FI97239B - Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

97239

Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi

Jakamalla erotettu hakemuksesta 925312.

Keksintö koskee menetelmää sellaisen fuusiopro-5 teiinin valmistamiseksi, jolla on sekä interleukiini-2-että hirudiiniaktiivisuutta. Kuvataan myös interleukiini-2:a koodaavan DNA:n "avointa lukuvaiheistusta" ja tämän DNA:n käyttöä ilmentymisapuneuvona peptidien tai proteiinien tuottamiseksi.

10 Valmistettaessa eukaryoottisia proteiineja geeni teknisesti saadaan bakteereissa usein pieni saanto, erityisesti pienten proteiinien, joiden molekyylipaino on korkeintaan noin 15 000 daltonia ja joiden rakenne sisältää disulfidisiltoja, ollessa kyseessä. Oletetaan, että 15 isännän omat proteaasit hajottavat nopeasti muodostuneita proteiineja. Siksi on tarkoituksenmukaista muodostaa gee-nirakenteita, jotka koodaavat fuusioproteiineja, joissa fuusioproteiinin epätoivottava osa on isännän oma proteiini, joka poistetaan primaarituotteen eristämisen jäl-20 keen sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

Nyt on yllättävästi havaittu, että interleukiini-2:n N-terminaalinen osa, joka vastaa suurin piirtein 100 ensimmäistä aminohappoa, soveltuu erityisen hyvin fuusio-proteiinien valmistamiseen. Primaarituotteena saadaan siis : 25 fuusioproteiini, joka kokonaan tai hyvin suurelta osin koostuu eukaryoottisista proteiinisekvensseistä. Yllättävästi kyseessä oleva isäntäorganismi ei ilmeisesti tunnista tätä proteiinia vieraaksi proteiiniksi, eikä se heti hajoa uudelleen. Lisäetuna on se, että keksinnön mukaiset 30 fuusioproteiinit ovat niukkaliukoisia tai liukenemattomia, ja ne voidaan siten erottaa liukoisista proteiineista yksinkertaisesti, tarkoituksenmukaisesti sentrifugoimalla. Koska interleukiini-2-osan toimiminen fuusioproteiinin "painolastiosana" ei ole riippuvainen siitä, että tämä osa 35 on biologisesti aktiivinen molekyyli, ei myös olla riippu- 2 97239 vaisia interleukiini-2-osan täsmällisestä rakenteesta. Tähän tarkoitukseen riittää, että läsnä on suurin piirtein 100 ensimmäistä N-terminaalista aminohappoa. Siten on esimerkiksi mahdollista tehdä N-päähän muutoksia, jotka mah-5 dollistavat fuusioproteiinin lohkeamisen, jos haluttu proteiini on liittyneenä siihen N-terminaalisesti. Samaten voidaan C-päähän tehdä muutoksia, jotka mahdollistavat halutun proteiinin lohkeamisen tai helpottavat sitä, kun tämä on - kuten tavallista - liittyneenä fuusioproteiinin 10 C-päähän.

Ihmisen interleukiini-2:a, tästedes "IL-2", koodaa-vaa luonnon DNA-sekvenssiä kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 0 091 539. Siinä annettu kirjallisuus käsittelee hiiren ja rotan IL-2. Tätä imettäväis-DNA:ta voidaan käyttää keksin-15 nön mukaisesti proteiinien syntetisoimiseen. Tarkoituksen mukaisempaa on kuitenkin lähteä synteettisestä DNAtsta, erityisen edullisesti ihmisen IL-2 vastaavasta DNArsta, jota on ehdotettu (esijulkaisemattomassa) DE-hakemusjulkaisussa 3 419 995 (vastaa EP-hakemusjulkaisua 0 163 249). 20 Tämä synteettinen DNA-sekvenssi annetaan selitysosan lo pussa liitteenä I (DNA-sekvenssi I). Tämän synteettisen DNA-sekvenssin etuna ei ole ainoastaan se, että se on ko-donivalikoimaltaan useimmin käytetyn isännän, E. colin, kannalta sopiva, vaan myös se, että se sisältää joukon : 25 restriktioendonukleaasipilkkoutumiskohtia, joita voidaan keksinnön mukaisesti käyttää hyödyksi. Seuraavassa taulukossa 1 esitetään soveltuvien katkaisukohtien valikoima jakson alusta tai 100. tripletin alueelta. Tällä ei kuitenkaan suljeta pois DNA-muutosten tekemistä välissä ole-30 valla alueella, jolloin voidaan käyttää hyväksi edellä mainitussa patenttihakemuksessa annettuja muita katkaisu-kohtia.

