FI86887B - Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning. - Google Patents
Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning. Download PDFInfo
- Publication number
- FI86887B FI86887B FI863041A FI863041A FI86887B FI 86887 B FI86887 B FI 86887B FI 863041 A FI863041 A FI 863041A FI 863041 A FI863041 A FI 863041A FI 86887 B FI86887 B FI 86887B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- sequence
- amino acids
- fusion protein
- plasmid
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
, 86887
Fuusioproteiineja, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö
Valmistettaessa geeniteknisin menetelmin pienehköjä 5 eukarioottisia proteiineja, joiden molekyylipaino on korkeintaan noin 15 000 daltonia, saadaan bakteereissa tuotetuksi usein vain pieni saanto. Isännän omat proteaasit pilkkovat otaksuttavasti nopeasti muodostuneita proteiineja. Mainitun kaltaiset on siksi usein tarkoituksenmukaista val-10 mistaa fuusioproteiineina, erityisesti sellaisina, jotka sisältävät myöhemmin poistettavan isännälle ominaisen pro-teiiniosan.
Nyt on havaittu, että E.colin trp-operonia vastaavan D-proteiinin osa, joka koostuu vain noin 70 aminohaposta, 15 soveltuu erityisen hyvin fuusioproteiinien muodostamiseen; tämä osa on aminohapposekvenssin alueella 23-93 /C. Yanofsky et ai.. Nucleic Acids Res. 9 (1981) 66477 ja siitä käytetään jäljempänä myös nimitystä "D-peptidi". Tämän peptidin karboksyylipään ja halutun eukaryoottisen proteiinin 20 aminohapposekvenssin välissä on yhdestä tai useammasta geneettisesti kooditettavissa olevasta aminohaposta koostuva jakso, joka mahdollistaa halutun proteiinin kemiallisen tai entsymaattisen lohkaisun. Tämän keksinnön edullisissa suoritusmuodoissa aminopäähän liittyy lyhyt aminohapposek-25 venssi, joka koostuu jaksosta Lys-Ala, joita seuraa mahdollisesti jakso, joka koostuu 1-10, erityisesti 1-3 muusta geneettisesti koodattavissa olevasta aminohaposta, edullisesti kahdesta aminohaposta ja erityisesti jaksosta Lys-Gly.
30 Keksintö koskee siten fuusioproteiinia, jolla on yleinen kaava
Met-X-D1 -Y-Z, n ' 35 jossa n on 0 tai 1; x on 1-12 geneettisesti kooditettavis- 86887 2 sa olevasta aminohaposta koostuva jakso, edullisesti Lys-Ala; D' on E. colin trp-operonia vastaavan D-pepti-din aminohapposekvenssin 23-93 alueella oleva, noin 70 aminohaposta koostuva jakso; Y on yhdestä tai useammasta 5 geneettisesti kooditettavissa olevasta aminohaposta koostuva jakso, joka mahdollistaa itseään seuraavan aminohappo-sekvenssin Z lohkeamisen ja Z on geneettisesti kooditettavissa olevista aminohapoista koostuva jakso.
Keksinnön muita puolia ja edullisia suoritusmuotoja Lo kuvataan seuraavassa ja ne määritellään patenttivaatimuksissa .
On luonnollisesti edullista, että fuusioproteiinin epätoivottava (isännälle ominainen) osa on mahdollisimman pieni, sillä tällöin solu tuottaa vain vähän "painolastia" L5 ja halutun proteiinin saanto on siten suuri. Lisäksi tällöin syntyy epätoivottavan osan lohkaisun yhteydessä vähemmän sivutuotteita, mikä helpottaa tuotteen käsittelyä. Edellä mainittua vastaan toimii se, että epätoivottavan osuuden (otaksuttu) suojausvaikutus on odotettavissa vasta 20 tietystä koosta alkaen. Yllättävästi on nyt käynyt ilmi, että keksinnön mukaisesti valittu D-proteiinin segmentti täyttää tämän tehtävän, vaikka siinä on vain noin 70 aminohappoa .
Useissa tapauksissa, ennen kaikkea sen edullisen 25 suoritusmuodon yhteydessä, jossa X on Lys-Ala tai sisältää N-päässään tämän jakson, muodostuu liukenematon fuu-sioproteiini. Tämä on helposti erotettavissa liukenevista proteiineista, mikä helpottaa suuresti käsittelyä ja suurentaa saantoa. Liukenemattoman fuusioproteiinin muodos-30 tuminen on yllättävää, sillä bakteerille ominainen osa, noin 70 aminohappoa, on sangen pieni ja on toisaalta rakenneosana isäntäsolussa liuenneena olevassa proteiinissa.
"Noin 70 aminohappoa D-peptidin aminohapposekvenssin alueella 23-93" tarkoittaa sitä, että variaatiot ovat 35 sinänsä tunnetulla tavalla mahdollisia, ts voidaan jättää 3 86887 pois tai vaihtaa yksittäisiä aminohappoja keksinnön mukaisten fuusioproteiinien ominaisuuksien muuttumatta merkitsevästi. Tällaiset variaatiot kuuluvat myös keksinnön piiriin.
5 Haluttu eukaryoottinen proteiini on edullisesti biologisesti aktiivinen proteiini, kuten hirudiini, tai tällaisen proteiinin esiaste, kuten ihmisen proinsuliini.
Fuusioproteiinia tuotetaan edullisesti sopivassa systeemissä tapahtuvan ilmentymisen kautta, ja eristetään 10 erityisen edullisessa suoritusmuodossa isäntäsolujen rikkomisen jälkeen sakasta, johon se rikastuu niukkaliukoisuu-tensa vuoksi. Siten on mahdollista tehdä helposti erottaminen solun liukenevista aineosista.
Isäntäsoluina tulevat kyseeseen lähinnä bakteeri-15 isäntäsysteemit, edullisesti E. coli, sillä onhan fuusio-proteiinin bakteeriperäinen osa E. colille ominainen proteiini.
DNA-sekvenssi, joka kcodaa keksinnön mukaista fuusioproteiinia, sisällytetään tunnetulla tavalla vektoriin, 20 joka ilmentyy hyvin valitussa iimentymissysteemissä.
Bakteeri-isännässä käytettävät promoottori ja operaattori on edullisesti ^-faagin Lac, Tae, PL tai PR, hsp, omp tai synteettinen promoottori, joita kuvataan esi-merkiksi DE-hakemusjulkaisussa 3 430 683 (EP-hakemusjulkai-.··. 25 su 0 173 149) .
Erityisen edullinen on vektori, joka sisältää E.
I colin trp-operonista seuraavat elementit: promoottorin, operaattorin ja L-peptidir, ribosomisitoutumiskohdan. Koo-'*·' daavaan alueeseen liittyy erityisen tarkoituksenmukaisesti 30 tämän L-peptidin kolme ensimmäistä aminohappoa, minkä jäl- keen seuraavat lyhyen aminohapposekvenssin jälkeen D-pro-: teiinin aminohapot 23-93.
: .·. Välisekvenssi Y, joka mahdollistaa halutun polypep- tidin lohkeamisen, määräytyy tämän halutun peptidin koos- 4 86837 tumuksen mukaan. Kun tämä ei esimerkiksi sisällä metio-niinia, voi Y olla Met, jonka kohdalta voidaan tehdä kemiallinen lohkaisu bromisyaanilla. Jos liittävän osan Y karboksyylipäässä on kysteiini tai Y on Cys, voidaan teh-5 dä entsymaattinen kysteiinispesifinen lohkaisu tai kemiallinen lohkaisu esimerkiksi spesifisen S-syanuloinnin jälkeen. Jos siltaosan Y karboksyylipäässä on tryptofaani tai Y on Trp, voidaan tehdä kemiallinen lohkaisu N-bromi-sukkinimidillä. Jos Y on Asp-Pro, voidaan tehdä sinänsä 10 tunnetulla tavalla /6. Piszkiewics et ai.. Biochemical ja Biophysical Research Communications 40 (1970) 1173-1178/7 proteolyyttinen lohkaisu. Asp-Pro-sidoksesta voidaan, kuten on havaittu, tehdä vielä herkempi hapoilla, kun Y on (AspJ^-Pro tai Glu-(AspJ^-Pro, jolloin m on 1, 2 tai 3.
