれか
   １項に記載の方法。 １０、遺伝子構造が、大腸菌ｔｒｐオペロン由来Ｌ−ペ
   プチドのプロモーター、オペレーター及びリボソーム結
   合部位を有するベクター中に相をなして（ｉｎ　ｐｈａ
   ｓｅ）含有されている、特許請求の範囲第６項〜第９項
   のいずれかに記載の方法。 １１、ベクターがｐＢＲ３２２誘導体であって、２９位
   のＨｉｎｄIII部位から２０６６位のＰｖｕII部位まで
   のセグメントがｐＢＲ３２２ＤＮＡから削除されたもの
   である、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、宿主細胞が細菌である、特許請求の範囲第６項〜
   第１１項のいずれか１項に記載の方法。 １３、宿主細胞が大腸菌である、特許請求の範囲第６項
   〜第１２項のいずれか１項に記載の方法。 １４、次式の融合タンパク質をコードする遺伝子構造。 Ｍｅｔ−Ｘ＿ｎ−Ｄ′−Ｙ−Ｚ 〔上記式中、 ｎは、０又は１である。 Ｘは、１〜１２個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配
   列である。 Ｄ′は、大腸菌ｔｒｐオペロン中のＤ−ペプチドのアミ
   ノ酸２３〜９３番目の配列領域における約７０個のアミ
   ノ酸の配列である。 Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断させ得る１以上の遺伝
   的にコード可能なアミノ酸の配列を表わす。 Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である〕 １５、次式の融合タンパク質をコードする遺伝子構造を
   含有するベクター。 Ｍｅｔ−Ｘ＿ｎ−Ｄ′−Ｙ−Ｚ 〔上記式中、 ｎは、０又は１である。 Ｘは、１〜１２個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配
   列である。 Ｄ′は、大腸菌ｔｒｐオペロン中のＤ−ペプチドのアミ
   ノ酸２３〜９３番目の配列領域における約７０個のアミ
   ノ酸の配列である。 Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断させ得る１以上の遺伝
   的にコード可能なアミノ酸の配列を表わす。 Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である〕 １６、２９位のＨｉｎｄIII部位から２０６６位のＰｖ
   ｕII部位までのセグメントがｐＢＲ３２２ＤＮＡから削
   除され、次式の融合タンパク質をコードする遺伝子構造
   を含有する、プラスミドｐＢＲ３２２の誘導体。 Ｍｅｔ−Ｘ＿ｎ−Ｄ′−Ｙ−Ｚ 〔上記式中、 ｎは、０又は１である。 Ｘは、１〜１２個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配
   列である。 Ｄ′は、大腸菌ｔｒｐオペロン中のＤ−ペプチドのアミ
   ノ酸２３〜９３番目の配列領域における約７０個のアミ
   ノ酸の配列である。 Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断させ得る１以上の遺伝
   的にコード可能なアミノ酸の配列を表わす。 Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である〕 １７、特許請求の範囲第１５項又は第１６項に記載され
   たベクターを含有する発現系。 １８、特許請求の範囲第１５項又は第１６項に記載され
   たベクターを含有する大腸菌。 １９、次式の融合タンパク質から化学的に又は酵素的に
   アミノ酸配列Ｚを切断することを特徴とする、真核生物
   タンパク質の生産方法。 Ｍｅｔ−Ｘ＿ｎ−Ｄ′−Ｙ−Ｚ 〔上記式中、 ｎは、０又は１である。 Ｘは、１〜１２個の遺伝的にコード可能なアミノ酸の配
   列である。 Ｄ′は、大腸菌ｔｒｐオペロン中のＤ−ペプチドのアミ
   ノ酸２３〜９３番目の配列領域における約７０個のアミ
   ノ酸の配列である。 Ｙは、下記アミノ酸配列Ｚを切断させ得る１以上の遺伝
   的にコード可能なアミノ酸の配列を表わす。 Ｚは、遺伝的にコード可能なアミノ酸の配列である〕 ２０、プラスミドｐＨ１５４／２５、ｐＨ ２５４、ｐＨ２５５、ｐＨ２５６、ｐＨ２５７、ｐＨ１
   ２０／１４、ｐＫ１５０、ｐＫ１６０、ｐＫ１７０、ｐ
   Ｋ１８０、ｐＨ１５４／５☆、ｐＨ２５．６☆、ｐＨ１
   ２０／１４☆、ｐＫ１５０☆、ｐＫ１７０☆及びｐＩｎ
   ｔ１３。