3 97239

Taulukko 1

Restriktio- Tunnistus- Tunnistussekvenssin entsyymi sekvenssi ensimmäisen nukleotidin _asema (koodaava säie) 5 5' 3'

Aha II, Ban I,

Hae II, Nar I, GGCGCC 8

Ban II, Sac I,

Sst I GAGCTC 291 10 Hha I GCGC 9

Hinf I GACTC 35

Pvu I CGATCG 346

Tag I_TCGA_387_ 15

Jos käytetään nukleaaseja Banll, Sacl tai SStI, saadaan IL-2-osasekvenssi, joka koodaa noin 95:ä aminohappoa. Tämä pituus on yleensä riittävä liukenemattoman fuu-sioproteiinin saamiseksi. Jos niukkaliukoisuus, esimerkik-20 si halutun hydrofiilisen eukaryoottisen proteiinin ollessa kyseessä, ei vielä ole riittävä eikä kuitenkaan haluta -mahdollisimman vähäisen "painolastin" aikaansaamiseksi -käyttää lähempänä C-päätä sijaitsevia pilkkoutumiskohtia, voidaan DNA-sekvenssiä pidentää N- ja/tai C- päästä sopi-25 valla adapterilla eli kytkijällä ja "räätälöidä" sillä tavalla "painolasti"-osaa. Voidaan luonnollisesti myös käyttää DNA-sekvenssi - enemmän tai vähemmän loppuun asti ja saada siten aikaan mahdollisesti muunnettua biologisesti aktiivista IL-2 "sivutuotteena" tai bifunktionaalista 30 proteiinia, jolla on koodatun proteiinin vaikutuksen lisäksi IL-2-vaikutus.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää fuusiopro-teiinin valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että bakteeri-isäntäsolussa saatetaan sellainen 35 geeni ilmentymään, joka koodittaa C- tai N-terminaalista osaa, joka oleellisesti vastaa interleukiini-2:n aminohapposekvenssiä ja joka lisäksi koodittaa hirudiinia.

4 97239

Edullisesti käytetään geeniä, joka koodittaa fuu-sioproteiinia, jolla on yleinen kaava

Met - X - Y - Z tai Met - Z - Y - X

5 (Ia) (Ib) jossa X vastaa oleellisesti ihmisen lL-2:n aminohapposekvenssiä, Y on suora sidos, jos halutun proteiinin vieressä oleva aminohappo tai aminohappojakso mahdollistaa halutun 10 proteiinin lohkaisemisen, tai muussa tapauksessa yhdestä tai useammasta geneettisesti koodattavissa olevasta aminohaposta koostuva siltajakso, joka mahdollistaa lohkeami-sen, ja Z on hirudiinin aminohapposekvenssi.

Kuten kaavoista Ia ja Ib käy ilmi - ja kuten jo 15 edellä mainittiin - on mahdollista saattaa proteiini ilmentymään IL-2-osan edellä tai jäljessä. Yksinkertaisuuden vuoksi valaistaan jäljempänä pääasiassa ensimmäistä mahdollisuutta, joka vastaa yleistä fuusioproteiinien valmistusmenetelmää. Kun siis jäljempänä kuvataan tätä "klassis-20 ta" vaihtoehtoa, ei täten suljeta pois toista vaihtoehtoa.

Fuusioproteiinin pilkkominen voidaan tehdä sinänsä tunnetulla tavalla kemiallisesti tai entsymaattisesti. Soveltuvan menetelmän valinta määräytyy ennen kaikkea halutun proteiinin aminohapposekvenssin mukaan. Jos tämä ei 25 esimerkiksi sisällä metioniinia, voi Y olla Met, jonka kohdalta tapahtuu kemiallinen lohkaisu kloori- tai bromi-syaanilla. Jos yhdistävän jakson Y karboksyylipäässä on kysteiini tai Y on Cys, voidaan tehdä entsymaattinen kys-teiinispesifinen lohkaisu tai kemiallinen lohkaisu, esi-30 merkiksi spesifisen S-syanoloinnin jälkeen. Jos yhdistävän jakson Y karboksyylipäässä on tryptofaani tai Y on Trp, voidaan tehdä kemiallinen lohkaisu N-bromisukkinimidillä.