15 Tällöin saadaan lohkeamistuotteitä, jotka alkavat N-pääs-tään Pro-ryhmällä tai päättyvät C-päästään Asp-ryhmään.
Tunnetaan myös esimerkkejä entsymaattisista lohkai-suista, joissa voidaan käyttää myös muunnettuja entsyymejä, joilla on parannettu spesifisyys /vert C.S. Craik et ai., 20 Science 228 (1985) 291-297/. Jos haluttu eukaryoottinen entsyymi on ihmisen proinsuliini, voidaan valita jaksoksi Y peptidisekvenssi, jossa trypsiinillä lohkaistavissa oleva aminohappo (Arg, Lys) on sitoutunut proinsuliinin N-terminaaliseen aminohappoon (Phe), esimerkiksi Ala-Ser-Met-Thr-25 Arg, sillä tällöin voidaan tehdä arginiinispesifinen lohkaisu trypsiiniproteaasilla. Ellei haluttu proteiini sisällä aminohappojaksoa Ile-Glu-Gly-Arg, on mahdollinen myös lohkaisu tekijä Xa:lla (EP-hakemusjulkaisu 0 161 937).
Jakson Y muodostuksessa on mahdollista käyttää hyväk-30 si myös synteettisiä mahdollisuuksia ja rakentaa soveltuvia restriktioentsyymipilkkomiskohtia. Aminohapposekvenssiä Y vastaava DNA-sekvenssi voi siten toimia myös kytkijä-tai adapteri-jaksona.
Ilmentyminen keksinnön mukaisena fuusioproteiinina 35 tapahtuu edullisesti E.colin trp-operonin ohjauksessa, trp- 5 86887 operonin promoottorin ja operaattorin sisältävä DNA-jakso on kaupallisesti saatava, trp-operonin ohjauksessa tapahtuvaa proteiineina ilmentymistä on kuvattu runsaasti kirjallisuudessa, esimerkiksi EP-hakemusjulkaisussa nro 5 0 036 776 (A2). trp-operonin indusointi voidaan saada aikaan L-tryptofaanin poissaololla alustasta ja/tai indo-lyyli-3-akryylihapon läsnäololla alustassa.
trp-operonin ohjauksen alaisena tapahtuu ensin L-peptidin, joka koostuu 14 aminohaposta, transkriptio.
10 Tämä L-peptidi sisältää kulloinkin asemissa 10 ja 11 L- tryptofäänin. L-peptidin proteiinisynteesin nopeus määrää sen, tapahtuuko samalla seuraavan rakennegeenin translaatio vai katkeaako proteiinisynteesi. Kun L-tryptofaanista on puutetta, tapahtuu L-peptidin hidas synteesi L-trypto-15 faania vastaavan tRNA:n pienen pitoisuuden vuoksi, ja sen jälkeen tapahtuu seuraavan proteiinin synteesi. L-trypto-faanipitoisuuden ollessa suuri tulee vastaava mRNA-jakso sitä vastoin nopeasti luetuksi, ja tapahtuu proteiinibio-synteesin katkeaminen, koska mRNArlla on terminaattorin 20 kaltainen rakenne /C. Yanofsky et ai., loc. sit^.
mRNA:n translaatiotiheyteen vaikuttaa voimakkaasti aloituskodonin lähellä olevien nukleotidien laatu, trp-operonin avulla tapahtuvan fuusioproteiini-ilmentymi-sen yhteydessä on siksi edullista käyttää L-peptidin en-25 simmäisiä aminohappoja vastaavia nukleotideja fuusiopro- teiinin rakennegeenin alkuna. Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa valittiin trp-systeemin yhteydessä L-peptidin kolmea ensimmäistä aminohappoa (tästedes L'-peptidi) vastaavat nukleotidit fuusioproteiinin N-terminaalisia amino-30 happoja vastaaviksi kodoneiksi.
Keksintö koskee siksi myös fuusioproteiinien ilmen-tymisvektoreita, edullisesti plasmideja, joissa vektorin DNA sisältää 5'-päästä lukien seuraavat tunnusmerkilliset osat (soveltuvassa järjestyksessä ja faasissa): pro-35 moottorin, operaattorin, ribosomisitoutumiskohdan ja fuu- 6 86887 sioproteiinin rakennegeenin, jolloin viimeksi mainittu sisältää aminohapposekvenssin I (liite) ennen halutun proteiinin sekvenssiä. Rakennegeenin edessä tai sen ensimmäisenä triplettinä on aloituskodoni (ATG) ja mahdolli-5 sesti muita aminohappoja vastaavia lisäkodoneja, jotka sijaitsevat aloituskodonin ja D‘-sekvenssin tai D'-sekvenssin ja haluttua proteiinia vastaavan geenin välissä. Halutun proteiinin aminohappokoostumuksen mukaan valitaan sellainen rakennegeeniä edeltävä DNA-jakso, joka mahdollistaa pg halutun proteiinin lohkeamisen fuusioproteiinista.
Keksinnön mukaisena fuusioproteiinina tapahtuvan ilmentymisen yhteydessä voi osoittautua tarkoituksenmukaiseksi muuttaa ATC-aloituskodonin jälkeisiä, ensimmäisiä aminohappoja vastaavia yksittäisiä triplettejä mahdollisen 15 mRNA-tasolla tapahtuvan emäspariutumisen estämiseksi. Tällaiset muutokset, samoin kuin D'-proteiinin yksittäisten aminohappojen muutokset, deleetiot ja lisäykset ovat alan ammattimiehelle tuttuja ja kuuluvat samoin keksinnön piiriin.
20 Koska pienehköillä plasmideilla on monia etuja, keksinnön edullisessa muodossa poistetaan plasmideista, jotka ovat pBR322-pohjaisia, tetrasykliiniresistenssira-kennegeenin sisältävä DNA-jakso. Edullisesti poistetaan segmentti, joka ulottuu asemassa 29 olevasta HindIII-kat-25 keamiskohdasta asemassa 2066 olevaan PvuII-katkeamiskoh-taan. Keksinnön mukaisten plasmidien yhteydessä on erityisen tarkoituksenmukaista poistaa vielä vähän suurempi DNA-jakso, jolloin käytetään hyväksi trp-operonin alussa (luentasuunnassa) olevaa PvuII-katkeamiskohtaa (joka si-30 jaitsee ei-välttämättömässä osassa). Siten voidaan muodostunut suuri fragmentti, jonka molemmissa päissä on PvuII-katkeamiskohta, ligatoida suoraan. Saatu, noin 2 keP:n (kiloemäsparin) verran lyhentynyt plasmidi saa aikaan ilmentymisen voimistumisen, joka johtaa mahdollises-35 ti myös kopiolukumäärän kasvuun isäntäsolussa.
7 86887
Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavissa esimerkeissä.