Proteiinit, joiden aminohapposekvenssi ei sisällä paria 35 Asp-Pro 5 97239 ja jotka ovat kyllin happostabiileja, voidaan lohkaista sinänsä tunnetulla tavalla proteolyyttisesti. Tällöin saadaan proteiineja, jotka sisältävät N-terminaalisen prolii-niryhmän tai C-terminaalisen asparagiinihapporyhmän. Tällä 5 tavalla voidaan siis syntetisoida myös muunnettuja proteiineja.

Asp-Pro-sidoksesta voidaan tehdä vielä herkempi hapoille, kun tämä välijakso on (Asp)n-Pro tai Glu-(Asp)n-Pro, jolloin n on 1 - 3.

10 Tunnetaan samoin esimerkkejä entsymaattisista loh- kaisuista, joissa voidaan käyttää myös muunnettuja entsyymejä, joilla on parannettu spesifisyys [vertaa C.S. Craik et ai.. Science 228 (1985) 291-297]. Jos haluttu euka-ryoottinen peptidi on proinsuliini; on tarkoituksenmukais-15 ta valita sekvenssiksi Y peptidisekvenssi, jossa trypsii-nillä lohkeava aminohappo (Arg, Lys) on liittyneenä proin-suliinin N-terminaaliseen aminohappoon (Phe), esimerkiksi jakso Ala-Ser-Met-Thr-Arg, koska tällöin voidaan tehdä arginiinispesifinen lohkaisu trypsiiniproteaasilla.

20 Ellei haluttu proteiini sisällä aminohappojaksoa

Ile-Glu-Gly-Arg, voidaan fuusioproteiini piikoa tekijä Xa:lla (EP-: 25 hakemusjulkaisut 0 025 190 ja 0 161 973).

Fuusioproteiinia muodostetaan sinänsä tunnetulla tavalla soveltuvassa ilmentymissysteemissä tapahtuvan ilmentymisen kautta. Tähän tarkoitukseen soveltuvat kaikki tunnetut isäntävektorisysteemit, siis esimerkiksi nisäkäs-30 solut ja mikro-organismit, esimerkiksi hiivat ja edullisesti bakteerit, erityisesti E. coli.

Haluttua proteiinia koodaava DNA-sekvenssi sijoitetaan tunnetulla tavalla vektoriin, joka saa aikaan hyvän ilmentymisen valitussa ilmentymissysteemissä.

6 97239

Bakteeri-isäntien yhteydessä valitaan promoottori ja operaattori tarkoituksenmukaisesti ryhmästä lac, tae, trp, λ-faagin PL tai P„, hsp, omp tai synteettinen promoottori, joita ehdotetaan esimerkiksi DE-hakemusjulkai-5 sussa 3 430 683 (EP-hakemusjulkaisu 0 173 149). Edullinen promoottori-operaattorisekvenssi on tae, joka sitä paitsi on kauppallisesti saatavissa (esimerkiksi ilmentymisvek-tori pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 64).

10 Keksinnön mukaisen fuusioproteiinin ilmentämisen yhteydessä voi osoittautua tarkoituksenmukaiseksi muuttaa ATG-aloituskodonia seuraavia, ensimmäisiä aminohappoja vastaavia yksittäisiä triplettejä mRNA:n tasolla tapahtuvan mahdollisen emäspariutumisen estämiseksi. Tällaiset 15 muuttamiset, samoin kuin yksittäisten aminohappojen muutokset, poistot tai lisäykset IL-2-proteiiniosassa, ovat alan ammattimiehen tehtävissä ja sisältyvät keksinnön piiriin.

Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavissa esimer-20 keissä ja piirroksissa. Tällöin kuvio 1 ja sen jatko-osa, kuvio la, esittävät plas-midin pK360 synteesiä, joka plasmidi koodaa hirudiinisek-venssin sisältävää fuusioproteiinia, kuvio 2 ja sen jatko-osa, kuvio 2a, esittävät plas-I 25 midin pK410 synteesiä, joka plasimidi samoin koodaa hiru-diiniaminohapposekvenssin sisältävää fuusioproteiinia, kuvio 3 ja sen jatko-osat, kuviot 3a - 3c, esittävät plasmidien pPH15, 16, 20 ja 30 muodostamista, jotka plasmidit koodaavat apinan proinsuliinin aminohapposek-30 venssin sisältäviä fuusioproteiineja, kuvio 4 esittää plasmidin pPHIOO, joka koodaa hiru-diiniaminohapposekvenssin sisältävää fuusioproteiinia, synteesiä, kuvio 5 ja sen jatko-osa, kuvio 5a, esittää plasmi-35 din pK370 muodostamista, joka plasmidi koodaa hirudiini-aminohapposekvenssin sisältävää fuusioproteiinia, ja 7 97239 kuvio 6 ja sen jatko-osa, kuvio 6a, esittävät plas-midin pKHIOI synteesiä, joka plasmidi koodaa apinan proin-suliiniaminohappojakson sisältävää fuusioproteiinia.