Esimerkki 1 a) Kromosomaalinen E.coli-DNA pilkotaan Hinfl:llä, 5 ja eristetään 492 emäsparin fragmentti, joka sisältää trp-operonista promoottorin, operaattorin, L-peptidin ra-kennegeenin, attenuaattorin ja trp-E-rakennegeenin kuutta ensimmäistä aminohappoa vastaavat kodonit. Tämä fragmentti täydennetään Klenow-polymeraasin avulla deoksinukleotidi-10 trifosfaateilla, liitetään molemmista päistään öligonukleo-tidiin, joka sisältää Hindlll-tunnistuskohdan ja pilkotaan uudelleen HindIII:lla. Siten saatu HindIII-fragmentti li-gatoidaan pBR322:n Hindlll-katkeamiskohtaan. Siten saadaan plasmidi ptrpE2-l /j.C. Edmann et ai., Nature 291 (1981) 15 503-506.7· Tämä muutetaan kirjallisuudessa kuvatulla taval la plasmidiksi ptrpLl.
Synteettisten oligonukleotidien (Nl) ja N2) 5’ CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3' (Nl) 5' CCT TTG CTT TCA TTG T 3' (N2) 20 avulla, jotka komplementoituvat kaksisäikeiseksi oligo-nulkeotidiksi (N3) 5' CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3' /kto.
(N3) 3' T GTT ACT TTC GTT TCC 5' muodostetaan plasmidin ptrpLl Clal-kohtaan L-peptidin 25 kolmea ensimmäistä aminohappoa vastaava DNA-sekvenssi samoin kuin restriktiokohta (Stul) muun DNA:n insertiota varten (kuva 1). Plasmidin ptrpLl annetaan reagoida valmistajan ohjeiden mukaisesti Clal-entsyymin kanssa, uutetaan seos fenolilla, ja saostetaan DNA etanolilla. Avatun plas-30 midin annetaan reagoida alkalisen fosfataasin kanssa fos-faattiryhmien poistamiseksi 5’-päistä. Synteettiset nukleotidit fosforyloidaan 5’-päistään ja liitetään T4-DNA-ligaasin avulla fosfataasilla käsiteltyyn, avattuun plas-midiin. Ligantointireaktion mentyä loppuun seuraa E.coli 35 294:n transformointi ja transformanttien valikointi Amp- 86887 8 resistenssin ja Stul-restriktiokohdan läsnäolon perusteella.
Noin 80 %:ssa saaduista klooneista oli odotettu restriktiokohta; kuvassa 1 annettu nukleotidisekvenssi määritettiin sekvenssianalyysillä. Saadaan plasmidi pH120/14, 5 joka sisältää L-peptidin ribosomisitoutumiskohdan jälkeen L-peptidin kolmea ensimmäistä aminohappoa vastaavat nuk-leotiditripletit (L'-peptidi) ja niiden jälkeen Stul-koh-dan, joka puolestaan mahdollistaa lisä-DNA:n insertoinnin ja siten fuusioproteiinien muodostamisen L-peptidin kol-10 men ensimmäisen aminohapon kanssa.
b) Seuraavassa valaistaan käyttäen esimerkkinä edellä käytettyä oligonukleotidia (Nl) tällaisen oligo-nukleotidin kemiallista synteesiä: M.J. Gaitin et ai. menetelmällä /Nucleic Acids 15 Research 8 (1980) 1081-1096/ sidotaan 3'-päässä oleva nuk-leosidi, tässä tapauksessa siis guanosiini, kovalentti-sesti lasihelmikantajalle /CPG (= kontrolloitu huokoslasi, controlled pore glass) LCAA (= pitkäketjuinen alkyyliamii-ni, long chain alkyl amine), valmistaja Pierce/ 3'-pään 20 funktionaalisen hydroksyyliryhmän kautta. Tällöin annetaan guanosiinin reagoida N-2-isobutyroyyli-3'-O-sukkino-yy1i-5'-dimetoksitrityylieetterinä N,N 1-disykloheksyyli-karbodi-imidin ja 4-dimetyyliaminopyridiinin läsnäollessa muunnetun kantajan kanssa, jolloin sukkinoyyliryhmän va-25 paa karboksyyliryhmä asyloi kantajalla olevan pitkäketjui-sen amiinin aminoryhmän.
Seuraavissa synteesivaiheissa käytetään emäskompo-nentteja 51-O-dimetoksitrityylinukleosidi-3'-fosforihappo-monometyyliesteridialkyyliamidin tai -kloridin muodossa, 30 jolloin adeniini on N6-bentsoyyliyhdisteenä, sytosiini N4-bentsoyyliyhdisteenä, guaniini N2-isobutyryyliyhdisteenä ja aminoryhmiä sisältämätön tyrniini suojaamattomana.
40 mg kantajaa, johon on sidottuna l^umol guano-siinia, käsitellään peräkkäin seuraavilla aineilla: 35 a) metyleenikloridi, b) 10 % trikloorietikkahappoa metyleenikloridissa, 9 86887 c) metanoli, d) tetrahydrofuraani, e) asetonitriili, f) 15^umol vastaavaa nukleosidifosfiittia ja 70^,umol 5 tetratsolia 0,3 ml:ssa vedetöntä asetonitriiliä (5 min), g) 20 % etikkahappoanhydridiä tetrahydrofuraanissa, joka sisältää 40 % lutidiinia ja 10 % dimetyyliaminopyridiiniä (2 min), h) tetrahydrofuraani, 10 i) tetrahydrofuraani, joka sisältää 20 % vettä ja 40 % lutidiinia, j) 3 % jodia seoksessa, joka sisältää kollidiinia, vettä ja tetrahydrofuraania tilavuussuhteessa 5:4:1, k) tetrahydrofuraani ja 15 1) metanoli.
"Fosfiitilla" tarkoitetaan tässä yhteydessä deoksi-riboosi-3'-monofosforihappomonometyyliesteriä, jossa kolmas valenssi on tyydytetty kloorilla tai tertiaarisella aminoryhmällä, esimerkiksi di-isopropyyliamiiniryhmällä.
20 Yksittäisten synteesivaiheiden saanto voidaan kulloinkin määrittää detritylointireaktion b) jälkeen spektrofotomet-risesti mittaamalla dimetoksitrityylikationin absorptio aallonpituudella 496 nm.
Kun oligonukleotidisynteesi on saatettu loppuun, 25 poistetaan oligomeerin metyylifosfaattisuojausryhmät p-tio-kresolin ja trietyyliamiinin avulla.
Sen jälkeen oligonukleotidi irrotetaan kiinteältä kantajalta käsittelemällä 3 tuntia ammoniakilla. Oligo-meerien 2-3 vrk kestävä käsitteleminen väkevällä ammo-30 niakilla poistaa kvantitatiivisesti emästen aminosuojaus-ryhmät. Siten saatu raakatuote puhdistetaan suurpainenes-tekromatografiän (HPLC) tai polyakryyliamidigeelielektro-foreesin avulla.
Muut oligonukleotidit syntetisoidaan aivan vastaa-35 valla tavalla.
86887 10 c) Plasmidin ptrpE5-l /R.A. Hallewell et al.f Gene 9 (1980) 27-477 annetaan reagoida restriktioentsyy-mien Hindlll ja Sali kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti, ja poistetaan noin 620 emäsparin pituinen DNA-5 fragmentti. Synteettiset oligonukleotidit (N4) ja (N5) 5' AGC TTC CAT GAC GCG T 3' (N4) 5' ACG CGT CAT GGA 3' (N5) fosforyloidaan, inkuboidaan yhdessä 37°C:ssa ja liitetään DNA-ligaasin avulla proinsuliinia vastaavaan tylppäpäiseen 10 DNA-jaksoon /W. Wetwkam et ai., Gene 19 (1982) 179-1837. HindIII:n ja Sali:n kanssa tapahtuneiden reaktioiden jälkeen liitetään täten pidentynyt proinsuliini-DNA T4-DNA-ligaasientsyymin avulla kovalenttisesti plasmidiin, joka on avattu, jolloin saadaan plasmidi pH106/4 (kuva 2).