Kuvioiden mittakaava ei yleensä ole oikea, ennen 5 kaikkea polykytkijän kohdalla on mittakaavaa "venytetty".

Esimerkki 1

Sijoittamalla lac-repressori [P.J. Farabaugh, Nature 274 (1978) 765 - 769] plasmidiin pKK177-3 [Amann et ai., Gene 25 (1983) 167] saadaan plasmidi pJE118 (1) (ku-10 vio 1, vrt. DE-patenttihakemus P 35 26 995.2, esimerkki 6, kuvio 6). Tämä avataan ainoan Aval-restriktiokohtansa kohdalta ja lyhennetään sinänsä tunnetulla tavalla eksonuk-leaasikäsittelyllä noin 100 emäsparin verran. Ligaation jälkeen saadaan plasmidi pEWlOOO (2) (kuvio 1), jossa on 15 tallella koko lac-repressorigeeni ja joka kuitenkin esiintyy pienemmän kokonsa ansiosta selvästi runsaslukuisempana.

Plasmidin pKK177-3 sijasta voidaan käyttää lähtö-tuotteena myös edellä mainittua kaupallisesti saatavaa 20 plasmidia pKK223-3, sijoittaa siihen lac-repressori ja lyhentää saatu tuote vastaavalla tavalla.

Plasmidi pEWlOOO (2) avataan restriktioentsyymeillä EcoRI ja Sali.

Hirudiinia koodaava plasmidi (4), joka valmistetaan : 25 DE-hakemusjulkaisun 3 429 430 (EP-hakemusjulkaisu 0 171 024) esimerkin 4 mukaisesti (kuvio 3), avataan restriktioentsyymeillä Accl ja Sali ja eristetään pieni fragmentti (5), joka sisältää suurimmaksi osaksi hirudiinisek-venssin.

30 Plasmidi pl59/6 (8), joka valmistetaan DE-hakemus- julkaisun 3 419 995 (EP-hakemusjulkaisu 0 163 249) esimerkin 4 mukaisesti (kuvio 5), avataan restriktioentsyymeillä EcoRI ja PvuI ja eristetään pieni fragmentti, joka sisältää suurimman osan IL-2-sekvenssistä. Tästä osasekvenssis-35 tä ja jäljempänä myös muista lyhennetyistä IL-2-sekvens-seistä käytetään kuvioissa merkintää "IL2".

8 97239

Sen jälkeen käsitellään sekvenssit (3), (5), (7) ja synteettinen DNA-sekvenssi (8, kuvio la) T4-ligaasilla. Saadaan plasmidi pK360 (9).

Kompetentit E. coli -solut transformoidaan ligaa-5 tiotuotteella ja siirrostetaan NA-maljoille, jotka sisältävät 25 pg/ml ampisilliinia. Kloonien plasmidi-DNA karakterisoidaan restriktio- ja sekvenssianalyysillä.

E. coli -soluviljelmä, jota on kasvatettu yön yli ja joka sisältää plasmidia (9), laimennetaan LB-alustalla 10 (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold

Spring Harbor Laboratory, 1972), joka sisältää 50 pg/ml ampisilliinia, suunnilleen suhteessa 1:100, ja seurataan kasvua mittaamalla optista tiheyttä (OD). OD-arvon ollessa 0,5 säädetään ravistusviljelmän isopropyyli-B-galaktopy-15 ranosidipitoisuus (IPTG-pitoisuus) arvoon 1 mM, ja erotetaan bakteerit sentrifugoimalla 150 - 180 min:n kuluttua. Bakteereita keitetään 5 min puskuriseoksessa (7 mol/1 ureaa, 0,1 % SDS, 0,1 mol/1 natriumfosfaattia, pH 7,0), ja näytteet siirretään SDS-geelielektroforeesilevylle. Elekt-20 roforeesin jälkeen saadaan bakteereista, jotka sisältävät plasmidia (9), proteiinivyöhyke, joka vastaa odotetun fuu-sioproteiinin kokoa. Bakteerien rikkomisen (French Press, <R)Dyno-Muhle) ja sentrifugoinnin jälkeen on fuusioproteiini sakassa, niin että supernatantin mukana voidaan jo erottaa : 25 huomattavia määriä muita proteiineja. Fuusioproteiinin eristämisen jälkeen vapautetaan haluttu hirudiinipeptidi bromisyaanilohkaisulla. se karakterisoidaan eristämisen jälkeen proteiinisekvenssianalyysillä.