15 Plasmidin pHl06/4 annetaan seuraavaksi reagoida vielä kerran Sali:n kanssa, täydennetään yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin avulla tylpiksi päiksi, ja inkuboidaan sitten entsyymin MstI kanssa. Eristetään noin 500 emäsparin DNA-fragmentti, joka sisältää koko proinsulii-20 nia koodittavan osan sekä E.colin trp-operonista noin 210 emäsparin D-proteiinia koodittavan jakson. Tämä DNA-fragmentti on tylppäpäinen, ja se insertoidaan plasmidin pH12Q/14 Stul-kohtaan, jolloin saadaan plasmidi pH154/25 (kuva 3). Tämä soveltuu trp-operonin ohjauksessa tapah-25 tuvaan fuusioproteiini-ilmentymiseen,jossa proteiinissa L'- ja D1-peptidiä seuraa aminohapposekvenssi Ala-Ser-Met-Thr-Arg, johon liittyy proinsuliinin aminohapposekvenssi .
Esimerkki 2 30 Plasmidin pH154/25 (kuva 3) annetaan reagoida rest- riktioentsyymien BamHI ja Xmalll kanssa. Yksisäikeiset päät täydennetään Klenow-polymeraasin avulla ja liitetään T4-DNA-ligaasia käyttäen. Saadaan plasmidi pH254 (kuva 4), joka soveltuu aminohapposekvenssin L',D'-proinsuliinia 35 sisältävän fuusioproteiinin tuottamiseen trp-promootto- 11 86887 rin ohjauksessa. Plasmidi on jonkin verran pienempi kuin pH154/25, mikä saattaa olla edullista.
Esimerkki 3
Inkuboimalla plasmidia pH254 (esimerkki 2, kuva 4) 5 restriktioentsyymien MluI ja Sali kanssa irrotetaan 280 emäsparin DNA-jakso, joka poistetaan. Loppuosa plasmidista muutetaan tylppäpäiseksi Klenow-polymeraasin avulla ja syklisoidaan kovalenttisesti takaisin DNA-ligaasia käyttäen. Täten saadaan plasmidi pH255 (kuva 4), johon voidaan 1Q sijoittaa rakennegeeni johonkin restriktiokohdista MluI,
Sali ja EcoRI. Induktio-olosuhteissa tapahtuu L*-D'-proteiini jakson sisältävän fuusioproteiinin muodostuminen. Plasmidiin pH255 voidaan luonnollisesti lisätä muita rest-riktiokohtia soveltuvien kytkijöiden avulla.
15 Esimerkki 4
Plasmidia pHl54/25 (kuva 3) inkuboidaan entsyymien MluI ja EcoRI kanssa, ja poistetaan vapautunut DNA-fragmentti (noin 3Q0 emäsparia). Loppuosa plasmidista täydennetään Klenow-polymeraasilla. Renkaan sulkeminen tehdään DNA-ligaasin 20 avulla. Muodostuneeseen plasmidiin pH256 (kuva 5) voidaan sijoittaa rakennegeeni EcoRI-kohtaan.
Esimerkki 5
Poistamalla 600 emäsparin fragmentti plasmidista pH256 (esimerkki 4, kuva 5) restriktioentsyymien BamHI ja 25 NruI avulla saadaan plasmidi pH257 (kuva 5). Tämä tehdään inkuboimalla pH256:a ensin BamHI:n kanssa ja muodostamalla tylpät päät Klenow-polymeraasin avulla. Kun plasmidia on inkuboitu NruI:n kanssa ja poistettu 600 emäsparin fragmentti, muodostetaan pH257 inkuboimalla DNA-ligaasin kanssa.
30 Esimerkki 6 . . Sijoittamalla lac-repressori /P.J. Farabaugh, Natu re 274 (1978) 765-7697 plasmidiin pKK 177-3 /Amann et ai., Gene 25 (1983) 1677 saadaan plasmidi pJF118. Tämän annetaan reagoida EcoRI:n ja Sali:n kanssa, ja eristetään loppu-35 osa plasmidista.
12 8 6 8 S 7
Plasmidista pHl06/4 (kuva 2) erotetaan Sallin avulla ja inkuboimalla Mstlin kanssa noin 495 emäsparin fragmentti.
Synteettisesti valmistetut oligonukleotidit (N6) 5 ja (N7) 5' ACG AAT TCA TGA AAG CAA AGG 3' (N6) 5' CCT TTG CTT TCA TGA ATT CGT 3' (N7) fosforyloidaan ja liitetään DNA-ligaasin avulla tylppäpäiseen DNA-fragmenttiin. Antamalla reagoida EcoRIin ja Sallin 10 kanssa vapautetaan komplementaariset päät, jotka mahdollistavat ligatoinnin avattuun plasmidiin pJFH8.
Kun on tehty E.Colin transformointi siten saadulla hybridiplasmidilla, valikoidaan oikeat kloonit restriktio-fragmenttien koon perusteella. Tästä plasmidista käytetään 15 merkintää pJ120 (kuva 6).
Fuusioproteiinien tuotanto toteutetaan ravistuspul-loissa seuraavastii Kun E.coli-transformantteja, jotka sisältävät plasmidia pJ120, on viljelty yön yli LB-alustassa (J.H. Miller, Experiments on Molecular Genetics, Cold Spring 20 Harbor Laboratory, 1972) , johon on lisätty 50^ug/ml ampi-silliinia, laimennetaan viljelmä suunnilleen suhteessa li 100, ja seurataan kasvua mittaamalla optista tiheyttä.
Kun optinen tiheys (OD) on 0,5, lisätään isopropyyli- -D-galaktopyranosidia (IPTG) pitoisuudeksi 1 mM, ja erote-25 taan bakteerit 150-180 minin kuluttua sentrifugoimalla.
Bakteereja keitetään 5 min puskuriseoksessa (7 mol/1 ureaa, 0,1 % SDSia, 0,1 mol/1 natriumfosfaattia, pH 7,0), ja siirretään näytteet SDS-geelielektroforeesilevyille. Elektroforeesissa saadaan bakteereista, jotka sisältävät plas-30 midia pJ120, proteiinivyöhyke, jonka koko vastaa odotettua fuusioproteiinia ja reagoi insuliinin vasta-aineiden kanssa. Kun fuusioproteiini on eristetty, voidaan haluttu pro-insuliinijohdos vapauttaa bromisyaanilohkaisulla. Kun bakteerit on rikottu (French-puristin; Dyno-Miihle) ja 35 sentrifugoitu, on L1-D'-proinsuliinifuusioproteiini sakassa, 13 86887 niin että jo supernatanttiin voidaan erottaa huomattavia määriä muita proteiineja.
Annetut induktio-olosuhteet pätevät ravistusviljel-mille; suurempien fermentointien ollessa kyseessä ovat 5 vastaavasti muutetut OD-arvot ja mahdollisesti hieman muutetut IPTG-pitoisuudet tarkoituksenmukaisia.
Esimerkki 7 E.coli-transformantteja, jotka sisältävät plasmidia pH154/25 (kuva 3), viljellään yön yli LB-alustassa, joka 10 sisältää 5Cyjg/ml ampisilliinia, ja laimennetaan viljelmä seuraayana aamuna suunnilleen suhteessa 1:100 M9-alustalla (J.H. Miller, loc.cit.), joka sisältää 2000^,ug/ml kasamino-happoja ja l^ug/ml tiamiinia. OD-arvon ollessa 0,5 lisätään indolyyli-3-akryylihappoa loppupitoisuudeksi15yUg/ml. 2-3 15 tunnin inkuboinnin jälkeen bakteerit erotetaan sentrifugoi-malla. SDS-elektroforeesissa näkyy fuusioproteiinille odotetussa kohdassa sangen selvä proteiinivyöhyke, joka reagoi insuliinin vasta-aineiden kanssa. Bakteerien rikkomisen ja sentrifugoinnin jälkeen L',D'-proinsuliinifuusioprote-20 iini on sakassa, niin että tälläkin kertaa supernatanttiin jää huomattavia määriä muita proteiineja.
Myös tässä tapauksessa pätevät annetut indusointi-olosuhteet ravistusviljelmille. Suurempitilavuuksiset fer-mentoinnin vaativat muutettuja kasaminihappopitoisuuksia 25 tai L-tryptofäänin lisäämistä.
Esimerkki 8
Plasmidi pH154/25 (kuva 3) avataan EcoRIrllä, ja täydennetään yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin avulla. Siten saatua DNA:ta inkuboidaan Mlul-entsyymin kanssa, ja 30 irrotetaan insuliinia koodittava DNA plasmidista. Tekemällä elektroforeettinen käsittely erotetaan tämä fragmentti plas-midin loppuosasta, ja eristetään tämä loppuosa.
DE-hakemusjulkaisun 3 249 430 /EP-hakemusjulkaisun 0 171 024.7 kuvan 3 mukaisen plasmidin annetaan reagoida 35 restriktioentsyymien Accl ja Sali kanssa, ja erotetaan hiru- 86887 14 diinisekvenssin sisältävä DNA-fragmentti. Kun Sall-kat- kaisukohtien yksisäikeiset päät on täydennetty Klenow-poly- meraasin avulla, ligatoidaan DNA-segmentti synteettiseen DNA:han, jolla on kaava (N8).
5 Met Thr 5' CCC ACG CGT ATG ACG T 3' „.Ttn (No) 3' GGG TGC GCA TAC TGC ATA 5'
Ligaatiotuotetta inkuboidaan Mlul:n kanssa. Kun entsyymi on inaktivoitu 65°C:ssa, käsitellään DNA-seosta alkalisella 10 naudan fosfataasilla tunnin ajan 37°C:ssa. Sen jälkeen fos-fataasi ja restriktioentsyymi poistetaan seoksesta fenolilla uuttamalla, ja puhdistetaan DNA saostamalla etanolilla. Siten käsitelty DNA sijoitetaan avattuun loppuosaan plas-midista pHl54/25 T4-ligaasin avulla, jolloin saadaan plas-15 midi pK150, joka karakterisoitiin restriktioanalyysillä ja Maxam-Gilbert-menetelmällä tehdyllä DNA-sekventoinnilla (kuva 7).
Esimerkki 9 E.coli 294-bakteereja, jotka sisältävät plasraidia 20 pK15Q (kuva 7), kasvatetaan LB-alustassa, joka sisältää ?Q-5Qy.ug/ml ampisilliinia, yön yli 37°C:ssa. Viljelmä laimennetaan suhteessa 1:100 M9-alustalla, joka sisältää 2Q00^ug/tnl kasciminohappoja l^ug/mltiamiinia, ja inkuboidaan 37°C:ssa koko ajan sekoittaen. Kun OD600-arvO on 0,5 25 tai 1, lisätään indolyyli-3-akryylihappoa loppupitoisuu- deksi 15^ug/m] ja inkuboidaan 2-3 tai 16 tuntia. Sen jälkeen erotetaan bakteerit sentrifugoimalla ja rikotaan ne 0,1 M natriumfosfaattipuskurissa (pH 6,5) paineella. Niukkaliu-koiset proteiinit erotetaan sentrifugoimalla, ja analysoi-30 daan SDS-polyakryyliamidielektroforeesilla. Osoittautuu, että solut, joiden trp-operoni on indusoitu, sisältävät uuden proteiinin, joka on pienempi kuin 20 000 mutta suurempi kuin 14 000 daltonia ja jota ei ollut indusoimatto-missa soluissa. Eristämällä fuusioproteiini ja antamalla 35 sen reagoida bromisyaanin kanssa vapautuu hirudiinia.
15 8 68 57
Esimerkki 10
Seuraavassa kuvataan rakenteita, jotka tekevät mahdolliseksi sijoittaa trp-D-sekvenssin 5·-pään eteen DNA-sekvenssejä, jotka sisältävät mahdollisimman runsaasti eri-5 laisten restriktioentsyymien tunnistuskohtia, jotta voitaisiin sijoittaa trp-D-sekvenssi mahdollisimman yleisesti mitä erilaisimpiin prokaryoottisiin ilmentymissysteemeihin.
Plasmidit pUC12 ja pUC13 (Pharmacia P-L Biohemicals, 54Q1 St. Goar: The Molecular Biology Catalogue 1983, liite IQ s 89) sisältävät poly-kytkijäsekvenssin, jolloin plasmi-diin pUC13 voidaan sijoittaa restriktiokohtien Xmal ja Sacl väliin plasmidista pl06/4 (kuva 2) saatava Mstl-Hind-III-trp-fragmentti, joka on fuusioitu plasmidista pK150 (kuva 7) saatavan Hindlll-hirudiini-SacI-fragmentin kanssa. 15 Tämä tehdään käsittelemällä plasmidin pUC13 DNA en sin restriktioentsyymillM Xmal. Linearisoidun plasmidin päät täydennetään Klenow-polymeraasin avulla. Kun DNA on saostettu etanolilla, se käsitellään Sacl-entsyymillä ja saostetaan uudelleen reaktioseoksesta etanolin avulla.
20 DNA:n annetaan sitten reagoida vesipitoisessa ligaatioseok-sessa plasmidista pHl06/4 eristetyn Mst-HindIII-trp-D-frag-mentin ja plasmidista pK150 eristetyn Hindlll-SacI-hirudii-nifragmentin kanssa T4-DNA-ligaasin läsnäollessa.
Siten saatu plasmidi pK160 sisältää nyt välittömäs-25 ti ennen trp-D-sekvenssin alkua moninkertaisen restriktio-entsyymitunnistussekvenssin, jossa on katkaisukohdat entsyymeille Xmal, Smal, BamHI, Xbal, Hindi, Sali, Accl,
PstI ja Hindlll. Tällä konstruktiolla saadaan aikaan lisäksi hirudiinisekvenssin 3'-pään taakse EcoRI-katkeamis-30 kohta (kuva 8).
Esimerkki 11
Plasmidi pHl31/5 valmistetaan seuraavasti DE-patent-tihakemuksen 35 14 113 esimerkin 1 kuvan 1 mukaisesti): • Plasmidi ptrpLl £).C. Edman et ai., Nature 291 (1981) 35 503-5067 avataan Clalrllä ja ligatoidaan synteettisesti 86887 16 valmistettuun itsekomplementaariseen oligonukleotidiin (N9) 5' pCGACCATGGT 3' (N9)
Siten saatu plasmidi pH131/5 (kuva 9) avataan muo-5 dostuneesta Ncol-restriktiokohdasta, ja täydennetään muodostuneet yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin avulla. Linearisoitu tasapäinen DNA pilkotaan sitten EcoRI-entsyy-millä, ja erotetaan suurempi muodostuneista DNA-sekvens-seistä pienemmästä saostamalla etanolilla. Siten saatu 2o plasmidin pH131/5 jäljelle jäänyt DNA ligatoidaan sitten pK160:sta saatuun trp-D'-hirudiinia koodittavaan fragmenttiin T4-ligaasin avulla. Tämä fragmentti eristettiin plas-midista pKl60 avaamalla se Hindi- ja EcoRI-entsyymeillä. Fragmentti erotetaan geelielektroforeesin avulla loppu-25 osasta plasmidia ja eluoidaan sitten geeliltä. Ligaatio- tuotteella transformoidaan E.coli K12. Plasmidi-DNA:ta sisältävät kloonit eristetään ja karakterisoidaan restriktio-analyysillä ja DNA-sekventoinnilla. Siten saatu plasmidi pK170 sisältää trp-operoniin fuusioituneena DNA-sekvenssin, 20 joka koodaa jaksoa Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-trp-D'-(hirudiini) (kuva 9).