Annetut indusointiolosuhteet pätevät ravistusvil-30 jelmille, suurempien fermentointien ollessa kyseessä ovat vastaavasti muutetut OD-arvot ja mahdollisesti hieman muutetut IPTG-pitoisuudet tarkoituksenmukaisia.

Esimerkki 2

Plasmidi (4) (kuvio 1) avataan Accl:llä, ja täyte-35 tään yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin avulla. Sen 9 97239 jälkeen tehdään pilkkominen Saclrllä, ja eristetään fragmentti (10), joka sisältää suurimman osan hirudiinisek-venssistä.

Kaupallisesti saatava vektori pUC13 avataan rest-5 riktioentsyymeillä Sacl ja Smal, ja eristetään suuri fragmentti (11).

Sitten ligatoidaan fragmentit (10) ja (11) plasmi-diin pK400 (12) (kuvio 2) T4-ligaasin avulla. Plasmidi (12) on esitetty kuviossa 2 kahtena piirroksena, joista 10 alemmassa näkyy täten saatavan hirudiinijohdannaisen aminohapposekvenssi .

Plasmidi (4) (kuvio 1) avataan restriktioentsyy- meillä Kpnl ja Sali, ja eristetään pieni fragmentti (13), joka sisältää hirudiiniosasekvenssin.

15 Plasmidin (12) annetaan reagoida restriktioentsyy- mien Hindi ja Kpnl kanssa, ja eristetään pieni fragmentti (14), joka sisältää hirudiiniosasekvenssin.

Plasmidi (9) (kuvio la) pilkotaan osittain EcoRI:-llä, täytetään vapaat päät Klenow-polymeraasin avulla 20 fill-in-reaktiolla, ja tehdään pilkkominen Sali:11a. Saadaan plasmidin pK360 johdannainen (15).

Ligatoimalla fragmentit (3), (13), (14) ja (15) saadaan plasmidi pK410 (16), joka esitetään kuviossa 2a kahdesti, jolloin alemmassa piirroksessa näkyy fuusiopro-: 25 teiinin ja siten happopilkkomisella saatavan hirudiinijoh dannaisen aminohapposekvenssi.

Esimerkin 1 mukaisen ilmentämisen ja käsittelyn jälkeen saadaan uusi hirudiinijohdannainen, jonka asemissa 1 ja 2 on aminohapot proliini ja histidiini. Tällä hiru-30 diinijohdannaisella on samanlainen aktiivisuus kuin DE-ha-kemusjulkaisun mukaisella luonnontuotteella, jossa näissä asemissa on aminohapot treoniini ja tyrosiini, mutta se on kestävämpi aminopeptidaasien vaikutusta vastaan, mistä voi olla etua in vivo -käytön yhteydessä.

10 97239

Vertailueslmerkki 3

Kaupallisesti saatava vektori pBR322 avataan BamHI:llä, jolloin saadaan linear!soitunut plasmidi (17). Yksisäikeiset päät täytetään osittain käyttämällä dATP:tä, 5 dGTP:tä ja dTTP:tä, ja poistetaan ylimääräinen nukleotidi G Sl-nukleaasilla, jolloin saadaan pBR322-johdannainen (18).

Apinan proinsuliinigeenin [Wetekam et ai., Gene 19 (1982) 181] Haelll-fragmentti (19) ligatoidaan muunnetun 10 plasmidin (18) kanssa, jolloin saadaan plasmidi pPHl (20). Koska insuliiniosasekvenssi sijoitettiin tetrasykliinigee-niin, eivät kloonit, jotka sisältävät tätä plasmidia, ole tetrasykliiniresistenttejä, ja ne voidaan siten tunnistaa.

Plasmidi (20) avataan BamHl:llä ja Ddel:llä, ja 15 eristetään pieni fragmentti (21).

Lisäksi eristetään apinan proinsuliinisekvenssistä Ddel-PvuII-osasekvenssi (22).

Vektori pBR322 avataan BamHl:llä ja PvuII:lla, ja eristetään linearisoitu plasmidi (23).

20 Ligatoimalla insuliiniosasekvenssit (21) ja (22) avatun plasmidin (23) kanssa saadaan plasmidi pPH5 (24). Tämä avataan BamHI:llä ja PvuII:lla, ja eristetään pieni fragmentti (25).

Insuliinirakenteen täydentämiseksi syntetisoidaan * 25 DNA-sekvenssi (26).

Kaupallisesti saatava vektori pUC8 avataan entsyymeillä BamHI ja Sali, ja eristetään jäännösplasmidi (27). Tämä ligatoidaan DNA-sekvenssien (25) ja (26) kanssa plas-midiksi pPHi5 (28). Tämä avataan Sällillä, ja täytetään 30 yksisäikeiset päät. Saadusta plasmidijohdannaisesta (29) lohkaistaan DNA-sekvenssi (30) BamHI:llä.

Kaupallisesti saatava vektori pUC9 avataan entsyymeillä BamHI ja Smal, ja eristetään suuri fragmentti (31). Tämä ligatoidaan DNA-sekvenssin (30) kanssa, jolloin saa-35 daan plasmidi pH16 (32).

11 97239

Plasmidl (32) avataan Sali:11a, täytetään lineari-soitu plasmidl (33) osittain dCTP:llä, dGTP:llä ja dTTP:-llä, ja lohkaistaan jäljelle jäävä nukleotidi T Sl-nuk-leaasilla. Siten saatu plasmidijohdannainen (34) käsitel-5 lään BamHI:llä, ja poistetaan tuotteesta (35) ylimääräinen yksinkertainen säie Sl-nukleaasilla, jolloin saadaan plasmidi johdannainen (36).

Plasmidijohdannaisen (35) tylpät päät syklisoidaan plasmidiksi pPH20 (37).

10 Kompetentit E. coli Hb 101 -solut transformoidaan ligaatioseoksella ja siirrostetaan selektiiviselle alustalle. Haluttua plasmidia sisältävät kloonit tuottavat proinsuliinia, ja 70 tutkitusta kloonista 28 sisälsivät radioimmunologisesti havaittavissa olevaa proinsuliinia. 15 Plasmidit karakterisoidaan lisäksi DNA-sekvenssianalyysil- lä. Ne sisältävät DNA:ta, jossa on B-ketjun ensimmäistä aminohappoa (Phe) vastaavan kodonin edellä arginiinia koo-daava kodoni.

Plasmidi (37) pilkotaan HindIII:lla, täytetään yk-20 sisäikeiset päät, ja pilkotaan uudelleen Ddel:llä. Eristetään pieni fragmentti (38).

Plasmidi (28) (kuvio 3a) pilkotaan Sall:llä ja Ddel:llä, ja erotetaan pieni fragmentti (39).

Plasmidi (9) (kuvio la) pilkotaan ensin Accl:llä, : 25 täytetään vapaat päät, ja pilkotaan sitten EcoRI:llä.

Eristetään fragmentti (40), joka sisältää lyhentyneen IL-2-sekvenssin.

Linearisoitu plasmidi (3) (kuvio 1) ja DNA-segmen-tit (38), (39), ja (40) ligatoidaan sitten plasmidiksi 30 pPH30 (41). Tämä plasmidi koodaa fuusioproteiinia, joka sisältää IL-2:n aminohappojen 1 - 114 jälkeen seuraavan aminohapposekvenssin:

Asp-Phe-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ala-Ala-Gly-Arg.

12 97239 Tämän välijakson Y viimeisenä aminohappona oleva arginiini mahdollistaa insuliiniketjun lohkaisemisen tryp-siinillä.

Plasmidista (9) (kuvio la) voidaan päästä plasmi-5 diin (41) myös seuraavaa tietä: (9) avataan Accl:llä, täytetään yksisäikeiset päät, pilkotaan Sall:llä ja ligatoidaan saatu plasmidijohdannainen (42) segmenttien (3), (38) ja (39) kanssa.