Esimerkki 12
Plasmidi pJF118 (esimerkki 6) avataan EcoRI:llä, ja muutetaan muodostuneet yksisäikeiset DNA-päät tylppä-25 päisiksi Klenow-polymeraasin avulla. Siten käsitelty DNA
pilkotaan sitten Sali-entsyymillä ja erotetaan geelielektro-foreettisesti lyhyestä EcoRI-Sall-fragmentista.
Plasmidi pK170 (esimerkki 11) pilkotaan NcoI:llä, ja täydennetään yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin 30 avulla. Plasmidi-DNA erotetaan reaktioseoksesta etanolilla saostamalla ja käsitellään Hindlll- ja BamHI-entsyy-meillä. Muodostuneista fragmenteista eristetään kaksi, nimittäin NcoI(päät täydennetty)-trpD'-Hindlll-fragmentti ja Hindlll-hirudiini-BamHI-fragmentti (DE-hakemusjulkaisu 35 3 429 430). Molemmat fragmentit eristetään geelielektrofo- reettisesti.
86887 17
Lisäksi eristetään DE-hakemusjulkaisun 3 429 430 kuvan 2 mukainen BamHI-Säll-hirudiinill-fragmentti. Sitten annetaan näiden neljän fragmentin, ts loppuosan pJF118-plasmidista, NcoI-trpD'-HindIII-fragmentin, Hindlll-hiru-5 diini-BamHI-fragmentin ja hirudiinill-fragmentin, liga-toitua toisiinsa, ja transformoidaan saadulla plasmidilla pKl80 (kuva 10) E.coli K12-W 3110. Oikeat plasmidit tunnistetaan siitä, että plasmidi-DNAtssa on havaittavissa EcoRI-trpD'-hirudiini-Sall-fragmentti. trpD'-hirudiini-sekvenssi 10 liittyy nyt tac-promoottoriin. Fuusioproteiinia tuotetaan esimerkin 6 mukaisesti.
Es imerkki 13
Plasmideissa, jotka ovat peräisin pBR322:sta, kuten pH120/14:ssä (esimerkki 1, kuva 1), pH154/25:ssä (esimerkki 15 1, kuva 3), pH256:ssa (esimerkki 4, kuva 5), pK150:ssä (esimerkki 8, kuva 7) ja pK 170:ssä (esimerkki 11, kuva 9) on - kuvissa myötäpäivään katsottuna - fuusioproteiinin aloituskodonin ja seuraavan Hindlll-kohdan (joka vastaa pBR322:n asemassa 29 olevaa Hindlll-kohtaa) välissä yli-20 määräinen PvuII-kohta sen fragmentin alueella, joka sisältää trp-promoottorin ja -operaattorin, mutta kuitenkin promoottorialueen ulkopuolella.
Nyt on todettu, että poistamalla se DNA-jakso, jota rajoittavat edellä kuvattu PvuII-kohta ja PvuII-kohta, 25 joka vastaa pBR322:ssa asemaa 2066, suurenee kloonatun proteiinin (eli fuusioproteiinin) saanto selvästi.
Seuraavassa kuvataan esimerkinomaisesti plasmidin pHl54/25 lyhentämistä plasmidiksi pHl54/25x, joka toimenpide voidaan tehdä vastaavalla tavalla muille edellä mai-30 nituille plasmideille (jolloin lyhennettyjen plasmidien tunnuksena käytetään samalla tavalla tähteä): pH154/25:n annetaan reagoida (valmistajan ohjeiden mukaisesti) PvuIIrn kanssa, jolloin muodostuu kolme fragmenttia: 35 Fragmentti 1:
Proinsuliinin PvuII-restriktiokohdasta pBR322:n 86 8 87 18 asemaa 2066 vastaavaan PvuII-restriktiokohtaan,
Fragmentti 2: trp-promoottorin lähellä olevasta PvuII-restriktio-kohdasta proinsuliinin PvuII-kohtaan ja 5 Fragmentti 3: trp-promoottorifragmentin lähellä olevasta PvuII-kohdasta pBR322:n asemaa 2066 vastaavaan PvuII-kohtaan.
Fragmentit voidaan erottaa agaroosilla elektroforeettisesti ja eristää sitten (Maniatis et ai., Molecular Cloning Cold Spring Harbor 1.982). 10 Fragmentit 1 ja 2 liitetään toisiinsa "tylppä pää"- olosuhteissa T4-DNA-ligaasientsyymin avulla. Kun on tehty E.coli 294:n transformointi, todetaan, missä kolonneissa on täydellisen proinsuliinisekvenssin sisältävä plasmidi ja fragmentit siten halutussa järjestyksessä. Kuva 11 15 esittää plasmidia pH154/25x.
Tehtäessä ilmentäminen, joka tapahtuu edellä olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla, havaitaan fuusiopro-teiinin osuuden selvä kohoaminen.
Esimerkki 14 20 Plasmidi pH154/25x (esimerkki 13, kuva 11) käsitel lään HindIII:lla ja Sall:llä, ja erotetaan pieni fragmentti (joka sisältää proinsuliinisekvenssin) geelielektro-foreettisesti. Suuri fragmentti eristetään ja ligantoi-daan synteettiseen DNA:han (N10).
25 (Ala)Trp Glu Asp Pro Met Ile Glu (Gly) (Arg) A GCT TGG GAG GAT CCT ATG ATC GAG GG (N10) ACC CTC CTA GGA TAC TAG CTC CCA GCT Saadaan plasmidi plntl3 (kuva 13).
DNA (N10) koodittaa aminohapposekvenssiä, joka si-30 sältää useita kemialliseen pilkkomiseen soveltuvia katkea-miskohtia: a) Met bromisyaanille, b) Trp N-bromisukkinimidi1le (NBS eli BSI) c) Asp-Pro proteolyyttiseen katkaisuun, jolloin edellä 35 oleva Glu lisää vielä Asp-Pro-sidoksen herkkyyttä happojen vaikutukselle.
i9 868 87 Tämä Hindlll-Sall-kytkijän (N10) sijoittaminen koo-ditetun polypeptidin lukukehykseen antaa siis edellä mainitun mahdollisuuden tehdä kemiallinen lohkaisu, halutun proteiinin aminohapposekvenssin tai sen lohkaisureagenssi-5 herkkyyden mukaan.
Kuvat eivät ole oikeassa mittasuhteessa.