Esimerkki 4 10 Plasmidi (6) (kuvio 1) avataan restriktioentsyy- meillä Taql ja EcoRI, ja eristetään pieni fragmentti (43). Tämä fragmentti ligatoidaan syntetisoidun DNA-sekvenssin

(44) ja segmenttien (3) ja (5) kanssa plasmidiksi pPHIOO

(45) . Tämä plasmidi koodaa fuusioproteiinia, jossa IL-2:n 15 132 ensimmäisen aminohapon jälkeen on välijakso Asp-Pro ja sen jälkeen hirudiiniaminohappojakso. Proteolyyttisellä lohkaisulla saadaan siten muunnettu, biologisesti aktiivinen IL-2', jossa on asemassa 133 Thr:n sijasta Asp, ja hirudiinijohdos, joka sisältää N-päässä ryhmän Pro ennen 20 luonnollisen tuotteen aminohapposekvenssiä. Myös tämä tuote on biologisesti aktiivinen ja luonnontuotteeseen verrattuna kestävämpi proteaaseja vastaan.

IL-2'-hirudiinifuusioproteiini on samoin biologisesti aktiivinen: 25 Proliferaatiokokeessa, joka tehtiin IL-2:sta riip puvaisella solulinjalla (CTLL2), havaittiin biologinen aktiivisuus.

Kun oli tehty denaturointi 6 M guanidiniumhydroklo-ridiliuoksessa ja sen jälkeen renaturointi puskuriliuok-30 sessa (10 mMl TrispHCl, pH 8,5, 10 mM EDTA), havaittiin lisäksi korkea IL-2-aktiivisuus. Lisäksi hapolla käsitellyn veren, johon oli lisätty trombiinia, hyytymisaika pi-teni fuusioproteiinin lisäämisen jälkeen.

Tuote oli siten bifunktionaalinen fuusioproteiini.

13 97239

Esimerkki 5

Kaupallisesti saatava vektori pUC12 avataan rest-riktioentsyymeillä EcoRI ja Sacl. Tähän linearisoituun plasmidiin (46) sijoitetaan lL-2-osasekvenssi, joka loh-5 kaistaan plasmidista (6) (kuvio 1) restriktioentsyymeillä EcoRI ja Sacl. Tämä sekvenssi (47) sisältää IL-2:n 94 ensimmäistä aminohappoa vastaavat täydelliset tripletit. Li-gatoimalla (46) ja (47) saadaan plasmidi pK300 (48).

Plasmidi (9) (kuvio la) avataan EcoRI:llä, täyte-10 tään yksisäikeiset päät, ja pilkotaan sitten HindIII:lla.

Eristetään pieni fragmentti (49), joka sisältää hirudiinia koodaavan DNA-segmentin jälkeen osan pUC12:n polykytkijäs-tä.

Plasmidi (48) avataan restriktioentsyymeillä Smal 15 ja Hinlll, ja eristetään suuri fragmentti (50). Ligatoi-malla (50) (49):ään saadaan plasmidi pK301 (51).

Kompetentit E. coli 294 -solut tranformoidaan li-gaatioseoksella. Kloonit, jotka sisältävät plasmidia (51), karakterisoidaan restriktioanalyysillä. Ne sisältävät 20 DNA:ta, jossa on IL-2:n 96 ensimmäistä aminohappoa vastaavien kodonien jälkeen 6 aminohaposta koostuvaa yhdistävää jaksoa vastaavat kodonit ja sen jälkeen hirudiinia vastaavat kodonit.

Plasmidi (51) käsitellään EcoRI:llä ja HindIII:lla, : 25 ja eristetään fragmentti (52), joka sisältää mainittua eukaryoottista fuusioproteiinia vastaavan DNA-sekvenssin.

Plasmidi (2) (kuvio 1) avataan EcoRI:llä ja Hind-III:lla. Saatu linearisoitu plasmidi (53) ligatoidaan DNA-sekvenssin (52) kanssa, jolloin saadaan plasmidi pH370 30 (54).

Kun plasmidi (54) saatetaan esimerkkiä 1 vastaavalla tavalla ilmentymään E. colissa, saadaan fuusioproteiinia, jossa on IL- 2:n 96 ensimmäisen aminohapon jälkeen välijakso 14 97239

Ala-Gln-Phe-Met-Ile-Thr ja sen jälkeen hirudiinin aminohappojakso.

Vertailuesimerkki 6 5 Plasmidista (41) (esimerkki 3; kuvio 3c) lohkais taan restriktioentsyymeillä EcoRI ja HindiII apinan proin-suliinia koodaava DNA-segmentti, ja täytetään yksisäikei-set päät. Saadaan DNA-segmentti (55).