20 86887
Aminohapposekvenssi_I
2 3
Ser Asn Orly His Asn Vai Val lie l o
Tyr Arg Asn His lie Pro Ala Gin 20
Thr Leu lie Glu Arg Leu Ala Thr 3 o
Met Ser Asn Pro Val Leu Met Leu 4 o
Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro Ser
Glu Ala Gly Cys Met Pro Glu Leu 5 o
Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu 6 0
Pro lie lie Gly lie Cys Leu Gly / o ^ 9 3
His Gin Ala He Val Glu Ala 21 868 87
DNA-sekvenssi I
Ser Asn Gly His Asn Vai Vai Ile
AGC AAT GGG CAT AAC GTG GTG ATT
. ·
1 O
Tyr Arg Asn His Ile Pro Ala Gin
TAC CGC AAC CAT ATA CCG GCG CAA
• · 20
Thr Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr
ACC TTA ATT GAA CGC TTG GCG ACC
5 0 # ♦ • 30
Met Ser Asn Pro Vai Leu Met Leu
ATG AGT AAT CCG GTG CTG ATG CTT
• # 40
Ser Pro Gly Pro Gly Vai Pro Ser
TCT CCT GGC CCC GGT GTG CCG AGC
100 *
Glu Ala Gly Cys Met Pro Glu Leu
GAA GCC GGT TGT ATG CCG GAA CTC
• · 50
Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu
CTC ACC CGC TTG CGT GGC AAG CTG
150 e 60
Pro Ile Ile Gly Ile Cys Leu Gly
CCC ATT ATT GGC ATT TGC CTC GGA
• » · 70
His Gin Ala Ile Vai Glu Ala
Cat CAG GCG ATT GTC GAA GCT
20 0
Claims (12)
1. Fuusioproteiini, tunnettu siitä, että sillä on yleinen kaava 5 Met-Xn-D' -Y-Z, jossa n on nolla tai 1; X on 1 - 12 geneettisesti koostettavissa olevasta aminohaposta koostuva sekvenssi; D' 10 on E. colin trp-operonia vastaavan D-peptidin aminohappo-sekvenssin 23 - 93 alueella oleva, noin 70 aminohaposta koostuva jakso; Y on yhdestä tai useammasta geneettisesti kooditettavissa olevasta aminohaposta koostuva jakso, joka mahdollistaa itseään seuraavan aminohapposekvenssin Z 15 lohkeamisen ja Z on geneettisesti kooditettavissa olevista aminohapoista koostuva jakso.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että n on 1 ja X käsittää korkeintaan 5 aminohappoa, jolloin jaksossa X on edullisesti
20 N-terminaalinen jakso Lys-Ala.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että Y sisältää C-termi-naalisen ryhmän Met, Cys, Trp, Arg, Lys tai jonkin ryhmistä (Asp^-Pro, Glu-(Asp)m-Pro tai Ile-Glu-Gly-Arg, 25 jolloin m on 1,2 tai 3, tai koostuu näistä aminohapoista tai jostakin näistä ryhmistä.
4. Yhden tai useamman edeltävän patenttivaatimuksen mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että Z on ihmisen proinsuliinin tai hirudiinin aminohappo- 30 sekvenssi.
5. Menetelmä yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen fuusioproteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että tätä fuusioproteiinia koodaava geenirakenne saatetaan ilmentymään bakteeri-isäntäsolus- 35 sa, edullisesti E.colissa ja erotetaan fuusioproteiini. 23 8 6 8 8 7
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geenirakenteessa koodittaa jaksoa (Dr) DNA-sekvenssi I (liite) ja/tai geenirakenteessa koodittaa jaksoa X DNA-sekvenssi (koodittava säie) 5 5' AAA GCA AAG GGC 3f, ja/tai geenirakenne valitaan siten, että fuusioproteiini on liukenematon ja/tai geenirakenne on faasissa vektorissa, joka sisältää E. colln trp-operonista promoottorin, operaattorin ja L-peptidin ribosomisitoutumiskohdan.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on pBR322-johdos, jossa pBR322-DNA:sta on poistettu jakso, joka ulottuu asemassa 29 olevasta HindiII-kohdasta asemassa 2066 olevaan PvuII-kohtaan.
8. Geenirakenne, tunnettu siitä, että se koodittaa patenttivaatimusten 1-4 mukaisia fuusiopro-teiineja.
9. Vektori, edullisesti plasmidin pBR322 johdos, jossa pBR322-DNA:sta on poistettu jakso, joka ulottuu 20 asemassa 29 olevasta HindiII-kohdasta asemassa 2066 olevaan PvuII-kohtaan, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 8 mukaisen genirakenteen.
10. Bakteeri-isäntäsolujen ilmentymissysteemi, edullisesti E. coli-systeemi, tunnettu siitä, et- 25 tä se sisältää patenttivaatimuksen 9 mukaisen vektorin.
11. Menetelmä eukaryoottisen proteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1-4 mukaisesta fuusioproteiinista lohkaistaan aminohapposekvenssi Z kemiallisesti tai entsymaattisesti.
12. Plasmidi, tunnettu siitä, että se on pH154/25 (kuva 3), pH254 (kuva 4), pH255 (kuva 4), pH256 (kuva 5), pH257 (kuva 5), pH120/14 (kuva 1), pK150 (kuva 7), pK160 (kuva 8), pKl70 (kuva 9), pK180 (kuva 10), pH154/25* (kuva 11), pH256*, joka vastaa kuvassa 5 esi- 35 tettyä pH256, josta PvuII:11a saatu fragmentti on pois- 24 8 6 8 S 7 tettu kuvassa 11 esitetyllä tavalla, pH120/14*, joka vastaa kuvassa 1 esitettyä pHl20/14, josta PvuII:lla saatu fragmentti on poistettu kuvassa 11 esitetyllä tavalla, pKl50*, joka vastaa kuvassa 7 esitettyä pK 150, josta 5 PvuIIilla saatu fragmentti on poistettu kuvassa 11 esitetyllä tavalla, pK170* joka vastaa kuvassa 9 esitettyä pK170, josta Pvu-II:lla saatu fragmentti on poistettu kuvassa 11 esitetyllä tavalla, tai plntl3 (kuva 12). 25 8 6 8 S 7
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3526995 | 1985-07-27 | ||
| DE19853526995 DE3526995A1 (de) | 1985-07-27 | 1985-07-27 | Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI863041A0 FI863041A0 (fi) | 1986-07-24 |
| FI863041A FI863041A (fi) | 1987-01-28 |
| FI86887B true FI86887B (fi) | 1992-07-15 |
| FI86887C FI86887C (fi) | 1992-10-26 |
Family
ID=6276985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI863041A FI86887C (fi) | 1985-07-27 | 1986-07-24 | Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0211299B1 (fi) |
| JP (1) | JPH07113040B2 (fi) |
| KR (1) | KR950000299B1 (fi) |
| AT (1) | ATE50596T1 (fi) |
| AU (1) | AU595221B2 (fi) |
| CA (1) | CA1336329C (fi) |
| DE (2) | DE3526995A1 (fi) |
| DK (1) | DK172618B1 (fi) |
| ES (1) | ES2000278A6 (fi) |
| FI (1) | FI86887C (fi) |
| GR (1) | GR861957B (fi) |
| HU (1) | HU197356B (fi) |
| IE (1) | IE59127B1 (fi) |
| IL (1) | IL79522A (fi) |
| NO (1) | NO175640C (fi) |
| NZ (1) | NZ216967A (fi) |
| PT (1) | PT83065B (fi) |
| ZA (1) | ZA865556B (fi) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| JPS62220192A (ja) * | 1986-03-12 | 1987-09-28 | インタ−ナシヨナル・ミネラルズ・アンド・ケミカル・コ−ポレイシヨン | ハイブリツド表現ベクタ−、その構造および使用 |
| EP0371041A1 (en) * | 1987-06-24 | 1990-06-06 | Novo Nordisk A/S | A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| US5358857A (en) * | 1989-08-29 | 1994-10-25 | The General Hospital Corp. | Method of preparing fusion proteins |
| US5227293A (en) * | 1989-08-29 | 1993-07-13 | The General Hospital Corporation | Fusion proteins, their preparation and use |
| IL95495A (en) * | 1989-08-29 | 1996-10-16 | Hoechst Ag | Fusion proteins their preparation and use |
| GB8927722D0 (en) * | 1989-12-07 | 1990-02-07 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
| DE3942580A1 (de) * | 1989-12-22 | 1991-06-27 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von hirudin |
| ATE264871T1 (de) | 1996-07-26 | 2004-05-15 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivate mit erhöhter zinkbindung |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| DE19825447A1 (de) | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
| DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
| WO2009066320A2 (en) | 2007-09-21 | 2009-05-28 | Cadila Healthcare Limited | Fusion protein systems suitable for high expression of peptides |
| KR101939557B1 (ko) | 2008-10-17 | 2019-01-17 | 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 | 인슐린과 ｇｌｐ－1 효능제의 병용물 |
| CN107308442B (zh) | 2009-11-13 | 2022-10-18 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 包含glp-1激动剂、胰岛素和甲硫氨酸的药物组合物 |
| PT3345593T (pt) | 2009-11-13 | 2023-11-27 | Sanofi Aventis Deutschland | Composição farmacêutica compreendendo despro36exendina- 4(1-39)-lys6-nh2 e metionina |
| LT2611458T (lt) | 2010-08-30 | 2016-12-27 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Ave0010 panaudojimas gaminant vaistą, skirtą 2 tipo cukrinio diabeto gydymui |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| MX370264B (es) | 2011-08-29 | 2019-12-09 | Sanofi Aventis Deutschland | Combinacion farmaceutica para uso en el control glucemico en pacientes con diabetes de tipo 2. |
| AR087744A1 (es) | 2011-09-01 | 2014-04-16 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa |
| SI3229828T1 (sl) | 2014-12-12 | 2023-06-30 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Formulacija s fiksnim razmerjem inzulin glargin/liksisenatid |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| KR20200080747A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법 |
| KR20200080748A (ko) | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA802992B (en) * | 1979-06-01 | 1981-10-28 | Univ California | Human pre-growth hormone |
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| WO1986005513A1 (en) * | 1985-03-18 | 1986-09-25 | Gene Labs, Inc. | Hybrid-gene cassette vector |
| GB8507666D0 (en) * | 1985-03-25 | 1985-05-01 | Wellcome Found | Epidermal growth factor production |
| DE3650011T2 (de) * | 1985-04-08 | 1994-11-17 | Genetic Systems Corp | EXPRESSION UND DIAGNOSE MIT gag-KODIERTEN PEPTIDEN, DIE MIT ANTIKÖRPERN GEGEN LAV IMMUNOLOGISCH REAKTIV SIND. |
-
1985
- 1985-07-27 DE DE19853526995 patent/DE3526995A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-07-19 DE DE8686109945T patent/DE3669175D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-19 AT AT86109945T patent/ATE50596T1/de active
- 1986-07-19 EP EP86109945A patent/EP0211299B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-24 ES ES8600544A patent/ES2000278A6/es not_active Expired
- 1986-07-24 FI FI863041A patent/FI86887C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 AU AU60565/86A patent/AU595221B2/en not_active Expired
- 1986-07-25 IE IE197786A patent/IE59127B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 CA CA000514682A patent/CA1336329C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-25 NO NO863000A patent/NO175640C/no unknown
- 1986-07-25 NZ NZ216967A patent/NZ216967A/xx unknown
- 1986-07-25 HU HU863100A patent/HU197356B/hu unknown
- 1986-07-25 IL IL79522A patent/IL79522A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 DK DK198603554A patent/DK172618B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-07-25 GR GR861957A patent/GR861957B/el unknown
- 1986-07-25 ZA ZA865556A patent/ZA865556B/xx unknown
- 1986-07-25 PT PT83065A patent/PT83065B/pt unknown
- 1986-07-26 KR KR1019860006142A patent/KR950000299B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-07-26 JP JP61176558A patent/JPH07113040B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0211299A3 (en) | 1988-06-01 |
| NO175640C (no) | 1994-11-09 |
| CA1336329C (en) | 1995-07-18 |
| AU595221B2 (en) | 1990-03-29 |
| AU6056586A (en) | 1987-01-29 |
| DK355486D0 (da) | 1986-07-25 |
| IE861977L (en) | 1987-01-27 |
| ZA865556B (en) | 1987-03-25 |
| IL79522A (en) | 1991-08-16 |
| JPS6229600A (ja) | 1987-02-07 |
| EP0211299B1 (de) | 1990-02-28 |
| KR950000299B1 (ko) | 1995-01-13 |
| FI863041A0 (fi) | 1986-07-24 |
| HU197356B (en) | 1989-03-28 |
| IE59127B1 (en) | 1994-01-12 |
| NZ216967A (en) | 1988-08-30 |
| PT83065A (de) | 1986-08-01 |
| JPH07113040B2 (ja) | 1995-12-06 |
| NO175640B (fi) | 1994-08-01 |
| FI86887C (fi) | 1992-10-26 |
| HUT43629A (en) | 1987-11-30 |
| ES2000278A6 (es) | 1988-02-01 |
| PT83065B (pt) | 1989-02-28 |
| ATE50596T1 (de) | 1990-03-15 |
| IL79522A0 (en) | 1986-10-31 |
| FI863041A (fi) | 1987-01-28 |
| DE3669175D1 (de) | 1990-04-05 |
| DK355486A (da) | 1987-01-28 |
| NO863000D0 (no) | 1986-07-25 |
| KR870001312A (ko) | 1987-03-13 |
| NO863000L (no) | 1987-01-28 |
| DK172618B1 (da) | 1999-03-01 |
| DE3526995A1 (de) | 1987-02-05 |
| GR861957B (en) | 1986-11-25 |
| EP0211299A2 (de) | 1987-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI86887B (fi) | Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning. | |
| IL95495A (en) | Fusion proteins their preparation and use | |
| JP2694840B2 (ja) | ポリペプチドを微生物により発現させる方法 | |
| US4366246A (en) | Method for microbial polypeptide expression | |
| EP0234888B1 (en) | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof | |
| Kuliopulos et al. | Production, purification, and cleavage of tandem repeats of recombinant peptides | |
| DK172210B1 (da) | Hirudinderivater | |
| US4356270A (en) | Recombinant DNA cloning vehicle | |
| US4425437A (en) | Microbial polypeptide expression vehicle | |
| US4431739A (en) | Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein | |
| US5648244A (en) | Production, purification, cleavage and use of fusion peptides | |
| CA1297813C (en) | Process for production of insulin-like growth factor i | |
| Sung et al. | Short synthetic oligodeoxyribonucleotide leader sequences enhance accumulation of human proinsulin synthesized in Escherichia coli. | |
| US6051399A (en) | Production of C-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs | |
| IE57664B1 (en) | The preparation of polypeptides having an amide carboxyl terminal end | |
| US5545564A (en) | Vector for expression and secretion of polypeptide microorganism transformed by the vector and production of polypeptide with the same microorganism | |
| US4711847A (en) | Preparation of secretin | |
| JPH0816120B2 (ja) | 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチド | |
| Kempe et al. | Production and characterization of growth hormone releasing factor analogs through recombinant DNA and chemical techniques | |
| IE52122B1 (en) | Somatostatin or somatostatin precursors | |
| IE852440L (en) | Signal for protein transport | |
| FI97549C (fi) | Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa | |
| SU1707078A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК рТНУЗ14, кодирующа полипептид со свойствами тимозина @ человека, рекомбинантна плазмидна ДНК рТНУ12 - промежуточный продукт дл ее конструировани и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент полипептида со свойствами тимозина @ человека | |
| NZ229748A (en) | Process of producing a protein from a precursor having an n-terminal pro by enzymatic cleavage | |
| FI97239B (fi) | Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT |
|
| MA | Patent expired |