Plasmidi (48) (esimerkki 5, kuvio 5) avataan Smal:-10 llä ja käsitellään alkalisella naudanfosfataasilla. Siten saatu linearoitu plasmidi (56) ligatoidaan DNA-segmentin (55) kanssa, jolloin saadaan plasmidi pK302 (57). E. coli 294 -solut transformoidaan ligaatioseoksella, ja karakterisoidaan kloonit, jotka sisältävät haluttua plasmidia, 15 tekemällä plasmidi-DNA:lie ensin restriktio- ja sitten sekvenssianalyysi.

Plasmidista (57) lohkaistaan EcoRI:llä ja Hindlll:-11a segmentti (58), joka koodaa IL-2 ja apinan proinsulii-nia.

20 Plasmidi (2) (esimerkki 1, kuvio 1) pilkotaan sa moin EcoRI:11a ja HindIII:lla, ja ligatoidaan segmentti (58) linearisoituun plasmidiin (3). Saadaan plasmidi pKHIOI (59).

Esimerkin 1 mukainen ilmentyminen johtaa fuusiopro-25 teiiniin, josta IL-2:n 96 ensimmäistä aminohappoa seuraa 14 aminohaposta koostuva yhdistyvä jakso (vastaa jaksoa Y DNA-segmentissä (58)), jota seuraa apinan proinsuliinin aminohappoj akso.

15 97239

Liite I: Interleukiini-2:n DNA-sekvenssi

Tripletti nro 012 5 Aminohappo Ala Pro

Nukleotidi nro 1 10

Koodattava säie 5' AA TTC ATG GCG CCG

Koodaamaton säie_2J_G TAC CGC GGC_ 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 10 Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu

20 30 40 ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG

TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTC TGA GTT GAC

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin 15 50 60 70

CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG

GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC CTG GAC GTC

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 ^ 80 90 100

ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC . AAC TAC AAA

TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT 1 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 25 110 120 130

AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC

TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAC TGG AAG

16 97239 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lye Ala Thr Glu 140 150 160

AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA

5 TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT

53 54 55 56 57 58 59 60 61 62

Leu Lye His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu 170 180 190

CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG

10 GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT CTC

63 64 65 66 67 68 69 70 71 72

Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu 200 210 220

CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG

15 GAC TTT GGC GAC CTC CTT CAA GAC TTG GAC

73 74 75 76 77 78 79 80 81 82

Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 230 240 250

GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG

20 CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC

83 84 85 86 87 88 89 90 91 92

Arg Asp Leu lie Ser Aen lie Aen Val lie 260 270 280

CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC

25 GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG 1 :8 tt-l ill) In# :: 94 95 96 97 98 99 100 101 102

Val Leu Glu Leu Lye Gly Ser Glu Thr Thr 290 300 310

GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG

30 CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC

17 97239 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340

TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG

5 AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC

113 114 115 116 117 118 119 120 121 122

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp lie 350 360 370

ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC

10 TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG

123 124 125 126 127 128 129 130 131 132

Thr Phe Cys Gin Ser lie lie Ser Thr Leu 380 390 400

ACC TTC TGC CAG TCG ATc' ATC TCT ACC CTG

15 TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC

133 134 135

Thr 410 ACC TGA TAG 3' 2Q TGG ACT ATC AGC T 5' • ·

Claims (7)

97239

1. Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että bakteeri-isäntäsolussa saate- 5 taan sellainen geeni ilmentymään, joka koodittaa C- tai N-terminaalista osaa, joka oleellisesti vastaa interleukii-ni-2:n aminohapposekvenssiä ja joka lisäksi koodittaa hi-rudiinia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että geeni koodittaa fuusiopro- teiinia, jolla on yleinen kaava Met - X - Y - Z (Ia) tai

15 Met - Z - Y - X (Ib) joissa kaavoissa X vastaa oleellisesti ihmisen interleu-kiini-2:n aminohapposekvenssiä, Y on suora sidos tai geneettisesti koodittavien aminohappojen muodostama silta-20 jäsen ja Z on hirudiinin aminohapposekvenssi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Y Z:n vieressä sisältää aminohapon Met, Cys, Trp, Arg tai Lys tai muodostuu näistä aminohapoista.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Y Z:n vieressä sisältää aminohapposekvenssin Asp - Pro tai koostuu siitä.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioproteiini 30 erotetaan liukoisista proteiineista sentrifugoimalla.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on E. coli.

7. Plasmidi pPH 100, joka on esitetty kuviossa 4. • 97239